專利名稱：：CpTI酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種豆工豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，本發(fā)明還涉及制備該試劑盒的方法。
背景技術(shù)：
：害蟲是危害我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要限制因素，大量化學(xué)農(nóng)藥的使用不但污染環(huán)境，而且也使得有益昆蟲妁數(shù)量銳減，害蟲的抗藥性不斷加強(qiáng)。此外，化學(xué)殺蟲劑使用后的農(nóng)藥殘留對人畜都會有嚴(yán)重的危害。因而轉(zhuǎn)基因植物抗蟲工程成為科學(xué)家的研究熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。豇豆胰蛋白酶抑制劑(CowpeaproteinaseTrypsinInhibitor,CpTI)是對靶標(biāo)昆蟲毒殺效果最好的蛋白酶抑制劑之一,通常能專一地與某一類消化酶結(jié)合,影響昆蟲的消化作用，同時(shí)引起昆蟲體內(nèi)蛋白酶產(chǎn)生,造成必需氨基酸虧空，破壞其正常生理功能,而導(dǎo)致昆蟲發(fā)育受阻或死亡。另外它們還可以引起昆蟲體內(nèi)水分平衡失調(diào)，影響酶的調(diào)節(jié)及昆蟲蛻皮。自Hilder等(1987)首次獲得轉(zhuǎn)CpTI基因煙草以來，蛋白酶抑制劑在抗蟲植物基因工程中的應(yīng)用已有十余年，很多其他作物如稻、甘藍(lán)、馬鈴薯、青椒、苜蓿、油菜、蕃茄都得到了轉(zhuǎn)蛋白酶抑制劑基因的植株或品系。與此同時(shí)，科學(xué)家們還將CpTI基因進(jìn)行修飾并與Bt殺蟲蛋白基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入棉花獲得雙價(jià)復(fù)合性狀的抗棉鈴蟲棉花如SGK321，轉(zhuǎn)入水稻獲得雙價(jià)抗螟蟲水稻如科豐6號等，這些轉(zhuǎn)CpTI基因作物對靶標(biāo)害蟲具有良好的抗蟲效果，同時(shí)也拓展了轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲譜，對延緩靶標(biāo)害蟲抗性上升具有重要的作用。轉(zhuǎn)CpTI基因作物對靶標(biāo)昆蟲具有控制作用關(guān)鍵在于植物能夠持續(xù)表達(dá)CpTI蛋白，所以外源殺蟲蛋白的含量對于評價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲效果是至關(guān)重要的，另外，轉(zhuǎn)CpTI基因作物的生態(tài)安全性也引起國際上極大的關(guān)注，轉(zhuǎn)基因作物及其后續(xù)加工產(chǎn)品中CpTI含量的精準(zhǔn)測定方法對于轉(zhuǎn)基因生物安全管理具有保駕護(hù)航的支撐作用。雖然，我國轉(zhuǎn)CpTI基因抗蟲作物發(fā)展迅速，但仍然缺乏精準(zhǔn)和快速的檢測與評價(jià)技術(shù)。轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品中表達(dá)產(chǎn)物的檢測方法主要在外源表達(dá)產(chǎn)物水平上進(jìn)行。即在翻譯水平上對特異性蛋白質(zhì)的檢測,主要包括酶學(xué)反應(yīng)檢測法和免疫學(xué)檢測法，和生物活性檢測法。目前對于胰蛋白酶抑制劑如CpTI含量或在轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品中表達(dá)水平的檢測方法也主要釆用上述檢測方法的一種或3種方法的整合。即室內(nèi)靶標(biāo)昆蟲的生物活性測定、酶抑制劑抑制活力檢測和通過蛋白質(zhì)與特異性抗體結(jié)合進(jìn)行檢測如酶聯(lián)免疫(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)法測定。室內(nèi)乾標(biāo)昆蟲的生物活性測定持續(xù)周期較長，易受環(huán)境因素的影響，對于不同時(shí)期的樣品很難比較，同時(shí)不同時(shí)期供試靶標(biāo)昆蟲種群也存在差異，給檢測結(jié)果的判定帶來一定的困難，然而生物測定法是最能夠反映轉(zhuǎn)基因植物抗蟲效果的方法。酶抑制法測定簡單，其原理是依據(jù)蛋白酶抑制劑對目標(biāo)蛋白酶具有抑制作用通過底物反應(yīng)檢測剩余蛋白酶的活力來間接測定蛋白酶抑制劑的含量。但蛋白酶酶抑制法進(jìn)行定量測定時(shí)，會受到來自植物本身的干擾。一方面，一些植物自身或多或少天然存在蛋白酶抑制劑對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾；另一方面特別當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物中抑制劑的含量非常低時(shí)，植物本底顏色往往會對底物反應(yīng)產(chǎn)生的顏色在吸光值因素有一定的干擾。所以，酶抑制法往往很不準(zhǔn)確。目前，特異性熒光酶抑制法逐漸發(fā)展起來，在一定程度上降低了傳統(tǒng)酶抑制法的不足。酶聯(lián)免疫法測定法測定簡單，準(zhǔn)確，快速，但需要純化抑制劑，制備特異的抗體，完成這些工作在前期需要花費(fèi)大量的時(shí)間，人力和物力。當(dāng)前，有關(guān)豇豆胰蛋白酶抑制劑或轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品中CpTI殺蟲蛋白表達(dá)免疫檢測的報(bào)道很少，國內(nèi)有關(guān)豇豆胰蛋白酶抑制劑或轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品中CpTI表達(dá)情況多數(shù)限于DNA或mRNA的檢測，核酸水平的檢測可能存在假陽性的結(jié)果而且基因的導(dǎo)入并不一定代表功能蛋白的表達(dá)，表達(dá)含量也為未可知，沒有蛋白表達(dá)的直接證明。有關(guān)蛋白檢測表達(dá)的檢測也只有酶抑制劑方法和極少的免疫學(xué)檢測而且在這個(gè)層次上報(bào)道的結(jié)果與田間實(shí)際抗蟲效率相差甚遠(yuǎn)，假陽性很高終不盡人意。因此，為了更好的評價(jià)豆工豆胰蛋白酶抑制劑及研究轉(zhuǎn)胰蛋白酶抑制劑基因作物的生態(tài)安全性、食品安全性，迫切需要制備特異性抗體并建立相應(yīng)精準(zhǔn)和快速的檢測的I工豆胰蛋白酶抑制劑酶聯(lián)免疫檢測方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對上述不足提供一種用于檢測CpTI的酶聯(lián)免疫分析試劑盒，其具有高專一性和靈敏度。本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備上述試劑盒的方法，本發(fā)明的目的還在于提供該試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明通過親和層析法以及凝膠電泳得到高純度的豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白，用該蛋白免疫動物得到多克隆抗體，并將得到多克隆抗體用于ELISA檢測。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種制備高純度虹豆蛋白酶抑制劑蛋白的方法，其包括用親和層析法純化豆工豆胰蛋白酶抑制劑蛋白粗品，還進(jìn)一步包括釆用凝膠電泳進(jìn)行分離。親和層析的方法是將豇豆蛋白酶抑制劑蛋白粗品用少量平衡液溶解后，加入預(yù)平衡的色譜柱，經(jīng)清洗后，洗脫得到豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白。這里親和層析所用的配體(即結(jié)合在固相載體上的吸附劑)可以是和豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白特異結(jié)合的蛋白，例如牛胰蛋白酶，平衡液和沖洗液的配制可為50mMTris-HCl+0.01~0.1MCaCl2，pH8.0;洗脫液的配制可為0.010.1MHC1+0.3MNaCl+0.01MCaCl2。其中親和層析所用色譜柱的填料可以是CNBr-activatedsepharose4B。上述豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白粗品可通過下述方法制備將豇豆種子粉碎后，用蛋白提取溶液提取，得粗提液；將粗提液離心，取上清，用飽和度為60%(0°C)的硫酸銨沉淀，離心，保留沉淀，得豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白粗品。在粉碎前可將種子浸泡34小時(shí)，并去掉種皮；所述蛋白提取溶液為醋酸鈉溶液(0.1MNaAC+0.3MNaCl+0.01MCaCl2，pH4.0pH4.5,)，提取時(shí)加入510倍(W/V)的醋酸鈉溶液，攪拌下提取1218個(gè)小時(shí)。將通過上述方法獲得的高純度的豇豆蛋白酶抑制劑蛋白作為免疫原，免疫動物，制備得到CpTI多克隆抗體或單克隆抗體。經(jīng)檢測，所得到的抗體具有高底物專一性和靈敏度。將上述抗體包被到酶標(biāo)板，并與適當(dāng)?shù)脑噭┙M成ELISA試劑盒，這里所述的試劑包括CpTI標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)記物、顯色液、終止液等。本發(fā)明進(jìn)一步還提供了一種檢測轉(zhuǎn)基因植物中豆工豆胰蛋白酶抑制劑蛋白的方法，包括樣品前處理，使用上述試劑盒進(jìn)行檢測，并分析檢測結(jié)果。本發(fā)明釆用親和層析色譜結(jié)合制備電泳技術(shù)分離得到豆工豆胰蛋白酶抑制劑作為抗原，通過免疫注射獲得專一性高的多克隆抗體，構(gòu)建了酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，降低了檢測的假陽性率(1%),提高了檢測的靈敏度(檢測極限達(dá)到0.5ng/g)。規(guī)范了轉(zhuǎn)豇豆胰蛋白酶抑制劑基因水稻和棉花材料中轉(zhuǎn)豆工豆胰蛋白酶抑制劑蛋白的提取制備方法，降低了植物本底，保持了抑制劑的抑制活性。本發(fā)明制備的豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白特異性檢測試劑盒能夠快速檢測轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品中的豆工豆胰蛋白酶抑制劑含量。該試劑盒和檢測方法具有快捷、方便等特點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測、鑒定及安全監(jiān)管提供了強(qiáng)有利的技術(shù)支撐，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。圖1豆工豆胰蛋白酶抑制劑蛋白的親和純化的洗脫峰圖，其中1是雜蛋白峰，2是豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白峰；圖2豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白SDS-PAGE鑒定電泳圖，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，12為親和純化的豆工豆胰蛋白酶抑制劑蛋白。圖3抗體ELISA法效價(jià)測定結(jié)果。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。需特別指出的是，盡管在實(shí)施例中詳盡描述了豆工豆胰蛋白酶抑制劑蛋白純化、抗血清獲得、以及轉(zhuǎn)基因水稻中目的蛋白的提取方法優(yōu)化，然而這并不意味本發(fā)明的檢測試劑盒及檢測方法只限于用轉(zhuǎn)基因植物中豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白含量的檢測。因此，使用本發(fā)明所描述的豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒制備方法和檢測方法(親和色譜制備分離、制備電泳純化)，提取方法，以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所具有的任何涉及上述的試劑盒方法和檢測方法檢測其他轉(zhuǎn)基因作物及其相關(guān)產(chǎn)品胰蛋白酶抑制劑和其他方面的應(yīng)用，均包括在本發(fā)明所要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例l豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白的制備1、豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白的提取選300g優(yōu)質(zhì)豇豆種子在大燒杯中蒸餾水浸泡34小時(shí)，去皮。4'C條件下用粉碎機(jī)粉碎，加5倍(W/V)的醋酸鈉提取液(0.1MNaAc+0.3MNaCl+0.01MCaCl2，pH4.0)，置于2升燒杯中于4。C冰箱用磁力攪拌器混勻16小時(shí)。然后10000轉(zhuǎn)4'C離心30分鐘。取上清液加60%的硫酸銨(即198g/L)在冰浴上沉淀30分鐘(一邊用玻璃棒緩慢攪拌,或用磁力攪拌器慢慢攪拌，避免蛋白質(zhì)變性)。隨后12000轉(zhuǎn)4°C離心15分鐘留沉淀。用盡量少的A洗脫液(50mMTris-HCl+0.01MCaCl2,pH8.0)溶解，10000轉(zhuǎn)4'C離心2分鐘，取上清過0.45P濾膜。)備色譜分離之用。2、sn豆胰蛋白酶抑制劑蛋白的親和層析純化稱取CNBr-activatedsepharose4B填料3~4g置于燒結(jié)濾器中按照每g干填料200mL比例，用lmM稀鹽酸沖洗15分鐘，形成凝膠。稱取適量的配體(牛胰蛋白酶，Trypsin)按照每mL凝膠/10mg配體的比例，用偶連緩沖液(0.1MNaHCO3+0.5MNaCl，pH8.3)充分溶解，將含配體的偶連緩沖液與凝膠在三角瓶中混勻。置搖床上輕微震蕩4€過夜(不可用磁力攪拌器攪拌)。次日，用5倍凝膠體積的偶連緩沖液在燒結(jié)濾器中沖洗凝膠。然后把凝膠轉(zhuǎn)移至200mL燒杯中加40mL的緩沖液(0.1MTris-HClpH8.0)4°C中靜止浸泡2小時(shí)。浸泡好的凝膠用0.1M醋酸鈉緩沖液(含0.5MNaCl,pH4.0)和O.lMTris-HCl(含0.5MNaCl，pH8.0)交替沖洗3個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)各緩沖液分別需5倍凝膠體積的溶液。沖洗過濾后，按照25%結(jié)合緩沖液(50mMTris-HCl+0.01MCaCl2，pH8.0)/75%凝膠的比例關(guān)系在燒杯中將凝膠混勻，脫氣后備裝柱。將膠漿連續(xù)沿柱壁緩緩流入柱(16mmx10cm)中，待凝膠沉淀后立即用結(jié)合緩沖液封頂，再用結(jié)合緩沖液清洗3~5個(gè)柱體積柱床穩(wěn)定至基線。將粗蛋白樣品沿柱壁緩緩注入色譜柱，待樣品完全浸入膠柱，立即用A洗脫液(50rnMTris-HCl+0.01MCaCl2pH8.0)洗脫雜蛋白至基線，棄去洗下的洗脫液。后用B洗脫液(O.OIMHC1+0.3MNaCl+0.01MCaCl2)洗脫目的蛋白，釆用自動收集器以每管2mL速度將含目的蛋白的溶液收集至盛有0.5mLlMTris-HCl，pH8.0溶液的試管中，釆用多功能酶標(biāo)儀OD，檢測記錄各個(gè)收集試管中溶液的吸光值，繪制洗脫曲線。合并B洗脫液第一個(gè)洗脫峰的溶液，在10mM的Tris-HCl,pH8.0溶液中4'C透析過夜(圖1)。透析后的蛋白經(jīng)冷凍干燥濃縮后，取適量干燥蛋白濃縮樣品溶解于100pL10mMTris-Cl緩沖液中，分別加入50pL3倍樣品緩沖液(25上樣緩沖液+75P-巰基乙醇)，100。C煮沸5min,離心除去沉淀；將樣品依次加入5%濃縮膠中，17.5。/。分離膠SDS-PAGE4t:下電泳.完成染色、脫色和凝膠掃描和數(shù)據(jù)記錄分析。親和層析純化的目標(biāo)蛋白為13kD，與預(yù)測結(jié)果一致(圖2)。3、在滅菌的eppendorf離心管中加入100pL豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白濃縮溶液、100|aL牛胰蛋白酶(0.5mg/ml)和IOOjiL的50mMTris-HCl溶液(含5mMCaCl2，pH8.0)置于37QC培養(yǎng)箱中孵育5~10分鐘，力卩300pL滅菌蒸餾水、50pL的50mMTris-HCl溶液(含5mMCaCl2,pH8.0)和250|iL的2.5%AZOCASEIN(50mMTris扁HCl，pH8.0溶液配制)置于37QC培養(yǎng)箱中孵育10分鐘，加入500juL10%TCA，10000轉(zhuǎn)離心1分鐘，取上清750pL，力口750pL0.5M的NaOH溶液。室溫反應(yīng)5min，428nm比色。結(jié)果表明，獲得的目標(biāo)蛋白具有很強(qiáng)的胰蛋白酶抑制活性(表1)。表1純化蛋白的蛋白酶抑制劑活性測定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將獲得的目的蛋白冷凍干燥濃縮后，用Bradford法測定蛋白的濃度，在六個(gè)Eppendorf管中加入O、5、10、15、20、25jil0.5mg/mlBSA，以0.15MNaCl補(bǔ)至體積lOOpl,加入lmL考馬斯亮蘭溶液室溫下反應(yīng)2min,以不含BSA的管為空白對照，測595nm下光吸收值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10nl樣品液加入90iil0.15MNaCl，測得OD595可由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出蛋白含量，獲得的豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白的濃度為2.3mg/mL。實(shí)施例2、豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白抗血清獲得及滴度測定參照《獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)》(曹澍澤等，北京北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992)和《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F-奧斯伯等，北京科學(xué)出版社，1998)中的方法以獲得的豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白為抗原進(jìn)行免疫家兔測定血清效價(jià)、抗體專一性(間接ELISA法)、間接ELISA法測定抗原的檢測精度。將得到的干燥蛋白配成濃度300ng/ml的蛋白溶液，即為注射用蛋白抗原。參照《獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)》免疫家兔，取血收集全部血清，加NaNs防腐。ELISA法測定效價(jià)(圖3)豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白由CBS包被液稀釋(0.015MNa2C03,0.035MNaHC03)200ng/200pL點(diǎn)樣，酶標(biāo)板置于4'C冰箱包被過夜，PBST溶液洗滌后，用1。/。小牛血清37。C培養(yǎng)箱內(nèi)封閉l小時(shí)，洗滌后將待測血清及陰性對照血清進(jìn)行等比稀釋(1:100，1:200，1:400,…l:102400等)后各取200nL加入檢測孔中，每個(gè)稀釋度均加雙孔，置于37'C溫箱孵育1小時(shí)后每孔加入用抗體稀釋液按1:1000稀釋好的HRP酶標(biāo)二抗溶液200juL，置于37。C溫箱孵育l小時(shí)，PBST洗滌后再用蒸餾水洗滌，加入底物反應(yīng)溶液(TMB原液PB:30%11202為20:1000:3的比例配制，TMB原液為60mgTMB溶于10mLDMSO后所得)。暗反應(yīng)15分鐘后加入2M112804以終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫檢測儀下于450nm比色，以待測血清OD值大于陰性對照2倍的抗體最高稀釋度的前一個(gè)稀釋度作為抗體的終點(diǎn)效價(jià)。結(jié)果顯示，抗血清效價(jià)為12000倍，工作效價(jià)2000倍適宜。另外，陰性對照沒有發(fā)生免疫顯色反應(yīng)，說明獲得的抗血清完全可運(yùn)用于ELISA檢測試劑盒(圖3)。實(shí)施例3試劑盒的組裝包被豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白的酶標(biāo)板(實(shí)施例l方法制備)虹豆胰蛋白酶抑制劑蛋白多克隆抗體酶標(biāo)記二抗(HRP標(biāo)記二抗)洗滌液(PBST)底物液(TMB溶液)終止液(2MH2S04)豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)施例4ELISA試劑盒靈敏度和特異性試驗(yàn)材料為轉(zhuǎn)CpTI基因水稻科豐6號(戎俊，宋志平，蘇軍,夏輝，王鋒，盧寶榮3t/CpTI轉(zhuǎn)基因稻及其非轉(zhuǎn)基因親本對照在間隔種植條件下的轉(zhuǎn)基因漂移.生物多樣性2006，14(4):309-314),非轉(zhuǎn)基因水稻受體明恢86(武漢惠華三農(nóng)種業(yè)有限公司)及常規(guī)非轉(zhuǎn)基因水稻汕優(yōu)63(武漢惠華三農(nóng)種業(yè)有限公司)苗期主莖頂葉。分別稱取0.5g水稻樣品加入2.5ml(50mMTris-HCl,pH9,5含10mg/mlPVP,0.001。/。PMSF)提取液，fC振蕩提取12小時(shí)。將提取的樣品在4。C下，11000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清，在酶標(biāo)版上每孔加200juL，重復(fù)3次。標(biāo)準(zhǔn)蛋白用包被液CBS(含O.OOP/。PMSF)稀釋，然后依次按照每孔6.25ng/200(iL，3.13ng/200(iL,1.56ng/200pL，0.78ng/200)iL，0.39ng/200^iL,0.20ng/200[iL，0.10ng/200)iL，0.05ng/200[iL加樣，每孔加入200pL。在37'C下，酶標(biāo)板在恒溫箱中孵育2.5小時(shí)。洗滌將檢測孔中液體迅速用力甩下，在濾紙上控干后，每孔加入300jaLPBST溶液，放置3分鐘，甩干，重復(fù)3次。每孔入稀釋2000倍的第一抗血清200juL,第一抗血清用10%小牛血清稀釋，小牛血清用PBST稀釋。37。C在恒溫箱里孵育1小時(shí)。洗滌后每孔加入稀釋1000倍的第二抗血清200mL，第二抗血清用10%小牛血清稀釋，小牛血清用PBST稀釋。37。C在恒溫箱里孵育1小時(shí)，PBST洗滌后換用蒸餾水洗滌2次。加入底物溶液100yL(底物溶液按TMB原液PB:30%H2O2為20:1000:3的比例配制，TMB原液為60mgTMB溶于10mlDMSO后所得)，室溫下暗反應(yīng)15分鐘，在搖床上輕微振蕩，然后加入2MH2S04終止。根據(jù)顯色反應(yīng)程度判定檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)蛋白6.25ng/200pL，3.13ng/200(^L,1.56ng/200|xL，0.78ng/200|aL，0.39ng/200pL，0.20ng脂nL,0.10ng/200pL孔中溶液呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，而0.05ng/200^iL孔中溶液顯色沒有達(dá)到判定陽性反應(yīng)的要求，判定本檢測試劑盒的靈敏度可以達(dá)到0.5ng/mL(g)。科豐6號苗期主莖頂葉孔中溶液呈現(xiàn)強(qiáng)烈的陽性反應(yīng)，而非轉(zhuǎn)基因水稻受體明恢86及常規(guī)非轉(zhuǎn)基因水稻汕優(yōu)63苗期主莖頂葉孔中溶液沒有顯色反應(yīng)，判定為陰性，說明該試劑盒檢測結(jié)果具有特異性。實(shí)施例5、ELISA試劑盒檢測轉(zhuǎn)CpTI基因水稻科豐6號不同時(shí)期不同組織中豇豆胰蛋白酶抑制劑的含量稱取0.5g水稻樣品加入2.5ml(50mMTris畫HCl，pH9.5含10mg/mlPVP，0.00P/。PMSF)提取液，4。C振蕩提取12小時(shí)。將提取的樣品在4。C下，11000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清，每孔200ML點(diǎn)樣。標(biāo)準(zhǔn)蛋白用包被液CBS(含0.001%PMSF)稀釋，然后依次按照每孔12.50ng/200|iL，6.25ng/200nL,3.13ng/200^L,1.56ng/200nL,0.78ng/200pL，0.39ng/200pL，0.20ng/200pL點(diǎn)樣，每孔點(diǎn)入200pL。在37'C下，酶標(biāo)板在恒溫箱中孵育2.5小時(shí)。洗滌將檢測孔中液體迅速用力甩下，在濾紙上控干后，每孔加入300iaLPBST溶液，放置3分鐘，甩干，重復(fù)3次。每孔加入稀釋2000倍的第一抗血清200PL,第一抗血清用10°/。小牛血清稀釋，小牛血清用PBST稀釋。37。C在恒溫箱里孵育1小時(shí)。洗滌后每孔加入稀釋IOOO倍的第二抗血清200iaL，第二抗血清用10%小牛血清稀釋，小牛血清用PBST稀釋。37。C在恒溫箱里孵育1小時(shí)，PBST洗滌后換用蒸餾水洗滌2次。加入底物溶液100jiL(底物溶液按TMB原液PB:30%H2O2為20:1000:3的比例配制，TMB原液為60mgTMB溶于10mlDMSO后所得)，室溫下暗反應(yīng)15分鐘，在搖床上輕微振蕩，然后加入2MH2S04終止。450nm檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因水稻各個(gè)時(shí)期各個(gè)組織均能夠檢測出虹豆胰蛋白酶抑制劑表達(dá)，而非轉(zhuǎn)基因陰性對照沒有顯色反應(yīng)，檢測不出表達(dá)(表2)。表2轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號豇豆胰蛋白酶抑制劑的時(shí)空表達(dá)量(ng/g)時(shí)期主莖頂葉主莖穗種子苗期7550.20±5.80分蘗期5455.07±98.476281.87±43.27拔節(jié)期4691.93±83.073337.80±106.40孕穗期3486.40±25.402789息50.803241.67±37.33齊穗期4254.67±48.072276.73±64.143627.80±71.40灌漿期2934.00±56.801918.13±132.675361.00±30.60乳熟期3446.07±135.874458.00±10.393465.53±70.141權(quán)利要求1、一種制備豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白的方法，其包括步驟用親和層析法純化豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白粗品。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其還包括在親和層析后進(jìn)一步釆用電泳分離。3、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，親和層析的方法是將豇豆蛋白酶抑制劑蛋白粗品用少量平衡液溶解后，加入預(yù)平衡的色譜柱，經(jīng)清洗后，洗脫得到豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白，其中平衡液和沖洗液的配制為50mMTris-HCl+0.01~0.1MCaCl2，pH8.0;洗脫液的配制為0.01~0.1MHCl+0.3MNaCl+0.01MCaCl2。4、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于親和層析所用色譜柱的填料為CNBr-activatedsepharose4B。5、如權(quán)利要求14任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白粗品的制備方法是將豇豆種子粉碎后，用蛋白提取溶液提取，得粗提液；將粗提液離心，取上清，用60%的硫酸銨沉淀，離心，保留沉淀，得豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白粗品。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于粉碎前將種子浸泡3~4小時(shí)，并去掉種皮；所述蛋白提取溶液為醋酸鈉溶液，提取時(shí)加入510倍(W/V)的醋酸鈉溶液，攪拌下提取12-18小時(shí)。7、由權(quán)利要求16任一項(xiàng)所述方法制備得到的純化虹豆胰蛋白酶抑制劑蛋白。8、用權(quán)利要求7所述的豆工豆胰蛋白酶抑制劑蛋白免疫動物制備得到的抗體。9、含有權(quán)利要求8所述抗體的試劑盒。10、權(quán)利要求9所述試劑盒在檢測豆工豆胰蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種用于檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒，本發(fā)明通過親和層析法，獲得了高純度的豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白，以此作為免疫原免疫動物制備得到了具有高底物專一性以及靈敏度的豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白抗體，本發(fā)明將此抗體用于豇豆胰蛋白酶抑制劑蛋白的檢測，特別是轉(zhuǎn)基因植物的胰蛋白酶抑制劑蛋白的檢測，取得了良好的效果。文檔編號C07K14/81GK101580534SQ20081010645公開日2009年11月18日申請日期2008年5月13日優(yōu)先權(quán)日2008年5月13日發(fā)明者吳孔明,瑩張,張永軍,冬許,洋陳申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所