專利名稱：：從人血漿組分FIV沉淀中分離純化α1-抗胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種a1-抗胰蛋白酶的制備方法，尤其是從人血漿組分沉淀中分離純化al-抗胰蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
：al-AT主要是由肝細(xì)胞合成的一種糖蛋白，分子量54KD，體內(nèi)半衰期6d。al-AT是人血漿中最豐富的一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，能抑制多種絲氨酸內(nèi)切肽酶，如抑制彈性蛋白酶、胰蛋白酶、纖溶酶、膠原酶、凝血酶和Hageman因子等的活性。al-AT是血液中最主要的抗胰蛋白酶，占血清胰蛋白酶抑制活性的90%以上。dl-AT具有較強(qiáng)的血管通透性，在肺組織中濃度高，而且對(duì)彈性蛋白酶活性更專一，它的主要生理功能是抑制肺部彈性蛋白酶的活性，保護(hù)肺部不受彈性蛋白酶的酶解損傷。人體血漿中al-AT缺乏直接相關(guān)的疾病主要是肺和肝臟疾病。如阻塞性肺氣腫、新生兒或成人呼吸窘迫綜合征、肺部囊性纖維化、兒童肝硬化和新生兒肝炎等，病情嚴(yán)重導(dǎo)致患兒夭折。對(duì)于al-AT缺乏癥的治療主要是進(jìn)行替代治療和基因治療。但由于基因療法目前尚處于實(shí)驗(yàn)階段，具有一定的局限性，因此al-AT替代或補(bǔ)充治療此類疾病是主要方法。我國(guó)目前尚無(wú)該產(chǎn)品的生產(chǎn)，市場(chǎng)需求主要依靠進(jìn)口產(chǎn)品來(lái)滿足。國(guó)內(nèi)外都開(kāi)展了al-AT的生產(chǎn)研究。Gadek等應(yīng)用兩步沉淀過(guò)程制備臨床應(yīng)用的al-AT濃縮制劑，al-AT僅占濃縮制劑蛋白總量的5%。Glaser等建立了獨(dú)特的cil-AT制備工藝，采用二硫蘇糖醇處理結(jié)合硫酸銨沉淀，DEAE—纖維素層析，從Cohn，s低溫乙醇工藝的廢棄組分FIV-l中提純出純度70%的al-AT濃縮制劑。朱威等[9從Cohn組分FIV中提純al-AT。將Cohn組分FIV抽提液經(jīng)沉淀，超濾，離子交換及凝膠過(guò)濾后，提純al-AT，用巴氏法滅活病毒，并考察其效果。用免疫單擴(kuò)散、雙向交叉免疫電泳、SDS-PAGE及合成基質(zhì)法檢測(cè)al-AT蛋白活性，用區(qū)帶掃描法測(cè)其純度達(dá)90%以上。上述工藝主要采用沉淀法或沉淀結(jié)合層析法純化al-AT，產(chǎn)品純度在70%-90%左右，純度較低；本發(fā)明采用兩步層析法純化，設(shè)備儀器少，操作簡(jiǎn)單易行，產(chǎn)品純度高，al-AT電泳純度達(dá)到98%。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的從人血漿組分FIV沉淀中分離純化a1-抗胰蛋白酶的方法，以降低生產(chǎn)成本及提高純度。為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種從人血漿組分FIV沉淀中分離純化a1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步驟(A)血漿沉淀預(yù)處理取FIV沉淀加溶解液稀釋到蛋白含量2%~5%,pH8.0~8.5，離子強(qiáng)度0.09-0.12，溫度控制在2-8。C攪拌過(guò)夜，按照0.5%~15%的比例(W/V)加入硅酸鹽助劑在2-8'C攪拌lh，固液分離，取上清液，按照0.5%-15%的比例(W/V)再次加入硅酸鹽助劑在2-8'C攪拌3h,固液分離，取上清液進(jìn)樣層析柱；(B)陰離子凝膠層析取凝膠，室溫放置達(dá)到溫度平衡后裝柱，以緩沖液洗脫平衡，pH6.0~6.5，平衡量為柱體積的812倍，將上清液上樣于平衡好的層析柱，用緩沖液洗脫，pH6.0~6.5，溫度控制在28。C,洗柱810倍柱體積，于紫外光280nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄層析圖譜，選擇性地收集以含有al-AT為主要成分的組分；(C)凝膠過(guò)濾層析取凝膠，室溫放置達(dá)到溫度平衡后裝柱，以緩沖液平衡，將層析后收集的al-AT的組分調(diào)至pH7.0-7.5，上樣于平衡好的Sephacryl5-200柱，用相同的緩沖液洗脫，同時(shí)于紫外光280nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄層析圖譜，選擇性地收集al-AT的組分；(D)超濾脫鹽濃縮；(E)巴氏病毒滅活將濃縮蛋白液加無(wú)熱原注射用水稀釋，加入保護(hù)劑，于60士0.5。C保溫8~12小時(shí)，滅活血漿蛋白制品中的病毒；(F)凍干分裝巴氏滅活的al-AT蛋白液經(jīng)除菌過(guò)濾，轉(zhuǎn)入凍干機(jī)真空凍干；(G)干熱消毒分裝的凍干粉針?lè)胖糜诒貛?kù)中保溫，滅活病毒，轉(zhuǎn)入成品庫(kù)全檢包裝。本發(fā)明是以人血白蛋白生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的棄料FIV組分沉淀為原料，采用層析技術(shù)分離純化一種蛋白酶抑制劑即a1-抗胰蛋白酶(al-antitrypsin，al-AT)，建立al-AT濃縮制劑的生產(chǎn)工藝。本方法制備的產(chǎn)品純度好、收率高，操作簡(jiǎn)單易行，同時(shí)占用設(shè)備少、勞動(dòng)強(qiáng)度小、能耗低，以白蛋白生產(chǎn)的廢棄物料作原料，生產(chǎn)成本低。圖l為工藝流程圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供的技術(shù)方案是al-AT濃縮制劑的生產(chǎn)工藝，工藝步驟如下(A)FIV沉淀預(yù)處理取FIV沉淀加8~18mM的磷酸或30~35mM的醋酸鹽緩沖液稀釋到蛋白含量2%-5%，pH8.0-8.5，離子強(qiáng)度0.09-0.12，溫度控制2-8'C攪拌過(guò)夜。按照0.5%-15%的比例(W/V)加入硅酸鹽助劑，2-8'C攪拌lh，固液分離，分離溫度控制在4°C,取上清液，按照0.5%-15%的比例(W/V)加入硅酸鹽助劑，2-8'C攪拌3h，調(diào)節(jié)溶液pH5.5-6.5，固液分離，溫度控制在4。C，取上清液進(jìn)樣層析柱。硅酸鹽助劑為硅藻土、珍珠巖，添加劑的用量為每100毫升溶解液添加0.5克-15克。(B)離子交換層析取出DEAF-SepharoseFastFlow凝膠，室溫放置達(dá)到溫度平衡后裝柱，以8~18mM的磷酸鹽緩沖液、30~35mM的醋酸鹽緩沖液或12~25mM的檸檬酸鹽緩沖液洗脫平衡，pH6.0-6.5,平衡量為柱體積的8-12倍。將上清液上樣于平衡好的層析柱，用8~18mM的磷酸鹽緩沖液、30~35mM的醋酸鹽緩沖液或12~25mM的檸檬酸鹽緩沖液洗脫，pH6.0-6.5,流速控制在每小時(shí)2.0~4.5倍柱體積，溫度控制在2-8'C，洗柱8-10倍柱體積。于紫外光280nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄層析圖譜，選擇性地收集以含有al-AT為主要成分的組分。(C)凝膠過(guò)濾層析取SephacrylS-200凝膠，室溫放置達(dá)到溫度平衡后裝柱，以818mM的磷酸鹽緩沖液、30~35mM的醋酸鹽緩沖液或12~25mM的檸檬酸鹽緩沖液平衡，pH7.(K7.5，平衡量為柱體積的8~12倍。將層析后收集的al-AT的組分調(diào)至pH7.0~7.5，上樣于平衡好的Sephacryl5-200柱，用相同的緩沖液洗脫，洗脫量為柱體積的8-12倍，流速控制在每小時(shí)1.5~3.5倍柱體積，洗脫溫度控制在2~8°C。同時(shí)于紫外光280nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄層析圖譜，選擇性地收集al-AT的組分。(D)超濾脫鹽濃縮經(jīng)層析純化的al-AT溶液泵入超濾機(jī)，用無(wú)熱原注射用水超濾脫鹽，超濾膜截留分子量為IOOKD。(E)巴氏消毒將濃縮蛋白液加無(wú)熱原注射用水稀釋到蛋白含量1.5%-2.5%，pH6.4~6.8，加入甘氨酸和麥芽糖作為巴氏消毒的混合保護(hù)劑，甘氨酸含量控制在45-55mM，麥芽糖含量控制在25%~35%于60±0.5°。保溫10小時(shí)，滅活血漿蛋白制品中的病毒o(F)凍干分裝巴氏滅活的al-AT蛋白液過(guò)0.22um微孔濾膜除菌過(guò)濾，轉(zhuǎn)入凍干機(jī)真空凍干，含水量控制在3%以下，凍干粉按500mg蛋白/瓶分裝，轉(zhuǎn)入待檢品庫(kù)。(G)干熱消毒分裝的凍干粉針?lè)胖糜?(TC保溫庫(kù)中，保溫60~72小時(shí)滅活病毒，轉(zhuǎn)入成品庫(kù)全檢包裝。實(shí)施例l:(1)FIV沉淀預(yù)處理稱取Cohn法組分沉淀FIV3kg，加入15mM，pH8.0的磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉緩沖溶液50L，于28。C攪拌過(guò)夜，加入3kg硅藻土，在28'C攪拌1小時(shí)，高速離心分離，溫度控制在4'C，濾液中加入珍珠巖l.5kg，2-8'C攪拌3h，以1MHCl調(diào)溶液pH6.2,高速離心分離，溫度控制在4。C，取上清液為層析上柱液。(2)DEAE-S印haroseFastFlow陰離子交換層析取出DEAF-SepharoseFastFlow凝膠，室溫放置以達(dá)到溫度平衡，取6L凝膠裝柱，以15mM，pH6.0的磷酸鈉緩沖液平衡洗柱，平衡液用量8倍柱體積。將上柱液IOL上樣于平衡好的DEAF-SepharoseFastFlow柱(9.5xll0cm)，用pH6.0,15mM的磷酸鈉緩沖液洗柱，洗柱液用量8倍柱體積，流速2.2L/h，以pH6.0，20mM的檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液洗脫，流速3.2L/h，洗脫溫度控制在2-8°C。同時(shí)于紫外光280nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄層析圖譜，選擇性收集含有a1-AT為主要成分的組分。(3)S印hacrylS-200凝膠過(guò)濾層析取SephacrylS-200凝膠5L，于室溫放置2h達(dá)到溫度平衡后裝柱，以15mM，pH7.0的磷酸鈉緩沖液平衡洗柱，平衡液用量10倍柱體積，以lMNaOH溶液將層析后收集的a1-AT組分調(diào)至pH7.2，上樣于平衡好的Sephacryl5-200柱(7.5x90cm)，用相同的緩沖液以1.8L/h的流速洗脫，洗脫溫度控制在2-8°C。同時(shí)于紫外光280nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄層析圖譜，選擇性地收集a1-AT的組分。(4)超濾脫鹽濃縮經(jīng)層析純化的a1-AT溶液泵入超濾機(jī)，用無(wú)熱原注射用水550L超濾脫鹽，超濾膜截留分子量為IOOKD，濃縮到蛋白含量12%。(5)巴氏消毒從超濾器中泵出蛋白濃縮液，加無(wú)熱原注射用水稀釋到蛋白含量2%，加入55mM甘氨酸和25X麥芽糖作為巴氏消毒的保護(hù)劑。蛋白溶液于60土0.5'C保溫IO小時(shí)，滅活血漿蛋白制品中的病毒。(6)凍干分裝巴氏滅活的al-AT蛋白液真空凍干，含水量控制在3%以下，凍干粉按照500mg蛋白/瓶無(wú)菌分裝，轉(zhuǎn)入待檢品庫(kù)。(7)干熱消毒/全檢包裝凍干品置80。C保溫庫(kù)放置60小時(shí)滅活制品病毒，轉(zhuǎn)入成品庫(kù)全檢包裝。成品檢測(cè)結(jié)果如下表l:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(1)FIV沉淀預(yù)處理稱取Cohn法組分沉淀FIV3kg，加入50L30mM的醋酸鈉緩沖溶液，于2~8'C攪拌過(guò)夜，加入3kg硅藻土，在28'C攪拌1小時(shí)，進(jìn)樣板框?yàn)V器加壓過(guò)濾，溫度控制在4'C，濾液中加入珍珠巖l.5kg，2-8'C攪拌3h，以1MHC1調(diào)溶液pH6.2，進(jìn)樣板框?yàn)V器加壓過(guò)濾，溫度控制在4'C，取上清液為層析上柱液。(2)DEAE-S印haroseFastFlow陰離子交換層析取出DEAF-SepharoseFastFlow凝膠，室溫放置以達(dá)到溫度平衡，取6L凝膠裝柱，以30mM，pH6.0的醋酸鈉緩沖溶液平衡洗柱，平衡液用量12倍柱體積。將上柱液IOL上樣于平衡好的DEAE-SepharoseFastFlow柱(9.5xll0cm)，用30mM，pH6.0的醋酸鈉緩沖溶液洗柱，洗柱液用量10倍柱體積，流速2.0L/h，以pH6.0,20mM的檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液洗脫，流速4.5L/h，洗脫溫度控制在2-8'C。同時(shí)于紫外光280nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄層析圖譜，選擇性收集含有al-AT為主要成分的組分。(3)S印hacrylS-200凝膠過(guò)濾層析取SephaerylS-200凝膠5L，于室溫放置2h達(dá)到溫度平衡后裝柱，以30Mm，pH7.2的醋酸鈉緩沖溶液平衡洗柱，平衡液用量10倍柱體積，以lMNaOH溶液將層析后收集的al-AT組分調(diào)至pH7.2，上樣于平衡好的Sephacryl5-200柱(7.5x90cm)，用相同的緩沖液以1.5L/h的流速洗脫，洗脫溫度控制在2-8°C。同時(shí)于紫外光280nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄層析圖譜，選擇性地收集al-AT的組分。(4)超濾脫鹽濃縮經(jīng)層析純化的al-AT溶液泵入超濾機(jī)，用無(wú)熱原注射用水550L超濾脫鹽，超濾膜截留分子量為100KD,濃縮到蛋白含量12%。(5)巴氏消毒從超濾器中泵出蛋白濃縮液，加無(wú)熱原注射用水稀釋到蛋白含量2%,加入55mM甘氨酸和32%麥芽糖作為巴氏消毒的保護(hù)劑。蛋白溶液于60士0.5'C保溫IO小時(shí)，滅活血漿蛋白制品中的病毒。(6)凍干分裝巴氏滅活的al-AT蛋白液真空凍干，含水量控制在3%以下，凍干粉按照500mg蛋白/瓶無(wú)菌分裝，轉(zhuǎn)入待檢品庫(kù)。(7)干熱消毒/全檢包裝凍干品置8(TC保溫庫(kù)放置72小時(shí)滅活制品病毒，轉(zhuǎn)入成品庫(kù)全檢包裝。權(quán)利要求1.一種從人血漿組分FIV沉淀中分離純化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步驟(A)血漿沉淀預(yù)處理取FIV沉淀加溶解液稀釋到蛋白含量2％～5％，pH8.0～8.5，離子強(qiáng)度0.09-0.12，溫度控制在2～8℃攪拌過(guò)夜，按照0.5％～15％的比例(W/V)加入硅酸鹽助劑在2-8℃攪拌1h，固液分離，取上清液，按照0.5％-15％的比例(W/V)再次加入硅酸鹽助劑在2-8℃攪拌3h，固液分離，取上清液進(jìn)樣層析柱；(B)陰離子凝膠層析取凝膠，室溫放置達(dá)到溫度平衡后裝柱，以緩沖液洗脫平衡，pH6.0～6.5，平衡量為柱體積的8～12倍，將上清液上樣于平衡好的層析柱，用緩沖液洗脫，pH6.0～6.5，溫度控制在2～8℃，洗柱8～10倍柱體積，于紫外光280nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄層析圖譜，選擇性地收集以含有a1-AT為主要成分的組分；(C)凝膠過(guò)濾層析取凝膠，室溫放置達(dá)到溫度平衡后裝柱，以緩沖液平衡，將層析后收集的a1-AT的組分調(diào)至pH7.0-7.5，上樣于平衡好的Sephacryl5-200柱，用相同的緩沖液洗脫，同時(shí)于紫外光280nm波長(zhǎng)下自動(dòng)監(jiān)測(cè)，記錄層析圖譜，選擇性地收集a1-AT的組分；(D)超濾脫鹽濃縮；(E)巴氏病毒滅活將濃縮蛋白液加無(wú)熱原注射用水稀釋，加入保護(hù)劑，于60±0.5℃保溫8～12小時(shí)，滅活血漿蛋白制品中的病毒；(F)凍干分裝巴氏滅活的a1-AT蛋白液經(jīng)除菌過(guò)濾，轉(zhuǎn)入凍干機(jī)真空凍干；(G)干熱消毒分裝的凍干粉針?lè)胖糜诒貛?kù)中保溫，滅活病毒，轉(zhuǎn)入成品庫(kù)全檢包裝。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟A的溶解液為為8~18mM的磷酸鹽緩沖液或30~35mM的醋酸鹽緩沖液；溶解液中添加的助劑為硅藻土、珍珠巖，添加劑的用量為每100毫升溶解液添加0.5克-15克。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟A中的固液分離采用高速離心分離或板框加壓過(guò)濾，分離溫度控制在4'C，固液分離后上清液調(diào)節(jié)到pH5.5-6.5。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟B中離子交換層析填料為DEAF-SepharoseFastFlow凝膠，洗脫液為8~18mM的磷酸鹽緩沖液或30~35mM的醋酸鹽緩沖液或12~25mM的檸檬酸鹽緩沖液，流速控制在2.0~4.5L/h。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟C中凝膠過(guò)濾層析填料為SephacrylS-200凝膠，洗脫液為8~18mM的磷酸鹽緩沖液或30~35mM的醋酸鹽緩沖液或12~25mM的檸檬酸鹽緩沖液，pH7.0-7.5，洗脫量為柱體積的8-12倍，流速控制在每小時(shí)1.5~3.5倍柱體積，洗脫溫度控制在2-8°C。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于:所述步驟D是將經(jīng)層析純化的al-AT溶液泵入超濾機(jī)，用無(wú)熱原注射用水超濾脫鹽，超濾膜截留分子量為IOOKD。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟E稀釋到蛋白含量控制在1.5%-2.5%，pH6.4-6.8。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟E中巴氏消毒的保護(hù)劑為甘氨酸和麥芽糖混合保護(hù)劑，甘氨酸含量控制在45-55mM，麥芽糖含量控制在25%-35%。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟F中所述除菌過(guò)濾采用的除菌膜孔徑0.22111!1，真空凍干含水量控制在3%以下。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟G中凍干制品的保溫溫度為80°C，保溫時(shí)間為60~72小時(shí)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種人血漿組分FIV沉淀中分離純化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步驟(A)血漿沉淀預(yù)處理；(B)陰離子凝膠層析；(C)凝膠過(guò)濾層析；(D)超濾脫鹽濃縮；(E)巴氏病毒滅活；(F)凍干分裝；(G)干熱消毒。本發(fā)明是以人血白蛋白生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的棄料FIV組分沉淀為原料，采用層析技術(shù)分離純化一種蛋白酶抑制劑即α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)，建立α1-AT濃縮制劑的生產(chǎn)工藝。本方法制備的產(chǎn)品純度好、收率高，操作簡(jiǎn)單易行，同時(shí)占用設(shè)備少、勞動(dòng)強(qiáng)度小、能耗低，以白蛋白生產(chǎn)的廢棄物料作原料，生產(chǎn)成本低。文檔編號(hào)C07K14/81GK101274956SQ20081002737公開(kāi)日2008年10月1日申請(qǐng)日期2008年4月11日優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日發(fā)明者呂應(yīng)年,朱光祖申請(qǐng)人:三九集團(tuán)湛江開(kāi)發(fā)區(qū)雙林藥業(yè)有限公司