專利名稱：Il2與抗gd2單鏈抗體融合蛋白及編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥，具體的說是一種新型的IL2-抗GD2單鏈抗體融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(biological response modifier，BRM)主要是指來自生物體自身的一些分子和免疫細(xì)胞，它們既是機(jī)體為內(nèi)外環(huán)境刺激應(yīng)答的效應(yīng)成分，也是維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的重要因素。此類因子范圍甚廣，包括細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素2(Il-2)、干擾素(INF)、腫瘤壞死因子(TNF)、單抗受體、LAK細(xì)胞、抗獨(dú)特型抗體疫苗和分子疫苗等。BRM單獨(dú)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力和殺傷腫瘤細(xì)胞，已取得了較好的療效。但由于其輸入體內(nèi)后，僅有部分到達(dá)腫瘤靶部位，其殺傷作用得不到充分的發(fā)揮，且有毒副作用。將BRM與單抗偶聯(lián)，通過單抗攜帶其達(dá)到靶部位而發(fā)揮殺傷腫瘤的作用，使這些分子的作用更強(qiáng)，且更加專一。常用的BRM有INF和IL-2等。
盡管IL-2有獨(dú)立的抗腫瘤作用，但是給人體反復(fù)應(yīng)用IL-2可產(chǎn)生多種副作用，輕者表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、腹瀉、體重減輕，重者表現(xiàn)為貧血、血小板減少、呼吸緊迫、休克和昏迷等。且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，單抗-IL-2交聯(lián)物較IL-2單獨(dú)應(yīng)用的生物學(xué)活性更佳，其殺傷腫瘤細(xì)胞的效果更好，副作用也小。如將IL-2與單抗交聯(lián)，其交聯(lián)物還可以激活LAK細(xì)胞共同殺傷腫瘤細(xì)胞，效果更強(qiáng)。
本實(shí)驗(yàn)選擇經(jīng)過突變改變其稀有密碼子的IL-2，與抗GD2單鏈抗體連接。形成有抗腫瘤作用的融合蛋白，為腫瘤的免疫治療提供了新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種IL-2與抗GD2單鏈抗體融合基因及該融合蛋白的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種IL2與抗GD2單鏈抗體融合蛋白，具有序列表SEQ ID No4中氨基酸序列；其編碼基因具有序列表SEQ ID NO3中的核苷酸序列。
所述的編碼基因通過PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行雙特異性抗體的編碼基因制備；具體過程①以人的經(jīng)過突變改變其稀有密碼子的IL-2基因(具有序列表SEQ ID No1中堿基序列)為模板，通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，引物引入連接肽序列；②以鼠源性抗GD2單鏈抗體基因(M-ScFv(源于HB8759)具有序列表SEQ ID No2中堿基序列)為模板，利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，引物引入連接肽序列his tag序列；③第三輪PCR反應(yīng)是利用重疊PCR技術(shù)，將兩種單鏈抗體基因連接形成融合基因(具有序列表SEQ ID No3中堿基序列)；Linker連接肽基因序列編碼氨基酸序列為Gly4Ser。
該融合蛋白可激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)，特異性殺傷黑色素瘤、成細(xì)胞纖維瘤、小細(xì)胞肺癌等腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.構(gòu)建了IL2與抗GD2單鏈抗體的融合基因，為人工制備的新基因，屬首次制得的融合基因。
2.應(yīng)用本發(fā)明，可進(jìn)一步提供直接用于生產(chǎn)IL2-M-ScFv融合蛋白的工程菌株。
3.有效防止了人體反復(fù)應(yīng)用IL-2產(chǎn)生的發(fā)熱，寒戰(zhàn)，休克等多種副作用，融合蛋白能特異性聚集在腫瘤周圍，引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，較IL-2單獨(dú)應(yīng)用的生物學(xué)活性更佳，其殺傷腫瘤細(xì)胞的效果更好，副作用也小。
4.因IL2突變了其稀有密碼子，因此融合蛋白在大腸桿菌中有較好的表達(dá)。
5.融合蛋白的分子量為普通抗體的30％，是單抗與IL-2融合蛋白分子量的25％，能更好的滲透組織，到達(dá)腫瘤細(xì)胞處。


圖1為融合蛋白IL2-M-ScFv的測(cè)序圖譜之一；圖2為融合蛋白IL2-M-ScFv的測(cè)序圖譜之二；圖3為融合蛋白IL2-M-ScFv的測(cè)序圖譜之三；圖4為IL2-M-ScFv融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)電泳圖其中2、3為本發(fā)明實(shí)例工程菌，A為誘導(dǎo)帶；1為對(duì)照；4為中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種經(jīng)過突變改變其稀有密碼子的IL2具有序列表SEQ ID No1中堿基序列(詳見中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3111487.3)。
GCTCCGACTTCTAGCTCTACCAAGAAAACCCAGCTGCAGCTGGAACACCTGCTGCTGGATTTACAGATGATTCTGAACGGTATCAACAACTACAAGAACCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAGTTTTACATGCCGAAGAAAGCTACCGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTTCTGAACCTGGCTCAGAGCAAAAACTTTCACCTGCGTCCGCGTGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTGAAAGGTTCTGAAACCACCTTCATGTGCGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACCGTTGGATTACCTTCTCTCAGTCTATCATCTCTACTCTGACT(1)SEQ ID No1的信息(參見序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度399堿基對(duì)*類型核酸
*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源經(jīng)過突變改變其稀有密碼子的IL2基因(2)經(jīng)過突變改變其稀有密碼子的IL2的制備Primer For(IL2-M1)5’-TCACCA TGGCT CCG ACT TCT AGC TCTACC AA-3’NcoI酶切位點(diǎn)Primer back(IL2-M2，含linker)5’-TGA ACC GCC TCC ACC AGT CAGAGTAGA GAT-3’擴(kuò)增條件以含經(jīng)過突變改變其稀有密碼子的IL2基因的質(zhì)粒為模板，以Pfu酶進(jìn)行擴(kuò)增。
反應(yīng)條件95℃變性2分鐘；95℃30秒，68℃30秒，72℃1分45秒，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物回收按上海華舜試劑盒使用說明書操作。
實(shí)施例2一種鼠源性抗GD2單鏈抗體基因M-ScFv，來源于雜交瘤HB8759，具有序列表SEQ ID No2中堿基序列。
CAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGTCTCTGGATTCACTTTCAGTAATTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGATTGCAGAAATTAGATTGAAATCCAATAATTTTGCAAGATATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAGGTAGTGTCTACCTGCAAATGATCAACCTAAGAGCTGAAGATACTGGCATTTATTACTGTACCAGTTATGGTAACTACGTTGGGCACTATTTTGACCACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAATGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTGAACCACTGCTTTTCTCGGCATCCTACCGTTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCTCTGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG(1)SEQ ID No2的信息(參見序列表)(A)序列特征*長(zhǎng)度735堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源鼠源性抗GD2單鏈抗體基因M-ScFv，源于雜交瘤細(xì)胞株HB8759(英文名稱hybridoma cell)(2)抗GD2單鏈抗體基因M-ScFv的制備以含有M-ScFv基因的質(zhì)粒pCAS1為模板，以Pfu酶進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增引物和條件如下M-ScFv擴(kuò)增引物Primer For(IL2-M3，含linker)5’-GGT GGA GGC GGT TCA GCA GGTGAAGCT GCAGGAGT-3’Primer back(N1-M4)5’-GTCAAG CTTTCA GTG GTG ATG ATG ATG CCG TTT GATHindIII酶切位點(diǎn)TTC CAG CTT GGT GCC T-3’引入His tag序列，HindIII酶切位點(diǎn)及終止子TGA反應(yīng)條件95℃變性2分鐘；95℃30秒，68℃30秒，72℃1分45秒，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物回收按上海華舜試劑盒使用說明書操作。
實(shí)施例3IL2-M-ScFv融合基因具有序列表SEQ ID No3的堿基序列ATGGCTCCGACTTCTAGCTCTACCAAGAAAACCCAGCTGCAGCTGGAACACCTGCTGCTGGATTTACAGATGATTCTGAACGGTATCAACAACTACAAGAACCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAGTTTTACATGCCGAAGAAAGCTACCGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTTCTGAACCTGGCTCAGAGCAAAAACTTTCACCTGCGTCCGCGTGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTGAAAGGTTCTGAAACCACCTTCATGTGCGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACCGTTGGATTACCTTCTCTCAGTCTATCATCTCTACTCTGACTGGTGGAGGCGGTTCACAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAGGGGGCTTGGTGCAACCTGsAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGTCTCTGGATTCACTTTCAGTAATTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGATTGCAGAAATTAGATTGAAATCCAATAATTTTGCAAGATATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCC AAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGATCAACCTAAGAGCTGAAGATACTGGCATTTATTACTGTAGCAGTTATGGTAACTACGTTGGGCACTATTTTGACCACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCATGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAATGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTGAACCACTGCTTTTCTCGGCATCCTACCGTTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACC
ATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCTCTGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGCATCACCATCATCACCACTGAAAGCTT(1)SEQ ID No3的信息(參見序列表)(A)序列特征*長(zhǎng)度1179堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型CDNA(C)假設(shè)否(d)反義否(2)將兩個(gè)基因通過重疊PCR法用Linker連接。
Linker翻譯后為Gly4SerPrimer For(IL2-M1)5’-TCACCA TGGCT CCG ACT TCT AGC TCTACC AA-3’NcoI酶切位點(diǎn)Primer back(N1-M4)5’-GTCAAG CTTTCA GTG GTG ATG ATG ATG CCG TTT GATHindIII酶切位點(diǎn)TTC CAG CTT GGT GCC T-3’擴(kuò)增條件以N和M的PCR回收產(chǎn)物等摩爾混合作為模板，LATag酶進(jìn)行擴(kuò)增。
反應(yīng)條件94℃變性5分鐘；94℃30秒，54℃45秒，72℃1分45秒，5個(gè)循環(huán)；加入引物后，94℃30秒，63℃45秒，72℃1分45秒，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸30分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收按上海華舜試劑盒使用說明書。
提取質(zhì)粒pMD18-Il2-M，NCoI、HindIII，雙酶切，膠回收約1200bp目標(biāo)片斷，連接雙酶切膠回收后的PSE380載體，16度過夜，pSE380-Il2-M轉(zhuǎn)化JM109，菌體電泳選擇有滯后質(zhì)粒的菌株，提取質(zhì)粒后雙酶切及PCR驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109或BL21菌株，挑取轉(zhuǎn)化子單菌落，接種于含Amp(100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基，37度過夜培養(yǎng)，次日1％轉(zhuǎn)種量轉(zhuǎn)于新鮮的含Amp的LB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD560達(dá)到0.6-0.8時(shí)用1.0mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。于37度誘導(dǎo)表達(dá)10小時(shí)。取1ml發(fā)酵液離心，菌體沉淀用1ml蒸餾水洗滌，離心后懸于1倍的上樣緩沖液中，沸水浴煮10分鐘，12000g離心兩分鐘。取10ul進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描檢測(cè)蛋白的表達(dá)。
結(jié)果在工程菌的細(xì)胞全蛋白電泳中有一條明顯的表達(dá)帶，誘導(dǎo)蛋白如圖2所示。分子量約為43000dalton；紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描顯示此蛋白占菌體中蛋白的33％。
IL2與抗GD2SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所<120>IL2與抗GD2單鏈抗體融合蛋白及編碼基因和應(yīng)用<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>399<212>DNA<213>Human interleukin-2<220>
<221>old_sequence<222>(1)..(399)<223>
<400>1gctccgactt ctagctctac caagaaaacc cagctgcagc tggaacacct gctgctggat60ttacagatga ttctgaacgg tatcaacaac tacaagaacc cgaaactgac ccgtatgctg120accttcaagt tttacatgcc gaagaaagct accgaactga aacatcttca gtgtctagaa180gaagaactca aacctctgga ggaagttctg aacctggctc agagcaaaaa ctttcacctg240cgtccgcgtg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactgaa aggttctgaa300accaccttca tgtgcgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaaccgt360
IL2與抗GD2tggattacct tctctcagtc tatcatctct actctgact 399<210>2<211>735<212>DNA<213>雜交瘤細(xì)胞株(hybridoma cell)<220>
<221>V_region<222>(1)..(735)<223>
<400>2caggtgaagc tgcaggagtc aggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc60tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aattactgga tgaactgggt ccgccagtct120ccagagaagg ggcttgagtg gattgcagaa attagattga aatccaataa ttttgcaaga180tattatgcgg agtczgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaggtagt240gtctacctgc aaatgatcaa cctaagagct gaagatactg gcatttatta ctgtaccagt300tatggtaact acgttgggca ctattttgac cactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc360tcctcaggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacattgag420ctcacccagt ctccaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc480aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcctggtatc aacaaaaacc agggcaatct540cctgaaccac tgcttttctc ggcatcctac cgttacactg gagtccctga tcgcttcaca600ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca atgtgcagtc tgaagacttg660gcagagtatt tctgtcagca atataacagc tatcctctga cgttcggtgg aggcaccaag720czggaaatca aacgg 735<210>3<211>1179
IL2與抗GD2<212>DNA<213>融合基因<220>
<221>CDS<222>(1)..(1179)<223>
<400>3atg gct ccg act tct agc tct acc aag aaa acc cag ctg cag ctg gaa 48Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu1 5 10 15cac ctg ctg ctg gat tta cag atg att ctg aac ggt atc aac aac tac 96His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr20 25 30aag aac ccg aaa ctg acc cgt atg ctg acc ttc aag ttt tac atg ccg 144Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro35 40 45aag aaa gct acc gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc 192Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu50 55 60aaa cct ctg gag gaa gtt ctg aac ctg gct cag agc aaa aac ttt cac 240Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His65 70 75 80ctg cgt ccg cgt gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa 288Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu85 90 95ctg aaa ggt tct gaa acc acc ttc atg tgc gaa tat gct gat gag aca 336Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr100 105 110gca acc att gta gaa ttt ctg aac cgt tgg att acc ttc tct cag tct 384Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser115 120 125atc atc tct act ctg act ggt gga ggc ggt tca cag gtg aag ctg cag 432Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln130 135 140gag tca gga ggg ggc ttg gtg caa cct gsa gga tcc atg aaa ctc tcc 480Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Xaa Gly Ser Met Lys Leu Ser145 150 155 160
IL2與抗GD2tgt gtt gtc tct gga ttc act ttc agt aat tac tgg atg aac tgg gtc528Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val165 170 175cgc cag tct cca gag aag ggg ctt gag tgg att gca gaa att aga ttg576Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Glu Ile Arg Leu180 185 190aaa tcc aat aat ttt gca aga tat tat gcg gag tct gtg aaa ggg agg624Lys Ser Asn Asn Phe Ala Arg Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg195 200 205ttc acc atc tca aga gat gat tcc aaa agt agt gtc tac ctg caa atg672Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met210 215 220atc aac cta aga gct gaa gat act ggc att tat tac tgt agc agt tat720Ile Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr225 230 235 240ggt aac tac gtt ggg cac tat ttt gac cac tgg ggc caa ggg acc acg768Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr245 250 255gtc acc gtc tcc tca tgt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc816Val Thr Val Ser Ser Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly260 265 270ggt ggc gga tct gac att gag ctc acc cag tct cca aaa ttc atg tcc864Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser275 280 285aca tca gta gga gac agg gtc agc gtc acc tgc aag gcc agt cag aat912Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn290 295 300gtg gat act aat gta gcc tgg tat caa caa aaa cca ggg caa tct cct960Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro305 310 315 320gaa cca ctg ctt ttc tcg gca tcc tac cgt tac act gga gtc cct gat1008Glu Pro Leu Leu Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp325 330 335cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc1056Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser340 345 350aat gtg cag tct gaa gac ttg gca gag tat ttc tgt cag caa tat aac1104Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn355 360 365agc tat cct ctg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg1152Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg370 375 380
IL2與抗GD2cat cac cat cat cac cac tga aag ctt 1179His His His His His His Lys Leu385 390<210>4<211>390<212>PRT<213>融合基因<220>
<221>misc_feature<222>(154)..(154)<223>The ’Xaa’at location 154 stands for Gly，Or Ala.
<400>4Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu1 5 10 15His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr20 25 30Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro35 40 45Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu50 55 60Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His65 70 75 80Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Ash Ile Asn Val Ile Val Leu Glu85 90 95Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr100 105 110Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Set Gln Ser115 120 125
IL2與抗GD2Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln130 135 140Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Xaa Gly Ser Met Lys Leu Ser145 150 155 160Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val165 170 175Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Glu Ile Arg Leu180 185 190Lys Ser Asn Asn Phe Ala Arg Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg195 200 205Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met210 215 220Ile Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr225 230 235 240Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr245 250 255Val Thr Val Ser Ser Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly260 265 270Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser275 280 285Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn290 295 300Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro305 310 315 320Glu Pro Leu Leu Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp325 330 335Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser340 345 350
IL2與抗GD2Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn355 360 365Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg370 375 380His His His His His His385 390
權(quán)利要求
1.一種IL2與抗GD2單鏈抗體融合蛋白，其特征在于具有序列表SEQ ID No4中氨基酸序列。
2.一種權(quán)利要求1所述IL2與抗GD2單鏈抗體融合蛋白的編碼基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO3中的核苷酸序列。
3.按照權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于通過PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行雙特異性抗體的編碼基因制備；具體過程①以人的經(jīng)過突變改變其稀有密碼子的IL-2基因?yàn)槟０澹ㄟ^PCR進(jìn)行擴(kuò)增，引物引入連接肽序列；②以鼠源性抗GD2單鏈抗體基因?yàn)槟０?，利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，引物引入連接肽序列his tag序列；③第三輪PCR反應(yīng)是利用重疊PCR技術(shù)，將兩種單鏈抗體基因連接形成融合基因；連接肽基因序列編碼氨基酸序列為Gly4Ser。
4.一種權(quán)利要求1所述IL2與抗GD2單鏈抗體融合蛋白的應(yīng)用，其特征在于該融合蛋白可用于制備特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制藥，具體的說是一種新型的IL2－抗GD2單鏈抗體融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)和應(yīng)用；選擇經(jīng)過突變改變其稀有密碼子的IL－2，與黑色素瘤單鏈抗體連接，形成有抗腫瘤作用的融合蛋白具有序列表SEQ ID No4中氨基酸序列；該融合蛋白可激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)，特異性殺傷黑色素瘤、成細(xì)胞纖維瘤、小細(xì)胞肺癌等腫瘤細(xì)胞，有效防止了人體反復(fù)應(yīng)用IL－2產(chǎn)生的多種副作用，融合蛋白較IL－2單獨(dú)應(yīng)用的生物學(xué)活性更佳，其殺傷腫瘤細(xì)胞的效果更好，副作用也小。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1721533SQ200410020979
公開日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2004年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者吳文芳, 倪劍鋒, 楊立泉, 呂安國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所