專利名稱：一種單鏈片段抗體-多肽融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
-^單鏈片^:#多^!^白;^其應(yīng)用絲領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物和醫(yī)藥4支術(shù)領(lǐng)域，M涉及一種單鏈片段抗l多l(xiāng)il蟲合蛋白及其 應(yīng)用。 背景牀Her2是乳腺癌惡化的標(biāo)志。近年研究發(fā)現(xiàn)，約25-30%的乳腺癌病人的癌組織細(xì)胞 表達(dá)一種4^細(xì)胞生長因子受體2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2， Her2 )， Her2蛋白是乳腺癌惡化的^^才射己。目前通過阻斷Her2受體來治療乳腺癌的途徑主要有抗Her2單克隆抗體、酪氨齢敫 酶抑制劑和傳統(tǒng)的反義基因方法等。其中，抗Her2單克隆抗體，如^^^Herceptin,通 過阻斷受體蛋白起作用，但由于乳腺癌細(xì)月&Her2受體是在基因水平過量表達(dá)，而新的 Her2蛋白仍在源源不斷iik^成并輸ii^細(xì)月^！, 4卜充喪失的受體。而且鑒于心臟毒性 和過壽t^， ^N元的用量不可能無限制;^口大。另一方面，Hercq)tin只作用于Her2if爭(zhēng) 膜蛋白的細(xì)月&陶分，其胞內(nèi)部分的酪^t^J敫i^乃可被鄰^^被阻斷的M生長因子 受體激活來傳導(dǎo)增殖信號(hào)。與酪#^1酶抑制劑^^主只針對(duì) 網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的某一環(huán)節(jié)， 而Her24言號(hào)i^可以通過旁i^途徑傳導(dǎo)。it"卜，酪氨敏敫酶抑制劑不能直才婦中制過量表 達(dá)的Her2基因，更不能徹^i也阻斷Her2蛋白的合成。更重要的是，酪氨酸敫酶也是正 常細(xì)胞所必需，佳月勘卬制劑干擾了很多正常組織細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，引起多種毒 副作用。傳統(tǒng)的反U因方法包4甜爭(zhēng)異性的反XS核苷酸和核糖酶(ribozyme)均曾 用于抑制乳腺癌細(xì)月&Her2基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究。但是由于這些傳統(tǒng)的^JC^因方法抑 制基因表達(dá)的歲i^較弱，因此不能滿足臨床應(yīng)用的需求。Andrew Z. Fire和Craig C. Mello兩位科學(xué)家于1998年報(bào)tt現(xiàn)了核糖核酸干擾(Ribonucleic Acid Interference, RNAi)現(xiàn)象，并于2006年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。2001年， Tuchl等把長度約為19-234tt對(duì)、人工合成的外源性(Small Interfering RNA, siRNA)導(dǎo) 入哺享L動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，能誘導(dǎo)出特異i似中制互補(bǔ)序列基因表達(dá)的RNAi歲紐。與傳統(tǒng)的抑 制基因表itX具^XS核苷酸和核糖酶tb4支，siRNA沉fl^因表達(dá)的效應(yīng)^^雖大數(shù)十 倍至數(shù)百倍，期中制疾病基因治療疾病的潛力"fc^大于傳統(tǒng)的itt因工具。目前， RNAi應(yīng)用的主要障礙在于如何在臨床應(yīng)用時(shí)^4爭(zhēng)異的RNAi導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)月&l包漿內(nèi)起作 用，特別是導(dǎo)入過量表達(dá)目標(biāo)基因的肺瘤細(xì)胞內(nèi)。針對(duì)腫瘤的把向治療要求^4元癌藥物il基因物質(zhì)高效特異:^lr送到癌細(xì)胞內(nèi)，需 ^^以下;i^^^f牛①胂瘤細(xì)月&4面表達(dá)特異性的^V受體，il些受體只在癌細(xì) 胞大量表達(dá)，而^jE常組織細(xì)JI^^^表絲表達(dá)極少；②受體與相應(yīng)的配M抗體結(jié)合后可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用^目應(yīng)的受體/抗體或受體/配基復(fù)^4勿導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)；③ 細(xì)月^^vl^4勿后，可以通過細(xì)胞內(nèi)的消化系統(tǒng)，如i^^等分離復(fù)^4勿，feS己M 抗體連4矣的藥物#^^胞漿中。Her2受^^合上述輩巴向?qū)氲那疤釛l件，因?yàn)樗淮罅勘磉_(dá)于癌細(xì)月包表面，在 正常組織細(xì)胞中表達(dá)甚少，這也A^細(xì)月^lr有惡'^4型的機(jī)制。另夕卜，Her2受粘 配絲抗體結(jié)合后，可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用循環(huán)到細(xì)胞內(nèi)。研究證明，Her2受體/抗 體復(fù)^4輛皮吞入細(xì)月^，復(fù)^^會(huì)凈紛離，如果復(fù)M同時(shí)結(jié)合了化療藥物tt因物 質(zhì)，這些物質(zhì)#^被吸收^#^文到胞漿中。因此，Her2抗體或配基攜帶的抗癌藥物 只攻擊Her2高表達(dá)的癌細(xì)胞，并飽偵利把藥物帶入細(xì)胞內(nèi)。單鏈抗體片段(ScFv),是指通祖因重組技術(shù)，人工表達(dá)保留了與^^、特異性 結(jié)合的免疫球蛋白Fab片段中的簡(jiǎn)^p分，由一段重鏈和一段l^y且成，兩鏈之間通 iiM多肽鉸Mi^l妄。ScFv既保留了^^識(shí)別和結(jié)合的特性，又去除了"fit抗體中免 ^f、性最強(qiáng)的Fc段，同時(shí)其襯小，可以與荷正電的多肽重M^融M白，便于攜 帶基因物質(zhì)。^f青蛋白是一種堿性蛋白，能與基因物質(zhì)結(jié)合。我們^^I的A^f青蛋白多肽一段 短肽，它保留了富4^^性# 的序列，同樣具有結(jié)合基因物質(zhì)的功能。如果能篩選并構(gòu)建出這樣一種物質(zhì)，即既能應(yīng)有于導(dǎo)向攜帶siRNA雙鏈分子， 又可特異I^4^^Her2陽性癌細(xì)胞，ii^減少細(xì)月汰面Her2 M，并可通過RNA 干護(hù)CA基因水平減少Her2mRNA表達(dá)，則可望徹^i也阻斷Her2的過量表達(dá)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問題，提供了一種單鏈片段抗I多AU^妙白，該蛋 白是一種具有結(jié)合Her2受體和攜帶抗癌siRNA藥物雙向功能的融合蛋白，可以作為 抗癌siRNA的藥物栽體。本發(fā)明通過以下方案實(shí)現(xiàn)該目的本發(fā)明的一種單鏈片革殳抗I多^U^^白，所述的單鏈片,殳抗體為Her2-ScFv， 所述的多肽為^t青蛋白片段多肽。該單鏈片段抗^多^Ui錯(cuò)白的序列是如SEQ ID NO.l所示的序列。本方明的一種單鏈片段抗體-多^l蟲合蛋白的基因序列的表ii^ 體包括pAcGP67B載體，其表ii^f^爭(zhēng)化的宿主細(xì)胞包括s 昆蟲細(xì)胞。本發(fā)明的一種單鏈片段抗體-多^1蟲*白作為抗癌siRNA的藥物栽體的應(yīng)用。本發(fā)明的方案*^如下1. 構(gòu)建具有結(jié)合Her2受體和攜帶siRNA藥物雙向功能的融合蛋白的質(zhì)粒；2. 構(gòu)建的pACgp67B-Her2-scf^protamine質(zhì)粒小量4^;3. 酶切鑒定Her2單鏈片段抗體與魚精蛋白多肽構(gòu)建的質(zhì)粒 pACgp67B-Her2陽sc^隱protamine;4. pACgp67B-Her2-scf^protamine質(zhì)粒大量4^;5. Her2隱sc^-protamine的觀'J序；6. 繪制質(zhì)粒圖；7 .Her2單鏈片段抗體與^^青蛋白多肽的融錯(cuò)白在sS昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與純化8. Her2單鏈片賴:抗體與^f青蛋白多肽的融M白的鑒定 9 .Her2單鏈片段抗體與^#蛋白多肽的融*白濃度測(cè)定 10.檢驗(yàn)Her2單鏈片段抗體與^f青蛋白多肽的融M白具有結(jié)合癌細(xì)月^面 Her2受體和^i宿D(zhuǎn)NA的雙向功能。 本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)1. 本發(fā)明構(gòu)建的Her2單鏈片段抗體與^f青多肽的融M白具有結(jié)合Her2受體和 攜帶抗癌siRNA藥物的雙向功能；魚精多肽帶正電荷，能與帶負(fù)電荷的DNA質(zhì)粒栽 體結(jié)合，并可i^i宿這些DNA襯，經(jīng)與癌細(xì)胞Her2受體介導(dǎo)敘細(xì)胞內(nèi)。在體外細(xì) 月^咅養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用Her2-ScFv與經(jīng)刪節(jié)的^T青蛋白片^ai蟲好白攜帶報(bào)告基因，能 大大提高報(bào)告基因在Her2陽性的乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。與同源的Her2陰性細(xì)胞比較， 報(bào)告基因表達(dá)肯汲高8到10倍。SiRNA與DNA都是攜帶大量負(fù)電荷的襯，也能 被荷正電的^l青多l(xiāng)i^i宿。2. 本發(fā)明篩選并構(gòu)建Her2-ScFv與^^青蛋白片段多肽的融妙白，應(yīng)用于導(dǎo)向攜 帶siRNA雙鏈襯，特異WW認(rèn)Her2陽性癌細(xì)胞。本發(fā)明構(gòu)建的Her2單鏈片段 抗體與^晴多肽的融M白成功^fe4元癌siRNA藥物定向?qū)肽繕?biāo)癌細(xì)胞中，開發(fā)了 非病毒載體工具，加速RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床。3. 該融合蛋白既可利用ScFviiLit減少細(xì)胞表面的Her2分子，也可通過RNA干 護(hù)C/人基因水平減少Her2 mRNA表式可望徹^i也阻斷Her2的過量表達(dá)。此融合蛋白 的成功開發(fā)為^1新型的抗癌基因藥物奠定堅(jiān)實(shí)的勤出，將為治療晚期乳腺癌提供有 效的武器。


圖1是pACgp67B-Her2-sc^-protamine用Bamffl和Xhol的Hi刀鑒定圖； 圖2是pACgp67B-Her2-scf^-protamine用Hindm的^^刀鑒定圖；圖3是Her2-scf^pratamine的測(cè)序圖譜與理論序列的t時(shí)圖； 圖4是pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine質(zhì)粒的簡(jiǎn)圖；圖5是Her2單鏈片段抗體與^T奮蛋白多肽的融錯(cuò)白經(jīng)過Weston blot進(jìn)行鑒定圖。圖6是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的^JL梯度和紫夕卜分ititl計(jì)的讀數(shù)平均^^^J的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖7是GFP siRNA與不同量的Her2單鏈片段抗體與^f青蛋白的多l(xiāng)^l蟲好白和L -蛋白珠行免疫共^i定結(jié)果圖；圖8是通it 文良Northern Blot 4&則細(xì)胞內(nèi)GFP siRNA的^J:結(jié)果圖；圖9是共聚焦顯微#^^^則siRNA經(jīng)Her2單鏈片段抗體與^T青蛋白多肽的融合蛋白導(dǎo)入細(xì)胞后的分布情況結(jié)果圖。絲實(shí)財(cái)式實(shí)施例1.構(gòu)建具有結(jié)合Her2受體和攜帶siRNA藥物雙向功能的融M白的質(zhì)粒。 M因坊中查到Her2單鏈片段抗體的4^f列后，用引物軟^H殳計(jì)相關(guān)引物。 設(shè)計(jì)的Her2-ScFv引物 正引物Ncol為內(nèi)切酶5,-GGGCCA^GGCCCAGGTGCAGCTGT^GCAGTCTGGGGCAGAG-3, 反引物Notl為內(nèi)切酵5，-TTGCGGCCGCTCCGGAATTCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC隱3， 設(shè)計(jì)的^f青多肽引物 正引物Notl為內(nèi)切酶5，-CCGGAGCGGCCGCAA^GGCCAGGTACAGA^GCTG隱3, 反引物PpuMI作為內(nèi)切酶，終止密碼子和6個(gè)組氨酸5，-GCCGGGTCCCAGGAAAGGArCAGATCTGCATTAATGGTGGTGGTGATGATGAGATCTGTGTCTTCTACATCTCGGTCTG-3 ，通過PCR克隆相關(guān)目的片^a:, Her2-ScFv的PCRAJl體系1: 50ul體系: ddH20 37ul dNTP 5ul 正引物 lul 反引物 lul 10 xPCR Buffer 5ul EasypfU lul ^f青多肽的PCR^jS體系2: 50ul體系 ddH20 37ul dNTP 5ul 正引物 lul 反引物 lul 10xPCRBuffer 5ul EasypfU lul PCR^循環(huán)預(yù)變性94 °C 5min 變性94°C30S 、 退火 48.5°C 30S 卜 30 Cycles 延伸72°C lmin > 絲延伸72°C 10min PCR產(chǎn)物酶切Her2 ScFv的PCR產(chǎn)物用Nco I和Not I內(nèi)切^^刀開 50ul體系Her2ScFv的PCR產(chǎn)物 20 ulddH20 20 ul Ncol 2ul Notl 2ul 10 x Buffer 5ul Her2 ScFv的PCR產(chǎn)物^系在37。C水浴4小時(shí)。 ^l青多肽的PCR產(chǎn)物用Notl和PpuMI內(nèi)切Hi刀開50ul體系 _^晴多肽的PCR產(chǎn)物 20 ul ddH20 20 ul PpuMI 2ul Notl 2ul 10 x Buffer 5ul 魚精多肽的PCR產(chǎn)物酶體系在37。C水浴4小時(shí)。 pAcGP67B用Ncol和PpuM內(nèi)切S^刀開 50ul體系 pAcGP67B 20 ul ddH20 20 ul PpuMI 2ul Notl 2ul 10 x Buffer 5ul pAcGP67B的i^刀體系在37。C水浴4小時(shí)。將上t個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收目的片段，將^fe7鑒定片段大小正確的PCR 產(chǎn)物4^[Ui樣1%瓊脂糖^^交電泳;將目的DNA片^JU干凈的手術(shù)刀切下,it^ 1.5ml 離心管，^^v回4i^交前離心管稱重；稱重后，在1.51111離心管中加入以每毫ii勁口入1微fH^只的膜結(jié)合溶液；60。C水浴中;^E lOmin(Ji統(tǒng)全溶解)，每2-3^4中混勻一 次(i^交液應(yīng)與膜結(jié)合溶^l貞色相同)；將柱子放樣品##入柱子中(柱子的最大容量為 800uL)，室^i!Elmin,然后16000g x lmin離心；取下柱子，棄伊u出液，將柱子放 回原收集管中；力口入700ul washing buffer至收集管，室^^t^ lmin，然后16000gx lmin離心；力口入500ul Membrane washing solution至收集管，然后16000g x lmin離心； 取下收集管，棄流出液，再次16000gxlmin離心；將收集管^X在一支新的1.5mL 離心管中，加入50uL Nudease-Free Water (或無菌H20)M中央，靜置片刻，然后 16000g x lmin離心，收集回j]緩粒DNA。 1鈔刀膠回收的目的片,更ii^亍連"l條 Her2ScFv 5ul Protamine 5ul pAcGP67B 5ul DNA Ligation Mix 15 ul PCR ^Jii^"l秦16°C x l小時(shí) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，CaC12制備感受態(tài)細(xì)胞DH5a。 在15ml試管中力口入3mlLB培養(yǎng)基,從平^Ji才4^一單克隆接種，37°C， 250rpm, 培養(yǎng)過夜，約16小時(shí)。取2ml過夜菌接入200ml新鮮的LB培養(yǎng)基，37°C, 260rpm， 培養(yǎng)，直至OD60OO.4"0.5,然后將菌液冰浴30"60分鐘。4°C, 5000rpm x 5min離心 收集細(xì)菌，棄上清。用10ml0.1M的CaCl2輕輕吹打，充分懸浮，水浴10min。 4°C, 5000ipmx5min離心，棄上清。力口入2ml 0.1M的CaCl2輕輕吹打，充分懸浮，冰浴 30min即感受態(tài)制備完成。轉(zhuǎn)^4受態(tài)細(xì)胞準(zhǔn)備L5ml的離心管2支，冰浴預(yù)冷；分別取100ulDH5a感 受態(tài)細(xì)胞，各加入10ul連接產(chǎn)物，混合均勻；將上述"曰^^勿;^i:水上30min;將混 ^4勿轉(zhuǎn)移至42。C水浴中溫育90sec;將混^4勿4^多至水J^文置2min后，加入800ul的LB培養(yǎng)液，在4S^Ji37。C, 150rpm培養(yǎng)60min; 4000ipmx5min離心；棄800ul 的上清液，剩余IOO ul混勻后涂LA板；^^20ul IPTG和70ul Xgal';^/^后涂布在 LA^Ji進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，然后4eJi步^^余的100ul菌液混勻后涂LA板；LA板置 37。C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；在過夜培養(yǎng)的LA ;^Ui挑取10個(gè)長得tb4支飽滿的白色克隆， 分別加入6mlLA培養(yǎng)基中，在搖^Ji37。C， 250ipm培養(yǎng)16h。 實(shí)施例2 pACgp67BJIer2"ScfV誦protamine質(zhì)粒小量^H:以12000g x 1 min離心收菌。(""^i^r^分用34ml菌液)，棄上清。加250ul水 浴BufferSl(含RnaseA)，渦旋振蕩，使菌體充分懸浮。力口250ulBufferS2，溫和混勻 6次。0tbit程不超過5min)加350ul Buffer S3,溫和混勻6次。以12000 g x 10 min離 心。取上清，過DNA制*,以12000 g x 1 min，棄濾液。DNA制錄內(nèi)力口 700ul Buffer Wl， 12000gxlmin，棄濾液。DNA制^f內(nèi)加500ulBufferW2， 12000gxlmin, 棄濾液。再次以12000 g x 1 min離心。加40ul ddH20(或EB buffer)于DNA制備管的 膜中央，室溫靜置lin(50。C預(yù)熱EBbuffer可能洗M^汰更好)。12000gxlmin離 心并收集S艦液，即質(zhì)粒DNA。實(shí)施例3.酶切鑒定Her2單鏈片段抗體與魚精蛋白多肽構(gòu)建的質(zhì)粒 pACgp67B-Her2-scfV-protamine進(jìn)4t^^刀鑒定pACgp67B-Her2-scfV-protamine質(zhì)粒片段① .Bamffl (CTGATCC)的酶切位點(diǎn)處于4259; Xhol (CTCGAG)的^i刀位 點(diǎn)處于1902;所以酶切后的條帶大小為2357 bp，位置準(zhǔn)確。如圖1所示， pACgp67B-Her2-scf^-protamine用Bamffl和XhoI的Hi刀鑒定。M為maricer ,1,2， 3, 4， 5, 6, 7為不同克隆細(xì)菌擴(kuò)增并M質(zhì)粒DNA后酶切可見2027bp^Ji方有相 應(yīng)的*，與預(yù)期條帶的位置相吻合。② .Hindm (AAAGCTT)的^i刀位點(diǎn)處于2， 5328, 6256, 7292，所以^i刀后 的四個(gè)條帶大小為5326 bp, 3423bp, 1036 bp， 928 bp,位置準(zhǔn)確。如圖2所示，pACgp67B-Her2-scf^-protamine用Hindm的i^fe7鑒定。M為marker ， 1， 2, 3， 4, 5, 6， 7為不同克隆細(xì)菌擴(kuò)增并^t粒DNA后酶切可見4條不同的條帶，與預(yù)期 絲的位置(5326bp, 3423bp, 1036 bp, 928bp)相吻合。。實(shí)施例4 pACgp67B-Her2誦sc^國protamine質(zhì)粒大量城吸取0.5ml上述菌勵(lì)口入500 ml LA培養(yǎng)基中在搖^Ji 37°C ， 250rpm培養(yǎng)16h, 菌液密度大約為3"4xi()9細(xì)^/ml。將菌液收集在200ml離心管中，在4。C條件下， 以6000 g的逸復(fù)離心15 min。以同樣的條f牛重復(fù)3次，把細(xì)菌收集在同一個(gè)離心管 中。將細(xì)菌沉淀重懸在20 ml Buffer Pl (佳月前力口入RNase A和LyseBlue reagent)中。 向離心管中力口入20 ml Buffer P2,并上下顛倒4-6次混勻，在室溫(15~25°(:)下力 5 min，此時(shí)〉V給紋為藍(lán)色。向離心管中力口入20 ml Buffer P3，并上下顛倒4-6次混勻， ^;水Ji^tf 30min，此時(shí)^給液藍(lán)色褪去，變?yōu)闊o色。將上述液體在4。C, 20000g離 心30 min ,并iiki4收集含有質(zhì)粒DNA的上清液。將上一步W^得的上清液4°C， 20000 g離心15 min， ^i4收集含有質(zhì)粒DNA的上清液。向上清液中力口入42 ml 異丙醇以;W定其中的質(zhì)粒DNA,并4。C , 20000 g離心15min，小心M上清液。 向質(zhì)粒DNA ^i定中加入500 TE buffer( pH 8.0),并加入Buffer QBT至總?cè)萘? ml。 寸詗QIAGEN-tip 100進(jìn)行質(zhì)^4^，取4 ml Buffer QBT力口入QIAGEN-tip 100柱子 進(jìn)行平衡，并讓液體在重力的作用下緩f曼^^。將步驟9所獲得的含有質(zhì)粒DNA的 液體加入柱子，讓其在重力的作用下M;IH交4灸^t脂。用BufferQC先法，2 x 10ml。 用5mlBufferQF過;fM^t^^,用一個(gè)干凈的離心管接;艦液。于洗脫液中加3.5ml 異丙醇以;;^^t粒DNA,并4。C, 15000 g離心30min。離心后將上清液小心絲。 室溫下用2 ml 70%的酒精M粒DNA,然后在4°C， 15000 g離心10 min，離心后 小心絲上清液。^i定物風(fēng)干10 min后加入250 的TE buffer (pH 8.0), 4^t粒 濃度測(cè)定應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒大量抽提后獲得的 pACgp67B-Her2-scf^protamine質(zhì)粒的^l^: 0.025 x 1000 x 50=1.25 ug/ul。實(shí)^fe例5 Her2"ScfV-protamine的效'傳^^才乇大連寶生物^S司進(jìn)"f力則序，Her2-scfV-protamine的序列完全正確ANGCTrArAAGGAAAACAGCAGATGGTAAGCGCTATTGTnTATArGTGCTnTGGCGGCG GCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGCGGATCTTGGATCCCGGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGTACArGGGGCTCArCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCATGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCArCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTAITACTGCCTTTCNTGGACCCGGCAAAACCAAAT將Her2-ScFv-protamine的測(cè)序圖譜與理論圖語進(jìn)行J^于，結(jié)果完全正確，如圖3 所示，Her2-scf^protamine的觀'J序圖語中可以直觀的進(jìn)行4—?jiǎng)t序列與理論序列的H^于， 可以看到我們插入的目標(biāo)序列均完全正確的插^i確的位置。實(shí)施例6 ^"j質(zhì)粒圖《#^所構(gòu)建質(zhì)粒pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine的質(zhì)粒圖，如圖4所示，為 pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine質(zhì)粒的簡(jiǎn)圖。這個(gè)質(zhì)粒圖闡明了質(zhì)粒的英文全稱為pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine,序列的總狄為10713bp,以及目標(biāo)序列Her2-ScFv, protamine和純/fW亍各His-tag的插入位置，并說明相應(yīng)的酶切位點(diǎn)等質(zhì)粒信息。。這個(gè) 質(zhì)粒圖闡明了質(zhì)粒的英文全稱為pAcGP67B-Her2-ScFv-prolamine,序列的總長度為 10713bp,以及目標(biāo)序列Her2-ScFv， protamine和純/R^亍各His-tag的插入位置，齊4兌 明相應(yīng)的S^刀位點(diǎn)等質(zhì)粒信息。通順粒可使本領(lǐng)域的專業(yè)技^/v員可以i^i4而全面 的理解;^發(fā)明。實(shí)施例7Her2單鏈片段抗體與^T青蛋白多肽的融好白在sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá) 與純化Her2單鏈片賴:抗體與魚^青蛋白多肽的融*白的表達(dá)pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine質(zhì)粒與桿狀病4^轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞(^j ] BD BaculoGold轉(zhuǎn)染試劑盒)，接種2 x 106S 于60mm組織培^中，初始細(xì)胞密戯 在50-70%鋪滿。使細(xì)胞牢固貼壁(大約15min)。除去培養(yǎng)基，力口入lml轉(zhuǎn)染《爰沖液 A。確認(rèn)培^JDL的所有區(qū)域被轉(zhuǎn)染緩沖液A覆蓋,以防止細(xì)胞干^L亡。于一無菌15ml 離心管中混合0.5 |a g Baculo Gold TM線性DNA和2 ja g重組壽封多載體質(zhì)^(含有目的 基因)。^^4勿靜置5min后加入lml轉(zhuǎn)染緩沖液B, 〉V給均勻。將lml轉(zhuǎn)染緩沖液B/DNA溶液逐滴力口Al且織培^，每加入2到3滴便溫和地 晃動(dòng)培^mi以^^其與轉(zhuǎn)染緩沖液A混勻。扭bit程期間，應(yīng)該可以^JU形成的^i定 使得溶:^J^fe微乳狀。27;li咅養(yǎng)4小時(shí)。4小時(shí)以后，除去轉(zhuǎn)染溶液，并加入3ml Grace's Insect Cell Culture Medium。溫和晃動(dòng)培#^,然后除去培養(yǎng)基。力口入3ml新 鮮Gmce，s Insect Cell Culture Medium, 27。C培養(yǎng)4-5天。4-5 A^，收紅清，用其 感染更多細(xì)胞以擴(kuò)增病毒，擴(kuò)增病毒后行蛋白表達(dá)。Her2單鏈片段抗體與^T奇蛋白多 肽的融^f"白在sS昆蟲細(xì)胞中的表iio注意生產(chǎn)目的蛋白時(shí)，病毒MOI應(yīng)該在3 -10。接種9 x 106 S 于T75培養(yǎng)瓶中，力口7vE含有10ml S 培養(yǎng)勒含有10%胎牛血清)。T75培養(yǎng)弁理培養(yǎng)箱中27。C培養(yǎng)1小時(shí)。1小時(shí)吸去舊培養(yǎng)基才躺新鮮培養(yǎng)基， 并加入高滴度的病毒液，使MOI介于5 - 10之間。T75培養(yǎng)并11_￡培養(yǎng)箱中27。C培養(yǎng) 72小時(shí)。72小時(shí)后把細(xì)月&^上清吸到一個(gè)離心管中，4"C， 1000g離心10^4中收集細(xì) 胞。用預(yù)冷的PBS力口入細(xì)胞中重懸洗滌，4°C, 1000g離心10^4中收集細(xì)胞。辦所 有細(xì)胞沉淀于lml裂解緩沖液10mM Tris-HCl，pH7.5，200mM Nacl,l%Triton X-100,10mM NaF/10mM Sodium Pyrophosphate/10mM Sodium phosphate,l x photease inhibitor cocktail.。腦0g， 10min, 4。C離心禱液，收壯清。 純化Her2單鏈片段抗體與^f青蛋白多狀的融*白先用3-5倍柱體積的Washing buffer洗Ni - NTA瓊脂膠柱(Pierce)。待Washing buffer it^后，力口入蛋白上清液過柱，讓其纟爰十曼流出。待上清液沭^，加入含有3-5 倍柱^^只的20mM咪峻洗滌Ni - NTA柱。力口入含有不同親的咪>^^爰沖液3倍柱體 積J^1i艦，^!分別為100mM， 250mM, 500mM和1000 mM,并分別收集;艦 液進(jìn)行分析。實(shí)施例8 Her2單鏈片段抗體與^^青蛋白多肽的融M白的鑒定 我們成功構(gòu)建了 Her2單鏈片段抗^^#蛋白多船蟲*白的桿狀病毒表絲 體(pAcGP67B-Her2-ScFv-Pratamine),質(zhì)粒圖鐠可見圖4，在sff昆蟲細(xì)月W干狀病毒 表達(dá)系纟棘達(dá)。我們4eii—載粘桿狀病毒^M粒DNA (BacuoGold Bright DNA， BD Pharmingen公司)^^共轉(zhuǎn)染SS細(xì)胞，敘己病毒載體顆粒，感染SS細(xì)胞，細(xì) 胞^if液過His-Tag蛋白分離4ii^i^屯化，表達(dá)出來的帶有6個(gè)組氨艦巴(His-Tag) 的Her2單鏈片段抗體與^t青蛋白多，*白，用拍人IgG ^4元作為一抗的Western Blot鑒定分離的融妙白，如圖5所示，Her2單鏈片段抗體與^f青蛋白多肽的融妙 白經(jīng)過Weston blot進(jìn)行鑒定圖。Control為為感染病毒的細(xì)胞|1 白，而MOI-l， 3, 5, 10和15則分別是不同病毒與細(xì)月&it量比時(shí)的結(jié)果，可以見到大小為36KD的 目標(biāo)條帶，而且MOI:5和10時(shí)表達(dá)量較高。結(jié)^4明用pAcGP67B-Her2-ScFv-Protamine質(zhì)沖:i^桿狀病毒可以成功的表達(dá)出 Her2單鏈片l殳抗體與^l青蛋白多^il種融^^白。而且，在MO卜5和10，即病毒 與細(xì)l&it量比為5和10時(shí)的表ii^汰更好，表達(dá)出來的融合蛋白大小為36KD。實(shí)施例9 Her2單鏈片段抗體與^f青蛋白多肽的融M白^^測(cè)定Her2單鏈片段抗體與^^青蛋白多船蟲M白經(jīng)it4^i^純^^,由于^M^內(nèi)含 有較多的有才M勿質(zhì)，需要通itit析去除有才/li^劑和超濾進(jìn)fr^i宿。常用PBS, 4。C透 析48小時(shí)后進(jìn)行超濾i^i宿。經(jīng)it^E濾后用蛋白^測(cè)定試劑盒進(jìn)fr濃度測(cè)定① .吸取180ulBSA(2mg/ml)于96孑Ul中的最靠邊緣的第一孔，同一排的其它11 個(gè)孔中各加入60ul 0.9 %生理鹽7jc;② .吸取120ul第一孔的液體加入一個(gè)盛有60ul生理鹽水的第^5L并充分>'^^ 均勻；③ .用同樣方法處J1^第十；L;④ .各吸取20ul上述稀釋液體加入另外兩排24個(gè)孔中； (D.各吸取20ul蛋白樣品液體加入96孑li反中，^i^:l孔； .分別吸取5ul5 x的細(xì)胞辦';^口入樣品孑L^BSA孔中；⑦ .以50:1的比例配制A + B 〉V曰洽液；⑧ .吸取200ul A + B齡脅Aji述^h孔中； . 96孑U1置37。C培養(yǎng)箱中孵育30 ^i中；⑩.將;fc^i:紫外分itibl計(jì)中進(jìn)^^lL才財(cái)居標(biāo)準(zhǔn)蛋白的^l梯度和紫外分i^bl計(jì)的讀數(shù)Ui^'麻準(zhǔn)曲線將曲線進(jìn)行 擬和后可得直狄其方程 Y412622+1.01542 X R=0.99666PO扁l如圖6所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的^i梯度和紫夕卜分ititl計(jì)的讀數(shù)平均n^^標(biāo)準(zhǔn) 曲線，然后進(jìn)行扣沐直線，并得到直線的相應(yīng)方程式。將^^贈(zèng)羊本的紫夕卜分iUeA讀數(shù)值4Vv^r程可得相應(yīng)的蛋白^yL)純4te Her2單鏈片段抗體與^f青蛋白多肽的融 *白的濃^ 100ug/ml, 5 x 10、田月包可^^尋2ml融M白溶液。實(shí)施例10 Her2單鏈片段抗體與^f青蛋白多肽的融M白具有結(jié)合癌細(xì)月^面 Her2受體和^i宿D(zhuǎn)NA的雙向功能,并負(fù)fe^目標(biāo)DNA選棒性導(dǎo)入Her2陽性細(xì)月&i行 表達(dá)。我們進(jìn)一步檢驗(yàn)Her2單鏈片段抗體與^f青蛋白多肽的融M白攜帶siRNA和耙 向?qū)際er2陽性細(xì)胞的雙向功能。① .Her2單鏈片段抗體與^#蛋白多肽的融*白與siRNA的結(jié)合力枱3則 我們用熒光素(FTTC)標(biāo)記的GFPsiRNA與不同量的Her2單鏈片,殳抗體與^l青蛋白多脇蟲^"白和L一蛋白J朱(L-proteinbeads:能結(jié)合人IgG)進(jìn)行免疫共^i定， 通過分光計(jì)定4^則FITC-siRNA。結(jié)^示Her2單鏈片段抗體與^l青蛋白多^l^^白與siRNA的々^N吉合力約 為l: 6摩爾比。圖7為GFPsiRNA與不同量的Her2單鏈片段抗體與^f青蛋白的多肽 融*白和L -蛋白珠行免疫共^i定，顯示Her2單鏈片段抗體與^4青蛋白多ia蟲M 白與siRNA的^結(jié)合力約為1: 6摩爾比。② .然后，我們用這種融好白攜帶GFPsiRNA (1: 6摩爾比)，處理Her2基因 表ii^體(pCMV-EAB2)轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞(效率達(dá)89% ),通過改良Northern Blot #^則細(xì)胞內(nèi)GFP siRNA的*。圖8所示為Her2單鏈片^史抗體與^f青蛋白多肽的融 M白負(fù)沐歲tfeteGFPsiRNA導(dǎo)入Her2陽性細(xì)胞。泳道l-3分別為100、 500、 1000 pmolsiRNA時(shí)細(xì)胞內(nèi)4&則到的siRNA信號(hào)，f錄siRNA量的增加，胞內(nèi)siRNA信號(hào) M強(qiáng)。泳道4和5分別為Her2單鏈片段抗體攜帶GFPsiRNA處理組和Her2陰性細(xì)月^i且，可JO包內(nèi)不育^^則到siRNA信號(hào)。結(jié)絲示Her2單鏈片段抗體與^f青蛋白多船蟲妙白育沐歲&4fe GFP siRNA導(dǎo) 入Her2陽性細(xì)胞，而JIJl^r siRNA量的增加(100、 500、 1000 pmol),細(xì)胞內(nèi)4S則到 的siRNA信號(hào)M強(qiáng)(泳道1-3)。而作為對(duì)照的不含^T奇蛋白多肽片段的Her2單鏈片 段抗^^夷帶GFPsiRNA處JH且(泳道4浙Her2陰性細(xì)胞(泳道5 )則不肯^^則到siRNA 信號(hào)。說明Her2單鏈片段抗倘^f青蛋白多録妙白負(fù)^siRNA選棒l^也導(dǎo)入Her2 陽'l"生細(xì)月包內(nèi)。③.共聚焦顯樣i鏡定位4企測(cè)Her2單鏈片段抗體與魚精蛋白多肽融合蛋白導(dǎo)入 siRNA在細(xì)月包內(nèi)的^^布。我們用共聚禁i微4i^fi^^則Her2單鏈片段抗體與^f青蛋白多l(xiāng)iil^^白導(dǎo)入 FUC - siRNA在細(xì)胞內(nèi)的分布，圖9為共聚禁i微4t^f^^則siRNA經(jīng)Her2單鏈片 段抗體與魚精蛋白多肽的融合蛋白導(dǎo)入細(xì)胞后的分布情況。可見瑩光siRNA分布于 Her2陽性Hela細(xì)胞的月錄中(A),而Her2陰性細(xì)月包內(nèi)則沒有siRNA(B)。發(fā)現(xiàn)siRNA 分布于Her2陽性Hela細(xì)胞的胞漿中，而Her2陰性細(xì)胞則沒有siRNA。這些實(shí)驗(yàn)i正實(shí) 了 Her2單鏈片段抗體與A^青蛋白多肽的融M白攜帶siRNA和特^f"入Her2陽性細(xì) 月包的功能。序列表SEQIDNO:l〈110〉中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院〈120〉 Her2單斷離購魚精多ttSfe^白作為繊si薩的l^體〈160> 1<170>〈210〉 1<211〉 960〈212〉脆〈213〉 Alff列〈220〉〈221> misc一feature <222> (1)…(960) <223〉 n巧或g或c或t <揚(yáng)1atggcccagg tgcagctggt aagatctcct gtaagggttc c卿tgcccg ggaaaggcct aaatacagcc cgtccttcca gcctacttgc aatg眺cag catgacgtgg gatattgcag tggggccagg gcaccctggt tctggcggtg gcggatcgca ggacagaagg tcaccatctc tcctggtacc agcagctccc cggcccgcag gggtccctga gccatcagtg ggttccggtc accctctcgg gctgggtgtt atggccaggt acagatgctg agaagtcgca gacgaaggag cgccccaggt acagaccgaggcagtctggggcagaggtgaaaaagcccggggagtctctg60tggatacagctttaccagctact卿tcgcctgggtgcgc120ggagtacatggggctcatctatcctggtgactctgacacc180郷ccaggtcaccatctcagtcgacaagtccgtcagcact240tctgaagccctcggacagcgccgtgtatttttgtgcgaga300tagttccaactgcgcaaagtggcctgaatacttccagcat360caccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcgg鄉(xiāng)tggc420gtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgcggcccca480ctgctctggaagc鄉(xiāng)tcc3acattgggaataattatgta540aggaacagcccccaaactcctcatctatgatcacaccaat600ccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctg660cgaggatgaggctgattattactgtgcctcctgggactac720cggcggaggaaccaagctgaccgtcctaggtgcggccgca780tcgcagccag鄉(xiāng)cggagcagatattaccgccagagacaa840gcggagctgcc卿cacggaggagagccatgaggtgttgt900atgtagaagacacagatctcatcatcaccaccaccattaa960
權(quán)利要求
1. 一種單鏈片段抗體-多肽融合蛋白，其特征在于，所述的單鏈片段抗體為Her2-ScFv。
2、 才財(cái)居權(quán)利要求l所述的一種單鏈片段抗l多脇蟲M白，^#棘于，所述的多 狀為A^青蛋白片,殳多狀。
3、 才財(cái)居權(quán)利要求l所述的一種單鏈片段抗l多l(xiāng)^li妙白，其序列是如SEQIDNO. 1 所示的序列。
4、 一種含有編碼權(quán)利要求1 -3之一所述的一種單鏈片段抗體-多l(xiāng)i^妙白的基因 序列的表ii^體。
5、 才財(cái)居權(quán)利要求4所述的表ii^體，^#棘于，包才舌pAcGP67B載體。
6、 一種權(quán)利要求4或5所述的表ii^/^4爭(zhēng)化的宿主細(xì)胞。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，^4爭(zhēng)4iE^于，包4舌sfi)昆蟲細(xì)月包。
8、 權(quán)利要求1 -3之一所述的一種單鏈片段抗體-多M^^白作為抗癌siRNA的藥 物載體的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種單鏈片段抗體-多肽融合蛋白及其應(yīng)用，該蛋白是一種具有結(jié)合Her2受體和攜帶抗癌siRNA藥物雙向功能的融合蛋白，可以作為抗癌siRNA的藥物載體。其中，單鏈片段抗體為Her2-ScFv，多肽為魚精蛋白片段多肽。該單鏈片段抗體-多肽融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示的序列。本發(fā)明構(gòu)建的Her2單鏈片段抗體與魚精多肽的融合蛋白具有結(jié)合Her2受體和攜帶抗癌siRNA藥物的雙向功能。本發(fā)明的融合蛋白能把抗癌siRNA藥物定向?qū)肽繕?biāo)癌細(xì)胞中，開發(fā)了非病毒載體工具，加速RNAi技術(shù)應(yīng)用于臨床。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101270163SQ200810027579
公開日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2008年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者姚燕丹, 宋爾衛(wèi), 朱鵬程 申請(qǐng)人:中山大學(xué)