專利名稱：經(jīng)擴增gnd基因發(fā)酵制備L－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用棒狀細菌經(jīng)發(fā)酵制備L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸和L-色氨酸的方法，在所述棒狀細菌中至少gnd基因是擴增的。
已知氨基酸可通過棒狀細菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于L-氨基酸的極其重要性，已持續(xù)進行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥戊酸(AHV)有抗性或重要的調(diào)節(jié)氨基酸缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸的菌株。
一段時間以來，重組DNA技術(shù)的方法也用于改良生產(chǎn)L-氨基酸的谷氨酸棒桿菌菌株。
發(fā)明目的本發(fā)明目的是提供新的用棒狀細菌經(jīng)發(fā)酵制備L-氨基酸的改良方法。
本發(fā)明提供了用棒狀細菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，尤其L-賴氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸和L-色氨酸的方法，在該棒狀細菌中編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶(EC1.1.1.44)(gnd基因)的核苷酸序列是擴增的，尤其是過表達的。
使用的菌株優(yōu)選在gnd基因擴增之前已生產(chǎn)L-氨基酸。
優(yōu)選的實施方案見于權(quán)利要求書。
文中術(shù)語“擴增”是指微生物中由相應(yīng)的DNA編碼的一或多種酶的胞內(nèi)活性的提高，例如通過提高基因的拷貝數(shù)，或使用強啟動子或編碼高活性相應(yīng)酶的基因，及任選地組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉，纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸。所述微生物可以是棒狀細菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬，在棒桿菌屬中尤其應(yīng)提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
以下已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032醋谷棒桿菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC 13870嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC 14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869擴展短桿菌ATCC 14020和從中獲得的生產(chǎn)L-氨基酸的突變體，如生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21649黃色短桿菌BB69黃色短桿菌DSM5399乳發(fā)酵短桿菌FERM-BP 269
乳發(fā)酵短桿菌TBB-10以及，如生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC14309谷氨酸棒桿菌ATCC14310谷氨酸棒桿菌ATCC14311谷氨酸棒桿菌ATCC15168產(chǎn)氨棒桿菌ATCC6871以及，如生產(chǎn)L-色氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21850谷氨酸棒桿菌KY9218(pKW9901)以及，如生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P 1709黃色短桿菌FERM-P 1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P 1712谷氨酸棒桿菌FERM-P 6463谷氨酸棒桿菌FERM-P6464谷氨酸棒桿菌DSM5715谷氨酸棒桿菌DSM58-1谷氨酸棒桿菌DSM12866是棒桿菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌合適菌株的實例。
已發(fā)現(xiàn)在編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶(EC1.1.1.44)的gnd基因過表達之后，棒桿菌以改良方式生產(chǎn)L-氨基酸，尤其L-賴氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸和L-色氨酸。
編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因，其催化6-磷酸葡糖酸氧化脫羧為5-磷酸核酮糖。gnd基因的核苷酸序列揭示于JP-A-9-224662。本發(fā)明首次應(yīng)用了在提及的參考文獻中闡述的gnd基因。得自遺傳密碼簡并或由于中性功能的有義突變導(dǎo)致的gnd基因的等位基因也可使用。
為獲得擴增(如過表達)，例如可提高相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或可使位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點突變。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達盒以同樣方式工作。通過可誘導(dǎo)啟動子，在L-氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)期間增加表達也是可能的。延長mRNA壽命的措施也可改善表達。另外，通過防止酶蛋白的分解也可提高酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建體可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或可在染色體中整合與擴增。或者，通過改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件，也可獲得相關(guān)基因的過表達。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員從以下文獻中可發(fā)現(xiàn)對此的詳述，參見Martin等(生物/技術(shù)5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術(shù)6,428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利說明書EPS0472869，美國專利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9，84-87(1991))，Reischeid等(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)60，126-132(1994))，LaBarre等(細菌學(xué)雜志175，1001-1007(1993))，專利申請WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特許公開JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術(shù)及生物工程58,191-195(1998))，及已知關(guān)于遺傳及分子生物學(xué)的教材。
例如，6-磷酸葡糖酸脫氫酶借助于質(zhì)粒被過表達。為此使用


圖1所示的大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2。在將gnd基因摻入pEC-T18mob2的EcoRI切割位點之后，形成圖2所示的質(zhì)粒pECgnd。
能在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的其它質(zhì)粒載體如pEKExl(Eikmarms等，基因10293-98(1991))，或pZ8-1(EP-B-0375889)也可以同樣方式使用。
另外，除編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因之外，特定生物合成途徑，糖酵解，添補反應(yīng)，戊糖磷酸途徑或氨基酸輸出的一或多種酶的過表達，對L-氨基酸的生產(chǎn)可以是有益的。
因此，例如選自以下一組的一或多個基因可被同時擴增尤其是過表達以生產(chǎn)L-蘇氨酸·編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因(Peoples等，分子微生物學(xué)2，63-72(1988))，或編碼“反饋抗性”高絲氨酸脫氫酶的homdr等位基因(Archer等，基因107，53-59(1991))，·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細菌學(xué)雜志174，6076-6086)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物學(xué)144915-927(1998))，·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，歐洲生物化學(xué)雜志254，395-403)·編碼轉(zhuǎn)酮酶的tkt基因(歐洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL，Heidelberg，德國)的數(shù)據(jù)庫，登記號AB023377)·編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因(JP-A-09224661)·編碼蘇氨酸輸出的thrE基因(DE 199 41 478.5；DSM12840)·zwa1基因(DE 199 59 328.0；DSM13115)·編碼烯醇酶的eno基因(DE19941478.5)。
因此，例如選自以下一組的一或多個基因可被同時擴增尤其是過表達以生產(chǎn)L-賴氨酸·編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，·編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等，(1990)，分子及普通遺傳學(xué)224317-324)，·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikamanns(1992)，細菌學(xué)雜志174，6076-6086)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikamanns(1992)，細菌學(xué)雜志174，6076-6086)，·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，歐洲生物化學(xué)雜志254，395-403)，·編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因(JP-A-09224661)，·編碼轉(zhuǎn)酮酶的tkt基因(歐洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL，Heidelberg，德國)的數(shù)據(jù)庫，登記號AB023377)，·編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，·zwa1基因(DE 199 59 328.0，DSM13115)，·編碼烯醇酶的eno基因(DE19941478.5)。
除擴增gnd基因之外，同時弱化選自以下一組的一或多個基因?qū)-氨基酸的生產(chǎn)也可以是有益的·編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，·編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM13114)，·zwa 2基因(DE19959327.2，DSM13113)。
除過表達6-磷酸葡糖酸脫氫酶之外，消除非所需的副反應(yīng)對L-氨基酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，倫敦英國，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)培養(yǎng)或非連續(xù)地通過分批法，補料分批法或重復(fù)補料發(fā)批法培養(yǎng)，以生產(chǎn)L-氨基酸。已知培養(yǎng)法見于由Chmiel(生物方法技術(shù)學(xué)1，生物工程入門，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反應(yīng)器及外周設(shè)備，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合特定菌株的需求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細菌學(xué)會的“細菌學(xué)通用方法手冊”(華盛頓D.C..USA，1981)?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔?，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨或混合使用?？墒褂玫牡窗ê挠袡C化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無機化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨或混合使用?？墒褂玫牧自窗姿幔姿岫溻浕蛄姿釟涠?，或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中，上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間適當(dāng)補加。
可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值?？古菽瓌├缰舅峋垡叶伎捎糜诳刂婆菽a(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小時范圍內(nèi)達到。
L-氨基酸的分析可通過陰離子交換層析，隨后經(jīng)過如Spackman等(分析化學(xué)30(1958)1190)所述茚三酮衍生化作用進行，或通過如Lindroth等(分析化學(xué)(1979)511167-1174)所述反向HPLC進行。
以下微生物根據(jù)布達佩斯條約，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)大腸桿菌K-12 DH5α/pEC-T18mob2，保藏號DSM13244。
本發(fā)明包括以下附圖
圖1質(zhì)粒pEC-T18mob2圖。
圖2質(zhì)粒pECgnd圖。
圖3質(zhì)粒pBGNA圖。
圖4質(zhì)粒pCR2.1poxBint圖。
堿基對數(shù)目是根據(jù)再現(xiàn)性獲得的大約值。
圖中所采用的縮寫有如下含義
圖1Tet四環(huán)素抗性基因oriV大腸桿菌的質(zhì)粒編碼的復(fù)制源點RP4mob轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的mob區(qū)域rep來自谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒pGA1的質(zhì)粒編碼的復(fù)制源點perpGA1的控制拷貝數(shù)的基因lacZ-alphaβ-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N末端)圖2Tet四環(huán)素抗性基因rep來自谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒pGA1的質(zhì)粒編碼的復(fù)制源點perpGA1的控制拷貝數(shù)的基因lacZ來自pEC-T18mob2的lacZα基因片段的克隆殘存片段gnd6-磷酸葡糖酸脫氫酶基因圖3lacP大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子CMV巨細胞病毒的啟動子ColE1質(zhì)粒ColE1的復(fù)制源點TkpolyA聚腺苷酸化位點Kan r卡那霉素抗性基因SV40ori猴病毒40的復(fù)制源點gnd6-磷酸葡糖酸脫氫酶基因圖4ColE1 ori質(zhì)粒ColE1的復(fù)制源點lacZlacZα基因片段的克隆殘存片段fl ori噬菌體fl的復(fù)制源點KmR卡那霉素抗性
ApR氨芐青霉素抗性poxBintpoxB基因的內(nèi)部片段另外，使用以下縮寫AccI限制酶AccI的酶切位點BamHI限制酶BamHI的酶切位點EcoRI限制酶EcoRI的酶切位點HindIII限制酶HindIII的酶切位點KpnI限制酶KpnI的酶切位點PstI限制酶PstI的酶切位點PvuI限制酶PvuI的酶切位點SalI限制酶SalI的酶切位點SacI限制酶SacI的酶切位點SmaI限制酶SmaI的酶切位點SphI限制酶SphI的酶切位點XbaI限制酶XabI的酶切位點XhoI限制酶XhoI的酶切位點估計所得PCR產(chǎn)物的大小大約為252bp。
最佳PCR條件確定如下35次循環(huán)94℃ 1分鐘55℃ 1分鐘72℃ 30秒2.5-3.5mM MgCl2100-150ng AS019基因組DNA對所得PCR產(chǎn)物進行測序分析證實此產(chǎn)物是gnd基因的內(nèi)部部分。用通用的正向和反向引物，和Pharmacia Biotech(St.Albans，Herts，UK)的T7測序試劑盒測序。PCR產(chǎn)物的序列示于SEQ ID NO1。2.克隆根據(jù)ёZap ExpressTM系統(tǒng)方案篩選AS019ёZap ExpressTM文庫(Stratagene，11011 North Torrey Pines Rd.，La Jolla，Califomia 92037)。然后對分離的克隆進行Southem印跡分析。如Schleicher和Schuell方法手冊所述，將NytranTM(“Nytran，修飾的尼龍-66濾膜”(1987年3月)，Schleicher和Schuell，Dassbl，德國)作為膜進行DNA的Southern轉(zhuǎn)移。將使用上述相同引物和最佳PCR條件產(chǎn)生的雙鏈DNA片段，用Amersham生命科學(xué)公司的MultiprimeTMDNA標(biāo)記試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech UK Limited，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)，根據(jù)說明書用α-32p-dCTP放射標(biāo)記。預(yù)雜交，雜交和沖洗條件如Schleicher和Schuell方法手冊所述。根據(jù)Sambrook等所述方法，用AgFa Curix RPIL膠片進行放射自顯影。由此鑒別一些gnd克隆。從稱為pBGNA(圖3)的一個克隆分離質(zhì)粒DNA，并選擇其進行進一步分析。3.測序通過Sanger等的Sanger雙脫氧鏈終止法(美國科學(xué)院院報74，5463-5467(1977))，對pBGNA中克隆的插入體進行測序。用PharmaciaBiotech公司的T7測序試劑盒和α-32P-dCTP(St.Albans，Herts，UK)進行此方法。根據(jù)Pharmacia克隆和測序指導(dǎo)手冊(“T7SequencingTM試劑盒”，ref.XY-010-00-19，Pharmacia Biotech，1994)，將樣品在TBE緩沖液中于6％聚丙烯酰胺/尿素凝膠上，以恒定的50mA進行電泳3-8小時。用自內(nèi)部gnd PCR產(chǎn)物的已知序列(SEQ ID NO1)設(shè)計的內(nèi)部引物測序，以推導(dǎo)全部gnd基因序列。
內(nèi)部引物的序列如下內(nèi)部引物15’GGT GGA TGC TGA AAC CG 3’內(nèi)部引物25’GCT GCA TGC CTG CTG CG 3’內(nèi)部引物35’TTG TTG CTT ACG CAC AG 3’內(nèi)部引物45’TCG TAG GAC TTT GCT GG 3’所得的序列在蘋果麥金托什機計算上用DNA Strider程序1.0版(Marck，(1998).核酸研究161829-1836)進行分析。這一程序可以進行限制性位點使用、開放讀框分析和密碼子使用分析。使用BLAST程序(Altschul等，(1997)核酸研究，253389-3402)在所得DNA序列和EMBL和Genbank中的序列之間進行查詢。DNA和蛋白質(zhì)序列比較使用Clustal V和Clustal W程序(Higgins and Sharp，1998基因73237-244)。
所得的序列如SEQ ID NO2所示。核苷酸序列分析揭示一1377個堿基對的開放讀框，命名為gnd基因，其編碼一個459個氨基酸的蛋白質(zhì)，如SEQ ID NO3所示。實施例3穿梭載體pEC-T18mob2的制備根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2。
此載體含有質(zhì)粒pGA1的包括復(fù)制效應(yīng)子per的復(fù)制區(qū)rep(US-A-5,175,108；Nesvera等，細菌學(xué)雜志179，1525-1532(1997))，質(zhì)粒pAG1的四環(huán)素抗性基因tetA(Z)(USA-5158891；國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的基因文庫，登記號AF121000)，質(zhì)粒pMB1(Sutcliffe，關(guān)于定量生物學(xué)的冷泉港討論會43，77-90(1979))的復(fù)制起點oriV，包括lac啟動子及多克隆位點(mcs)(Norrander，J.M.等，基因26，101-106(1983))的lacZα基因片段，和質(zhì)粒RP4(Simon等，(1983)生物/技術(shù)1784-791)的mob區(qū)域。
將此構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株DH5α中(Hanahan，DNA克隆實用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，華盛頓，美國)。通過將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于補加5mg/l四環(huán)素的LB平板(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.)上，選擇攜帶質(zhì)粒的細胞。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制備試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindIII限制，及隨后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)檢測。
此質(zhì)粒稱為pEC-T18mob2并示于
圖1。其以大腸桿菌K-12菌株DH5α/pEC-T18mob2形式保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Braunschweig，德國)，保藏號DSM 13244。實施例4大腸桿菌-谷氨酸穿梭載體pEC-T18mob2中g(shù)nd基因的克隆用pBGNA作模板，經(jīng)PCR擴增含有谷氨酸棒桿菌的全長gnd基因和兩側(cè)上游和下游區(qū)域的DNA片段。用設(shè)計自SEQ ID NO2的寡核苷酸引物進行PCR反應(yīng)。所用引物是gnd正向引物5’ACT CTA GTC GGC CTA AAA TGG 3’gnd反向引物5’CAC ACA GGA AAC AGA TAT GAC 3’PCR參數(shù)如下35次循環(huán) 95℃ 6分鐘94℃ 1分鐘50℃ 1分鐘72℃ 45秒1mM MgCl2大約150-200ng pBGNA-DNA作模板。
將所得PCR產(chǎn)物克隆入購自Promega公司的pGEM-T載體(pGEM-T Easy Vector System 1，目錄號A1360，Promega UK，Southampton)中，用大腸桿菌菌株JM109(Yanisch-Perron等，基因33103-119(1985))作宿主。全長gnd基因隨后分離自pGEM-T載體的EcoRI片段，并克隆入大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2的lacZ EcoRI位點(
圖1)，并稱之為pECgnd(圖2)。用AccI(Boehringer Mannheim GmbH，德國)進行的限制酶分析顯示pEC-T18mob2的lacZα基因中g(shù)nd基因的正確方向(即在lac啟動子下游)。實施例5制備具有擴增的6-磷酸葡糖酸脫氫酶的氨基酸生產(chǎn)菌株通過Tauch等的電穿孔方法(FEMS微生物學(xué)通信，123343-347(1994))，將實施例3的質(zhì)粒pECgnd電穿孔入谷氨酸棒桿菌菌株DSM5399和DSM5714中。DSM5399菌株是生產(chǎn)蘇氨酸的菌株，見于EP-B-0358940所述。DSM5714菌株是生產(chǎn)賴氨酸的菌株，見于EP-B-0435132所述。將電穿孔混合物鋪板于LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上選擇轉(zhuǎn)化體，所用LB瓊脂已補加25mg/l卡那霉素。以此方式形成菌株DSM5399/pECgnd和DSM5714/pECgnd。
首先，在33℃在具有適當(dāng)抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環(huán)素的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是腦心浸液(Merck，Darmstadt，德國)。向此培養(yǎng)基中加入四環(huán)素(5mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物24小時。此預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(波長660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM-蘇氨酸用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MM-蘇氨酸CSL5g/lMOPS 20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/l
MgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lCaCO325g/l用氨水將CSL(玉米漿)，MOPS(嗎啉代丙磺酸)和鹽溶液調(diào)至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養(yǎng)。
48小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測定在660nm波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定蘇氨酸生成量。
實驗結(jié)果示于表1。
表1
實施例7制備賴氨酸將實施例5中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5714/pECgnd，在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
首先，在33℃在具有適當(dāng)抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環(huán)素的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgIII。
培養(yǎng)基CgIIINaCl2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 2％(w/v)pH調(diào)節(jié)為7.4。
加入四環(huán)素(5mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物24小時。此預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(波長660nm)為0.05。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌)0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養(yǎng)。
48小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測定在660nm波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實驗結(jié)果示于表2。
實施例8制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘粒文庫如Tauch等(1995，質(zhì)粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。將得自Stratagene公司(La Jolla，USA，產(chǎn)品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編碼251301)的粘粒載體SuperCosl(Wahl等，(1987)美國科學(xué)院院報842160-2164)的DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述XbaI編碼27-0948-02)酶切，并也用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性的內(nèi)切酶BamHI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，編碼27-0868-04)酶切。將以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC 13032 DNA混合，并用T4 DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后用Gigapack II XL包裝提取物(Stratagene，La Jolla，USA，產(chǎn)品描述Gigapack II XL包裝提取物，編碼200217)包裝進噬菌體中。為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，將細菌置于10mM MgSO4中并與噬菌體懸浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒文庫的感染和滴定，細胞在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox.1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。實施例9poxB基因的分離與測序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號27106，Qiagen，Hilden，德國)根據(jù)廠商指導(dǎo)分離單個菌落的粘粒DNA(實施例8)，并用限制性內(nèi)切酶Sau 3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AJ，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酶酶(Roche分子生物化學(xué)，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。經(jīng)凝膠電泳分離后，用QiaExII凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號20021，Qiagen，Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。將得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA，用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，產(chǎn)品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，將DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biobech，F(xiàn)reiburg，德國)保溫過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信，123343-7)進大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美國科學(xué)院院報874645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。重組克隆的質(zhì)粒制備用Biorobot 9600(產(chǎn)品號900200，Qiagen，Hilden，德國)進行。測序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美國科學(xué)院院報745463-5467)的雙脫氧鏈終止法進行。使用得自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的“RR羅丹明終止循環(huán)測序試劑盒”(產(chǎn)品號403044，Weiterstadt，德國)，在帶有購自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism377”測序儀的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/雙丙烯酰胺”凝膠(291)(產(chǎn)品號A124.1，Roth，Karlsruhe，德國)中，進行凝膠電泳分離和序列分析。
所得原始序列數(shù)據(jù)資料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)進行計算機輔助編碼區(qū)分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)對“國家生物技術(shù)信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫進行進-步分析。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，對該核苷酸序列的分析顯示一1737堿基對的開放讀框，其被稱為poxB基因，poxB基因編碼579個氨基酸的多肽(SEQ ID NO5)。實施例10制備整合載體以整合誘變poxB基因從菌株ATCC13032中，通過Eikmanns等所述方法(微生物學(xué)1401817-1828(1994))分離染色體DNA?；趶膶嵤├?中已知的谷氨酸棒桿菌的poxB基因序列，選擇以下寡核苷酸進行聚合酶鏈反應(yīng)poxBint15’TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3’poxBint25’GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3’所示引物是通過MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成的，通過Innis等的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR方案，方法指導(dǎo)和應(yīng)用，1990，Academic出版社)，用Boehringer的Pwo-聚合酶進行PCR反應(yīng)。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，分離大約0.9kb的DNA片段，其攜帶poxB基因的內(nèi)部片段，并如SEQ ID NO6所示。
將擴增的DNA片段用Invitrogen公司的TOPO TA克隆試劑盒(Carlsbad，CA，美國；Catalogue Number K4500-01)，連接在載體pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)，生物/技術(shù)9657-663)中。然后將連接混合物電穿孔入大腸桿菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆實用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，華盛頓DC，美國，1985)。將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，選擇攜帶質(zhì)粒的細胞，所用LB瓊脂已補加25mg/ml卡那霉素。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制備試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過限制酶EcoRI限制及隨后的瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)檢測。此質(zhì)粒稱為pCR2.1poxBint(圖4)。
質(zhì)粒pCR2.1poxBint以大腸桿菌菌株DH5α/pCR2.1poxBint形式，根據(jù)布達佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心，DSMZ；Braunschweig，德國)，保藏號DSM13114。實施例11在賴氨酸生產(chǎn)菌DSM5715中整合誘變poxB基因?qū)嵤├?0中所述的載體pCR2.1poxBint，通過Tauch等的電穿孔方法(FEMS微生物學(xué)通信，123343-347(1994))，電穿孔入谷氨酸棒桿菌DSM5715中。菌株DSM5715是一種AEC抗性賴氨酸生產(chǎn)菌。載體pCR2.1poxBint在DSM5715中不能獨立復(fù)制，并只有已整合入DSM5715的染色體中時，才在細胞中保留。通過將電穿孔混合物鋪板于LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，選擇具有整合入染色體的pCR2.1poxBint的克隆，所用LB瓊脂已補加15mg/l卡那霉素。為檢測整合情況，將poxBint片段用Boehringer公司的Dig雜交試劑盒，通過Boehringer Mannheim GmbH的“進行濾膜雜交的DIG系統(tǒng)使用指導(dǎo)”(Mannheim，德國，1993)進行標(biāo)記。潛在整合子的染色體DNA是通過Eikmanns等的方法(微生物學(xué)1401817-1828(1994))分離的，并分別用限制酶SalI，SacI和HindIII酶切。形成的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，并在68℃用Boehringer公司的Dig雜交試劑盒雜交。實施例9中所述的質(zhì)粒pCR2.1poxBint已插入DSM5715的染色體中的染色體poxB基因內(nèi)。此菌株稱為DSM5715∷pCR2.1poxBint。實施例12過表達gnd基因同時消除poxB基因?qū)嚢彼嶂苽涞淖饔?2.1制備菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd通過Libel等所述電穿孔方法(FEMS微生物學(xué)通信，53299-303(1989))，將菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint用質(zhì)粒pECgnd轉(zhuǎn)化。在含有18.5g/l腦心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/lBacto-胰化蛋白胨，2.5g/lBacto-酵母膏，5g/lNaCl，和18g/lBacto-瓊脂，并補加5mg/l四環(huán)素和25mg/l卡那霉素的LBHIS瓊脂上，選擇轉(zhuǎn)化體。在33℃溫育2天。
通過常規(guī)方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物學(xué)144，915-927)從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶AccI酶切，并通過隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢測此質(zhì)粒。以此方式獲得的菌株稱為DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd。12.2制備L-賴氨酸將實施例12.1中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pECgnd，在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
首先，在33℃在具有適當(dāng)抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環(huán)素和25mg/l的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgIII。
培養(yǎng)基CgIIINaCl 2.5g/l
Bacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 2％(w/v)pH調(diào)節(jié)為7.4。
加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物16小時。此預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(波長660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 58g/lNH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌)0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養(yǎng)。
72小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測定在660nm波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實驗結(jié)果示于表3。
表3
序列表<110>國立愛爾蘭大學(xué)戈爾韋分校德古薩-于爾斯股份公司<120>用棒狀細菌發(fā)酵制備L-氨基酸的方法<130>990229 BT<140><141><160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>252<212>DNA<2l3>谷氨酸棒桿菌<400>1atggtccaca acggcatcga gtacgccgac atgcaggtca tcggcgaggc ataccacctt 60ctgccctacg cagcaggcat gcagccagct gaaatcgctg aggttttcaa ggaatggaac 120gcaggcgacc tggattccta cctcatcgaa atcaccgcag aggttctctc ccaggtggat 180gctgaaaccg gcaagccact aatcgacgtc atcgttgacg ctgcaggtca gaagggcacc 240ggcaagtgga ct 252<210>2<211>2335<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>CDS<222>(474)..(1850)<223>gnd<400>2ttgttcggcc acgatgacac cggagctcac agcagaaatg aagtcggtgt tgttgttgat 60gccgacgacc atttttccag gggcggaaat catgctggcg actgatccag tggattcggc 120gatggcggcg tagacaccac cgttgaccaa gcccaccact tgcaggtgct tggatgccac 180gtgaagttcg ctgaccaccc ggccgggctc gatggtggtg tagcgcagcc ccagattgcg 240gtcgaggcca taattggcgt tgttgagtgc ttcaagttcg tctgtggtta aagctctggt 300ggcggcaagt tctgcaagcg aaagcagatc ttggggttga tcatcgcggg aagtcataat 360taattactct agtcggccta aaatggttgg attttcacct cctgtgacct ggtaaaatcg 420ccactacccc caaatggtca caccttttag gccgattttg ctgacaccgg gct atg476Met1ccg tca agt acg atc aat aac atg act aat gga gat aat ctc gca cag 524Pro Ser Ser Thr Ile Asn Asn Met Thr Asn Gly Asp Asn Leu Ala Gln5 10 15atc ggc gtt gta ggc cta gca gta atg ggc tca aac ctc gcc cgc aac 572Ile Gly Val Val Gly Leu Ala Val Met Gly Ser Asn Leu Ala Arg Asn20 25 30ttc gcc cgc aac ggc aac act gtc gct gtc tac aac cgc agc act gac 620Phe Ala Arg Asn Gly Asn Thr Val Ala Val Tyr Asn Arg Ser Thr Asp35 40 45aaa acc gac aag ctc atc gcc gat cac ggc tcc gaa ggc aac ttc atc 668Lys Thr Asp Lys Leu Ile Ala Asp His Gly Ser Glu Gly Asn Phe Ile50 55 60 65cct tct gca acc gtc gaa gag ttc gta gca tcc ctg gaa aag cca cgc 716Pro Ser Ala Thr Val Glu Glu Phe Val Ala Ser Leu Glu Lys Pro Arg70 75 80cgc gcc atc atc atg gtt cag gct ggt aac gcc acc gac gca gtc atc 764Arg Ala Ile Ile Met Val Gln Ala Gly Asn Ala Thr Asp Ala Val Ile85 90 95aac cag ctg gca gat gcc atg gac gaa ggc gac atc atc atc gac ggc 812Asn Gln Leu Ala Asp Ala Met Asp Glu Gly Asp Ile Ile Ile Asp Gly100105 110ggc aac gcc ctc tac acc gac acc att cgt cgc gag aag gaa atc tcc 860Gly Asn Ala Leu Tyr Thr Asp Thr Ile Arg Arg Glu Lys Glu Ile Ser115 120 125gca cgc ggt ctc cac ttc gtc ggt gct ggt atc tcc ggc ggc gaa gaa 908Ala Arg Gly Leu His Phe Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Gly Glu Glu130 135 140 145ggc gca ctc aac ggc cca tcc atc atg cct ggt ggc cca gca aag tcc 956Gly Ala Leu Asn Gly Pro Ser Ile Met Pro Gly Gly Pro Ala Lys Ser150 155 160tac gag tcc ctc gga cca ctg ctt gag tcc atc gct gcc aac gtt gac 1004Tyr Glu Ser Leu Gly Pro Leu Leu Glu Ser Ile Ala Ala Asn Val Asp165 170 175ggc acc cca tgt gtc acc cac atc ggc cca gac ggc gcc ggc cac ttc 1052Gly Thr Pro Cys Val Thr His Ile Gly Pro Asp Gly Ala Gly His Phe180 185 190gtc aag atg gtc cac aac ggc atc gag tac gcc gac atg cag gtc atc 1100Val Lys Met Val His Asn Gly Ile Glu Tyr Ala Asp Met Gln Val Ile195 200 205ggc gag gca tac cac ctt ctg ccc tac gca gca ggc atg cag cca gct 1148Gly Glu Ala Tyr His Leu Leu Pro Tyr Ala Ala Gly Met Gln Pro Ala210 215 220 225gaa atc gct gag gtt ttc aag gaa tgg aac gca ggc gac ctg gat tcc 1196Glu Ile Ala Glu Val Phe Lys Glu Trp Asn Ala Gly Asp Leu Asp Ser230 235 240tac ctc atc gaa atc acc gca gag gtt ctc tcc cag gtg gat gct gaa 1244Tyr Leu Ile Glu Ile Thr Ala Glu Val Leu Ser Gln Val Asp Ala Glu245 250 255acc ggc aag cca cta atc gac gtc atc gtt gac gct gca ggt cag aag 1292Thr Gly Lys Pro Leu Ile Asp Val Ile Val Asp Ala Ala Gly Gln Lys260 265 270ggc acc ggc aag tgg act gtc aag gct gct ctt gat ctg ggt att gct 1340Gly Thr Gly Lys Trp Thr Val Lys Ala Ala Leu Asp Leu Gly Ile Ala275 280 285acc acc ggc atc ggc gaa cgt gtt ttc gca cgt gca ctc tcc ggc gca 1388Thr Thr Gly Ile Gly Glu Arg Val Phe Ala Arg Ala Leu Ser Gly Ala290 295 300 305acc agc cag cgc gct gca gca cag ggc aac cta cct gca ggt gtc ctc 1436Thr Ser Gln Arg Ala Ala Ala Gln Gly Asn Leu Pro Ala Gly Val Leu310 315 320acc gat ctg gaa gca ctt ggc gtg gac aag gca cag ttc gtc gaa gga 1484Thr Asp Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Lys Ala Gln Phe Val Glu Gly325 330 335ctt cgc cgt gca ctg tac gca tcc aag ctt gtt gct tac gca cag ggc 1532Leu Arg Arg Ala Leu Tyr Ala Ser Lys Leu Val Ala Tyr Ala Gln Gly340 345 350ttc gac gag atc aag gct ggc tcc gac gag aac aac tgg gac gtt gac 1580Phe Asp Glu Ile Lys Ala Gly Sar Asp Glu Asn Asn Trp Asp Val Asp355 360 365cct cgc gac ctc gct acc atc tgg cgc ggc ggc tgc atc att cgc gct 1628Pro Arg Asp Leu Ala Thr Ile Trp Arg Gly Gly Cys Ile Ile Arg Ala370 375 380 385aag ttc ctc aac cgc atc gtc gaa gca tac gat gca aac gct gaa ctt 1676Lys Phe Leu Asn Arg Ile Val Glu Ala Tyr Asp Ala Asn Ala Glu Leu390 395 400gag tcc ctg ctg ctc gat cct tac ttc aag agc gag ctc ggc gac ctc 1724Glu Ser Leu Leu Leu Asp Pro Tyr Phe Lys Ser Glu Leu Gly Asp Leu405 410 415atc gat tca tgg cgt cgc gtg att gtc acc gcc acc cag ctt ggc ctg 1772Ile Asp Ser Trp Arg Arg Val Ile Val Thr Ala Thr Gln Leu Gly Leu420 425 430cca atc cca gtg ttc gct tcc tcc ctg tcc tac tac gac agc ctg cgt 1820Pro Ile Pro Val Phe 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270 275 280ctt cct aaa gac aac gtt gcc cag gtg gat atc aac ggt gcg cac att 1217Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile285 290 295ggt cga cgt acc acg gtg aag tat ccg gtg acc ggt gat gtt gct gca 1265Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala300 305 310aca atc gaa aat att ttg cct cat gtg aag gaa aaa aca gat cgt tcc 1313Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser315 320 325ttc ctt gat cgg atg ctc aag gca cac gag cgt aag ttg agc tcg gtg 1361Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val330 335 340 345gta gag acg tac aca cat aac gtc gag aag cat gtg cct att cac cct 1409Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro350 355 360gaa tac gtt gcc tct att ttg aac gag ctg gcg gat aag gat gcg gtg 1457Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val365 370 375ttt act gtg gat acc ggc atg tgc aat gtg tgg cat gcg agg tac atc 1505Phe Thr Val Asp Thr Gly Met Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile380 385 390gag aat ccg gag gga acg cgc gac ttt gtg ggt tca ttc cgc cac ggc 1553Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly395 400 405acg atg gct aat gcg ttg cct cat gcg att ggt gcg caa agt gtt gat 1601Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp410 415 420 425cga aac cgc cag gtg atc gcg atg tgt ggc gat ggt ggt ttg ggc atg 1649Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met430 435 440ctg ctg ggt gag ctt ctg acc gtt aag ctg cac caa ctt ccg ctg aag 1697Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys445 450 455gct gtg gtg ttt aac aac agt tct ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg 1745Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met460 465 470ctc gtg gag gga cag cca gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat 1793Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn475 480 485ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt atc aaa tcg gta cgc atc acc 1841Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr490 495 500 505gat ccg aag aaa gtt cgc gag cag cta gct gag gca ttg gca tat cct 1889Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro510 515 520gga cct gta ctg atc gat atc gtc acg gat cct aat gcg ctg tcg atc 1937Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile525 530 535cca cca acc atc acg tgg gaa cag gtc atg gga ttc agc aag gcg gcc 1985Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala540 545 550acc cga acc gtc ttt ggt gga gga gta gga gcg atg atc gat ctg gcc 2033Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala555 560 565cgt tcg aac ata agg aat att cct act cca tgatgattga tacacctgct 2083Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile Pro Thr Pro570 575gttctcattg accgcgagcg cttaactgcc aacatttcca ggatggcagc tcacgccggt 2143gcccatgaga ttgccct2160<210>5<211>579<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>5Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu Ile ASp Thr Leu Glu Ala Gln1 5 10 15Gly Val Lya Arg Ile Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile20 25 30Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile Glu Trp Val His Val Arg Asn35 40 45Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly50 55 60Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu65 70 75 80Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala85 90 95Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln100 105 110Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lye Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu115 120 125Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg Ile Leu His His Ala Ile130 135 140Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val Ile Pro Gly145 150 155 160Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr165 170 175Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala180 185 190Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys
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1.一種通過發(fā)酵棒狀細菌制備L-氨基酸的方法，包括進行以下步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生所需L-氨基酸的細菌，該細菌中至少gnd基因是擴增的，b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞中的L-氨基酸，及c)分離產(chǎn)生的L-氨基酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中使用的細菌中，所需L-氨基酸的生物合成途徑的其它基因也被擴增，尤其是過表達。
3.權(quán)利要求1的方法，其中使用制備L-蘇氨酸，L-賴氨酸，L-異亮氨酸或L-色氨酸的棒狀細菌。
4.權(quán)利要求3的方法，其中使用制備L-賴氨酸的的棒狀細菌。
5.如權(quán)利要求2發(fā)酵制備L-賴氨酸的方法，其中在尤其已經(jīng)產(chǎn)生L-賴氨酸的棒狀微生物中，選自以下一組的一或多個基因被同時擴增、特別是過表達5.1編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，5.2編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，5.3編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，5.4編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，5.5編碼轉(zhuǎn)酮酶的tkt基因，5.6編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因，5.7編碼賴氨酸輸出的lysE基因，5.8zwal基因，5.9編碼烯醇化酶的eno基因。
6.如權(quán)利要求2發(fā)酵制備L-蘇氨酸的方法，其中在尤其已經(jīng)產(chǎn)生L-蘇氨酸的棒狀微生物中，選自以下一組的一或多個基因被同時擴增、尤其是過表達6.1編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因或編碼“反饋抗性”高絲氨酸脫氫酶的homdr等位基因，6.2編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，6.3編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，6.4編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因，6.5編碼轉(zhuǎn)酮酶的tkt基因6.6編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因，6.7編碼蘇氨酸輸出的thrE基因，6.8zwal基因，6.9編碼烯醇化酶的eno基因。
7.權(quán)利要求2的方法，其中為制備L-氨基酸尤其L-賴氨酸或L-蘇氨酸，發(fā)酵這樣的細菌，該細菌中選自以下一組的一或多個基因被同時弱化7.1編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，7.2編碼葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶的pgi基因，7.3編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因，7.4zwa2基因。
8.權(quán)利要求2-6任一項的方法，其中為實現(xiàn)擴增，所述基因或核苷酸序列的拷貝數(shù)，通過用攜帶這些基因或核苷酸序列的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化微生物而提高。
9.
圖1所示的質(zhì)粒載體pEC-T18mob2，其以在大腸桿菌K-12DH5α中的形式保藏，保藏號DSM 13244。
10.一種通過導(dǎo)入權(quán)利要求9的質(zhì)粒載體而轉(zhuǎn)化的棒狀微生物，尤其棒桿菌屬，所述載體另外還含有g(shù)nd基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過發(fā)酵棒狀細菌制備L－氨基酸的方法,包括進行以下步驟:a)發(fā)酵產(chǎn)生所需L－氨基酸的細菌,該細菌中至少gnd基因是擴增的,b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞中的L－氨基酸,及c)分離產(chǎn)生的L－氨基酸。
文檔編號C12P13/08GK1350586SQ00807548
公開日2002年5月22日 申請日期2000年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月20日
發(fā)明者L·K·杜尼肯(死亡), 阿什令·麥科麥克, 克里奧娜·斯特普爾頓, 凱文·伯克, 貝蒂娜·默克爾 申請人:德古薩股份公司, 國立愛爾蘭大學(xué)