專利名稱：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)(mTOR)蛋白的截短變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物雷帕霉素(rapamycin)靶標(biāo)(mTOR)蛋白的截短變體。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)(mTOR)為絲氨酸/蘇氨酸激酶，其屬于PI3K相關(guān)激酶大 家族，該家族還包括DNA依賴性蛋白激酶ATM和ATR。生物化學(xué)和遺傳學(xué)研究證明，mTOR將 生長因子刺激、能量和營養(yǎng)有效性結(jié)合在一起，以調(diào)節(jié)負(fù)責(zé)細(xì)胞生長、細(xì)胞大小和細(xì)胞周期 進(jìn)程的生物合成過程。最近十年一直在廣泛研究響應(yīng)各種胞外信號(hào)的mTOR激酶活性調(diào)節(jié) 作用。大量具有各種酶活性、支架功能和連接功能(adaptor function)的細(xì)胞蛋白參與對(duì) mTOR活性進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)并調(diào)節(jié)mTOR活性，這些蛋白包括蛋白激酶PKB/Akt和AMPK、腫瘤抑 制劑PTEN和結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體TSC1/2、小GTP-結(jié)合蛋白R(shí)heb、支架蛋白R(shí)aptor和Rictor。 mTOR處于活化狀態(tài)時(shí)，通過使主要下游靶標(biāo)例如S6K、4E-BP1和PKB/Akt磷酸化來轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào) 和代謝信息。不同實(shí)驗(yàn)室的研究指出，存在兩種功能上不同的mTOR復(fù)合體，稱為mTOR復(fù)合 體1 (mTORCl)和mT0RC2。mTORCl含有核心組分mT0R、raptor和mLST8/G L,并對(duì)雷帕霉素 敏感。mT0RC2被認(rèn)為對(duì)雷帕霉素不敏感，并含有mTOR、Rictor和mLST8/G L。目前在大量 臨床試驗(yàn)中評(píng)價(jià)雷帕霉素及其類似物為抗癌藥物。另外，雷帕霉素被廣泛用于涂覆支架，以 在冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后減少裝支架后再狹窄。與具有兩個(gè)TOR基因的酵母菌相反，哺乳動(dòng)物 只具有一個(gè)基因，已知其編碼分子量大約280kDa的單一多肽。mTOR的一個(gè)重要的下游靶標(biāo)為S6K。S6激酶(p70S6激酶(p70S6k))負(fù)責(zé)核糖體 S6蛋白的S6磷酸化，S6蛋白是真核核糖體(即負(fù)責(zé)mRNA翻譯和蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞器) 的40S亞單位的組分。S6K還被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要的生理學(xué)上的S6激酶(Proud， 1996 Trends Biochem. Sci. 21 181-185)。40S核糖體蛋白S6是真核核糖體的40S亞單位 的組分。S6蛋白因響應(yīng)某些細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)事件而被磷酸化，這些事件例如有激素或生長因 子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。S6激酶受到多種生長因子例如胰島素和促細(xì)胞分裂原激活(Alessi等，1998 Curr. Biol. 8 :69_81)。業(yè)已確定出調(diào)節(jié)S6激酶活性的某些藥物，其中包括雷帕霉素，雷帕 霉素是S6激酶的最有效的抑制劑(Pullen等，1997 FEBS Letters 410 :78_82)。美國專利 第6，830，909號(hào)公開了 S6激酶α和S6激酶β的結(jié)構(gòu)和某些功能，該專利以其整體在此 引作參考。已顯示S6激酶既被磷酸化也被乙?；Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)S6激酶蛋白可通過ρ300和P/ CAF乙酰轉(zhuǎn)移酶在體內(nèi)和體外乙?；?。更準(zhǔn)確地說，在S6K乙酰化作用提高(即存在HDAC 抑制劑/過量表達(dá)Ρ300)的條件下，S6激酶活性和412磷酸化作用降低。P-環(huán)賴氨酸突 變(由Ρ300在體外乙酰化)為谷氨酰胺(模擬乙?；饔?，能導(dǎo)致S6K完全失活和412 磷酸化失敗。還證明S6K2(S6Ki3)具有AT-hook DNA結(jié)合基序。因此，S6激酶2蛋白結(jié)合 DNA并藉此被活化，進(jìn)而刺激其激酶活性。因此，S6K2被認(rèn)為因響應(yīng)促細(xì)胞分裂原和營養(yǎng)素 而轉(zhuǎn)導(dǎo)促生長作用。當(dāng)S6K2與DNA形成復(fù)合體并由該相互作用激活時(shí)，可涉及通過磷酸化
4作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子和/或染色質(zhì)重建蛋白。S6激酶蛋白活性的調(diào)節(jié)及相關(guān)方法公開于WO 2007/019421，該專利以其整體在此引作參考。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及最近發(fā)現(xiàn)的mTOR的剪接形式，稱作mT0Ri3。具體而言，本發(fā)明提供使 S6K1和/或4E-BP1磷酸化的分離的多肽，所述多肽選自(a)包含SEQ ID NO 2氨基酸序列的分離的多肽；(b)包含與SEQ ID NO :2氨基酸序列具有至少75%序列同一性的氨基酸序列的分 離的多肽；和(C)包含由SEQ ID NO 1編碼的氨基酸序列的分離的多肽。本發(fā)明還提供-選自以下的分離的多核苷酸(a)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸；(b)包含SEQ ID NO 1核苷酸序列或其互補(bǔ)體的多核苷酸；(c)包含與SEQ ID No 1的完整鄰接序列具有至少80%序列同一性并且編碼使 S6K1和/或4E-BP1磷酸化的蛋白的多核苷酸；和(d)與SEQ ID NO 1核苷酸序列或其互補(bǔ)體在68°C采用0. IXSSC條件下雜交的 分離的核酸分子，該核酸分子編碼使S6K1和/或4E-BP1磷酸化的蛋白。-包含本發(fā)明多核苷酸的載體。-包含本發(fā)明多肽、本發(fā)明多核苷酸或本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。-特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的分離的抗體。-用于制備多肽的方法，該方法包括在表達(dá)本發(fā)明多肽或表達(dá)由本發(fā)明多核苷酸 編碼的多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明宿主細(xì)胞。-篩選調(diào)節(jié)rnTORii活性的作用劑的方法，該方法包括以下步驟(a)使本發(fā)明多肽與測試作用劑接觸；和(b)檢測所述多肽活性的任何變化，其中活性變化表明作用劑能夠調(diào)節(jié)mT0Ri3活性。-篩選調(diào)節(jié)mT0Ri3表達(dá)和/或活性的作用劑的方法，該方法包括以下步驟(a)提供權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含或表達(dá)本發(fā)明多肽或由本發(fā)明多核 苷酸編碼的多肽；(b)使所述宿主細(xì)胞與測試作用劑接觸；和(c)檢測所述多肽表達(dá)和/或活性的任何變化，其中表達(dá)和/或活性變化表明作用 劑能夠調(diào)節(jié)mT0Ri3表達(dá)和/或活性。-治療與本發(fā)明多肽異常表達(dá)有關(guān)的疾病的方法，該方法包括將有效量的作用劑 給予需要治療的對(duì)象，其中所述作用劑改變所述多肽的活性和/或表達(dá)。_用于治療所述多肽表達(dá)異常相關(guān)疾病的改變本發(fā)明多肽活性和/或表達(dá)的作用 劑。附圖
簡述fil顯示用C-末端和Fll抗mTOR抗體在大鼠組織中進(jìn)行的mTOR表達(dá)的蛋白印 跡分析。通過SDS-PAGE分離大鼠組織的蛋白提取物(30 μ g)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用來自多克隆抗體探測(上圖)。然后剝洗(strip)該膜，用抗 肌動(dòng)蛋白抗體重新探測(下圖)。Ml顯示在人組織中mTOR表達(dá)的RNA印跡分析。剝洗印跡，重新探測β肌動(dòng)蛋 白的表達(dá)(下圖)。Ml顯示用C-末端抗mTOR抗體對(duì)來自H印2G、Hek293和MCF7細(xì)胞的mTOR β進(jìn) 行的免疫沉淀。用C-末端抗mTOR抗體(CellSignaling)與H印2G、Hek293和MCF7細(xì)胞的 裂解液進(jìn)行免疫沉淀，并用N-末端抗mTOR抗體(Santa Cruz)在蛋白印跡中探測免疫復(fù)合 體。Mi顯示通過PCR對(duì)人細(xì)胞系中潛在的mTOR剪接變體進(jìn)行的鑒定。圖4A顯示來 自H印2G、HEK293和MCF7的總RNA和mTOR β RNA的瓊脂糖凝膠。純化了來自H印2G、HEK293 和MCF7細(xì)胞系的總RNA，并將其轉(zhuǎn)換為第一鏈DNA。將一組mTOR特異性引物用于PCR反應(yīng) 中，以搜尋潛在的剪接變體。在2%瓊脂糖凝膠中電泳分離所擴(kuò)增的片段。從凝膠上切下最 顯著的條帶，進(jìn)行序列分析。一組引物(m和C3)從三種細(xì)胞系中都一致地?cái)U(kuò)增得到IOObp 的片段。擴(kuò)增了甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)和β肌動(dòng)蛋白特定片段，將其用作第一鏈 DNA的加樣和質(zhì)量對(duì)照。圖4Β顯示用附和C3mT0R特異性引物擴(kuò)增的IOObp PCR片段的 序列比對(duì)。對(duì)所擴(kuò)增得片段進(jìn)行測序，由Clustal W程序進(jìn)行比對(duì)。由箭頭指出潛在剪接 融合的位置。圖4C顯示用附和C3mT0R特異性引物擴(kuò)增的IOObp PCR產(chǎn)物的氨基酸序列。 箭頭指出潛在剪接融合的位置。在對(duì)應(yīng)于mTOR的N-末端區(qū)和FATN結(jié)構(gòu)域的序列下面畫 線。■顯示全長mTORa和mT0Ri3剪接同等型(isoform)的結(jié)構(gòu)域組織。指出了 各個(gè)結(jié)構(gòu)域位置，包括其氨基酸位置。指出了對(duì)應(yīng)于抗mTOR抗體的表位的地點(diǎn)。在介導(dǎo) 已知的mTOR結(jié)合配偶體相互作用的區(qū)域下畫線。有20個(gè)37-43個(gè)氨基酸的HEAT基序 (Huntingtin、EF3、PP2A的A亞單位和Tor)，每一個(gè)都參與蛋白間的相互作用。HEAT18和 19足以將mTOR靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體。mTOR經(jīng)由這些HEAT區(qū)域二聚體化。FAT結(jié)構(gòu)域= FRAP/ATM/TRAPP ；FATN = FAT結(jié)構(gòu)域N-末端；FATC = FAT結(jié)構(gòu)域的C-末端。發(fā)現(xiàn)FATC結(jié) 構(gòu)域?qū)τ趍TOR激酶活性和功能必不可少。FRB(FKBP12-雷帕霉素結(jié)合)結(jié)構(gòu)域是保守的 IlkDa區(qū)域，是FKBP12-雷帕霉素結(jié)合的充分必要區(qū)域。KD =激酶結(jié)構(gòu)域，認(rèn)為其是PI3K 相關(guān)結(jié)構(gòu)域。RD =調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。_顯示mTOR0因響應(yīng)血清刺激而在與完整mTOR α氨基酸序列的Ser2448對(duì)應(yīng) 的絲氨酸殘基處被磷酸化，并在體外激酶測定中使S6K1和4E-BP1磷酸化。圖6A顯示用 pcDNA 3. ImTOR β轉(zhuǎn)染后表達(dá)mTOR β的細(xì)胞的凝膠。用pcDNA3. 1或pcDNA 3. Im TOR β轉(zhuǎn) 染ΗΕΚ293細(xì)胞。一天后，讓細(xì)胞饑餓24小時(shí)，然后用10%胎牛血清刺激1小時(shí)。在刺激前 30分鐘加入雷帕霉素(IOnM)。裂解細(xì)胞，通過SDS-PAGE分離，并用C-末端抗mTOR抗體和 抗pS2448mT0R抗體進(jìn)行免疫印跡。圖6B顯示mTOR體外激酶測定的結(jié)果。用pcDNA3. 1、 pcDNA 3. l/FLAG-mT0R^ 或 pcDNA 3. l/FLAG-mTORa 轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞。兩天后，裂解細(xì)胞， 用抗FLAG抗體進(jìn)行免疫沉淀。在mTOR體外激酶測定中使用免疫復(fù)合體，且用His-4E_BP1 和His-S6K1C作為底物。通過SDS-PAGE分離激酶反應(yīng)物，用針對(duì)4E-BP1 p65和S6Klp389 的磷酸化特異性抗體(phosphospecific antibody)進(jìn)行免疫印跡。通過用抗FLAG抗體進(jìn) 行的蛋白印跡測量免疫沉淀的FLAG-mTORa和FLAG-mT0Ri3的水平。
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ΜΛ顯示mTORP與Raptor、Rictor和G β L的特異性相互作用。用 pcDNA3. 1-mTOR β -FLAG 和 pRK-Raptor-HA 或 pcDNA3. l-mTOR β -FLAG 和 pRK-Rictor-Myc 或 pcDNA3. 1-mTOR β -FLAG和pcRK_G β L轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。用抗FLAG抗體或?qū)φ辗翘禺愋钥?體對(duì)所裂解的細(xì)胞上清液進(jìn)行免疫沉淀。通過SDS-PAGE分離免疫復(fù)合體或來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞 的總細(xì)胞裂解液(15 μ g)，并在蛋白印跡中用抗HA、抗Rictor或抗G β L抗體探測。Ml顯示，與mTORa比較，mTOR0對(duì)雷帕霉素敏感性更低。用pcDNA3. 1、pcDNA 3. ImTOR^或pcDNA 3. ImTOR α轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。一天后，讓細(xì)胞饑餓24小時(shí)，然后用10% 血清刺激1小時(shí)。在刺激前30分鐘加入各種濃度的雷帕霉素。裂解細(xì)胞，由SDS-PAGE分 離，并用C-末端mTOR抗體、抗肌動(dòng)蛋白抗體和不同的磷酸化特異性抗體進(jìn)行免疫印跡。Ml顯示mTOR0的亞細(xì)胞定位。用ProteoExstract提取試劑盒(Calbiochem)分 級(jí)分離指數(shù)生長的HEK293細(xì)胞。用抗mTOR C-末端抗體從所有分離物中免疫沉淀mTOR α 和mTOR β，通過SDS-PAGE分離免疫復(fù)合體，并用抗mTOR N-末端抗體進(jìn)行免疫印跡。將抗 4EBP1抗體、抗HSP60抗體和抗c-Jim抗體分別用作細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核分離物的對(duì)照。Mi^顯示mT0Ri3而非HiTORa的過量表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。將過量表達(dá) mTOR β wt (野生型)、mTORa wt或EGFP的Hek293穩(wěn)定細(xì)胞系以不同密度(每孔250、500、 1000和2000個(gè)細(xì)胞)接種到96孔板，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)7天。隨后通過基于刃天青的測 定來測量各孔的細(xì)胞數(shù)目。用來自6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)計(jì)算各細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)化的生長曲線
(A)。用針對(duì)c-myc及其轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)的抗體進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞系的總細(xì)胞裂解液的蛋白印跡分析
(B)。光密度測量蛋白水平，以肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算相對(duì)于表達(dá)EGFP的穩(wěn)定細(xì)胞系的倍數(shù)
(C)。fill顯示誘導(dǎo)增殖需要mTOR β激酶活性。將過量表達(dá)mTOR β wt、無激酶活性的 mTOR β或EGFP的Hek293穩(wěn)定細(xì)胞系以不同密度(每孔1000、2000、4000和8000個(gè)細(xì)胞) 接種到96孔板，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)5天。隨后通過基于刃天青的測定來測量各孔的細(xì)胞數(shù) 目。用來自6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)計(jì)算各細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)化生長曲線(A)。用針對(duì)c-myc及其 轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)的抗體進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞系的總細(xì)胞裂解液的蛋白印跡分析。光密度測量蛋白水平， 以肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，并計(jì)算相對(duì)于表達(dá)EGFP的穩(wěn)定細(xì)胞系的倍數(shù)(B)。fill顯示mT0Ri3對(duì)細(xì)胞周期Gl的進(jìn)展至關(guān)重要。用BrdU對(duì)穩(wěn)定過量表達(dá) mTOR β ,mTOR α或EGFP的HEK293細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記30分鐘，在24小時(shí)內(nèi)每2小時(shí)追蹤一 次。通過FACS分析測量摻入的BrdU。圖表表示對(duì)各個(gè)細(xì)胞系所觀察到的細(xì)胞周期的G1、 S和G2期的持續(xù)時(shí)間(duration)。標(biāo)準(zhǔn)差，ρ = 0. 05。Sl^顯示mT0Ri3的過量表達(dá)保護(hù)細(xì)胞免遭饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(A)。mTOR β 激酶活性為介導(dǎo)促存活作用(pro-survival effect)所需(B)。將過量表達(dá)mTOR β wt、 mTOR α wt、無激酶活性的mTOR β或EGFP的Hek293穩(wěn)定細(xì)胞系血清饑餓60小時(shí)。通過錐 蟲藍(lán)染料排除測定法評(píng)估細(xì)胞存活率。數(shù)據(jù)為5個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值士SE。*P值<0.01。Sli顯示mTOR β過量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞致癌可能性增加。將穩(wěn)定過量表達(dá)mTOR β、 mTOR α或EGFP的ΗΕΚ293細(xì)胞鋪板在培養(yǎng)基中的薄層瓊脂糖上。14天后，用MTT對(duì)染色 (A)。用Quantity One軟件(Bio-Rad)計(jì)集落數(shù)，并用倍數(shù)作圖(B)。數(shù)據(jù)為4個(gè)實(shí)驗(yàn)的平 均值 士SE。*P 值；^ 0.01。序列表簡述
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SEQ ID NO :1為編碼人mTOR β剪接變體的多核苷酸序列，而SEQ ID NO :2為人 mT0Ri3蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO :3為編碼全長人mTOR α蛋白的多核苷酸序列，而SEQ ID NO :4為人 mTORa蛋白的氨基酸序列。SEQ ID No 5-8為用于實(shí)施例4的引物。SEQ ID NO 9為通過PCR從人MCF7、Keh293和HEP2G細(xì)胞系產(chǎn)生的擴(kuò)增片段，而 SEQ ID NO 10為由SEQ ID NO 9編碼的氨基酸序列。發(fā)明詳述本發(fā)明基于對(duì)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)(mTOR)蛋白的新型剪接形式的鑒定和表 征。這是首次顯示mTOR新型剪接形式(下文稱為mTOR β的存在。本發(fā)明基于對(duì)mT0Ri3 蛋白的測定及其活性的研究。業(yè)已確定mT0Ri3為當(dāng)前已知的mTOR(下文中稱為mTORa )的N-末端氨基酸1_23 和C-末端氨基酸1867-2549的剪接融合體(splicefusion)，這產(chǎn)生長706個(gè)氨基酸的融 合蛋白(SEQ ID NO :2)。在融合蛋白中，缺失了 HEAT和FAT調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。還顯示對(duì)應(yīng)于 mTOR β的mRNA轉(zhuǎn)錄體在心臟和肝臟中高度表達(dá)，同時(shí)腎臟、肝臟、血液、小腸和大腸具有 最高的mT0Ri3蛋白水平。此外，與全長mTORa相似，剪接形式也能夠與呈遞底物的分子 Raptor、Rictor和GL締合。mTOR0還能在體外使S6K1和4E-BP1磷酸化。另外，業(yè)已顯示 mTOR β因響應(yīng)血清刺激而在對(duì)應(yīng)于完整mTOR α氨基酸序列Ser2448 (S2448)的絲氨酸殘基 (mTOR β的Ser605)處被磷酸化。mTOR β在對(duì)應(yīng)于完整mTOR α氨基酸序列Ser2448的絲 氨酸殘基處的磷酸化作用對(duì)雷帕霉素敏感。此外，當(dāng)與mTORa比較時(shí)，rnTORii顯示出對(duì)雷 帕霉素較不敏感。本文所用術(shù)語“mTOR β ”指mTOR的剪接形式。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO :2多 肽為天然存在的人mT0Ri3多肽。據(jù)認(rèn)為，該蛋白長706個(gè)氨基酸，由長約2121個(gè)核苷酸的 SEQ ID NO :1核酸編碼。本文所用術(shù)語“mTOR α ”指全長的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)(mTOR) 蛋白。例如，人mTORa多肽被認(rèn)為是大約2549個(gè)氨基酸長的蛋白(SEQID N0:4)，并被認(rèn) 為由SEQ ID NO 3核苷酸編碼。多肽本發(fā)明提供了 mT0Ri3多肽。本文所用“多肽”就其最廣泛的意義而言是指兩個(gè)或多個(gè)亞單位氨基酸(subimit amino acid)、氨基酸類似物或其它肽模擬物化合物。因此術(shù)語“多肽”包括短肽序列以及 較長的多肽和蛋白。本文所用術(shù)語“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘 氨酸和D或L兩種旋光異構(gòu)體及氨基酸類似物和肽模擬物。本發(fā)明多肽優(yōu)選以分離的形式提供。當(dāng)采用物理、機(jī)械或化學(xué)方法從通常與蛋白 締合的細(xì)胞組成中移出蛋白時(shí)，認(rèn)為本文所用蛋白得到分離。技術(shù)人員可采用標(biāo)準(zhǔn)純化方 法容易地獲得分離的蛋白。本發(fā)明包括mT0Ri3多肽。如本文所述，本發(fā)明mTOR β多肽可為天然存在的mTOR β 多肽，或可為其變體、衍生物或片段。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，mT0Ri3多肽由SEQ ID Ν0 2氨基酸序列組成、基本上由SEQ ID NO :2氨基酸序列組成，或包含SEQ ID NO :2氨基酸序 列。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，mTOR β多肽是mTORa的N-末端氨基酸1_23和C-末端氨基酸1867-2549之間的剪接融合體，這些氨基酸例如是在SEQ ID N0:4的mTORa多肽中的 那些氨基酸。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，mT0Ri3多肽由、基本上由以下序列組成或包含 以下序列并且使S6K1和/或4E-BP1磷酸化與SEQ ID NO 2氨基酸序列具有至少75%或 至少95%序列同一性的序列。本發(fā)明多肽可由本文所述的本發(fā)明多核苷酸編碼，例如由SEQ IDNO 1核苷酸序 列或由包含SEQ ID NO :1的多核苷酸編碼。本發(fā)明多肽可由與SEQ ID NO :1完整鄰接序 列具有至少80%或至少95%序列同一性的多核苷酸編碼，或由在68°C采用0. Ix SSC的條 件下與SEQ IDNO :1多核苷酸雜交的多核苷酸編碼。由所述多核苷酸編碼的多肽將能夠使 S6K1和/或4E-BP1磷酸化。rnTORii多肽可為天然存在的mT0Ri3多肽或其變體、衍生物或片段。天然存在的 mT0Ri3多肽可為在任何物種中天然表達(dá)的mT0Ri3多肽，優(yōu)選在哺乳動(dòng)物中表達(dá)。例如，合 適的天然存在的mT0Ri3多肽可為來自人、非人的靈長類、嚙齒動(dòng)物(例如大鼠或小鼠)、兔、 馬或家畜動(dòng)物(例如山羊、綿羊、豬或牛)等的哺乳動(dòng)物mT0Ri3多肽。mT0Ri3多肽可為兔、 小鼠、大鼠、豬、牛、綿羊、馬、人或非人靈長類mT0Ri3多肽。優(yōu)選mT0Ri3多肽為人mT0Ri3多 肽。例如，人mT0Ri3多肽氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。編碼人mT0Ri3多肽的多核苷 酸序列如SEQ ID N0:1所示。本發(fā)明mT0Ri3多肽可為任何所述天然存在的mTORβ多肽， 例如人多肽，或可為其等位基因變體。等位基因變體盡管具有與上述的稍微不同的氨基酸 序列，但仍具有與所公開的蛋白有關(guān)的相同或相似的生物學(xué)功能。mTORii多肽可為變體多肽，例如天然存在的mT0Ri3肽的衍生物、類似物、多肽片 段或模擬物。所述變體多肽優(yōu)選保留與天然存在的mT0Ri3肽相同的生物學(xué)功能或活性?；?性可為天然存在的mT0Ri3多肽所具有的任何活性。本文公開了 mT0Ri3的多種活性。合適 的變體多肽可具有這些活性中的任何一種或多種。例如，變體多肽可保留被乙?；哪芰?和/或使第二種蛋白磷酸化的能力和/或結(jié)合DNA的能力。例如，合適的變體多肽可誘導(dǎo) cMyc表達(dá)(impression)。合適的變體多肽可在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :4完整mTORa氨基酸序 列的S2448的絲氨酸殘基(SEQ ID N0:2的mTOR0多肽Ser605處被磷酸化。合適的變體 多肽可具有使S6K1磷酸化的能力。合適的變體多肽可具有使4E-BP1磷酸化的能力。合適 的變體多肽可具有使S6K1和4E-BP1磷酸化的能力。合適的變體多肽可與Raptor、RiCtor 和Gi3 L中的一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)起作用。合適的變體多肽可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。合適的變體 多肽可保護(hù)細(xì)胞免遭饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。合適的變體多肽可增加細(xì)胞的致癌可能性。合 適的變體多肽可縮短細(xì)胞周期Gl期的長度。本文闡述了評(píng)估這些活性的方法，其將易于為 技術(shù)人員所理解。實(shí)施例顯示如何評(píng)估所述活性，并用SEQ ID NO :2多肽作為實(shí)例。這些 方法可易于在本文所述其它多肽中使用。本發(fā)明mT0Ri3多肽可保留全長mTORa多肽的一種或多種功能。這些功能可包括 以下中的一種或多種激酶活性；通過在對(duì)應(yīng)于SEQID NO :4的mTORa氨基酸序列的S2448 的絲氨酸殘基(SEQ ID NO :2的mT0Ri3多肽的Ser605處的磷酸化來活化；使其它蛋白磷 酸化的能力，例如使S6K1磷酸化的能力和/或使4E-BP1磷酸化的能力；與Raptor、RiCtor 和Gi3 L中的一個(gè)、兩個(gè)或所有三個(gè)相互作用或結(jié)合的能力。本發(fā)明mT0Ri3多肽可保留不同于全長mTORa多肽的天然存在的mTORβ的至少 一種活性。例如，如本文所述，表達(dá)mT0Ri3的細(xì)胞比表達(dá)mTORa的細(xì)胞增殖得更快；表達(dá)
9mTOR^而非mTORa導(dǎo)致誘導(dǎo)c_Myc蛋白表達(dá)；表達(dá)mTORβ的細(xì)胞具有比表達(dá)mTORα的 細(xì)胞更短的Gl期；表達(dá)mT0Ri3而非mTORa保護(hù)細(xì)胞抵抗血清饑餓作用；與表達(dá)mTORa的 細(xì)胞相比，mT0Ri3表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞致癌可能性增加。當(dāng)與mTORa多肽比較時(shí)，本發(fā)明mTOR β 多肽可保留這些差異中的任何一種或多種。多肽變體包括但不限于天然存在的mT0Ri3多肽(例如SEQ ID NO 2多肽)的缺 失、添加或取代變體。例如，合適的變體可為所述序列的取代、缺失或添加變體，或可為任何 所述序列的片段。變體多肽可包含天然存在的mTOR β多肽序列(例如SEQ ID NO 2)的1、 2、3、4、5、至多10、至多20、至多30、至多40、至多50、至多75個(gè)或更多個(gè)氨基酸的取代和/
或缺失?！叭〈弊凅w優(yōu)選涉及用相同數(shù)量的氨基酸置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且進(jìn)行保守 氨基酸取代。多肽可具有一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸對(duì)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代。本領(lǐng)域 技術(shù)人員知道不同氨基酸具有相似特性。多肽的一個(gè)或多個(gè)這樣的氨基酸通?？杀灰粋€(gè) 或多個(gè)其它這樣的氨基酸取代而不會(huì)消除該多肽期需的性質(zhì)(例如乙酰轉(zhuǎn)移酶活性)。例 如，氨基酸可被具有相似性質(zhì)的備選氨基酸取代，后者例如為另一個(gè)堿性氨基酸、另一個(gè)酸 性氨基酸、另一個(gè)中性氨基酸、另一個(gè)帶電荷的氨基酸、另一個(gè)親水性氨基酸、另一個(gè)疏水 性氨基酸、另一個(gè)極性氨基酸、另一個(gè)芳香族氨基酸或另一個(gè)脂肪族氨基酸?？捎糜谶x擇合 適取代的20種主要氨基酸的某些性質(zhì)如下
權(quán)利要求
使S6K1和/或4E BP1磷酸化的分離的多肽，所述多肽選自(a)包含SEQ ID NO2氨基酸序列的分離的多肽；(b)包含與SEQ ID NO2氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的分離的多肽；和(c)包含由SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列的分離的多肽。
2.分離的多核苷酸，其選自(a)編碼權(quán)利要求1的多肽的多核苷酸；(b)包含SEQID NO 1核苷酸序列或其互補(bǔ)體的多核苷酸；(c)包含與SEQID No 1的完整鄰接序列具有至少80%序列同一性并且編碼使S6K1 和/或4E-BP1磷酸化的蛋白的多核苷酸；和(d)與SEQID NO 1核苷酸序列或其互補(bǔ)體在68°C下采用0. IXSSC的條件下雜交的 分離的核酸分子，所述核酸分子編碼使S6K1和/或4E-BP1磷酸化的蛋白。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)表達(dá)調(diào)控元件可操作地連接。
4.包含權(quán)利要求2或3的多核苷酸的載體。
5.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的多肽、權(quán)利要求2或3的多核苷酸或權(quán)利要求4的載體。
6.特異性結(jié)合權(quán)利要求1的多肽的分離的抗體。
7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
8.權(quán)利要求6或7的抗體，其中所述抗體為人源化抗體。
9.用于制備多肽的方法，所述方法包括在以下條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1 的多肽或表達(dá)由權(quán)利要求2的多核苷酸編碼的多肽的條件。
10.篩選調(diào)節(jié)mT0Ri3活性的作用劑的方法，該方法包括以下步驟(a)使權(quán)利要求1的多肽與測試作用劑接觸；和(b)檢測所述多肽活性的任何變化，其中活性變化表明作用劑能夠調(diào)節(jié)mT0Ri3活性。
11.篩選調(diào)節(jié)mT0Ri3表達(dá)和/或活性的作用劑的方法，該方法包括以下步驟(a)提供權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含或表達(dá)權(quán)利要求1的多肽或由權(quán)利要求2 的多核苷酸編碼的多肽；(b)使所述宿主細(xì)胞與測試作用劑接觸；和(c)檢測所述多肽表達(dá)和/或活性的任何變化，其中表達(dá)和/或活性變化表明作用劑能 夠調(diào)節(jié)mT0Ri3表達(dá)和/或活性。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中通過測定S6K1和/或4E-BP-1的磷酸化情況來檢 測所述活性。
13.權(quán)利要求10或11的方法，其中通過測定c-Myc蛋白的表達(dá)情況來檢測所述活性。
14.權(quán)利要求11的方法，其中通過測定包含SEQID NO :1的核酸水平來檢測所述表達(dá)。
15.治療與權(quán)利要求1多肽的表達(dá)異常有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括將有效量的 作用劑給予需要治療的對(duì)象，其中所述作用劑改變所述多肽的活性和/或表達(dá)。
16.用于治療與所述多肽異常表達(dá)有關(guān)的疾病的作用劑，所述作用劑改變權(quán)利要求1 的多肽的活性和/或表達(dá)。
17.權(quán)利要求15的方法或權(quán)利要求16的作用劑，其中所述作用劑是權(quán)利要求7-9中任 一項(xiàng)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及mTOR剪接形式mTORβ、編碼mTORβ的核酸和針對(duì)mTORβ的抗體。本發(fā)明還涉及mTORβ制備方法和篩選調(diào)節(jié)mTORβ表達(dá)和/或活性的作用劑的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過給予改變mTOR活性和/或表達(dá)的作用劑來治療與異常表達(dá)mTORβ有關(guān)的疾病的方法。
文檔編號(hào)C07K14/47GK101939332SQ200880023258
公開日2011年1月5日 申請日期2008年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月1日
發(fā)明者A·茲海沃羅普, G·帕納修克, I·內(nèi)馬扎尼, I·古特, M·沃特菲爾德 申請人:路德維格癌癥研究所;Ucl商業(yè)有限公司