專利名稱：抗獨(dú)特型綴合物及其在免疫測定中作為標(biāo)準(zhǔn)物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括綴合物，及其在測定抗藥物抗體的免疫測定中作為標(biāo)準(zhǔn)物 或陽性對照的用途。
背景技術(shù)：
使用單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)固相免疫測定涉及在吸附于固相支持物上的抗 體(捕獲抗體)、抗原，以及針對抗原另一表位并綴合了可檢測標(biāo)記的抗
體(示蹤抗體)之間形成復(fù)合物。由此形成夾層固相支持物-捕獲抗體-抗原-示蹤抗體。在夾層中，抗體綴合的可檢測標(biāo)記的強(qiáng)度與孵育介質(zhì)中的 抗原濃度成比例。由于捕獲抗體和示蹤抗體與抗原的不同表位結(jié)合，標(biāo)準(zhǔn) 夾心法也稱為雙抗原橋連免疫測定法(double antigen bridging immunoassay )。 Hoesel， W.等人在J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110 中報(bào)道了抗EPO雙抗原橋連測定法，其中使用了與氨基和與糖基偶聯(lián)的固 定4匕rhEPO混合物。
諸如雙抗原橋連ELISA的免疫測定法是研究患者對于抗體藥物(治療
Mire-Sluis, A.R.等人，在J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16中總結(jié)了 設(shè)計(jì)和優(yōu)化檢測針對生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主抗體的免疫測定法的建議。根據(jù) Mire-Sluis等人所述，眾所周知的抗藥物抗體測定法形式顯示出顯著的缺 點(diǎn)?？顾幬锟贵w測定法在例如WO 2005/045058和WO 90/006515中有所 提及?？躬?dú)特型抗體測定法在例如US 5，219，730、 WO 87/002778、 EP 0 139 389和EP 0 170 302中有所提及。Wadhwa, M.等人在J. Immunol. Methods 278 (2003) l-17中才艮道了檢測、測量和表征由治療性生物制品誘導(dǎo)的不期望抗體的策略。
Ritter， G.， Cancer Res. 61 (2001) 6851-6859和WO 2003/016909中描
述了對于人抗人抗體的血清學(xué)分析。對于IgG類人抗人抗體的鑒定，在測 定之前需要進(jìn)行G蛋白沉淀的額外步驟。
發(fā)明簡述
本發(fā)明包括綴合物，其包含與親本抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的抗獨(dú) 特型抗體和屬于單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白。
性結(jié)合。
本發(fā)明還包括本發(fā)明的綴合物在免疫測定中作為標(biāo)準(zhǔn)物的用途，所述 免疫測定用于測定人類樣品中抗親本抗體的抗體。
優(yōu)選所述綴合物在對樣品中抗親本抗體的抗體的免疫測定中用作標(biāo)準(zhǔn) 物或陽性對照，該免疫測定使用包含捕獲抗體和示蹤抗體的夾心免疫測定 法。
優(yōu)選所述捕獲抗體或所述示蹤抗體為所述親本抗體。
優(yōu)選所述親本抗體為治療性抗體或診斷性抗體。
優(yōu)選所述捕獲抗體選自所述親本抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)、Fab、 Fab'、 F(ab)2、或F(ab，)2片段。
優(yōu)選捕獲抗體通過被動(dòng)吸附與固相支持物進(jìn)行綴合。 優(yōu)選捕獲抗體通過特異性結(jié)合對固定化。
優(yōu)選捕獲抗體與生物素綴合，通過固定化抗生物素蛋白或鏈霉抗生物 素蛋白進(jìn)行固定。
優(yōu)選示蹤抗體通過特異性結(jié)合對與可檢測性標(biāo)記綴合。
優(yōu)選示蹤抗體與洋地黃毒苷綴合，并通過針對洋地黃毒苷的抗體與可 檢測性標(biāo)記進(jìn)行連接。
優(yōu)選免疫測定用表面等離振子共振進(jìn)行。優(yōu)選捕獲抗體和/或示蹤抗體與其綴合配偶體的綴合通過化學(xué)結(jié)合實(shí)
現(xiàn)，所述化學(xué)結(jié)合經(jīng)由N端和/或s-i^(賴氨酸)、不同賴氨酸的& 、 抗體氨基酸骨架的羧基、巰基、羥基和/或酚官能團(tuán)、和/或抗體糖結(jié)構(gòu)的糖 醇基進(jìn)行結(jié)合。
優(yōu)選捕獲抗體通過被動(dòng)吸附與固相支持物綴合，因此與固相支持物綴 合的捕獲抗體包含通過不同抗體位點(diǎn)與固相支持物綴合的至少兩種捕獲抗 體的混合物。例如Butler ， J.E. ， Solid Phases in Immunoassay, 在 Immunoassay, Diamandis， E.P.和Christopoulos， T.K.(編著)學(xué)術(shù)出版 社，圣地亞哥(1996),第205-225頁中對^皮動(dòng)吸附有所描述。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲抗體通過特異性結(jié)合對固定化。這 樣的結(jié)合對(第一組分/第二組分)為，例如鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素 蛋白/生物素、抗體/抗原(參見例如Hermanson， G.T.等人,Bioconjugate Techniques,學(xué)術(shù)出版社，1996)、凝集素/多糖、類固醇/類固醇結(jié)合蛋白、 激素/激素受體、酶/底物、IgG/A蛋白和/或G蛋白等。優(yōu)選捕獲親本抗體 與生物素綴合，通過固定化的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行固定。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，示蹤抗體與可檢測性標(biāo)記綴合，優(yōu)選通 過特異性結(jié)合對綴合。這樣的結(jié)合對(第一組分/第二組分)為，例如鏈霉 抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素、抗體/抗原(參見例如Hermanson， G.T.等人，Bioconjugate Techniques,學(xué)術(shù)出版社，1996)、凝集素/多糖、 類固醇/類固醇結(jié)合蛋白、激素/激素受體、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。 優(yōu)選，示蹤親本抗體通過洋地黃毒苷和針對洋地黃毒苷的抗體與可檢測性 標(biāo)記綴合。備選地，示蹤親本抗體與電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記綴合，如釕聯(lián)吡咬復(fù) 合物。
發(fā)明詳述
本發(fā)明包括綴合物，其包含與親本抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的抗獨(dú) 特型抗體，以及屬于單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白。優(yōu)選所述親 本抗體為治療性抗體。優(yōu)選所述親本抗體為診斷性抗體。本發(fā)明的術(shù)語"與親本抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體"表 示在非人動(dòng)物中針對親本抗體產(chǎn)生的抗體，即為非人抗體。優(yōu)選所述針對 親本抗體產(chǎn)生的抗體在嚙齒類動(dòng)物或獼猴中產(chǎn)生，特別優(yōu)選在小鼠、兔或
食蟹猴中產(chǎn)生，或通*示(display)技術(shù)，優(yōu)選噬菌體或核糖體展示技 術(shù)獲得。優(yōu)選所述抗獨(dú)特型抗體為多克隆抗體。還優(yōu)選所述抗獨(dú)特型抗體 為單克隆抗體。優(yōu)選用親本抗體或其片段對所述動(dòng)物進(jìn)行免疫。在之后的 步驟中，通過對親本抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的親和吸附來分離和純化 來自所述動(dòng)物的免疫球蛋白。術(shù)語"親本抗體的CDR區(qū)"表示親本抗體輕 鏈和重鏈的CDR區(qū)，即包含親本抗體輕鏈CDR1、 CDR2、 CDR3，親本 抗體重鏈CDR1、 CDR2、 CDR3。
本發(fā)明的術(shù)語"親本抗體"表示可以作為藥物(藥物抗體或治療性抗體) 或診斷工具(診斷性抗體)對個(gè)體施用的抗體，因此推測在施用之后所述個(gè)
體的樣品包含所述親本抗體。在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的一種測定法中，親本抗 體、捕獲(親本)抗體和/或示蹤(親本)抗體包含"相同的"抗體分子，例如用 相同的表達(dá)載體重組生產(chǎn)，并包含相同的M酸序列。藥物抗體(治療性 單克隆抗體)廣泛應(yīng)用于治療多種疾病如腫瘤疾病(例如血液惡性癌和實(shí) 體惡性癌，包括非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和結(jié)直腸癌)。例如在Levene， A.P.等人，Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 146-152中描 述了此類抗體。此類抗體為例如針對CCR4、 CD19、 CD20、 CD22、 CD28、 HLA-DR、 CD33、 CD40、 CD52、 CD80、 CSF畫1R、 CTLA隱4、成纖維細(xì) 胞活化蛋白(FAP)、 EGFR、 G250、 GD3、 HER2/neu、 HER3、 HER4、前 列腺特異性膜抗原(PSMA)、 CD56、 VEGF、 VEGF2、 TLSP-R、 TIE畫1、 TIE-2、 TNF-a、 TNF樣凋亡孩吏弱+秀導(dǎo)劑(TNF like weak inducer of apoptosis， TWEAK)、 CEA、 Ep畫CAM、 TRAIL、 TRAIL受體1、 TRAIL 受體2、淋巴毒素p受體、Levis Y抗原、hepsin、黑素瘤相關(guān)的硫酸軟骨 素蛋白聚糖(MCSP)、 IL-1受體、IL-6受體、VEGF-受體1、 VEGF-受體2 或IGF-1受體的抗體。治療性抗體在Groner， B.等人，Curr. Mol. Meth. 4 (2004)539-547;和Harris, M.， Lancet Oncol. (2004) 292-302中也有所描述。
本文使用的術(shù)語"參考免疫球蛋白"表示完整的免疫球蛋白，即包含
Fab區(qū)和Fc區(qū)的免疫球蛋白，以及完整免疫球蛋白的片段，如Fc區(qū)、CH2 結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域。參考免疫球蛋白優(yōu)選為人免疫球蛋白。優(yōu)選"參考 免疫球蛋白"為人免疫球蛋白或人免疫球蛋白的Fc區(qū)。本發(fā)明的"參考免疫 球蛋白"不與抗獨(dú)特型抗體特異性結(jié)合，不與綴合物的親本抗體特異性結(jié) 合。免疫球蛋白的Fc區(qū)由對完整免疫球蛋白的胃蛋白酶切割或木瓜蛋白酶 切割得到。參考免疫球蛋白屬于"單個(gè)免疫球蛋白類"。術(shù)語"單個(gè)免疫球蛋 白類，，表示所述參考免疫球蛋白包含免疫球蛋白類特異性恒定區(qū)氨基酸序 列，其選自免疫球蛋白A、 E、 M和G類。關(guān)于免疫球蛋白類特異性恒定 區(qū)^J^斷列，參見例如Pink， J.R.等人，Biochem. J. 117(1970)33-47。
"抗親本抗體的抗體"為與親本抗體特異性結(jié)合的抗體，即針對親本抗 體的抗體。同樣，抗-抗IL-6R抗體的抗體為與抗IL-6R抗體特異性結(jié)合的 抗體。"抗親本抗體的抗體"為針對親本抗體任何區(qū)域的抗體，如親本抗體 的可變區(qū)、恒定區(qū)或糖結(jié)構(gòu)。此類抗親本抗體的抗體可能在抗體治療過程 中作為患者的免疫原性反應(yīng)出現(xiàn)(見Pan, Y.等人，F(xiàn)ASEB J. 9 (1995) 43-49)。"抗獨(dú)特型抗體"為與親本抗體CDR區(qū)特異性結(jié)合的抗體?？躬?dú)特 型抗體特異性結(jié)合親本抗體的輕鏈CDR1區(qū)、輕鏈CDR2區(qū)、輕鏈CDR3 區(qū)、重鏈CDR1區(qū)、重鏈CDR2區(qū)或重鏈CDR3區(qū)。
親本抗體(優(yōu)選單克隆)的實(shí)例為針對IL-6受體的抗體(抗IL-6R抗 體)。此類抗體在例如Mihara， M.等人，Clin. Immunol. 98 (2001) 319-326; Nishimoto， N.等人，Blood 106(2005)2627-2632;臨床實(shí)驗(yàn)NCT00046774; 或WO 2004/096274中有所描述。
親本抗體(優(yōu)選單克隆)的實(shí)例為針對IGF-1受體的抗體(抗IGF-1R 抗體)。此類抗體在例如WO 2004/087756， WO 2005/005635中有所描述。
本發(fā)明的術(shù)語"結(jié)合"或"特異性結(jié)合"指以小于l(T6 M (M=mol/l)(例如 10"2M)的Ko值，更優(yōu)選以范圍在l(T9 M到1(T15M中的KD值與抗原、免 疫球蛋白的恒定區(qū)、親本抗體或親本抗體的CDR區(qū)結(jié)合，KD值以BIAcore測定法測定。當(dāng)Ku值大于10-s M(例如l(T4 M)時(shí)見到"非特異性結(jié)合"。
例如Hage， D.S.在Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R中描述了不同免 疫測定法的原理。Lu, B.等人在Analyst. 121 (1996) 29R-32R中報(bào)道了抗 體的定向固定，以用于免疫測定法。例如Wilchek， M.和Bayer， E.A.， Methods Enzymol. 184 (19卯)467-469報(bào)道了抗生物素蛋白-生物素介導(dǎo)的 免疫測定法。
抗體(特別是其恒定結(jié)構(gòu)域)包含氬基酸側(cè)鏈功能性，即化學(xué)反應(yīng)性 基團(tuán)，以與結(jié)合配偶體偶聯(lián)，所述結(jié)合配偶體如表面、蛋白質(zhì)、聚合物(例 如PEG、纖維素、或聚苯乙烯)、酶、或結(jié)合對的成員?？贵w的化學(xué)反應(yīng) 基團(tuán)為例如，氨基(賴氨酸的s-氨基、oi-氨基)、巰基(胱氨酸、半胱氨 酸、曱硫氨酸)、羧酸基團(tuán)(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。例如Aslam， M.和Dent, A.， Bioconjuation，麥考林出版公司(MacMillan Ref. Ltd.) (1999) ， 50-100頁，對此類方法有所描述。
多肽與例如固相支持物的綴合需要適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)保護(hù)劑。這些保護(hù)劑例 如與無保護(hù)的側(cè)鏈胺結(jié)合，這種結(jié)合沒有在N端的結(jié)合穩(wěn)定，且與之不同。 許多這樣的化學(xué)保護(hù)劑是已知的(參見例如EP 0 651 761)。優(yōu)選的化學(xué)保護(hù) 劑包括環(huán)狀二羧酸酐如馬來酸酐或檸康酸酐(citraconylic anhydride )。
術(shù)語"樣品"包括但不限于來自人的任意量的物質(zhì)。此類物質(zhì)包括但不 限于來自個(gè)體的全血、血清或血漿，這些是在臨床實(shí)踐中最廣泛使用的樣 品來源。
本發(fā)明免疫測定的固相支持物在本領(lǐng)域技術(shù)中有廣泛描述(參見例如 Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23)。
術(shù)語"固相支持物"表示非流體物質(zhì)，包括芯片、小管和顆粒(包括 微粒和小珠)，其由如諸如聚合物、金屬(順磁、鐵磁性顆粒)、玻璃和 陶瓷等材料制成；凝膠物質(zhì)如硅膠、氧化鋁和聚合物凝膠；毛細(xì)管，其可 以由聚合物、金屬、玻璃和/或陶資制成；沸石和其他多孔物質(zhì)；電極；微 量滴定板；固體檢測條(strip);比色亞、管或其他分光計(jì)樣品容器。測 定法中的固相支持物元件與測定法中可能接觸到的惰性固體表面的不同之處在于，"固相支持物，，表面包含至少 一個(gè)預(yù)期與捕獲抗體直接或間接相互 作用的部分。固相支持物可以是固定元件，如管、檢測條、比色皿或微量 滴定板，或可以是不固定的元件，如小珠和微粒。孩^立還可以作為勻相測 定法形式的固相支持物。可以使用允許蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)非共價(jià)或共價(jià)連
接的多種微粒。這樣的顆粒包括聚合物顆粒如聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸 甲酯；金顆粒如金納米顆粒和膠體金；和陶瓷顆粒如硅膠、玻璃和金屬氧 化物顆粒。見例如Martin ， C.R.等人，Analytical Chemistry-News & Features 70 (1998) 322A-327A，其引入本文作為參考。
"芯片"為固相、無孔材料，如金屬、玻璃或塑料。該材料可以任選完 全或在某些區(qū)域被包被。在該材料的表面上，點(diǎn)的任何排列可見地或在坐 標(biāo)中呈現(xiàn)。在各點(diǎn)上，確定的多肽可以通過或不通過連接體(linker)或間 隔物(spacer)固定到材料的表面上。
上文和下文中提到的所有文件均在此引入本文作為參考。
可檢測性標(biāo)記的實(shí)例為色原(熒光或發(fā)光基團(tuán)和染料)、酶、NMR-活性基團(tuán)或金屬顆粒、半抗原(例如洋地黃毒苷)?？蓹z測性標(biāo)記還可以 是光活化交聯(lián)基團(tuán)，例如疊氮基或吖丙咬基(azirine)?？梢杂秒娀瘜W(xué)發(fā)光 檢測的金屬螯合物也是用作可檢測標(biāo)記的優(yōu)選信號發(fā)射基團(tuán)，特別優(yōu)選釕 螯合物，例如釕(聯(lián)吡咬)32+螯合物。例如EP 0 580 979、 WO卯/05301、 WO 90/11511和WO 92/14138中描述了適合的釕標(biāo)記基團(tuán)。
本發(fā)明包括綴合物，其包含與親本抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的抗獨(dú) 特型抗體和屬于單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白。
本發(fā)明包括綴合物，其包含與親本抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的抗獨(dú) 特型抗體和屬于選自人免疫球蛋白E、人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M 或人免疫球蛋白A的單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白，即所述參考 免疫球蛋白為人IgE類、或?yàn)槿薎gG類、或?yàn)槿薎gM類、或?yàn)槿薎gA類。
優(yōu)選本發(fā)明包括綴合物，其包含與親本抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的 抗獨(dú)特型抗體和屬于單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白，所述參考免 疫J求蛋白不與所述抗獨(dú)特型抗體特異性結(jié)合，不與所述親本抗體特異性結(jié)合。
優(yōu)選所述親本抗體為治療性抗體或診斷性抗體。優(yōu)選所述參考免疫球 蛋白為屬于單一免疫球蛋白類別的無功能的免疫球蛋白，或?yàn)閷儆趩我幻?br> 疫球蛋白類別的免疫球蛋白的Fc區(qū)。
術(shù)語"診斷性抗體"表示用于檢測和顯示其耙抗原的抗體，其為天然抗 體或重組生產(chǎn)的抗體。診斷性抗體在例如測定系統(tǒng)(例如ELISA)中使用， 或用于體外成像。診斷性抗體可以為例如標(biāo)記的治療性抗體。
優(yōu)選所述參考免疫球蛋白為人免疫球蛋白或人免疫球蛋白Fc區(qū)。 參考免疫球蛋白提供免疫球蛋白類別特異性恒定區(qū)，該免疫球蛋白類 別特異性恒定區(qū)可以與抗免疫球蛋白類抗體，如抗人免疫球蛋白G抗體特 異性結(jié)合。因此參考免疫球蛋白為本發(fā)明的綴合物提供了免疫球蛋白類別 特異性標(biāo)記，該免疫球蛋白類別特異性標(biāo)記可以通過標(biāo)記特異性抗體得到 特異性鑒定。例如，如果該標(biāo)記為免疫球蛋白G恒定區(qū)，則標(biāo)記特異性抗 體為抗免疫球蛋白G抗體。
優(yōu)選所述抗獨(dú)特型抗體為多克隆抗體，所述參考免疫球蛋白為多克隆 免疫球蛋白。還優(yōu)選所述抗獨(dú)特型抗體為多克隆抗體，所述參考免疫球蛋 白為單克隆免疫球蛋白。更優(yōu)選所述抗獨(dú)特型抗體為單克隆抗體，所述參 考免疫球蛋白為單克隆免疫球蛋白。
本發(fā)明的綴合物由抗獨(dú)特型抗體和參考免疫球蛋白的化學(xué)綴合得到。 在本發(fā)明的綴合物中，抗獨(dú)特型抗體為有功能的免疫球蛋白，參考免 疫球蛋白為無功能的免疫球蛋白。這表示抗獨(dú)特型抗體與其靶抗體特異性 結(jié)合，而參考抗體不與任何人抗原特異性結(jié)合。提供參考抗體是為了呈現(xiàn) 與天然存在的免疫球蛋白盡可能相似的Fc區(qū)，而不是為了結(jié)合抗原?？躬?dú) 特型抗體和參考抗體不是相同抗體的情況也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)，這樣 的情況即它們有至少20 %的氨基酸殘基不同，即它們基于氨基^列的同 一性為80%或更少。參考抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本申請中 使用的術(shù)語"單克隆"表示由單種細(xì)胞或其子代產(chǎn)生的抗體群。該術(shù)語表示 所述抗體具有相同的氨基酸序列，即所述抗體具有相同的氨基酸序列，雖然在產(chǎn)生抗體的細(xì)胞增殖的過程中有偶然突變。
本申請中使用的術(shù)語"無功能的免疫球蛋白，，表示以10-5 mol/1或更高 (例如l(T3 mol/l)的Ku值(結(jié)合親和力)，優(yōu)選以l(T6 mol/1或更高的Ko值與 人抗原結(jié)合的免疫球蛋白。結(jié)合親和力用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測定法，如表面等離振 子共振技術(shù)(BIAcor^)測定。此結(jié)合親和力值不必作為精確值對待；它只 是參考點(diǎn)。該結(jié)合親和力值用于確定和/或選擇對于人抗原不顯示免疫球蛋 白典型的特異性結(jié)合，從而在人類中沒有治療活性的免疫球蛋白。這不排 除免疫球蛋白對于非人抗原顯示特異性結(jié)合。此與非人抗原的特異性結(jié)合 的Ku值為l(T7 mol/1或更低(例如1(T1Q mol/l)，優(yōu)選Ko值為l(T8 mol/1或更 低。
基于轉(zhuǎn)染瘤，即從免疫的小鼠獲得的包含轉(zhuǎn)染的免疫球蛋白基因的淋 巴樣細(xì)胞，本發(fā)明的綴合物可以通過核酸水平上的綴合得到。
對哺乳動(dòng)物使用源自受體生物之外的藥物，例如施用外源性治療多肽， 會(huì)導(dǎo)致受體哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。此免疫應(yīng)答通過抗藥物抗體的出現(xiàn)而變 得顯而易見。評估此類免疫應(yīng)答需要檢測針對該藥物的抗體的方法。
本發(fā)明的綴合物可以在免疫測定中用作標(biāo)準(zhǔn)物。因此，本發(fā)明包括綴 合物用于在測定人類樣品中抗親本抗體的抗體的免疫測定中作為標(biāo)準(zhǔn)物的 用途的用途，所述綴合物包含與親本抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的抗獨(dú)特 型抗體和屬于單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白。
本發(fā)明的綴合物還可以在免疫測定中用作陽性對照。這使得例如可以 例如建立檢測限。因此，本發(fā)明包括綴合物在用于測定人類樣品中抗親本 抗體的抗體的免疫測定中作為陽性對照的用途，所述綴合物包含與親本抗
體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體和屬于單一免疫球蛋白類別的參 考免疫球蛋白。在此實(shí)施方案中優(yōu)選所述綴合物在免疫測定之前加入人類 樣品中。
親本抗體優(yōu)選為治療性抗體。并且優(yōu)選親本抗體為鼠抗體、嵌合抗體、 人源化抗體或人抗體。優(yōu)選親本抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。 特別優(yōu)選所述親本抗體為治療性的嵌合、人源化或人抗體。檢測針對親本抗體的抗體可以z使用不同的方法，如放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測 定(ELISA)、免疫放射測定(IRMA)或表面等離振子共振(SPR)。
本申請中使用的術(shù)語"治療性抗體"及其語法上的等同用語優(yōu)選表示單 克隆抗體，其預(yù)期施用于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類，用于疾病的治療 (treatment),療法(therapy )或診斷。治療性抗體通常用重組方法生產(chǎn)， 例如通過培養(yǎng)用編碼所述治療性抗體的核酸轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞生產(chǎn)。優(yōu)選治 療性抗體為嵌合抗體、或人源化抗體、或人抗體。施用治療性抗體以實(shí)現(xiàn) 期望的效果，例如消耗靶細(xì)胞、或介導(dǎo)ADCC (依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì) 胞毒性)、或介導(dǎo)CDC(依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性)。靶細(xì)胞可以是例如癌細(xì)胞或 病毒感染的細(xì)胞。要介導(dǎo)ADCC或CDC，治療性抗體必須結(jié)合乾細(xì)胞， 因此是對例如腫瘤抗原特異性的，即與其特異性結(jié)合。
本文使用的"肺瘤抗原"，包括本領(lǐng)域已知的含義，其包括在腫瘤細(xì)胞 上表達(dá)(或與腫瘤細(xì)胞發(fā)育相關(guān))、已知或被認(rèn)為對腫瘤細(xì)胞的致瘤特性 有作用的任何分子。許多腫瘤抗原為本領(lǐng)域已知。 一種分子是否為腫瘤抗 原還可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)和測定法確定，例如克隆發(fā)生測 定法(clonogenic assay )、轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、體外或體內(nèi)肺瘤形成測定法、凝膠 遷移測定法(gel migration assay)、基因敲除分析等。優(yōu)選術(shù)語"腫瘤抗 原"在本文中使用時(shí)指AJ^膜蛋白，即錨定在細(xì)胞脂雙層中的細(xì)胞膜蛋白。 本文使用的人跨膜蛋白通常會(huì)包含"細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域"，其可以結(jié)合配體、親 脂跨膜結(jié)構(gòu)域、保守的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，例如酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，和具有若干 可被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基末端信號結(jié)構(gòu)域。肺瘤抗原包括分子如 EGFR、 HER2/neu、 HER3、 HER4、 EpCAM、 CEA、 TRAIL 、 TRAIL 受體l、 TRAIL受體2、淋巴毒素p受體、CCR4、 CD19、 CD20、 CD22、 CD28、 CD33、 CD40、 CD80、 CSF-1R、 CTLA畫4、成纖維細(xì)胞活4匕蛋白 (FAP)、 hepsin、黑素瘤相關(guān)的硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、前列腺特異 性膜抗原(PSMA)、 VEGF受體1、 VEGF受體2、 IGF1-R、 TSLP-R、 TIE-1、 TIE-2、 TNF-a、 TNF樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑(TWEAK)或IL-1R。
優(yōu)選本發(fā)明的綴合物在^f吏用包含捕獲抗體和示蹤抗體的夾心免疫測定法對樣品中的抗親本抗體的抗體進(jìn)行的免疫測定中用作標(biāo)準(zhǔn)物。特別優(yōu)選 所述捕獲抗體或所述示蹤抗體為所述親本抗體。
例如，抗藥物抗體測定法在WO 2005/045058和WO卯/006515中有 所提及，抗獨(dú)特型抗體測定法在US 5，219，730、WO 87/002778、EP 0 139 389 和EP 0 170 302中有所提及。
優(yōu)選所述抗獨(dú)特型抗體為單克隆抗體，所述參考免疫球蛋白為多克隆 人免疫球蛋白。還優(yōu)選所述抗獨(dú)特型抗體為單克隆抗體，所述參考免疫球 蛋白為單克隆人免疫球蛋白。
本發(fā)明的綴合物優(yōu)選在對樣品中針對親本抗體的抗獨(dú)特型抗體進(jìn)行的 免疫測定中用作標(biāo)準(zhǔn)物。所述免疫測定使用捕獲抗體和示蹤抗體。在一個(gè) 實(shí)施方案中捕獲抗體為親本抗體。優(yōu)選用作捕獲抗體的親本抗體為完整抗 體，即它包含輕鏈和重鏈，其中輕鏈包含可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域，其中 重鏈包含可變結(jié)構(gòu)域、CH1、 CH2、 CH3和任選的CH4結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)。 優(yōu)選捕獲抗體選自所述親本抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)、Fab、 Fab，、 F(ab)2 或F(ab，)2片段，即其為所述親本抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)、Fab、或Fab，、 或F(abh、或F(ab，)2片段。在其他實(shí)施方案中，示蹤抗體為親本抗體。在 此實(shí)施方案中，例如本發(fā)明的綴合物通過與綴合物的參考免疫球蛋白特異 性結(jié)合的免疫球蛋白與固相支持物結(jié)合。
示蹤抗體和/或捕獲抗體與其綴合配偶體的綴合可以通過不同方法實(shí)
現(xiàn)，如被動(dòng)吸附、化學(xué)結(jié)合或通過特異性結(jié)合對結(jié)合。本文使用的術(shù)語"綴 合配偶體，，表示例如固相支持物、多肽、可檢測性標(biāo)記、特異性結(jié)合對的成
員。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲抗體和/或示蹤抗體與其綴合配偶體的綴合是 通過化學(xué)結(jié)合實(shí)現(xiàn)，其經(jīng)由N端和/或s-氨基(賴氨酸)、不同賴氡酸的s-氨基、抗體氨基酸骨架的氛基、巰基、羥基和/或酚官能團(tuán)、和/或抗體糖結(jié) 構(gòu)的糖醇基進(jìn)行結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲抗體和/或示蹤抗體通過特 異性結(jié)合對與其綴合配偶體綴合。優(yōu)選捕獲抗體與生物素綴合，通過固定 于固相支持物的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白實(shí)現(xiàn)與固相支持物的固 定。優(yōu)選示蹤抗體與洋地黃毒苷綴合，通過針對洋地黃毒普的抗體實(shí)現(xiàn)與可檢測標(biāo)記的連接。在另一實(shí)施方案中，捕獲抗體通過被動(dòng)吸附與固相支 持物綴合。通過被動(dòng)吸附與固相支持物綴合的抗體包含通過不同抗體位點(diǎn) 與固相支持物綴合的抗體的混合物。因此，通過^皮動(dòng)吸附與固相支持物綴 合的捕獲抗體為兩種或多種不同綴合物的混合物，其中綴合物在實(shí)現(xiàn)與固
相支持物的綴合的抗體位點(diǎn)(即抗體殘基)上有所不同。例如Butler，丄E.， Solid Phases in Immunoassay, Immunoassay,第205-225頁，Diamandis， E.P.和Christopoulos， T.K.(編)學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥(1996)中對被 動(dòng)吸附有所描述。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲抗體通過特異性結(jié)合對固定化。此 類結(jié)合對(第一組分/第二組分)為，例如鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋 白/生物素、抗體/抗原(參見例如Hermanson, G.T.等人，Bioconjugate Techniques,學(xué)術(shù)出版社，1996)、凝集素/多糖、類固醇/類固醇結(jié)合蛋白、 激素/激素受體、酶/底物、IgG/ A蛋白和/或G蛋白和/或L蛋白等。優(yōu)選 捕獲親本抗體與生物素綴合，通過固定化的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素 蛋白進(jìn)行固定。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方案中，示蹤抗體與可檢測性標(biāo) 記綴合，優(yōu)選通過特異性結(jié)合對綴合。這樣的結(jié)合對(第一組分/第二組分) 為，例如鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素、抗體/抗原、凝集素/ 多糖、類固醇/類固醇結(jié)合蛋白、激素/激素受體、酶/底物、IgG/A蛋白和/ 或G蛋白和/或L蛋白等。優(yōu)選示蹤親本抗體通過洋地黃毒苷和針對洋地 黃毒普的抗體與可檢測性標(biāo)記綴合?？蛇x地，示蹤親本抗體與電化學(xué)發(fā)光 標(biāo)記(如釕聯(lián)吡啶復(fù)合物)綴合。
如果本發(fā)明的綴合物在測定人類樣品中針對親本抗體的抗獨(dú)特型抗體 的免疫測定中用作標(biāo)準(zhǔn)物，則優(yōu)選以兩種或多種不同濃度^f吏用該綴合物。 使用測定的對不同濃度標(biāo)準(zhǔn)物的反應(yīng)，計(jì)算/可以計(jì)算校準(zhǔn)曲線。
如果本發(fā)明的綴合物在測定人類樣品中針對親本抗體的抗獨(dú)特型抗體 的免疫測定中用作標(biāo)準(zhǔn)物，可以使用與所述綴合物的所述參考免疫球蛋白 特異性結(jié)合的(任選的)其他抗體。本發(fā)明的綴合物可以作為標(biāo)準(zhǔn)物單獨(dú)使 用，或與任選其他的抗人免疫球蛋白抗體組合使用(圖3和4)。在本申請中可以互換使用的術(shù)語"標(biāo)準(zhǔn)物"或"標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)"表示分析方法
中的參考點(diǎn)，用于設(shè)定相對于相同分析方法中比較的其他結(jié)果的值。本文 使用的術(shù)語"陽性對照"表示這樣的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，當(dāng)在分析方法中使用它時(shí)， 會(huì)得到高于確定的截?cái)嘀祷蜷撝档姆磻?yīng)。截?cái)嘀低ǔＪ窃诓缓顾幬锟贵w 樣品的分析中得到的平均值加上兩倍、優(yōu)選三倍所得值的標(biāo)準(zhǔn)差。
本發(fā)明還包含在免疫測定中使用本發(fā)明的綴合物作為標(biāo)準(zhǔn)物的方法，
所述方法包含下列步驟a)本發(fā)明的綴合物與捕獲抗體相接觸，b)檢測 所述綴合物與所述捕獲抗體的結(jié)合。對步驟a)中的結(jié)合的檢測可以例如通 過SPR角度的變化直接進(jìn)行，或例如通過示蹤抗體和/或可檢測性標(biāo)記間 接進(jìn)行。
本發(fā)明還包含測定抗藥物抗體是否與親本抗體的Fc區(qū)或Fab區(qū)結(jié)合， 以及測定所述抗藥物抗體屬于哪種免疫球蛋白類別的方法(見例如圖7)。在 此方法中，樣品的結(jié)合^f吏用固定化的親本抗體、固定化的所述親本抗體的 Fc區(qū)和/或固定化的所述親本抗體的Fab區(qū)進(jìn)行測定。這可以例如在 BIAcore芯片上實(shí)現(xiàn)，其上的四個(gè)槽(channel)中一個(gè)含有固定化的親本 抗體， 一個(gè)含有固定化的親本抗體的Fc區(qū)， 一個(gè)含有固定化的親本抗體的 Fab區(qū)， 一個(gè)不含固定化的親本抗體。取決于哪些槽，于是也就是親本抗 體的哪(些)部分顯示與來自樣品的抗藥物抗體結(jié)合，由此可以確定抗藥 物抗體的結(jié)合區(qū)域。免疫球蛋白的類別通過結(jié)合抗人免疫球蛋白E抗體、 抗人免疫球蛋白M抗體、抗人免疫球蛋白G抗體或抗人免疫球蛋白A抗 體確定。依次或伴隨使用抗人免疫球蛋白抗體，優(yōu)選依次使用。本發(fā)明的 綴合物可以在此方法中用作標(biāo)準(zhǔn)物。
本發(fā)明還包括用包含捕獲抗體、示蹤抗體和本發(fā)明的綴合物的夾心免 疫測定法，以測定樣品中與親本抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的抗獨(dú)特型抗 體的免疫球蛋白類別的方法，其包含下列步驟
a) 所述樣品與捕獲抗體在適合形成捕獲抗體/抗獨(dú)特型抗體復(fù)合 物的條件下相接觸，
b) 分別以0 抗人免疫球蛋白A抗體，
ii) 抗人免疫球蛋白E抗體，
iii) 抗人免疫球蛋白M抗體，和
iv) 抗人免疫球蛋白G抗體
作為示蹤抗體與所述捕獲抗體/抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物相接觸， c)測定各所述示蹤抗體與所述復(fù)合物的結(jié)合，由此確定所述抗獨(dú)特 型抗體的免疫球蛋白類別，
其中本發(fā)明的綴合物用作陽性對照。
此方法的圖解和示例性反應(yīng)圖在圖1和2中給出。
優(yōu)選所述示蹤抗體與所述捕獲抗體/抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物接觸的順序 為i)抗人免疫球蛋白A抗體，ii)抗人免疫球蛋白E抗體，iii)抗人免疫 球蛋白M抗體，iv)抗人免疫球蛋白G抗體，即示蹤抗體與復(fù)合物依次接 觸。
優(yōu)選所述捕獲抗體選自所述親本抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)、Fab、 Fab，、 F(ab)2或F(ab，)2片段。
本發(fā)明還包含特異性結(jié)合抗IL-6R抗體CDR區(qū)的多克隆抗體。本發(fā) 明的多克隆抗體的制備方法在實(shí)施例la)中描述。
驟
a) 所述樣品在適合形成捕獲抗體/抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物的條件下與 捕獲抗體相接觸，
b) 用選自抗人免疫球蛋白G抗體、抗人免疫球蛋白E抗體、抗人 免疫球蛋白M抗體、抗人免疫球蛋白A抗體的示蹤抗體與所述捕獲抗體/ 抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物相接觸，
c) 測定所述示蹤抗體與所述復(fù)合物的結(jié)合，
d) 分解所述捕獲抗體/抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物，
e) 用之前未選擇的示蹤抗體重復(fù)步驟a)至d)，
f) 確定所述抗獨(dú)特型抗體的免疫球蛋白類別為特異性結(jié)合所述捕獲抗體/抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物的所述示蹤抗體的免疫球蛋白類別。
示蹤抗體優(yōu)選選自抗人免疫球蛋白G抗體、或抗人免疫球蛋白E抗體、 或抗人免疫球蛋白M抗體、或抗人免疫球蛋白A抗體。
本申請中使用的術(shù)語"在適合形成[...l復(fù)合物的條件下"及其語法上的 等同語表示在這樣的M下當(dāng)目的抗體/免疫球蛋白(例如抗獨(dú)特型抗體) 與二級抗體相接觸時(shí)會(huì)與其結(jié)合。這并不一定表示100 %的目的抗體都與 二級抗體結(jié)合，而是基本上100。/。的目的抗體與二級抗體結(jié)合，即至少85 %的目的抗體與二級抗體結(jié)合，優(yōu)選至少90 %的目的抗體與二級抗體結(jié)
合，優(yōu)選至少95%的目的抗體與二級抗體結(jié)合，更優(yōu)選多于95%的目的 抗體與二級抗體結(jié)合。
提供下文的實(shí)施例和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍由隨 附的權(quán)利要求書闡明。應(yīng)理解在不偏離本發(fā)明精神的情況下可以對列出的 方法做出修改。


圖1用任選的隨后亞類測定檢測樣品中的抗親本抗體的抗體的圖解。 圖2本發(fā)明的抗獨(dú)特型抗體亞類測定的BIAcoreSPR圖。(1)注入樣
品，(2) + (3)注入抗人免疫球蛋白E抗體，(4)注入抗人免疫球蛋白G抗體。
圖3用本發(fā)明的綴合物作為標(biāo)準(zhǔn)物并使用任選類別的特異性抗體的 圖解。
圖4用本發(fā)明的化合物作為標(biāo)準(zhǔn)物(一級反應(yīng))并使用任選的隨后抗標(biāo) 準(zhǔn)物免疫球蛋白亞類抗體(二級反應(yīng))的BIAcore SPR圖。 圖5抗獨(dú)特型抗體ELISA測定的圖解。 圖6測定抗獨(dú)特型抗體的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖7用隨后的免疫球蛋白類別測定對抗親本抗體的抗體的結(jié)合區(qū)域 的多槽檢測的圖解。在下列實(shí)施例中使用針對IL-6受體的抗體只是為了舉例說明本發(fā)明， 而不是旨在限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
制備與親本抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的多克隆抗獨(dú)特型抗體和多克 隆Aj6l清免疫球蛋白E、 G、 A和M類的組合物。
抗-抗IL-6R抗體的多克隆抗體(抗-抗IL-6R-mAb pAb) i)制備4f對單克隆抗IL-6R抗體的多克隆抗體 從兔血清中純化多克隆抗體
才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用單克隆抗IL-6R抗體免疫兔。通過用珪膠(Aerosil) (1.5 。/。(w/v))脫脂除去五只免疫的兔的原始血清中的脂質(zhì)成份，用硫酸銨 (1.7 M)沉淀免疫球蛋白。經(jīng)過酸處理(30分鐘，pH 5.5)和以補(bǔ)充有50 mM NaCl, pH7.0的15 mM磷酸鉀緩沖液透析之后，用DEAE離子交換層析 在pH 7.0分離混合物。免疫球蛋白G級分在流出液中(二兔抗-抗IL-6R-mAb pAb)，濃縮至約25mg/ml。
制備與針對IL-6R的親本抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的兔抗-抗 IL-6R-mAb抗體
將之前步驟中濃縮的IgG級分轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有150 mM NaCl， pH 7.5 的50 mM磷酸鉀(PBS)緩沖系統(tǒng)中。用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)將抗IL-6R抗體與 NHS-瓊脂糖綴合，制備具有固定化的抗IL-6R抗體(親本抗體)的免疫吸附 劑，將其填充到柱中，用補(bǔ)充有150 mM NaCl， pH 7.5的50 mM磷酸鉀
緩沖液平衡。
將10 mg濃縮的免疫球蛋白G級分/ml免疫吸附劑上樣至用PBS平衡 的柱上。用PBS、補(bǔ)充有0.05 % (w/v) Tween 20的0.5 M NaCl和30 mM NaCl相繼洗滌柱。用3 mM HC1和1 M丙酸洗脫特異性結(jié)合免疫吸附劑 的IgG。以PBS透才斤洗脫液。
為除去與人免疫球蛋白G(IgG)恒定區(qū)具有交叉反應(yīng)性的抗體，將親和 純化的抗體上樣至具有固定化的人IgG的親和柱上，該親和柱用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)將非特異性人IgG與NHS-瓊脂糖綴合制備得到。用PBS平衡該柱。 將約6 mg IgG/ml免疫吸附劑上樣至該柱上。期望的特異性多克隆IgG級 分在流出液中。用補(bǔ)充有0.05。/。(w/v)Tween⑧20的0.5MNaCl、 30 mM NaCl、 1 M丙酸和PBS令柱再生之后，重復(fù)兩次對與人IgG恒定區(qū)非特 異性結(jié)合的抗體的免疫吸附，以完全除去對人IgG具有交叉反應(yīng)性的抗體。 將所得純化的對人IgG恒定區(qū)不具有交叉反應(yīng)性的抗-抗IL-6R抗體 的多克隆抗體濃縮至約4 mg/ml ，儲存在-80 'C 。
ii)抗-抗IL-6R抗體的多克隆抗體與多克隆人免疫球蛋白E、人免疫 球蛋白G、人免疫球蛋白A和人免疫球蛋白M的綴合
制備兔抗-抗IL-6R抗體的多克隆抗體(aa-IL-6R pAb)與人免疫球蛋白 G的綴合物
步驟1:制備兔aa-IL-6R pAb-SATP
以含有150 mM NaCl， pH 7.8的100 mM磷酸鉀緩沖液透析aa-IL-6R pAb，將蛋白質(zhì)溶液調(diào)整至蛋白質(zhì)濃度為約15 mg/ml。 ]\-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)溶于DMSO,以l:5(aa-IL-6R pAb:SATP)的摩爾 比加入至抗體溶液。調(diào)整pH至pH 7.1，混合物在25。C孵育60分鐘。通 過加入終濃度為10 mM的L-賴氨酸停止反應(yīng)，以含有200 mM NaCl、 1 mM E1)TA， pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩沖液透析除去剩余的SATP。
步驟2:制備人多克隆人免疫球蛋白G-MH
以pH 7.4的30 mM磷酸鉀緩沖液透析多克隆人抗體，而后將蛋白質(zhì) 溶液調(diào)整至蛋白質(zhì)濃度為約25 mg/ml。馬來酰亞胺己酰-N-羥基琥珀酰亞 胺酉旨(Maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimide ester ， MHS)溶于DMSO， 以l:6(IgG:MHS)的摩爾比加入至抗體溶液中。調(diào)整pH至pH7.1，混合物 在25匸孵育60分鐘。通過加入L-賴氨酸至終濃度為10 mM停止反應(yīng)，調(diào) 整pH至pH 6.2，通過以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM 磷酸鉀緩沖液透析除去剩余的MHS。
步驟3: aa-IL-6R pAb-SATP與多克隆人免疫球蛋白G-MH的綴合通過用2 % (v/v)l M羥胺(hydroxylamine)， pH 7,5孵育將aa-IL-6R pAb-SATP脫去乙?；鶠閍a-IL-6R pAb-SH,在25。C孵育45分鐘。脫去 乙?；目贵w與多克隆人免疫球蛋白G-MH混合(摩爾比為 IgG-SH:IgG-MH = 1:3)，用含有200 mM NaCl、 lmMEDTA， pH 6.1的 10 mM磷酸鉀緩沖液稀釋至終濃度為1.5 mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和4.5 mg/ml多克隆人免疫球蛋白G-MH。調(diào)整pH至pH7.1，在25^孵育混合 物。用分析性凝膠過濾柱(例如TSK 3000)分析綴合過程。通常在45分鐘 后通過加入半胱氨酸至終濃度為1 mM停止綴合。再經(jīng)過30分鐘孵育時(shí)間 后，加入終濃度為5 mM的N-曱基馬來酰亞胺(NMM)，并調(diào)整pH至pH 7.5。在25。C孵育60分鐘后，用S300^m過濾層析純化綴合物，除去未綴 合的抗體。
制備兔aa-IL-6R pAb與人免疫球蛋白M的綴合物 步驟1:制備兔aa-IL-6R pAb-SATP
以含有150 mM NaCl， pH 7.8的100 mM磷酸鉀緩沖液透析aa-IL-6R pAb，將蛋白質(zhì)溶液調(diào)整至蛋白質(zhì)濃度為約15 mg/ml。 N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)溶于DMSO，以l:5(aa-IL-6R pAb:SATP)的摩爾 比加入至抗體溶液。調(diào)整pH至pH 7.1，混合物在25。C孵育60分鐘。通 過加入終濃度為10 mM的L-賴氨酸停止反應(yīng)，以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM確酸鉀緩沖液透析除去剩余的SATP。
步驟2:制備多克隆人免疫球蛋白M-MH
以pH 7.4的30 mM磷酸鉀緩沖液透析多克隆人抗體，而后將得到的 蛋白質(zhì)溶液調(diào)整至蛋白質(zhì)濃度為約20 mg/ml。馬來酰亞胺己酰-N-羥基琥 珀酰亞胺酯(MHS)溶于DMSO,以l:50(IgM:MHS)的摩爾比加入至抗體溶 液中。調(diào)整pH至pH 7.1 ，混合物在25°C孵育60分鐘。通過加入L-賴氨 酸至終濃度為10 mM停止反應(yīng)。調(diào)整pH至pH 6.2,通過以含有200 mM NaC1、1 mM EDTA，pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩沖液透析除去剩余的MHS。
步驟3: aa-IL-6R pAb-SATP與多克隆人免疫球蛋白M-MH的綴合通過用2 % (v/v)l M羥胺，pH 7.5孵育將aa-IL-6R pAb-SATP脫去 乙?；鶠閍a-IL-6R pAb-SH,在25匸孵育45分鐘。脫去乙?；贵w與多 克隆人免疫球蛋白M-MH混合(摩爾比為aa-IL-6R pAb-SH:IgM-MH = 1:2)，用含有200mMNaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩沖 液稀釋至終濃度為約0.9 mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和9.1 mg/ml多克隆人免 疫球蛋白M-MH。調(diào)整pH至pH7.1，在25。C孵育混合物。用分析性i^ 過濾柱(例如TSK 5000)監(jiān)測綴合過程。通常在60分鐘后通過加入半胱氨 酸至終濃度為1 mM停止綴合反應(yīng)。再經(jīng)過30分鐘孵育時(shí)間后，加入終濃 度為5 mM的N-曱基馬來酰亞胺(NMM)，并調(diào)整pH至pH 7.5。在25匸 孵育60分鐘后，用S400凝膠過濾層析純化綴合物，除去未綴合的抗體。
制備兔aa-IL-6R pAb與多克隆人免疫球蛋白E的綴合物 步驟1:制備兔aa-IL-6R pAb-SATP
以含有150 mM NaCl， pH 7.8的100 mM磷酸鉀緩沖液透析aa-IL畫6R pAb,將蛋白質(zhì)溶液調(diào)整至蛋白質(zhì)濃度為約15 mg/ml。 N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)溶于DMSO,以l:5(aa-IL-6R pAb:SATP)的摩爾 比加入至抗體溶液。調(diào)整pH至pH 7.1,混合物在25X:醉育60分鐘。通 過加入終濃度為10 mM的L-賴氨酸停止反應(yīng)，以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩沖液透析除去剩余的SATP。
步驟2:制備多克隆人免疫球蛋白E-MH
以pH 7.4的30 mM磷酸鉀緩沖液透析多克隆人抗體，將得到的蛋白 質(zhì)溶液調(diào)整至最終蛋白質(zhì)濃度為約13 mg/ml。馬來酰亞胺己酰-N-羥基琥 珀酰亞胺酯(MHS)溶于DMSO，以l:6(IgE:MHS)的摩爾比加入至抗體溶 液中。調(diào)整pH至pH7.1，混合物在25"C孵育60分鐘。通iti口入L-賴氨 酸至終濃度為10 mM停止反應(yīng)，調(diào)整pH至pH 6.2，通過以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA,pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩沖液透析除去剩余的MHS。 步驟3:兔aa-IL-6R pAb-SATP與多克隆人免疫球蛋白E-MH的綴合 通過用2 % (v/v)l M羥胺，pH 7.5孵育將aa-IL-6R pAb-SATP脫去25。C孵育45分鐘。脫去乙?；贵w與多 克隆人免疫球蛋白E-MH混合(摩爾比為aa-IL-6R pAb-SH:IgE-MH = 1:1.7)，用含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA, pH 6.1的10 mM磷酸鐘緩 沖液稀釋至濃度為2.9 mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和6.3 mg/ml多克隆人免疫 球蛋白E-MH。調(diào)整pH至7.1，在25X:孵育混合物。用分析性^過濾 柱(例如TSK 4000)監(jiān)測綴合過程。通常在90分鐘后通過加入半胱氨酸至 終濃度為1 mM停止綴合過程。再經(jīng)過30分鐘孵育時(shí)間后，加入N-甲基 馬來酰亞胺(NMM)終濃度至5 mM，并調(diào)整pH至pH 7.5。在25。C孵育 60分鐘后，用S300凝膠過濾層析純化綴合物，除去未綴合的抗體。
制備兔aa-IL-6R pAb與多克隆人免疫球蛋白A的綴合物 步驟l:制備兔aa-IL-6RpAb-SATP
以含有150 mM NaCl, pH 7.8的100 mM磷酸鉀緩沖液透析aa-IL-6R pAb，將蛋白質(zhì)溶液調(diào)整至蛋白質(zhì)濃度為約15 mg/ml。 N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP)溶于DMSO，以l:5(aa-IL-6R pAb:SATP)的摩爾 比加入至抗體溶液。調(diào)整pH至pH 7.1，混合物在25。C孵育60分鐘。通 過加入終濃度為10 mM的L-賴氨酸停止反應(yīng)，以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM鱗酸鉀緩沖液透析除去剩余的SATP。
步驟2:制備多克隆人免疫球蛋白A-MH
以pH 7.4的30 mM砩酸鉀緩沖液透析多克隆人抗體，將得到的蛋白 質(zhì)溶液調(diào)整至最終蛋白質(zhì)濃度為約13 mg/ml。馬來酰亞胺己酰-N-羥基琥 珀酰亞胺酉旨(MHS)溶于DMSO，以l:6(IgA:MHS)的摩爾比加入至抗體溶 液中。調(diào)整pH至pH7.1，混合物在25X:孵育60分鐘。通過加入L-賴氨 酸至終濃度為10 mM停止反應(yīng)，調(diào)整pH至pH 6.2，通過以含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA, pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩沖液透析除去剩余的MHS。 步驟3:兔aa-IL-6R pAb-SATP與多克隆人免疫球蛋白A-MH的綴合 通過用2 % (v/v)1 M羥胺，pH 7.5孵育將aa-IL-6R pAb-SATP脫去 乙?；鶠閍a-IL-6R pAb-SH，在25。C賻育45分鐘。脫去乙酰基抗體與多克隆人免疫球蛋白A-MH混合(摩爾比為aa-IL-6R pAb-SH:IgA-MH = 1:2)，用含有200 mM NaCl、 1 mM EDTA， pH 6.1的10 mM磷酸鉀緩沖 液稀釋至濃度為2.9 mg/ml aa-IL-6R pAb-SH和6.3 mg/ml多克隆人免疫 球蛋白A-MH。調(diào)整pH至7.1,在25'C孵育混合物。用分析性凝膠過濾 柱(例如TSK 4000)監(jiān)測綴合過程。通常在90分鐘后通過加入半胱氨酸至 終濃度為1 mM停止綴合過程。再經(jīng)過30分鐘孵育后，加入終濃度為5 mM 的N-曱基馬來酰亞胺(NMM)，調(diào)整pH至pH 7.5。在25C孵育60分鐘后， 用S300凝膠過濾層析純化綴合物，除去未綴合的抗體。
實(shí)施例2
將生物素化的抗IL-6R抗體偶聯(lián)到鏈霉抗生物素蛋白包被的芯片上 抗IL-6R抗體用緩沖液透析(100mM磷酸鉀緩沖液，pH8.5)。之后將 溶液調(diào)整至蛋白質(zhì)濃度為10 mg/ml。 D-生物素-氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞 胺酯溶于DMSO，以1:5的摩爾比加入至抗體溶液中。60分鐘后通過加入 L-賴氨酸停止反應(yīng)。通過以補(bǔ)充有150 mM氯化鈉，pH 7.5的25 mM砩 酸鉀緩沖液透析除去剩余的標(biāo)記試劑。
第一步，用NHS-EDC混合物活化CM5芯片流動(dòng)池(flow cell)的表 面。表面活化后，注入100ng/ml的中性鏈親和素(Neutravidin)溶液(用pH 4.5的緩沖液稀釋；Pierce),以使其與活化的表面酯之間得以形成共價(jià)鍵。 然后，通過注入lM乙醇胺實(shí)現(xiàn)剩余的未偶聯(lián)的酯的失活。將生物素化的 抗體注入單個(gè)流動(dòng)池，以20 pl/分鐘的流速和20照/ml的濃度流動(dòng)5分鐘。 這使得抗體固定到流動(dòng)池上。
實(shí)施例3
檢測Ajk清中的IgG類抗-抗IL-6R抗體的抗體
將樣品稀釋至1:10到1:100之間，以20 pl的體積、流速20 inl/分鐘注 入到如實(shí)施例2中制備的芯片上。注入樣品之后，抗IgG類抗體即單克隆 抗人免疫球蛋白G抗體以20 pl/分鐘的流速和20 jig/ml的濃度注入。最后，開始時(shí)測量標(biāo)準(zhǔn)樣 品。20 pi兔抗-抗IL-6R抗體的多克隆抗體(aa-IL-6R pAb)與人IgG的綴 合物作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，以流速20 inl/分鐘注入到具有固定化的抗IL-6R抗體 完整抗體、F(ab，)2片段，和/或Fc片段的免疫原性芯片上。標(biāo)準(zhǔn)注射之后， 任選地以相同流速注入抗IgG類抗體即單克隆抗人免疫球蛋白G抗體。
實(shí)施例4
檢測人血清中的IgE類抗-抗IL-6R抗體的抗體
將樣品稀釋至1:10到1:100之間，以20 |nl的體積、流速20 pl/分鐘注 入到如實(shí)施例2中制備的芯片上。注入樣品之后，抗IgE類抗體即單克隆 抗人免疫球蛋白E抗體以20 pl/分鐘的流速和20 ng/ml的濃度注入。最后， 進(jìn)行一次再生溶液(100 mM HbP04)的注射。在各測量開始時(shí)測量標(biāo)準(zhǔn)樣 品。20 pi兔aa-IL-6R pAb與人IgE的綴合物作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，以流速20 p1/ 分鐘注入到具有抗IL-6R抗體的固定化完整抗體、F(ab，)2片段，和/或Fc 片段的免疫原性芯片上。標(biāo)準(zhǔn)注射之后，任選地以相同流速注入抗IgE類 抗體即單克隆抗人免疫球蛋白E抗體。
實(shí)施例5
檢測人血清中的IgM類抗-抗IL-6R抗體的抗體
將樣品稀釋至1:10到1:100之間，以20 jal的體積、流速20 jal/分鐘注 入到如實(shí)施例2中制備的芯片上。注入樣品之后，抗IgM類抗體即單克隆 抗人免疫球蛋白M抗體以20 nl/分鐘的流速和20 pg/ml的濃度注入。最后， 進(jìn)行一次再生溶液(100 mM H3P04)的注射。在各測量開始時(shí)測量標(biāo)準(zhǔn)樣 品。20 pl兔aa-IL-6R pAb與人IgM的綴合物作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，以流速20 p1/ 分鐘注入到具有抗IL-6R抗體的固定化完整抗體、F(ab，)2片段，和/或Fc 片段的免疫原性芯片上。標(biāo)準(zhǔn)注射之后，任選地以相同流速注入抗IgM類 抗體即單克隆抗人免疫球蛋白M抗體。實(shí)施例6
檢測人血清中IgE、 IgG和IgM類抗-抗IL-6R抗體的抗體 將樣品稀釋至1:10到1:100之間，以20 pl的體積、流速20 inl/分鐘注 入到如實(shí)施例2中制備的芯片上。注入樣品之后，抗IgE類抗體即單克隆 抗人免疫球蛋白E抗體以流速20 jtU/分鐘和20 jig/ml的濃度注入。注射之 后，記錄反應(yīng)。之后抗IgM類抗體即單克隆抗人免疫球蛋白M抗體以20 p1/ 分鐘的流速和20照/ml的濃度注入。注射之后，記錄反應(yīng)。之后抗IgG類 抗體即單克隆抗人免疫球蛋白G抗體以流速20 n!/分鐘和20照/ml的濃度 注入。注射之后，記錄反應(yīng)。最后，進(jìn)行一次再生溶液(IOO mM H3P04) 的注射。在各測量開始時(shí)測量所述的三種標(biāo)準(zhǔn)樣品(綴合物)。標(biāo)準(zhǔn)物1: 20 nl 兔aa-IL-6R pAb與人IgM的綴合物作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，注入到免疫原性芯片 上；標(biāo)準(zhǔn)物2: 20 pl兔aa-IL-6R pAb與人IgE的綴合物作為陽性標(biāo)準(zhǔn)注入 到免疫原性芯片上；標(biāo)準(zhǔn)物3: 20 pl兔aa-IL-6R pAb與人IgG的綴合物作 為陽性標(biāo)準(zhǔn)注入到免疫原性芯片上。
實(shí)施例7
用標(biāo)準(zhǔn)綴合物對IgE類抗親本抗體進(jìn)行ELISA測定 第一步，將生物素化的針對IL-6受體(親本抗體)的抗體結(jié)合到鏈霉抗 生物素蛋白包被的微量滴定板(SA-MTP)的孔表面上。用廣域緩沖液洗滌除 去未結(jié)合的抗體。之后，將樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)物(綴合多克隆人IgE的針對抗 IL-6受體抗體的兔抗體)加入不同孔中并孵育。來自樣品的抗親本抗體和參 考標(biāo)準(zhǔn)物分別與固定化親本抗體結(jié)合。洗滌步驟之后，結(jié)合的抗親本抗體 和參考標(biāo)準(zhǔn)物分別用洋地黃毒苷化的針對人IgE的抗體進(jìn)行檢測，而后與 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗洋地黃毒香抗體孵育?？贵w-酶綴合物催化ABTS 底物的顯色反應(yīng)。用ELISA讀板器在波長405 nm處(參考波長490 nm ) 測量信號。以一式三份測定各血清樣品的吸光值。標(biāo)準(zhǔn)物獲得陽性信號， 在抗親本抗體為IgE亞類的情況下，樣品也得到陽性信號(圖5和6)。
權(quán)利要求
1.綴合物，其包含與單克隆治療性抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體和屬于單一免疫球蛋白類別的參考免疫球蛋白，其中所述參考免疫球蛋白為人免疫球蛋白或人免疫球蛋白的Fc區(qū)。
2. 權(quán)利要求1所述的綴合物，其特征在于所述參考免疫球蛋白不與所 述抗獨(dú)特型抗體特異性結(jié)合，且不與所述治療性抗體特異性結(jié)合。
3. 權(quán)利要求1所述的綴合物在免疫測定中作為標(biāo)準(zhǔn)物或陽性對照的用 途，所述免疫測定用于測定樣品中抗親本抗體的抗體。
4. 權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述免疫測定為包含捕獲抗體 和示蹤抗體的夾心免疫測定法，其中捕獲抗體或示蹤抗體為所述親本抗體。
5. 權(quán)利要求3或4所述的用途，其特征在于所述抗親本抗體的抗體為 針對所述親本抗體的抗獨(dú)特型抗體。
6. 權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述捕獲抗體選 自所述親本抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)、Fab、 Fab，、 F(ab)2或F(ab，)2片段。
7. 測定樣品中與親本抗體的CDR區(qū)特異性結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體的免 疫球蛋白類別的方法，所述方法使用包含捕獲抗體和示蹤抗體及本發(fā)明的 綴合物的夾心免疫測定法，所述方法包含下列步驟a) 所述樣品在適合形成捕獲抗體/抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物的條件下與 捕獲抗體接觸，b) 分別以i) 抗人免疫球蛋白A抗體，ii) 抗人免疫球蛋白E抗體，iii) 抗人免疫球蛋白M抗體，和iv) 抗人免疫球蛋白G抗體作為示蹤抗體與所述捕獲抗體/抗獨(dú)特型抗體復(fù)合物接觸，c) 測定所述示蹤抗體與所述復(fù)合物的結(jié)合，由此確定所述抗獨(dú)特型 抗體的免疫球蛋白類別，其中權(quán)利要求1所述的綴合物用作陽性對照。
全文摘要
本發(fā)明報(bào)道了包含綴合物的組合物以及所述組合物在免疫測定中作為標(biāo)準(zhǔn)物的用途，所述綴合物為特異性結(jié)合親本抗體CDR區(qū)的抗獨(dú)特型抗體和E、G、M或A類多克隆人血清免疫球蛋白的綴合物。
文檔編號C07K16/42GK101541835SQ200780042996
公開日2009年9月23日 申請日期2007年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月21日
發(fā)明者K-G·施圖本拉赫, R·福格爾, U·韋塞爾斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司