專利名稱：一種現(xiàn)場(chǎng)快速定性鑒定赤潮微藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速定性檢測(cè)赤潮微藻的方法，具體說(shuō)是全細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù)(Whole-cell Fluorescence in Situ Hybridization)在防治赤潮方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
FISH技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)(主要是分子雜交技術(shù))相結(jié)合的產(chǎn)物，主要是選擇一個(gè)已知序列中特異的DNA片段，用熒光標(biāo)記后作為FISH的探針與中期細(xì)胞的染色體或細(xì)胞核的DNA雜交(結(jié)合)，在染色體上顯示與熒光探針同源的DNA片段的位置，從而將這個(gè)已知序列的DNA片段定位在細(xì)胞中。FISH技術(shù)不僅準(zhǔn)確、快速、靈敏，而且簡(jiǎn)單方便，目前已經(jīng)在細(xì)胞遺傳學(xué)、產(chǎn)前診斷及腫瘤生物學(xué)上廣泛應(yīng)用。
目前赤潮生物的分類與識(shí)別方法主要有三方面(1)根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)及其生活史。但是，這些產(chǎn)生赤潮的微型生物的形態(tài)有時(shí)很難區(qū)分，有些形態(tài)的細(xì)微差別是由于環(huán)境條件的不同而產(chǎn)生的，以這些形態(tài)上的差別作為分類的標(biāo)準(zhǔn)會(huì)造成赤潮生物分類上的混亂；同時(shí)，以形態(tài)上的差異作為分類的依據(jù)不同的分類學(xué)家有不同的標(biāo)準(zhǔn)，帶有一定的主觀性。(2)采用分子生物學(xué)技術(shù)。如序列測(cè)定、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性RFLP(Restricted Fragment Length Polymorphism)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)等。應(yīng)用這些方法均可以有效地鑒定某株藻并通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹確定該株藻的分類位置。但上述分子生物學(xué)方法都有著無(wú)法避免的缺點(diǎn)，如操作時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)樣品少以及不能定性檢測(cè)自然水體樣品等。同時(shí)應(yīng)用分子生物學(xué)方法鑒定赤潮藻的前提條件是赤潮藻必須經(jīng)過(guò)分離純化以及實(shí)驗(yàn)室單種培養(yǎng)。有些赤潮藻難以分離，實(shí)驗(yàn)室單種培養(yǎng)更為困難，這些因素?zé)o疑限制了用分子生物學(xué)方法鑒別赤潮藻。(3)將在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛使用的免疫熒光技術(shù)應(yīng)用到赤潮藻分類上。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)首先要制備合適的抗體(單抗或多抗)，如果制備的抗體合適，則免疫熒光技術(shù)表現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)不僅靈敏、簡(jiǎn)單，而且可以對(duì)水體中同種赤潮藻細(xì)胞進(jìn)行定量，比赤潮藻的分子生物學(xué)鑒定更為優(yōu)越。然而，赤潮藻抗體的獲得基于藻細(xì)胞的外部形態(tài)特征，藻細(xì)胞的外部形態(tài)又極易受環(huán)境的影響，因而其準(zhǔn)確性受到懷疑。同時(shí)，在自然水體中某些微生物往往會(huì)和赤潮藻的抗體發(fā)生非特異性免疫交叉反應(yīng)，在進(jìn)行自然水體赤潮藻細(xì)胞定量分析時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重偏差。因此，用免疫熒光方法對(duì)自然水體中的赤潮藻細(xì)胞進(jìn)行定性和定量分析時(shí)，可信度并不高。
以上赤潮藻鑒定方法具有局限性和對(duì)赤潮藻鑒定的不準(zhǔn)確性，到目前為止，在國(guó)內(nèi)還未檢索到赤潮藻快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的報(bào)道。
赤潮(red tide)是泛指海洋浮游生物(主要是甲藻類)過(guò)度繁殖造成海水變色(一般為紅色)的現(xiàn)象。自20世紀(jì)70年代之后，有關(guān)赤潮的報(bào)道越來(lái)越多。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，1972～1998年我國(guó)(香港地區(qū)和臺(tái)灣省未統(tǒng)計(jì)在內(nèi))有記載的赤潮達(dá)360次(文獻(xiàn)1.齊雨藻鄒景忠，梁松等著，中國(guó)沿海赤潮[M].北京科學(xué)出版社，2003.302-303)。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國(guó)的赤潮發(fā)生頻率明顯增加，發(fā)生規(guī)模及危害程度也日益加劇。赤潮的頻繁爆發(fā)不僅危害海洋生態(tài)環(huán)境，給海洋漁業(yè)、海水養(yǎng)殖業(yè)和濱海旅游業(yè)等造成一定的危害，而且也給人類健康和生命安全帶來(lái)威脅(文獻(xiàn)2.彭昆侖，李錦蓉.一次發(fā)生在深圳赤灣赤潮的初步報(bào)告.[J]暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(赤潮研究?？?，1989，86-89；文獻(xiàn)3.齊雨藻，洪英，呂頌輝等.中國(guó)赤潮生物新記錄種—海洋褐胞藻.[J]暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)報(bào))1991，12(3)92-95；文獻(xiàn)4.HoKC，Hodgkiss IJ.severe fishkills in Hong Kongcaused by noctiluca scintillans blooms.[J]Red Tide Newsletter.1992，512；文獻(xiàn)5.Wang DF.red tides in Hong Kongproblems and management.strategy with special reference to the mariculture industry.[J]J ShorelineManagement.1987，32-21；文獻(xiàn)6.Sournia A，red tide and marinephytoplankton of the world oceanan inquiry into biodiversity.Lassus P，Arzul G，Denn E et al.(eds)Harmful Marine Algal Blooms.London，NewYork，ParisTechnique & Documentation-Lavoisier/Andover，England UKIntercept Ltd，1995.103-112)。赤潮已成為全球性的主要海洋災(zāi)害之一。Sournia做了一個(gè)統(tǒng)計(jì)(文獻(xiàn)6.Sournia A，red tide and marine phytoplanktonof the world oceanan inquiry into biodiversity.Lassus P，Arzul G，Denn Eet al.(eds)Harmful Marine Algal Blooms.London，New York，ParisTechnique & Documentation-Lavoisier/Andover，England UKIntercept Ltd，1995.103-112)，認(rèn)為海洋種有3365～4025種浮游藻類，其中赤潮種約占6％，為184～267種，有毒種約占2％，為60～78種。由于某些赤潮藻形態(tài)高度多樣化，有毒赤潮的種類也在增加，如以前從未在中國(guó)出現(xiàn)過(guò)的鏈狀裸甲藻、異彎藻、海洋褐胞藻等都是新赤潮種出現(xiàn)的例證(文獻(xiàn)7.郭玉潔.大連灣赤潮生物—赤潮異彎藻[J]海洋與湖沼，1994，25(2)211-215；文獻(xiàn)8.齊雨藻，洪英，呂頌輝等.南海大鵬灣海洋褐胞藻赤潮及其成因[J]海洋與湖沼，1994，25(2)132-137)，因此單憑傳統(tǒng)的以形態(tài)鑒定為主的分類學(xué)已顯得力不從心。
分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展為赤潮藻的鑒定提供了新思路。目前運(yùn)用分子生物學(xué)的方法主要有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、限制性片段產(chǎn)度多態(tài)性(RFLP)、測(cè)定序列，如研究核糖體大小亞基或其轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)間隔區(qū)(ITS)rDNA序列等，在鑒定赤潮微藻方面已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展(文獻(xiàn)9.Scholin C A.，Anderson D M.Identification of species and strain-specificgenetic markers for globally distributed Alexandrium(Dinophyceae).I.RFLPanalysis of SSU rRNA genes.[J]J.Phycol，1994，30744-754；文獻(xiàn)10.Scholin C A.，Herzog M.，Sogin ML.，et al.Identification of group and strain-specific genetic markers for globally distributed Alexandrium(Dinophyceae).II.Sequence analysis of a fragment of the LSU rRNA gene.[J]J.Phycol，1994，30999-1011；文獻(xiàn)11.Adachi M.，Sako Y.and Ishida Y.Restriction fragmentlength polymorphism of ribolsomal DNA internal transcribed spacer and 5.8Sregions in Japanese Alexandrium species(Dinophyceae).[J]J.Phycol，1994，30857-863；文獻(xiàn)12.莊麗，陳月琴，李欽亮等.赤潮叉角藻18SrDNA和ITS區(qū)序列測(cè)定與分析.[J]海洋與湖沼，2001，32(2)148-153)。但這些方法均不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)自然水體樣品。因?yàn)閼?yīng)用上述方法的前提條件是赤潮藻必須經(jīng)過(guò)分離純化及實(shí)驗(yàn)室單種培養(yǎng)。因此要達(dá)到早期預(yù)報(bào)的目標(biāo)還有很大的距離。如何找到一種準(zhǔn)確、快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)自然水體樣品的方法已成為研究赤潮的重要方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單的應(yīng)用全細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù)現(xiàn)場(chǎng)快速定性鑒定赤潮微藻的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為應(yīng)用全細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù)鑒定赤潮微藻的步驟包括從赤潮藻目的序列中尋找高度特異的DNA序列作為探針—制備探針—固定赤潮藻細(xì)胞—雜交—熒光顯微鏡檢測(cè)1.探針的確定比較多種浮游植物的核糖體大小亞基基因18S/28S rDNA(18S/28Sribosomal RNA gene)和二者之間的轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)間隔區(qū)ITS(InternalTranscribed Spacer)序列表明，rDNA序列是由相互間隔的保守區(qū)和多變區(qū)構(gòu)成。保守區(qū)rDNA序列較為相似，反映了生物在進(jìn)化上的同源性。不同海洋浮游植物的rDNA多變區(qū)序列以及ITS序列存在較大差異，因此這些區(qū)域不僅是鑒定這些生物的良好遺傳標(biāo)記，而且是尋找特異性分子標(biāo)記的良好區(qū)域；目前，用rDNA和ITS區(qū)作為分子指標(biāo)在研究赤潮甲藻系統(tǒng)發(fā)育方面已取得了較好的結(jié)果。因此本發(fā)明采用赤潮藻核糖體大亞基DNA序列和核糖體大小亞基之間的轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)ITS作為目的序列，或以ITS序列設(shè)計(jì)探針，或在這些目的片段中尋找高度特異的DNA序列作為探針。
2.探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記主要有4種方法，即隨機(jī)引物法、缺口平移法、PCR擴(kuò)增法和末端標(biāo)記法。
3.赤潮藻細(xì)胞的固定本發(fā)明涉及固定細(xì)胞的方法包括2方面；一是細(xì)胞的固定；用該法固定的細(xì)胞不僅不變形而且保存時(shí)間長(zhǎng)，在室溫下可保存6周；在4℃可長(zhǎng)達(dá)15周再用于雜交時(shí)效果也很好；二是將細(xì)胞固定在載玻片上。普通的載玻片經(jīng)處理后，滴加上固定后的藻細(xì)胞，30-45℃干燥20min即可。
4.雜交將含有探針的雜交液加到有固定細(xì)胞的載玻片上，在一定溫度下進(jìn)行雜交反應(yīng)(將該片置于鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子，漂浮于一定溫度的恒溫水浴中過(guò)夜；沖洗后滴加抗體，37℃溫育1h)；5.熒光顯微鏡觀察封片，用熒光顯微鏡觀察或保存于4℃。
所述雜交前固定的赤潮藻細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行DNA變性，即加變性液于干燥后的載玻片上，80℃1.5min后迅速放在-20℃的一系列濃度的酒精中脫水；系列酒精的體積濃度分別為50-70％，70-90％，90-100％。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明是將FISH技術(shù)改良后應(yīng)用到赤潮生物檢測(cè)上，改良的FISH技術(shù)在定性檢測(cè)赤潮微藻方面顯示了無(wú)可比擬的優(yōu)越性；本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，且準(zhǔn)確性也較高；細(xì)胞固定后不變形，這對(duì)于檢測(cè)自然水體樣品打下良好的基礎(chǔ)。
2.本發(fā)明鑒定赤潮微藻的方法—全細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù)不僅具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單的的優(yōu)點(diǎn)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程所需時(shí)間小于20小時(shí)，而且操作簡(jiǎn)單；更重要的是該法能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，即可以在自然水體中進(jìn)行藻細(xì)胞的定性分析，這是目前其它鑒定赤潮微藻的方法所不能達(dá)到的。因此該發(fā)明將會(huì)在海洋微藻鑒定方面顯示良好的應(yīng)用前景。


圖1為東海原甲藻在熒光顯微鏡下的觀察圖片(Abs/Em＝492/519nm；20X10)；圖2為第二次實(shí)驗(yàn)東海原甲藻在熒光顯微鏡下的觀察圖片(40x10)；圖3為東海原甲藻細(xì)胞按一定的比例稀釋后雜交的結(jié)果觀察圖片(40x10)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明采用赤潮藻核糖體大亞基DNA序列和核糖體大小亞基之間的轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)ITS(Internal Transcribed Spacer)作為目的序列，在此目的片段中尋找高度特異的DNA序列作為探針。應(yīng)用該技術(shù)對(duì)自然水體赤潮藻進(jìn)行定性分析的關(guān)鍵是要在藻細(xì)胞基因組中找到合適的DNA片段作為探針。這個(gè)DNA片段必須高度變異，也就是說(shuō)，不同種之間甚至同種不同地理株之間的序列表現(xiàn)不同。ITS序列因高度變異，可以考慮作為FISH探針。其它的DNA序列，如28S rDNA中的D1和D2區(qū)域也高度變異(分析亞歷山大藻核糖體大亞基的結(jié)構(gòu)已證實(shí))，也可以作為FISH探針。因此，篩選合適的DNA片段作為探針是FISH技術(shù)成功的前提。
實(shí)施例1以東海原甲藻為例具體實(shí)驗(yàn)步驟如下
東海原甲藻是在我國(guó)東海新出現(xiàn)的赤潮物種，也是引發(fā)東海赤潮的主要物種。該物種經(jīng)單種分離培養(yǎng)后，提取該種藻細(xì)胞的總DNA。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到含5.8S rDNA的ITS序列。該序列在國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中比對(duì)后，證實(shí)該ITS序列為該藻所特有。因此在該區(qū)域構(gòu)建探針。東海原甲藻ITS序列如下gcacgcatcc atttgattca ttgtgaataa cagttggtga ggatctgggt ggggatgaag60atagcatcga tgcccccatg cggatactcg agggcagcaa gccaggctca gaccgtcttc120tgggcttgtc cttgctgcca gtgtctgttt gatattctgt atgttccaat ttgttctgag180tggtcttcca ctctttatct tcttacaact ttcagcgacg gatgtctcgg ctcgaacaac240aatgaagggc gcagcgaagt gtgataagca ttgtgaattg cagaattccg tgaaccaata300gggacttgaa cgtatactgc gctttcggga tatccctgaa agcatgcctg cttcagtgtc360tattcttatt attccagcat ctgacttgtt cggaatgctt gtgtgtgttt gtgtgccagg420gcgcctctac ggcctctggc gcattcagtg cacagggtct tcccgcgcaa acaactagaa480gagtatctct gatgctatct gttgtcttgt tgtcgggctg ggccttgttg tctagtgcat540atcgcactta ta552(1)SEQ ID No1的信息(參見序列表)source1..552/organism＝″Prorocentrum donghaiense″/mol_type＝″genomic DNA″/note＝″authorityProrocentrum donghaiense Lu″misc_RNA1..203/product＝″internal transcribed spacer 1″rRNA204..362/product＝″5.8S ribosomal RNA″misc_RNA363..552/product＝″internal transcribed spacer 2″(A)序列特征*長(zhǎng)度552個(gè)堿基*類型核酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA (c)假設(shè)否 (d)反義否(e)最初來(lái)源東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)ITS(Internal Transcribed Spacer)即核糖體轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)的非間隔區(qū)。真核生物的rDNA成簇排列在一起，由16-18SrDNA，5.8SrDNA和26-28SrDNA組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，彼此被轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)間隔區(qū)ITS(Internal TranscribedSequences)分開，目前.rDNA及ITS區(qū)被廣泛用作研究系統(tǒng)發(fā)育、進(jìn)化及分類鑒定的分子指標(biāo)，在動(dòng)物(Gonzalez et al.，1990)、被子植物(Baldwin，1992)、真菌(Morales et al.，1993)和綠藻(Bakker et al.，1992)等均已獲得理想的結(jié)果。ITS區(qū)因進(jìn)化速率較核糖體大小亞基及5.8S rDNA快，因此在不同物種之間，甚至同種不同地理株之間差別較大，因此，該區(qū)域的序列不僅可以作為相對(duì)接近生物種類的分析的指標(biāo)，而且是尋找特異性分子標(biāo)記(如設(shè)計(jì)探針)的良好區(qū)域。
1.離心收集藻細(xì)胞，加固定液MSE22mL 95％的乙醇，5mL無(wú)菌水和3mL 25×SET(3.75M NaCl；25mM EDTA；0.5M Tris-cl，pH 7.8)固定1-2h，離心再用5×SET懸浮，離心后重懸于1×PBS(100mM NaCl；10mMNa2HPO4；10mM NaH2PO4；1mM EDTA，pH7.0)中；2.取一定體積的重懸液(視固定細(xì)胞的濃度而定，若細(xì)胞濃度大，則加200μl左右，若細(xì)胞濃度低，則加500μl左右)滴加于處理過(guò)的載玻片上(載玻片事先用多聚賴氨酸處理過(guò))，45℃干燥20min。
3.變性玻片上滴加70％DF(去離子甲酰胺)，2×SSC，80℃1.5min后立即放到-20℃的一系列不同濃度的酒精中脫水(50％；75％；95％)；4.探針的制備(隨機(jī)引物法)參照試劑盒(Roche DIG High PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit)說(shuō)明；即取10ng-3μg純化的東海原甲藻ITS DNA，補(bǔ)加高壓蒸汽滅菌的雙蒸水到16μl；將裝有此混合物的eppendorf管在沸水浴中煮10分鐘后，迅速放到冰水中，然后加入試劑盒中1號(hào)管藥品4μl，混勻后37℃溫育1h或過(guò)夜；5.雜交液50％DF；10％DS；2×SSC；10ng Probe；10μg salmon spermDNA，80℃10min.然后保存與4℃，在使用前于37℃溫育1hour；6.約200μl雜交液加到載玻片上，將該片置于鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子，漂浮于42℃的恒溫水浴中過(guò)夜；7.該載玻片先用預(yù)熱到該雜交溫度的2×SSC沖洗5min，再在室溫下用2×SSC沖洗10min；8.滴加30μl抗Dig的抗體，抗體上標(biāo)記的熒光素是FITC，37℃溫育1h；9.室溫干燥后用含2.5％的KI的甘油PBS緩沖液(1∶1)封片，用熒光顯微鏡觀察或保存于4℃。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果本過(guò)程以東海原甲藻為材料，以其ITS序列為目標(biāo)片段設(shè)計(jì)探針(通過(guò)隨機(jī)引物法合成并標(biāo)記)；依上述步驟共進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照是一株赤潮甲藻-塔馬亞歷山大藻。該藻經(jīng)上述步驟處理后在熒光顯微鏡下并未觀察到熒光，故無(wú)法附加圖片。東海原甲藻在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果如下從圖1可以看出，圖中顯示綠色熒光的是探針與目的片段雜交的結(jié)果(Abs/Em＝492/519nm；20X10)；有的藻細(xì)胞顯示有綠色的熒光，這標(biāo)明探針與目的片段結(jié)合。未顯示有綠色熒光的表明無(wú)探針結(jié)合到目的片段上。
圖2是第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。大部分藻細(xì)胞的前端顯示有熒光分子，標(biāo)明此次大部分細(xì)胞的目的片段與探針結(jié)合。
圖3是藻細(xì)胞按一定的比例稀釋后雜交的結(jié)果。此結(jié)果表明即使細(xì)胞的濃度很低，只要探針準(zhǔn)確且特異性高，同樣可以檢測(cè)出水體中低濃度的樣品。
結(jié)論陰性對(duì)照塔馬亞歷山大藻在熒光顯微鏡下未觀察到熒光，而目的藻東海原甲藻在熒光顯微鏡下能觀察到FITC發(fā)出的綠色熒光。這說(shuō)明該探針是(高度)特異性的。上述固定方法的優(yōu)點(diǎn)為檢測(cè)自然水體的樣品打下基礎(chǔ)。只要探針設(shè)計(jì)準(zhǔn)確，應(yīng)用上述步驟能準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)自然水體中地目的赤潮藻。
實(shí)施例2與實(shí)施例不同之處在于，所選取的赤潮藻物種為海洋原甲藻(Prorocentrum micans Ehrenberg)，它是我國(guó)南海北部近岸水域常見種和誘發(fā)赤潮的主要種類。該物種經(jīng)單種分離培養(yǎng)后，提取該種藻細(xì)胞的總DNA。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到含5.8S rDNA的ITS序列。該序列在國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中比對(duì)后，證實(shí)該ITS序列為該所特有，因此可在該區(qū)域構(gòu)建探針；其ITS序列如下ttaccacacc taaagtctac cggcctcggg ctagtagcaa aaaacgaaag gagagactgg 60gtaaaaccgg tctcgaattt tgtgtcccgc ggacctataa ttttaatggc gtctctcgag 120atgcccaaag ctgatacccc gtctttgttg ggcgctgcat ggcgttccaa caggatactg 180aaccatgagt aatcataatt cggcgtcgtg cacttcggtg tcggtatcgg ttacgaaaca 240atgtcaaaac actttcagca atggatgtct cggctcccac atcgatgaag aacgcagtga 300aatgcgatac gtaatgcgaa ttgcaaaatc agcgagtcat caaaactttg aacgcaactt 360gcacttcctt cggggagtat gtctgttgga gtgtctgttc atccccacca tcccccactc 420cccctaaaca agggagctgg tgcaggatgc agtccaccgc tttcctggta aagcgagtgc 480agatgaaaaa actaatctta taatcgttcc tactcggtgt aatgccggaa ggacgcgaga 540tgatatcatt tacgcgtccc gatagcaata catacaaagc cggatgggcc ctcgattatt 600ctcaattagg acctccaatc agtcaagaat a 631SEQ ID No2的信息(參見序列表)source1..631/organism＝″Prorocentrum micans″/mol_type＝″genomic DNA″misc RNA 1..245/product＝″internal transcribed spacer 1″rRNA 246..410/product＝″5.8S ribosomal RNA″misc RNA411..631/product＝″internal transcribed spacer 2″(A)序列特征
*長(zhǎng)度631個(gè)堿基*類型核酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA (c)假設(shè)否 (d)反義否(e)最初來(lái)源海洋原甲藻(Prorocentrum micans Ehrenberg)實(shí)施例3與實(shí)施例不同之處在于，所選取的赤潮藻物種為東海中肋骨條藻[Skeletonema costatum(Greville)Cleve]它是在我國(guó)東海海域新出現(xiàn)的赤潮種。該物種經(jīng)單種分離培養(yǎng)后，提取該種藻細(xì)胞的總DNA。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到含5.8S rDNA的ITS序列。該序列在國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中比對(duì)后，證實(shí)該ITS序列為該株藻所特有，因此可在該區(qū)域構(gòu)建探針；其ITS序列如下tagtcttact tgatttgagg ttaaattatg ctttcaactc actgcatcag tacattgtgt60gacacagttc agcgcagaca tgcgttcgtt gctcagacac ttccctatat ataaagtatt120gatagacaca gagaggcaca cattgctgca taccatcatc atagaatcct acttgtatat180ataaatgtgg atgcgttgtc gcaatcaaac atctacatag ctttaaagca actatcgtgt240aaggatagat gctcacactc ctcccaacct cactcttccg cgaagaagaa tggatgagag300agttttgtta accaacactc aaacaagcat gctcacagtt tcctgcaagc gctatgtgcg360ttcaaagatt cgatgattca ctgagttctg caattcacat tacgtatcgc attttgctgc420gttcttcatc gttacaggag cctagatatc cgttgctaac agttgttttt ctattacgtt480tatctcttga accatttgga ggtcaaccac aagggcctct ctcacaaatt ttcaatcgat540gaaatcatta gtatgtatga attcaataga cattgggtgt taaaaagtgt aaagacttta600acagttcaca caaggtgtta tgccaatgcc actctccaat gctacttctc tccgaaaaga660gttgacagca acactcgaga agtgacagtg acaaaaggtt ggattatagt gttaa 715SEQ ID No3的信息(參見序列表)source 1..715/organism＝″Skeletonema costatum″/mol_type＝″genomic DNA″misc_RNAcomplement(＜1..＞715)/note＝″contains internal transcribed spacer 1 and 5.8Sribosomal RNA″(A)序列特征*長(zhǎng)度715個(gè)堿基*類型核酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA (c)假設(shè)否 (d)反義否(e)最初來(lái)源東海中肋骨條藻[Skeletonema costatum(Greville)Cleve]
鑒定赤潮微藻SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院海洋研究所<120>一種現(xiàn)場(chǎng)快速定性鑒定赤潮微藻的方法<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>552<212>DNA<213>東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)..(203)<223>
<220>
<221>rRNA<222>(204)..(362)<223>
<220>
<221>misc_RNA<222>(363)..(552)<223>
<400>1gcacgcatcc atttgattca ttgtgaataa cagttggtga ggatctgggt ggggatgaag60atagcatcga tgcccccatg cggatactcg agggcagcaa gccaggctca gaccgtcttc120tgggcttgtc cttgctgcca gtgtctgttt gatattctgt atgttccaat ttgttctgag180tggtcttcca ctctttatct tcttacaact ttcagcgacg gatgtctcgg ctcgaacaac240aatgaagggc gcagcgaagt gtgataagca ttgtgaattg cagaattccg tgaaccaata300
鑒定赤潮微藻gggacttgaa cgtatactgc gctttcggga tatccctgaa agcatgcctg cttcagtgtc360tattcttatt attccagcat ctgacttgtt cggaatgctt gtgtgtgttt gtgtgccagg420gcgcctctac ggcctctggc gcattcagtg cacagggtct tcccgcgcaa acaactagaa480gagtatctct gatgctatct gttgtcttgt tgtcgggctg ggccttgttg tctagtgcat540atcgcactta ta552<210>2<211>631<212>DNA<213>海洋原甲藻(Prorocentrum micans)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)..(245)<223>
<220>
<221>rRNA<222>(246)..(410)<223>
<220>
<221>misc_RNA<222>(411)..(631)<223>
<400>2ttaccacacc taaagtctac cggcctcggg ctagtagcaa aaaacgaaag gagagactgg60gtaaaaccgg tctcgaattt tgtgtcccgc ggacctataa ttttaatggc gtctctcgag120atgcccaaag ctgatacccc gtctttgttg ggcgctgcat ggcgttccaa caggatactg180aaccatgagt aatcataatt cggcgtcgtg cacttcggtg tcggtatcgg ttacgaaaca240atgtcaaaac actttcagca atggatgtct cggctcccac atcgatgaag aacgcagtga300aatgcgatac gtaatgcgaa ttgcaaaatc agcgagtcat caaaactttg aacgcaactt360gcacttcctt cggggagtat gtctgttgga gtgtctgttc atccccacca tcccccactc420cccctaaaca agggagctgg tgcaggatgc agtccaccgc tttcctggta aagcgagtgc480agatgaaaaa actaatctta taatcgttcc tactcggtgt aatgccggaa ggacgcgaga540tgatatcatt tacgcgtccc gatagcaata catacaaagc cggatgggcc ctcgattatt600ctcaattagg acctccaatc agtcaagaat a 631
鑒定赤潮微藻<210>3<211>715<212>DNA<213>東海中肋骨條藻(Skeletonema costatum)<220>
<221>misc_RNA<222>(1)..(715)<223>
<400>3tagtcttact tgatttgagg ttaaattatg ctttcaactc actgcatcag tacattgtgt60gacacagttc agcgcagaca tgcgttcgtt gctcagacac ttccctatat ataaagtatt120gatagacaca gagaggcaca cattgctgca taccatcatc atagaatcct acttgtatat180ataaatgtgg atgcgttgtc gcaatcaaac atctacatag ctttaaagca actatcgtgt240aaggatagat gctcacactc ctcccaacct cactcttccg cgaagaagaa tggatgagag300agttttgtta accaacactc aaacaagcat gctcacagtt tcctgcaagc gctatgtgcg360ttcaaagatt cgatgattca ctgagttctg caattcacat tacgtatcgc attttgctgc420gttcttcatc gttacaggag cctagatatc cgttgctaac agttgttttt ctattacgtt480tatctcttga accatttgga ggtcaaccac aagggcctct ctcacaaatt ttcaatcgat540gaaatcatta gtatgtatga attcaataga cattgggtgt taaaaagtgt aaagacttta600acagttcaca caaggtgtta tgccaatgcc actctccaat gctacttctc tccgaaaaga660gttgacagca acactcgaga agtgacagtg acaaaaggtt ggattatagt gttaa 71權(quán)利要求
1.一種現(xiàn)場(chǎng)快速定性鑒定赤潮微藻的方法，其特征在于1)探針的確定從已知的赤潮藻目的序列中尋找高度特異的DNA序列作為探針；采用赤潮藻核糖體大亞基rDNA序列和核糖體大小亞基之間的轉(zhuǎn)錄單元間隔區(qū)ITS作為目的序列，或以ITS序列設(shè)計(jì)探針，或在這些目的片段中尋找高度特異的DNA序列作為探針；2)探針的標(biāo)記按常規(guī)方法對(duì)所選探針進(jìn)行標(biāo)記；3)固定赤潮藻細(xì)胞并裂解離心收集藻細(xì)胞，加固定液MSE固定，將用固定液固定后的赤潮藻細(xì)胞固定在載玻片上干燥；4)雜交將含有探針的雜交液加到有固定細(xì)胞的載玻片上，進(jìn)行雜交反應(yīng)；5)沖洗、滴加抗體、干燥后封片，熒光顯微鏡檢測(cè)。
2.按照權(quán)利要求1所述的鑒定赤潮微藻的方法，其特征在于所述探針的標(biāo)記可采用隨機(jī)引物法、缺口平移法、PCR擴(kuò)增法或末端標(biāo)記法。
3.按照權(quán)利要求1所述的鑒定赤潮微藻的方法，其特征在于所述加固定液MSE固定藻細(xì)胞后，離心再用SET懸浮，離心后重懸于PBS中。
4.按照權(quán)利要求1所述的鑒定赤潮微藻的方法，其特征在于所述雜交前固定的赤潮藻細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行DNA變性，即加變性液于干燥后的載玻片上，80℃1.5min后迅速放在-20℃的一系列濃度的酒精中脫水。
5.按照權(quán)利要求4所述的鑒定赤潮微藻的方法，其特征在于所述一系列酒精的體積濃度分別為50-70％，70-90％，90-100％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速定性檢測(cè)赤潮微藻的方法，具體說(shuō)是全細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù)在防治赤潮方面的應(yīng)用。具體過(guò)程為1)從已知的赤潮藻目的序列中尋找高度特異的DNA序列作為探針；2)對(duì)所選探針標(biāo)記；3)固定赤潮藻細(xì)胞離心收集藻細(xì)胞，加固定液MSE固定，將藻細(xì)胞固定在載玻片上干燥；4)將含有探針的雜交液加到載玻片上進(jìn)行雜交反應(yīng)；5)沖洗、滴加抗體、干燥后封片，熒光顯微鏡檢測(cè)。本發(fā)明是將FISH技術(shù)改良后應(yīng)用到赤潮生物檢測(cè)上，其在定性檢測(cè)赤潮微藻方面有無(wú)可比擬的優(yōu)越性；簡(jiǎn)單易行，且準(zhǔn)確性也較高；細(xì)胞固定后不變形，這對(duì)檢測(cè)自然水體樣品打下良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1710097SQ200410020770
公開日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2004年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月16日
發(fā)明者王廣策, 張寶玉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所