專利名稱：：一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白的凝膠層析復(fù)性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體地說是涉及一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的凝膠層析復(fù)性方法。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明中的復(fù)性目標(biāo)水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白，是通過一個(gè)(Gly)3柔性肽基團(tuán)首次將重組水蛭素HV3的C末端12肽與rPA基因融合而成的一種全新蛋白。大腸桿菌表達(dá)體系因具有低廉性、高效性和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)在科研生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。然而，重組蛋白在大腸桿菌中的高水平表達(dá)經(jīng)常導(dǎo)致蛋白聚集而形成不溶的、無(wú)活性的包涵體。目前上市的重組蛋白藥物中，54%以大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)，而大腸桿菌表達(dá)蛋白中有一半形成包涵體。本研究所構(gòu)建的水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白是通過大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，以包涵體的形式存在。包涵體雖然由無(wú)活性的蛋白組成，但包涵體形成對(duì)于重組蛋白的生產(chǎn)也提供了幾個(gè)優(yōu)勢(shì)①以包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)的濃度比較高，有時(shí)甚至可以達(dá)到細(xì)胞總蛋白含量的30%(S.A/^awfl,/義wwagOT..5/opo(v附era(^e^/ife"/e"ce人1999,57:297-307.);②如果重組蛋白質(zhì)以包涵體形式存在，由于包埋了酶攻擊的位點(diǎn)，可以最大限度地抵抗蛋白質(zhì)酶的攻擊；③包涵體表達(dá)的蛋白質(zhì)沒有活性，細(xì)胞破碎和以后的純化步驟，不用考慮蛋白質(zhì)的失活問題；包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞的其他蛋白質(zhì)的分離比可溶蛋白質(zhì)的分離方法簡(jiǎn)便，造價(jià)低，使用簡(jiǎn)單的離心或者過濾的手段就能使包涵體與宿主細(xì)胞的其他蛋白質(zhì)成分進(jìn)行有效的分離；有些表達(dá)的外源蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞有毒性或者致死，大量表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，最終的細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)物相當(dāng)?shù)停w形式的蛋白質(zhì)由于喪失了生物活性從而可以高效大量地表達(dá)；◎?qū)τ谝园w形式表達(dá)的產(chǎn)物可以比較容易地進(jìn)行在線的觀測(cè)定性。包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性是生物工程下游技術(shù)中的一個(gè)重要問題。一個(gè)有效的、理想的折疊復(fù)性方法應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn)①活性蛋白質(zhì)的回收率高；②正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)分離；③折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品；④折疊復(fù)性方法易于放大；⑤復(fù)性過程耗時(shí)較少。就實(shí)際生產(chǎn)而言，要求折疊復(fù)性過程必須快速、低成本、高效。雖然蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性已有很多方法，但針對(duì)每一種蛋白質(zhì)仍需通過實(shí)驗(yàn)摸索出最佳的方法。由于蛋白質(zhì)本身的復(fù)雜性和多樣性，蛋白質(zhì)的復(fù)性方法也各不相同，本研究目標(biāo)是對(duì)已采用第三代基因工程技術(shù)-蛋白質(zhì)工程技術(shù)在分子水平上有目的設(shè)計(jì)構(gòu)建的水蛭素12肽與瑞替普酶新型抗凝溶栓雙功能重組融合蛋白HV12p-rPA進(jìn)行復(fù)性。対該具有9對(duì)二硫鍵的HV12p-rPA融合蛋白體外折疊復(fù)性具有相當(dāng)?shù)奶魬?zhàn)性和難度。由于融合蛋白的r-PA分子中18個(gè)Cys要形成9對(duì)二硫鍵，所以大腸桿菌表達(dá)HV12p-rPA時(shí)，因發(fā)生二硫鍵的錯(cuò)配而形成致密的包涵體，溶解變性后要使其重新正確折疊和復(fù)性成活性狀態(tài)非常困難，這是由于組成九對(duì)二硫鍵的18個(gè)Cys在復(fù)性時(shí)錯(cuò)誤配對(duì)造成的。蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)是基因工程蛋白產(chǎn)生的重大共性關(guān)鍵技術(shù)，直接關(guān)系到生產(chǎn)成本和技術(shù)能否產(chǎn)業(yè)化，所以，研究基因工程蛋白的復(fù)性技術(shù)不但在理論上有重大意義而且也有重大的應(yīng)用價(jià)值。蛋白的體外復(fù)性被認(rèn)為是一項(xiàng)異常艱巨的任務(wù)，目前己存在的復(fù)性方法是很多的，較常見的除了稀釋復(fù)性以外，還有透析復(fù)性、柱上復(fù)性，但普遍復(fù)性率不高，只有20%左右的目的蛋白分子(汪家政等，蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)，科學(xué)出版社，2001年，p31)得到正確的空間構(gòu)型，獲得生物學(xué)活性。并且，變性蛋白的體外復(fù)性受外部環(huán)境的影響較大，不同蛋白的復(fù)性過程不同，特異的復(fù)性環(huán)境，包括緩沖液的組成、蛋白濃度、溫度、pH等應(yīng)根據(jù)蛋白的不同而異。沒有哪種復(fù)性方法可以通用于所有的蛋白。近來，有人轉(zhuǎn)向于體內(nèi)蛋白質(zhì)折疊的模擬，產(chǎn)生了一些新的方法，例如將小分子伴侶固定化后，相當(dāng)于親和層析的原理，復(fù)性蛋白質(zhì)的同時(shí)使其濃縮和純化。有很大的應(yīng)用前景，但是，由于這些分子伴侶均需要特別制備技術(shù)，對(duì)于大規(guī)模多種蛋白質(zhì)制備，仍屬昂貴試劑。所以，要將實(shí)驗(yàn)室的研究成果產(chǎn)業(yè)化，獲取實(shí)際的生產(chǎn)成果，就不得不考慮生產(chǎn)成本以及操作難易程度這兩個(gè)問題。因此，制約基因藥物生產(chǎn)的一個(gè)關(guān)鍵性難題就是復(fù)性效率、復(fù)性成本以及生產(chǎn)操作難易的問題。HV12p-rPA融合蛋白含有九對(duì)二硫鍵，無(wú)疑為其復(fù)性增加了更大的難度，其復(fù)性問題是下游工作的一個(gè)很大的考驗(yàn)。目前，對(duì)于這種含有多對(duì)二硫鍵的蛋白的復(fù)性率普遍不高。例如同樣含有九對(duì)二硫鍵的瑞替普酶(r-PA)，Kohnert(KohnertU,effl/.ProteinEngineering，1992,5:93-100)等用稀釋復(fù)性法復(fù)性r-PA，復(fù)性率不超過5%。孫石靜(孫石靜等，中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36:363-367)等運(yùn)用金屬螯合柱一步復(fù)性，融合蛋白復(fù)性率也僅達(dá)10%。趙友春(趙友春等，化工科技，2003，11:15-17)等改進(jìn)了Kohnert的方法，在谷胱甘肽還原體系中，用重組人二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)輔助瑞替普酶復(fù)性，其復(fù)性率達(dá)到14%以上。但PDI價(jià)格昂貴，用于工業(yè)化無(wú)疑大大提高了成本。相比于傳統(tǒng)的稀釋復(fù)性方法，凝膠層析復(fù)性有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。1994年Werner(M.H.Werner,GM.Clore,R丄Fisher,erFEBSLett.1994，345:125-130.)等人第一次使用SEC復(fù)性蛋白質(zhì)，最后洗脫出71±15%的活性蛋白質(zhì)。為提高蛋白復(fù)性率，2002年谷等人(Z.Gu，Z.Su,J,C.Janson，eM/.ProteinExpress.Purif.2002,25:174-179.)利用Superdex30預(yù)裝柱復(fù)性scFv蛋白質(zhì)，在柱內(nèi)預(yù)先設(shè)置了變性劑濃度梯度和pH值的梯度，獲得了25%的活性收率。2006年劉海峰(HaifengLiu,XiangshanZhou,YuanxingZhang,Wa/'BiotechnologyLetters,2006,28:457~463)等用Sephacryl-200層析復(fù)性和兩步溫控法復(fù)性Trx-r-PA融合蛋白，收集到的樣品在25'C下復(fù)性20h，其復(fù)性率達(dá)到13.8%。本發(fā)明中的凝膠層析復(fù)性方法，與文獻(xiàn)方法相比，其改進(jìn)在于(l)進(jìn)行柱上層析復(fù)性的樣品事先進(jìn)行6-12h的氧化復(fù)性處理，使GSSG與變性蛋白中的半胱氨酸形成復(fù)合物，有效降低了二硫鍵的錯(cuò)配幾率，大大提高了該融合蛋白的復(fù)性率。(2)在層析復(fù)性時(shí)在層析柱內(nèi)預(yù)先設(shè)置了長(zhǎng)度為O.l—OJ個(gè)柱體積的變性劑(脲，鹽酸胍等，含有L-Arg)濃度梯度，使變性蛋白在復(fù)性過程中緩慢脫離變性劑環(huán)境進(jìn)入復(fù)性環(huán)境，有效抑制其聚集及二硫鍵錯(cuò)配。(3)在復(fù)性緩沖液中添加了氧化還原體系(GSSG/GSH等)以及一定濃度的L-Arg和脲，有效促進(jìn)了該融合蛋白的正確折疊和分子內(nèi)二硫鍵的正確配對(duì)。(4)在復(fù)性過程中簡(jiǎn)化了調(diào)pH過程及其他操作，降低了蛋白活性的影響。改進(jìn)后使復(fù)性蛋白溶液的濃度和比活有了一定程度的提高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提出了一種抗凝溶栓雙功能HV12p-rPA融合蛋白的復(fù)性方法。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于復(fù)性產(chǎn)品比活高、收率高、濃度高、體積小便于后續(xù)處理，操作簡(jiǎn)便、易于推廣。本發(fā)明所述抗凝溶栓雙功能HV12p-rPA融合蛋白凝膠層析復(fù)性的技術(shù)方案內(nèi)容如下(1)將發(fā)酵所得的HV12p-rPA融合蛋白包涵體，使用20-50mmol/LTris-HCl、6-8mol/L的尿素或3-7mol/L胍緩沖液，pH8.5，37'C-40'C變性6-8h，使包涵體變性溶解，其中緩沖液含有還原劑DTT(0.5-lmmol/L)或p-巰基乙醇(1%-1.5%,v/v)，12000r/min，15min，除去不溶物，收集上清液。(2)用20-50mmol/LTris-HCl、6-8mol/L尿素或3-7mol/L胍緩沖液將變性蛋白溶液稀釋至濃度為8-12mg/ml，該溶液中含有GSSG(0.05-0.lmol/L)、L-Arg(0.5-0.9mol/L)，pH9.0-9.5。25。C下，溫育6-12h。(3)采用平衡緩沖液(20國(guó)50mmol/LTris-HCl，0.5-0.7mol/LL-Arg，0.5-1.5mol/LUrea,l-10mmol/LGSH,1-10纖ol/LGSSG，l匪ol/LEDTA，pH8.5)以0.5ml/min的流速平衡層析柱。(4)平衡后，在層析柱內(nèi)設(shè)置0.1-0.3柱體積的變性劑緩沖液(20-50mmol/LTris-HCl,6-8mol/L的尿素或3-7mol/L胍，0.5-0.7mol/LL-Arg，pH8.5)。(5)將(2)作為樣品，進(jìn)樣50nl。(6)用平衡緩沖液(20-50mmol/LTris-HCl，0.5-0.7mol/LL-Arg，0.5-1.5mol/LUrea,1-10mmol/LGSH，1-10mmol/LGSSG，1mmol/LEDTA，pH8.5)以0.5ml/min的流速進(jìn)行洗脫，按照280nm吸光度的變化收集目的蛋白液，并對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)處理。(7)活性測(cè)定HV12p-rPA融合蛋白的溶栓活性測(cè)定釆用纖維蛋白-瓊脂糖平板測(cè)定法，抗凝活性采用凝血酶直接滴定法測(cè)定。本發(fā)明提供的復(fù)性抗凝溶栓雙功能HV12p-rPA融合蛋白的技術(shù)方法，復(fù)性產(chǎn)品比活高、收率高、體積小、濃度高便于后續(xù)處理，且操作簡(jiǎn)便、易于推廣，下面結(jié)合具體實(shí)施方式加以說明。圖1是HV12p-rPA融合蛋白的SuperdexG75柱上復(fù)性色譜圖(實(shí)施例一)。圖2是本發(fā)明HV12p-rPA融合蛋白樣品溶栓試驗(yàn)結(jié)果的平板圖。圖中標(biāo)示的1、2、3、4、5分別為r-PA1000、400、10、50、200IU/ml;標(biāo)示6為本發(fā)明HV12p-rPA融合蛋白樣品稀釋20倍的試樣。圖3是HV12p-rPA融合蛋白基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜。圖4是HV12p-rPA融合蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一LHV12p-rPA融合蛋白復(fù)性用平衡緩沖液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG，lmmol/LEDTA,pH8.5)平衡柱，流速為0.5ml/min。上樣前先在層析柱內(nèi)設(shè)置一個(gè)長(zhǎng)度為0.2個(gè)柱體積的8mol/L脲的濃度梯度，使得變性劑在0.2個(gè)柱體積的長(zhǎng)度內(nèi)濃度由8mol/L逐漸降至lmol/L，由此變性蛋白在進(jìn)入復(fù)性緩沖液時(shí)有一個(gè)脲濃度逐漸降低的過程。將在25'C溫度下溫育10h小時(shí)的變性蛋白溶液(10mg/ml)作為柱上復(fù)性的樣品，上樣5(V1。以平衡緩沖液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG,lmmol/LEDTA，pH8.5)洗脫，流速為0.5ml/min。根據(jù)蛋白質(zhì)在280nm的吸光度得到如附圖l所示的吸收峰。根據(jù)出峰情況收集到三個(gè)樣品P,、P2、P3(如圖l內(nèi)所示)，其中P2為目標(biāo)蛋白。2.生物活性測(cè)定抗凝活性的測(cè)定(滴定法)于酶標(biāo)板小孔中加200pl0.5°/。牛血纖維蛋白原(0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.4)配制)，再加入10-10(^1復(fù)性蛋白溶液，充分混勻。用微量進(jìn)樣器吸取標(biāo)準(zhǔn)的凝血酶溶液(100NIH/ml)，時(shí)間間隔為lmin，若在lmin內(nèi)纖維蛋白原發(fā)生凝固，即說明己達(dá)滴定終點(diǎn)。每消耗一個(gè)凝血酶單位(NIH)相當(dāng)于一個(gè)抗凝血酶單位(ATU)。溶栓活性測(cè)定(纖維蛋白-瓊脂糖平板測(cè)定法)配制平板用溶液均為PBS(pH7.4)。將1BP單位/ml的凝血酶溶液貼壁加入10ml血纖蛋白原(5mg/ml)溶液中，快速混勻，傾入至完全融化且已降至45'C的10mL瓊脂糖溶液(1.0Q/Q)中，混勻，倒入直徑90mm的平皿中，凝固后打孔使用。分別吸取不同比活性的r-PA和復(fù)性后稀釋20倍的HV12p-rPA融合蛋白滴于孔中，平皿加蓋于37'C溫育14h。溶栓平板試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過檢測(cè)，本發(fā)明技術(shù)復(fù)性HV12p-rPA融合蛋白后其溶栓活性可達(dá)93106IU/mg，抗凝活性達(dá)到273ATU/mg，融合蛋白溶栓活性的復(fù)性率約為18.6%。3.—級(jí)結(jié)構(gòu)解析本發(fā)明采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)準(zhǔn)確測(cè)定了該融合蛋白的分子量，使用胰蛋白酶和糜蛋白酶將融合蛋白進(jìn)行降解，LC-ESI-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)酶解產(chǎn)物中的多肽進(jìn)行了識(shí)別，使用肽序列標(biāo)簽法對(duì)目標(biāo)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了分析。結(jié)果實(shí)際測(cè)定該融合蛋白的分子量(如圖3所示)為41473Da，與理論分子量41472.38Da相符；本發(fā)明采用液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行肽圖分析，識(shí)別出的多取匹配度Xcorr均超過1.5,部分多肽的Xcorr超過3.0(如表1所示)，表明本實(shí)驗(yàn)測(cè)定過程中多肽識(shí)別結(jié)果準(zhǔn)確可靠胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解后進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，目標(biāo)蛋白的氨基酸覆蓋率超過85%(如表1所示)；對(duì)融合蛋白的N末端結(jié)構(gòu)分析，采用胰凝乳蛋白酶對(duì)融合蛋白進(jìn)行了酶切處理，并使用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)生的多肽進(jìn)行了識(shí)別，識(shí)別出了多肽^^ASDF5(m/z570.3)，E6PIPEDAY13(m/z933.2)，E6PIPEDAYDEGGGSY20(m/zl599.2)，Q21GNSDCY27(m/z786.5)，L364DWIRDNMRP373(m/z1315.4)(如表1所示)。從而確定了該融合蛋白的N末端MASDFEPIPEDAYDEGGGSYQGNSDCY和C末端LDWIRDNMRP的多肽序列與理論值(如圖4所示)相符。上述結(jié)果證明本發(fā)明所復(fù)性的該蛋白不僅具有雙功能的生物活性，而且結(jié)構(gòu)正確。表1HV12p-rPA融合蛋白酶解后使用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)識(shí)別出的多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注c:Chymotrypsin酶解產(chǎn)物，其它為Trypsin酶解產(chǎn)物；d:離子帶雙電荷；t:理論平均值；o實(shí)驗(yàn)檢測(cè)值實(shí)施例二用平衡緩沖液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea,lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5)平衡柱，流速為0.5ml/min。上樣前先在層析柱內(nèi)設(shè)置一個(gè)長(zhǎng)度為0.1個(gè)柱體積的8mol/L脲的濃度梯度，使得變性劑在0.1個(gè)柱體積的長(zhǎng)度內(nèi)濃度由8mol/L逐漸降至lmol/L，由此變性蛋白在進(jìn)入復(fù)性緩沖液時(shí)有一個(gè)脲濃度逐漸降低的過程。將在25'C溫度下溫育6h小時(shí)的變性蛋白溶液(12mg/ml)作為柱上復(fù)性的樣品，上樣50^1。以平衡緩沖液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，l蘭ol/LGSH，l腿ol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5)洗脫，流速為0.5ml/min。根據(jù)蛋白質(zhì)在280nm的吸光度收集目標(biāo)蛋白，按照實(shí)施例一中的方法測(cè)定復(fù)性后HV12p-rPA融合蛋白的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其溶栓活性可達(dá)83242IU/mg，抗凝活性達(dá)到251ATU/mg，融合蛋白溶栓活性的復(fù)性率約為16.6%。實(shí)施例三用平衡緩沖液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmoI/LGSSG，lmmol/LEDTA,pH8.5)平衡柱，流速為0.5ml/min。上樣前先在層析柱內(nèi)設(shè)置一個(gè)長(zhǎng)度為0.3個(gè)柱體積的8mol/L脲的濃度梯度，使得變性劑在0.3個(gè)柱體積的長(zhǎng)度內(nèi)濃度由8mol/L逐漸降至lmol/L，由此變性蛋白在進(jìn)入復(fù)性緩沖液時(shí)有一個(gè)脲濃度逐漸降低的過程。將在25'C溫度下溫育8小時(shí)的變性蛋白溶液(10mg/ml)作為柱上復(fù)性的樣品，上樣50pl。以平衡緩沖液(50縣oI/LTris-HCI，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5)洗脫，流速為0.5ml/min。根據(jù)蛋白質(zhì)在280nm的吸光度收集目標(biāo)蛋白，按照實(shí)施例一中的方法測(cè)定復(fù)性后HV12p-rPA融合蛋白的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其溶栓活性可達(dá)87574IU/mg，抗凝活性達(dá)到262ATU/mg，融合蛋白溶栓活性的復(fù)性率約為17.5%。權(quán)利要求1.一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白的凝膠層析復(fù)性方法，其特征在于以水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的包涵體為原料，變性溶解后得到融合蛋白的變性溶液，變性蛋白先在氧化復(fù)性緩沖液中進(jìn)行氧化復(fù)性，然后在具有脲濃度梯度的凝膠層析柱中進(jìn)行層析復(fù)性，最后經(jīng)過適當(dāng)后續(xù)操作得到具有抗凝溶栓雙功能的融合蛋白。2.按照權(quán)利要求1所述的凝膠層析復(fù)性法，其特征在于復(fù)性對(duì)象為水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白包涵體，復(fù)性后的蛋白具有抗凝溶栓雙功能。3.按照權(quán)利要求1所述的抗凝溶栓雙功能融合蛋白凝膠層析復(fù)性方法，其特征在于變性溶解包涵體的緩沖溶液組成為20-50mmol/LTris-HCl、6-8mol/L脲或3-7mol/L胍，含0.5-1mmol/LDTT或ni.5X(v/v)p-巰基乙醇，pH8.5，變性溫度為37。C一40。C，變性時(shí)間為6隱8h。4.按照權(quán)利要求1所述抗凝溶栓雙功能融合蛋白凝膠層析復(fù)性方法，其特征在于氧化復(fù)性緩沖液組成為20-50mmol/LTris-HCl，6-8mol/L尿素或3-7mol/L胍，0.05-0.1mol/LGSSG、0.5隱0.9mol/LL隱Arg，pH9.0-9.5，氧化復(fù)性溫度為25。C，時(shí)間為6-12h。5.按照權(quán)利要求l所述抗凝溶栓雙功能融合蛋白凝膠層析復(fù)性方法，其特征在于所用層析介質(zhì)為SuperdexG75。6.按照權(quán)利要求1所述雙功能抗凝溶栓HV12p-rPA融合蛋白凝膠層析復(fù)性方法，其特征在于柱平衡及洗脫所用的緩沖液為20-50mmol/LTris-HCl，0.5-0.7mol/LL-Arg，0.5-1.5mol/LUrea，1-10mmol/LGSH，1-10mmol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5。7.按照權(quán)利要求15所述新型抗凝溶栓雙功能HV12p-rPA融合蛋白凝膠層析復(fù)性方法，其特征在于在層析柱中構(gòu)建了0.1-0.3柱體積長(zhǎng)度的變性劑緩沖液梯度。全文摘要本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白即水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白包涵體的凝膠層析復(fù)性方法。該方法特征在于先將變性蛋白進(jìn)行一定時(shí)間氧化復(fù)性，然后采用Superdex75進(jìn)行層析復(fù)性。層析復(fù)性時(shí)先在Superdex75柱內(nèi)預(yù)設(shè)一段變性劑濃度梯度，融合蛋白在變性劑濃度梯度降低的過程中恢復(fù)其空間構(gòu)象。同時(shí)在緩沖液中添加氧化還原體系和分子伴侶輔助蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變。該方法得到的雙功能融合蛋白經(jīng)過一定處理后復(fù)性效果更好。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單，易于放大，復(fù)性后蛋白濃度較高，復(fù)性率較高。文檔編號(hào)C07K1/00GK101386639SQ20081010496公開日2009年3月18日申請(qǐng)日期2008年4月25日優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日發(fā)明者蓉余,劉永東,張貴峰,蘭梁,蘇志國(guó),凈陳,玲高申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所