專利名稱：蛋白酶活化受體-1(par1)的拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白酶活化受體-l(PARl)的抗體和抗原結(jié)合分子拮抗劑。
背景技術(shù)：
蛋白酶活化受體l(PARl)是屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GCPR)類別的凝血 酶受體。PARI在多種組織例如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神 經(jīng)元和Ajk小板中表達(dá)。其涉及與止血、增殖和組織損傷相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)答。 通過PAR1經(jīng)凝血酶介導(dǎo)的對(duì)血小板聚集的刺激是血管中血塊形成和傷口 愈合中重要的步驟。凝血酶以如下方式活化PARI:蛋白水解去除PARI 的細(xì)胞外N-端結(jié)構(gòu)域的一部分并暴露新的PARI N-端。然后，新PARI N-端的頭幾個(gè)氨基酸(SFLLRN; SEQ ID NO:37)作為束縛配體(tethered ligand)起作用，所述束縳配體與受體的另一部分結(jié)合，通過結(jié)合的G-蛋白 起始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。也可以通過血塊形成中涉及的其他絲氨酸蛋白酶活化 PARI,
對(duì)PARl-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)具有若干種治療性應(yīng)用。PARI 的抑制有助于治療血栓形成和血管增生病癥和抑制癌癥的發(fā)展。見例如 Darmoul，等，Mol Cancer Res (2004) 2(9):514曙22和Salah， et al, Mol Cancer Res (2007) 5(3):229-40。 PARI抑制劑(包括拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子)可用于治療由PARI細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的大量疾病狀況。例如，PARI 抑制劑(包括拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子)可用于預(yù)防或抑制慢性腸道炎 性病癥，包括炎性腸病(IBD)、腸易激綜合征(IBS)和潰瘍性結(jié)腸炎；和纖 維變性病癥，包括肝纖維化和肺纖維化。見例如Vergnolle，等，J Clin Invest (2004) 114(10):1444; Yoshida， et al， Aliment Pharmacol Ther (2006) 24(Suppl 4):249; Mercer，等，Ann NY Acad Sci (2007) 1096:86-88; Sokolova and Reiser, Pharmacol Ther (2007) PMID:17532472。 PARI抑制劑(包括 拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子)還可用于預(yù)防或抑制缺血-再灌注損傷，包括 心肌、腎、腦和腸的缺血-再灌注損傷。參閱例如Strande，等，Basic Res. Cardiol (2007) 102(4):350-8; Sevastos，等，Blood (2007) 109(2):577-583; Junge，等，Proc Natl Acad Sci USA. (2003) 100(22): 13019-24和Tsuboi，等， Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2007) 292(2):G678陽83。抑制PARI 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也可用于抑制細(xì)胞的單純皰疹病毒(HSV1和HSV2)感 染。見Sutherland，等，J Thromb Haemost (2007) 5(5):1055-61。
發(fā)明概述
本發(fā)明一方面提供抗人蛋白酶活化受體-l(hPARl)的單克隆拮抗劑抗 體或抗原結(jié)合分子。該抗體或抗原結(jié)合分子以和第二抗體相同的結(jié)合特異 性結(jié)合人PAR1。所述第二抗體具有(i)SEQIDNO:5的重鏈可變區(qū)序列和 SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)序列，或(ii) SEQ ID NO:7的重鏈可變區(qū)序列 和SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)序列。
在一些實(shí)施方案中，抗體與下述hPARl表位特異結(jié)合，所述表位包 含氨基酸序列 SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)或其片段，例如至少8、 9、 10、 11、 12、 13、 14或15個(gè)連續(xù)^JL 酸的片段。在一些實(shí)施方案中，抗體不與來自其他物種的PARI (例如小 鼠PARI (mPARl))或除PARI以外的其它PAR亞型如蛋白酶活化受體 -2(PAR2)發(fā)生顯著結(jié)合(即交叉反應(yīng))。
一些抗體或抗原結(jié)合分子具有SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQID NO:23的重鏈互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)序列；或SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的輕鏈CDR序列。這些分子中的一些具有分別 為SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重鏈CDRl、 CDR2 和CDR3序列；和分別為SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26 的輕鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列。
一些抗體或抗原結(jié)合分子具有SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的重鏈互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)序列；或SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的輕鏈CDR序列。這些分子中的一些具有分別 為SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重鏈CDRl、 CDR2 和CDR3序列；和分別為SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32 的輕鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列。
一些抗體或抗原結(jié)合分子具有與SEQ ID NO:5至少85%、卯％、95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同一性的重鏈可變區(qū)氨基酸序列，和與 SEQIDNO:6至少85%、卯％、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100% 同一性的輕鏈可變區(qū)^J^酸序列。而其他一些具有與SEQ ID NO:7至少 85%、卯％、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同一性的重鏈可變 區(qū)^J^紗列，和與SEQIDNO:8至少85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同一性的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。 一些分子具有SEQ ID NO: 5的重鏈可變區(qū)氨基^列和SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)^J^絲 列。其他一些具有SEQ ID NO:7的重鏈可變區(qū)M酸序列和SEQ ID NO:8 的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
一些抗體或抗原結(jié)合分子具有與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7至少 85%、卯％、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同一性的重鏈可變 區(qū)JL&酸序列。 一些抗體或抗原結(jié)合分子具有與SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8至少85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同一性 的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
本發(fā)明的一些抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子是小鼠抗體。其他一些 是嵌合抗體。 一些抗-hPARl分子是人源化抗體。其他一些是人抗體。還有一些其他的是單鏈抗體、Fab片段或具有來自人纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域 的支架(scaffold)的單抗體(monobody)。
另一方面，本發(fā)明提供了分離或重組的多核苷酸，其編碼含有抗 -hPARl抗體或抗原結(jié)合分子的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的多肽。 一些多 核苷酸編碼含有人抗體可變區(qū)的多肽。該多肽可含有分別為SEQ ID NO:21、 SEQIDNO:22和SEQIDNO:23的重鏈CDR1、 CDR2和CDR3 序列；和分別為SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的輕鏈 CDR1、 CDR2和CDR3序列。多肽也可含有分別為SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重鏈CDR1 、 CDR2和CDR3序列；和分別 為SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的輕鏈CDRl、 CDR2 和CDR3序列。
一些多核苷酸編碼與SEQ ID NO:5的成熟區(qū)至少卯％同一性的成熟 重鏈可變區(qū)序列，和/或與SEQ ID NO:6的成熟區(qū)至少90%同一性的成熟 輕鏈可變區(qū)序列。 一些其他的編碼與SEQ ID NO:7至少90%同一性的成 熟重鏈可變區(qū)氨基酸序列，和/或與SEQ ID NO:8至少卯％同一性的成熟 輕鏈可變區(qū)^J^酸序列。 一些多核苷酸編碼與SEQ ID NO:5的成熟區(qū)相同 的成熟重鏈可變區(qū)序列，和/或與SEQ ID NO:6的成熟區(qū)相同的成熟輕鏈 可變區(qū)序列。一些其他的編碼與SEQIDNO:7的成熟區(qū)相同的成熟重鏈可 變區(qū)序列，和/或與SEQIDNO:8的成熟區(qū)相同的成熟輕鏈可變區(qū)序列。
本發(fā)明另一方面提供分離的宿主細(xì)胞，其含有(l)重組DNA區(qū)段，其 編碼本發(fā)明的抗-PARl抗體或抗原結(jié)合分子的重鏈；和(2)第二重組DNA 區(qū)段，其編碼抗體或抗原結(jié)合分子的輕鏈。在一些宿主細(xì)胞中，所述DNA 區(qū)段各自與啟動(dòng)子有效連接并能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)。 一些宿主細(xì)胞能夠 表達(dá)人來源的抗-PARl抗體或抗原結(jié)合分子。 一些宿主細(xì)胞能夠表達(dá)下述 抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子，所述抗體或抗原結(jié)合分子含有分別為 SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重鏈CDR1、 CDR2 和CDR3序列；和分別為SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26 的輕鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列。 一些其他的表達(dá)下述抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子，所述抗體或抗原結(jié)合分子含有分別為SEQIDNO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列； 和分別為SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的輕鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列。
本發(fā)明提供了包含與人PAR1的表位特異結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合分子 的藥物組合物，其中所述表位包含氨基酸序列 SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)或其片段，且 其中所述抗體或抗原結(jié)合分子是PAR1拮抗劑。組合物中使用的抗體和抗 原結(jié)合分子的實(shí)施方案如本文所述。
本發(fā)明提供了改善疾病狀況之癥狀的方法，所述疾病狀況由通過 PARI的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)，所述方法包括對(duì)有需要的受試者施用與人 PARI表位特異結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合分子，其中所W位包含氨基i^ 列SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)或其片段， 且其中所述抗體或抗原結(jié)合分子是PAR1拮抗劑。該方法中使用的抗體和 抗原結(jié)合分子的實(shí)施方案如本文所述。
在一些實(shí)施方案中，疾病狀況由通過PAR1的異常細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介 導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，疾病狀況是血栓形成或血管增殖病癥。在一些實(shí) 施方案中，疾病狀況是異常表達(dá)PAR1的癌癥，例如癌(carcinomas)或 上皮癌，包括例如皮膚癌(包括黑素瘤)、胃腸癌(包括結(jié)腸癌)、肺癌 和乳腺癌(包括乳癌和導(dǎo)管癌)、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、腺癌 等等。在一些實(shí)施方案中，疾病狀況是慢性腸道炎性病癥，例如炎性腸病 (IBD)、腸易激綜合征(IBS)和潰瘍性結(jié)腸炎。在一些實(shí)施方案中，疾病狀 況是纖維變性病癥，例如肝纖維化和肺纖維化。
在一些實(shí)施方案中，疾病狀況由通過PAR1的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)， 所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以是或不是異常的。在一些實(shí)施方案中，所迷方法涉及抑 制或預(yù)防缺血-再灌注損傷，包括心肌、腎、腦和腸的缺血-再灌注損傷。 在一些實(shí)施方案中，所述方法涉及抑制或預(yù)防細(xì)胞的單純皰疹病毒(HSV1 和HSV2)感染?？蓞⒖颊f明書的剩余部分和權(quán)利要求書實(shí)現(xiàn)對(duì)本發(fā)明的本質(zhì)和優(yōu)點(diǎn) 的進(jìn)一步理解。
定義
除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。以下的參考文獻(xiàn)為技術(shù)人
員提供了本發(fā)明中使用的許多術(shù)語的 一般定義Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith等(eds.), Oxford University Press (revised ed.， 2000); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton等(Eds.)， John Wiley & Sons (3PrdP ed.， 2002);和A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.)， Oxford University Press (4PthP ed.， 2000)。另外，提供以下的定義
幫助讀者實(shí)踐本發(fā)明。
術(shù)語"抗體"和"抗原結(jié)合分子"用于表示多肽鏈，其對(duì)(一個(gè)或多個(gè))
給定的表位顯示出強(qiáng)的單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)結(jié)合。除非另有說明，本發(fā)明的 抗體或抗原結(jié)合分子可具有來自任何脊推動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、駝科(camelid)、 禽或魚綱物種的序列。它們可使用任何合適的技術(shù)產(chǎn)生，例如雜交瘤技術(shù)、 核糖體展示、噬菌體展示、基因改組文庫、半合成或全合成的文庫或其組 合。如本文所詳述的，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合分子包括完整的抗體、抗 原結(jié)合多肽鏈和其他i殳計(jì)抗體(designer antibody)(見例如Serafmi， J Nucl Med. 34:533-6， 1993 )。
完整的"抗體，，通常包含通過二硫鍵相互連結(jié)的至少兩條重(H)鏈(約 50-70 kD)和兩條輕(L)鏈(約25kD)。公認(rèn)的編碼抗體鏈的免疫球蛋白 基因包括k、 k、 ou y、 & s和H恒定區(qū)基因，以及無狄疫球蛋白可變 區(qū)基因。輕鏈被劃分為K或k。重鏈被劃分為y、 p、 a、 8或￡，它們又分 別定義免疫球蛋白類型IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。
抗體的每一條重鏈都由重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為HCVR或VH) 和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、 CH2和CH3組成。
12每一條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為L(zhǎng)CVR或VL)和輕鏈恒定區(qū) 組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗 原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或 因子的結(jié)合，所述組織或因子包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞) 和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一個(gè)組分(Clq)。
抗體的VH和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，也稱作互補(bǔ)性決定區(qū) (CDR)，其間點(diǎn)綴更加保守的構(gòu)架區(qū)(FR)。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和 四個(gè)FR組成，按以下的順序從氨基端到氣基端排列為FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。例如Kabat等，Sequences of Proteins of
Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1987 and 1991)已定義了 CDR和FR區(qū) 的定位和編號(hào)體系。
來自免疫球蛋白成熟重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸分別被命名為Hx和 Lx，其中x是根據(jù)Kabat等上引文的方案定義M酸位置的編號(hào)。Kabat 等針對(duì)各亞組的抗體列出了許多氨基酸序列，并針對(duì)該亞組中每個(gè)殘基位 置列出最常存在的氨基酸，以產(chǎn)生共有序列。Kabat等使用向所列序列中 各^J^酸指定殘基編號(hào)的方法，并且指定殘基編號(hào)的該方法已成為本領(lǐng)域 中的標(biāo)準(zhǔn)。通過參考保守氨基酸將問題抗體與Kabat等中的共有序列之一 進(jìn)行比對(duì)，可將Kabat的方案擴(kuò)展至他的目錄中未包含的其他抗體。使用 Kabat編號(hào)體系能容易地鑒定不同抗體中等價(jià)位置上的氨基酸。例如，人 抗體L50位置上的氨基酸占據(jù)與小鼠抗體M酸位置L50等價(jià)的位置。同 樣地，當(dāng)根據(jù)Kabat編號(hào)規(guī)則比對(duì)相應(yīng)核酸編碼的氨基酸序列時(shí)，可以比 對(duì)編碼抗體鏈的核酸。
抗體或抗原結(jié)合分子還包括含有完整抗體的抗原結(jié)合部分的抗體片 段，其保留結(jié)合關(guān)連(cognate)抗原的能力。這類抗體片段的實(shí)例包括(i)Fab 片段，其為由VL、 VH、 CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab，)2 片段，其為包含兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段，所述兩個(gè)Fab片段由鉸鏈區(qū)的 二石克鍵連接；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段;(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward 等，Nature 341:544-546， 1989);和(vi)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。另夕卜， 盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH可以由獨(dú)立的基因編碼，但是也可使 用重組的方法，通過合成的接頭將它們連接在一起，使得它們能夠被制成 單一蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱作單鏈Fv(scFv); 見例如Bird等，Science 242:423-426， 1988;和Huston等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883， 1988 )。
本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合分子還包括一條或多條與其他蛋白質(zhì)化學(xué) 綴合或表達(dá)為與其他蛋白質(zhì)的融合蛋白的免疫球蛋白鏈。還包括雙特異性 抗體。雙特異性或雙功能抗體是具有兩個(gè)不同的重^/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同的
結(jié)合位點(diǎn)的人工雜種抗體。本發(fā)明的其他抗原結(jié)合片段或抗體部分包括二 價(jià)scFv (雙抗體) 一一其中抗體分子識(shí)別兩種不同表位的雙特異性scFV 抗體、單結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dAb)和小抗體(minibody)。
可以通過完整抗體的酶學(xué)修飾或化學(xué)修飾產(chǎn)生本文所述的各種抗體 或抗原結(jié)合片段，或使用重組DNA方法從頭合成(例如單鏈Fv)，或使 用噬菌體展示文庫鑒定(見例如McCafferty等，Nature 348:552-554， 1990 )。例如，可使用本領(lǐng)域例如Vaughan and SoHazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001中所述方法產(chǎn)生小抗體?？赏ㄟ^大量方 法產(chǎn)生雙特異性抗體，所述方法包括雜交瘤的融合或Fab'片段的連接。見 例如Songsivilai & Lachmann， Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny等，J. Immunol. 148,1547-1553 (1992)?？墒褂檬删w展示文庫或 核糖體展示文庫、基因改組文庫鑒定單鏈抗體。這類文庫可從合成的、半 合成的或幼稚的(nave)和具有免疫活性的來源構(gòu)建。
"嵌合抗體"是一種抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、替換或
更換，從而抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))與類型、效應(yīng)子功能和/或物種不同或 改變的恒定區(qū)連接，或與賦予嵌合抗體新特性的完全不同的分子連接，所 述分子例如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物等；或(b)可變區(qū)或其部分用 具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)更換、替換或改變。例如，如下文實(shí)施例中所示，可通過用來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)替換小鼠抗-hPARl 抗體的恒定區(qū)對(duì)其進(jìn)行修飾。歸因于用人恒定區(qū)的替換，該嵌合抗體能夠 保留其識(shí)別人PAR1的特異性，同時(shí)與原始的小鼠抗體相比在人中具有降 低的抗原性。
"人源化的"抗體是保持非人抗體的反應(yīng)性但在人中免疫原性較低的抗 體。這可以通過例如保留非人CDR區(qū)并將抗體的剩佘部分替換為其人類 對(duì)應(yīng)物(即恒定區(qū)以及可變區(qū)的構(gòu)架部分)達(dá)成。見例如Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855， 1984; Morrison and Oi， Adv. Immunol.， 44:65-92, 1988; Verhoeyen等，Science, 239:1534-1536， 1988; Padlan， Molec. Immun" 28:489-498， 1991;和Padlan， Molec. Immun.， 31:169-217， 1994。
術(shù)語"抗體結(jié)合分子"或"非抗體配體"是指使用非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)
支架的抗體才莫擬物，包括adnectin、 avimer、單鏈多肽結(jié)合分子和抗體樣 結(jié)合性肽模擬物(antibody-like binding peptidomimetic)。
本文使用術(shù)語"拮抗劑"是指下述藥劑(agent)，所述藥劑能夠特異結(jié)合 受體并抑制通過受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以完全阻斷或可檢測(cè)地抑制受體介導(dǎo)的 應(yīng)答。例如，PARI的拮抗劑特異地結(jié)合該受體，并全部或部分地抑制 PARl-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一些情況下，能夠通過PARl拮抗劑的下述能 力對(duì)其進(jìn)行鑒定其能夠結(jié)合PAR1并抑制繼自PARI的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 出現(xiàn)的凝血酶誘導(dǎo)的鈣流或凝血酶誘導(dǎo)的IL-8生產(chǎn)(例如在FlipR測(cè)定法 中測(cè)量，或通過ELISA測(cè)量)。另外的測(cè)定法由Kawabata，等，J Pharmacol Exp Ther. (l外9) 288(l):358-70描述。當(dāng)來自與本發(fā)明拮抗劑接觸的PARI 的PARI細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如通過鉤流或IL-8生產(chǎn)所測(cè)量的)與來自未 與拮抗劑接觸的對(duì)照PARI的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相比減少至少約10%，例如 減少至少約25%、 50%、 75%或被完全抑制時(shí)，發(fā)生抑制。對(duì)照PAR1可 不與抗體或抗原結(jié)合分子接觸、或與特異結(jié)合另 一抗原的抗體或抗原結(jié)合 分子接觸，或與已知不作為拮抗劑起作用的抗-PARl抗體或抗原結(jié)合分子 接觸。"抗體拮抗劑"是指拮抗劑是抑制性抗體的情況。術(shù)語"蛋白酶活化受體-l"、"蛋白水解酶活化受體-l，，或"PARl，，可互換 地表示通過凝血酶切割以暴露N-端束綽配體而被活化的G-蛋白偶聯(lián)受體。 PARI還稱為"凝血酶受體"和"凝血因子II受體前體"。見例如Vu，等，Cell (1991) 64(6):1057-68; Coughlin， et al， J Clin Invest (1992) 89(2):351-55;和 GenBank登錄號(hào)NM—001992。束縳配體與PARI細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的分子內(nèi) 結(jié)合引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣流。見例如Traynelis and Trejo， Curr Opin Hematol (2007) 14(3):230-5;和Hollenberg， et al， Can J Physiol Pharmacol. (1997)75(7):832-41。 PARI的核苷酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的。見例 如Vu，等，Cell (1991) 64(6): 1057-68; Coughlin， et al， J Clin Invest (1992) 89(2):351-55;和GenBank登錄號(hào)NM—001992。人PARI的核酸序列作為 GenBank登錄號(hào)NM_001992(也見M62424.1和gi4503636 乂>開。人PARI 的^J^^^列作為NP_001983和AAA36743公開。本文使用的PARI多 肽在功能上是G蛋白偶聯(lián)受體，其被凝血酶活化，并在N-端束綽配體結(jié) 合后引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣流。PARlM^f列在結(jié)構(gòu)上與GenBank 登錄號(hào)NP—001983、 AAA36743或M62424.1的^J^酸有至少約90%、91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%的序列同一 性。PARI核苷酸序列在結(jié)構(gòu)上與GenBank登錄號(hào)NM_001992或 M62424.1的^J^酸有至少約90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%的序列同一性。
抗體或抗原結(jié)合分子的結(jié)合特異性是指抗體或抗原結(jié)合分子個(gè)體的 結(jié)合部位(combining site)與僅一種抗原決定簇反應(yīng)的能力。典型的抗體的 結(jié)合部位位于分子的Fab部分，并由重鏈和輕鏈的高變區(qū)組成。在一些實(shí) 施方案中，結(jié)合特異性是指被本發(fā)明的抗體優(yōu)先結(jié)合的PARI多肽中的特 定表位(例如SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE或其片段)。共
有對(duì)特定表位的結(jié)合特異性的抗體會(huì)竟?fàn)幗Y(jié)合該表位。如使用本領(lǐng)域已知 的任何結(jié)合測(cè)定法例如固相放射免疫測(cè)定法(SPRIA)所測(cè)量的，與共同表 位竟?fàn)幗Y(jié)合的抗體能夠彼此置換與該共同表位結(jié)合，在所述SPRIA測(cè)定法 中用放射性同位素標(biāo)記第一竟?fàn)幮钥贵w或第二竟?fàn)幮钥贵w。共享結(jié)合特異性的竟?fàn)幮钥贵w并不必與同一表位結(jié)合，而是可以與重疊的表位結(jié)合，從 而允許在結(jié)合測(cè)定法中發(fā)生竟?fàn)幮灾脫Q。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合特異性
是指與本發(fā)明的抗體優(yōu)先結(jié)合的PAR亞型(例如PARI對(duì)PAR2或另一 PAR亞型，例jn PAR3或PAR4 )。
結(jié)合親合力(binding affinity)是單個(gè)抗原決定簇和抗體或抗原結(jié)合分 子上的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間反應(yīng)的強(qiáng)度。其是作用于抗原決定簇和結(jié)合位點(diǎn) 之間的吸引力和排斥力的總和。親和力(affinity)是描述抗原抗體反應(yīng)的平 衡常數(shù)。
短語"特異(或選擇性)結(jié)合"是指在一群異質(zhì)蛋白質(zhì)和其他生物制品 中抗體或抗原結(jié)合分子(例如抗-hPARl抗體)和關(guān)連抗原(例如人PARI 多肽)之間的優(yōu)先結(jié)合反應(yīng)。短語"識(shí)別抗原的抗體"和"對(duì)抗原特異的抗體" 在本文中與術(shù)語"特異結(jié)合抗原的抗體"可互換使用。公認(rèn)的是抗體和非靶
標(biāo)表位之間可能發(fā)生某種程度的非特異相互作用。然而，特異結(jié)合可以通 過如下方式辨別其通過對(duì)靶標(biāo)表位的特異識(shí)別來介導(dǎo)。特異結(jié)合通常導(dǎo) 致在遞送的分子和帶有耙標(biāo)表位的實(shí)體(例如測(cè)定孔或細(xì)胞)之間比在所 結(jié)合抗體和缺乏靶標(biāo)表位的實(shí)體(例如測(cè)定孔或細(xì)胞)之間有強(qiáng)得多的結(jié) 合。特異結(jié)合通常導(dǎo)致與結(jié)合到缺乏靶標(biāo)表位的細(xì)胞或組織上的抗-PARl 抗體數(shù)量(每單位時(shí)間)相比，結(jié)合到帶有靶標(biāo)表位的細(xì)胞或組織上的抗 -PARI抗體數(shù)量(每單位時(shí)間)有大于約10倍且最優(yōu)選大于100倍的增 加。兩個(gè)實(shí)體之間的特異結(jié)合一般意味著至少1(^M"的親和力。優(yōu)選大于 108 M—1的親和力。可使用本領(lǐng)域已知用于抗體結(jié)合的任何測(cè)定法測(cè)定特異 結(jié)合，包括Western印跡、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)。
術(shù)語"表位，，表示能夠特異結(jié)合抗體的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由分子 的化學(xué)活性表面定群(grouping )如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，并通常具有特 異的三維結(jié)構(gòu)特征以及特異的電荷特征。構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位的區(qū)別在 于存在變性劑時(shí)與前者的結(jié)合喪失而與后者的結(jié)合則不喪失。
術(shù)語"核酸，，在本文中與術(shù)語"多核苷酸"可互換使用，并表示單鏈或雙 鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術(shù)語包括含有已知核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或鍵的核酸，其可以是合成的、天然存在 的和非天然存在的，其具有與參照核酸類似的結(jié)合特性，且其以類似于參 照核苷酸的方式代謝。這些類似物的實(shí)例包括，但不僅限于硫代磷酸酯、
氨基磷酸酯、曱基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另有說明， 一個(gè)特定的核酸序列還隱含包括其保守修飾(例如簡(jiǎn) 并密碼子替代)變體和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。特別地，如下文 所述，可通過產(chǎn)生下述序列達(dá)成簡(jiǎn)并密碼子替代，其中一個(gè)或多個(gè)選定的 (或所有)密碼子的第三位被替代為混合的威基和/或脫氧肌苷殘基(Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19:5081， 1991; Ohtsuka等，J. Biol. Chem. 260:2605-2608， 1985;和Rossolini等，Mol. Cell. Probes 8:91-98， 1994)。
術(shù)語"氨基酸"是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以類似于天然存 在的氨基酸的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的 氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及^皮隨后修飾的氨基酸(例如羥脯 氨酸、y-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸)。氨基酸類似物是指與天然存在的 氨基酸具有相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(即與氫、羧基、氨基和R基團(tuán)結(jié)合的a碳) 的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸曱基锍。 這類類似物具有修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但是保 留與天然存在的M酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指下述化合 物，其具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但是以類似于天然存在
的氨基酸的方式發(fā)揮作用。
術(shù)語"多肽"和"蛋白質(zhì)，，在本文中可互換使用表示氨基酸殘基的聚合 物。該術(shù)語適用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合 物，以及其中 一個(gè)或多個(gè)M酸殘基是相應(yīng)天然M酸的人工化學(xué)模擬物 的氨基酸聚合物。除非另有說明， 一個(gè)特定的多肽序列也隱含包括其保守 修飾的變體。
術(shù)語"保守修飾的變體"適用于氨基酸和核酸序列。就具體的核酸序列 而言，保守修飾的變體是指這些核酸編碼相同或基本相同的氨基酸序列，
18或當(dāng)這些核酸不編碼M酸序列時(shí)，編碼基^目同的序列。由于遺傳密碼 的簡(jiǎn)并性，任何給定的蛋白質(zhì)都可以由大量功能上相同的核酸編碼。例如，
密碼子GCA、 GCC、 GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在密碼 子規(guī)定丙氨酸的每個(gè)位置上，均可以將該密碼子改變?yōu)樗龅娜魏蜗鄳?yīng)密 碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是"沉默變異"，其是保守 修飾變異的一種。本文中編碼多肽的每條核酸序列也描述了該核酸的每種 可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，核酸中的每個(gè)密碼子(除了 AUG, 其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子) 均可以被改變，以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，在描述的每個(gè)序列中暗 含了編碼多肽的核酸的每個(gè)沉默變異。
對(duì)多肽序列而言，"保守修飾的變體"包括對(duì)多肽序列的替代、缺失或 添加，其導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸替代。提供功能相似氨基酸的 保守替代表是本領(lǐng)域公知的。這類保守修飾的變體還可以是并且不排除多 態(tài)變體、種間同源物和本發(fā)明的等位基因。以下八組含有彼此是保守性替 代的氨基酸l)丙氨酸(A)、甘氨酸(G); 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E); 3)天 冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q); 4)精氨酸(R)、賴氨酸(K); 5)異亮氨酸(1)、亮氨 酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V); 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W); 7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(見例如 Creighton， Proteins (1984))。
與兩條或兩條以上核酸或多肽序列相關(guān)時(shí)，術(shù)語"同一(相同)"或百分 比"同 一性，，是指相同的兩條或兩條以上序列或亞序列。如果使用以下的序 列比較算法之一測(cè)量或通過手工比對(duì)和目視觀察測(cè)量，當(dāng)在比較窗口或指 定區(qū)域中為獲得最大對(duì)應(yīng)而進(jìn)行比較和比對(duì)時(shí)兩條序列具有規(guī)定百分比 的相同氨基酸殘基或核苷酸(即在指定區(qū)域上或當(dāng)在不指定時(shí)在整條序列 上有60%同一性，任選地65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或 99%同一性)，則這兩條序列是"基本同一"的。任選地，同一性存在于長(zhǎng) 度至少約50個(gè)核苷酸(或10個(gè)氨基酸)的區(qū)域上，或更優(yōu)選存在于長(zhǎng)度 為100到500或1000到更多個(gè)核苷酸(或的區(qū)域上。
對(duì)序列比較而言，通常一條序列作為與待測(cè)序列進(jìn)行比較的參照序 列。使用序列比較算法時(shí)，將待測(cè)和參照序列輸入計(jì)算機(jī)，需要時(shí)指定亞 序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)?？墒褂媚J(rèn)的程序參數(shù)，或可指定 備選參數(shù)。隨后序列比較算法以程序參數(shù)為基礎(chǔ)計(jì)算待測(cè)序列相對(duì)于參照 序列的百分比序列同一性。
本文使用的"比較窗口 "包括提及具有選自以下的任一連續(xù)位置數(shù)目的
區(qū)段20到600，通常約50到約200，更通常約100到約150，其中可以 在將一條序列與具有相同連續(xù)位置數(shù)目的參照序列進(jìn)行最佳比對(duì)之后比 較該兩條序列。用于比較的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域^^知的。可如下進(jìn)行為 了比較的最佳序列比對(duì)，例如通過Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c, 1970的局部同源性算法；通過Needleman and Wunsch， J. Mol. Biol. 48:443， 1970的同源性比對(duì)算法；通過Pearson and Lipman， Proc. Nat，l. Acad. Sci. USA 85:2444， 1988的相似性搜索方法；通過這些算法的計(jì) 算機(jī)化執(zhí)行程序(Wisconsin Genetics軟件包中的TFASTA、 FASTA、 BESTFIT和GAP, Genetics Computer Group, Madison, WI);或通過手 動(dòng)比對(duì)和目視觀察(見例如Brent等,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed.， 2003))。
適用于測(cè)定百分比序列同 一 性和序列相似性的算法的兩個(gè)實(shí)例是 BLAST和BLAST 2.0算法，其分別描述于Altschul等，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402， 1977;和Altschul等，J, Mol. Biol. 215:403-410， 19卯中。公眾 可通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)獲得用于進(jìn)行BLAST分析的軟件。該算法涉及首先，通過 在查詢序列中鑒定長(zhǎng)度為W的短字來鑒定高得分序列對(duì)(HSP)，所述短字 當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)匹配或者滿足某正值閾分?jǐn)?shù)T。 T
是指相鄰字得分閾值(上引文Altschul等)。這些初始的相鄰字命中物(hit) 作為種子起作用，用于起始搜索以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長(zhǎng)HSP。將字命中物 在兩個(gè)方向上沿著每個(gè)序列延伸，只要累計(jì)的比對(duì)分?jǐn)?shù)能夠提高即可。對(duì)核苷酸序列而言，使用參數(shù)M(—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分?jǐn)?shù)；始終X))和N (錯(cuò)配殘基的懲罰分?jǐn)?shù)；始終<0)計(jì)算累計(jì)分?jǐn)?shù)。對(duì)M酸序列而言，使 用評(píng)分矩陣計(jì)算累計(jì)分?jǐn)?shù)。字命中物在每個(gè)方向上的延伸在下列情形下終 止當(dāng)累計(jì)比對(duì)分?jǐn)?shù)從其達(dá)到的最大值減少數(shù)量X時(shí)；當(dāng)累計(jì)分?jǐn)?shù)由于一 個(gè)或多個(gè)負(fù)分殘基比對(duì)的累計(jì)而走向零或低于零時(shí)；或當(dāng)達(dá)到任一序列的 終點(diǎn)時(shí)。BLAST算法參數(shù)W、 T和X決定比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN 程序(對(duì)核苷酸序列而言)默認(rèn)使用ll的字長(zhǎng)(W)、 IO的預(yù)期(E)、 M=5、 N二4和雙鏈比較。對(duì)氨基酸序列而言，BLASTP程序默認(rèn)使用3的字長(zhǎng)、 10的預(yù)期(E)、BLOSUM62評(píng)分矩陣(見Henikoff and Henikoff， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915， 1989 ) 50的比對(duì)(B)、 10的預(yù)期(E)、 M=5、 N=-4 和雙鏈比較。
BLAST算法還進(jìn)行兩條序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(見例如Karlin and Altschul， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787， 1993 ) 。 BLAST算 法提供的一種相似性度量是最小總和概率(P(N)),其指出兩條核苷酸或氨 基酸序列之間由偶然而發(fā)生匹配的概率。例如，如果在待測(cè)核酸與參照核 酸的比較中最小總和概率少于約0.2，更優(yōu)選少于約0.01，最優(yōu)選少于約 0.001,則認(rèn)為該核酸與參照序列類似。
除了上述的序列同 一性百分比以外，兩條核酸序列或多肽基本同 一的 另 一指標(biāo)是，第 一核酸編碼的多肽可與抗第二核酸編碼的多肽產(chǎn)生的抗體 發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，如下所述。因此，例如當(dāng)多肽與第二多肽的差異僅在 于保守性替代時(shí)，該多肽通常與第二多肽是基本同一的。兩條核酸序列基 本同一的另一指標(biāo)是，兩個(gè)分子或其互補(bǔ)體在嚴(yán)格條件下彼此雜交，如下 所述。兩條核^列基本同一的又一指標(biāo)是可使用相同的引物擴(kuò)增序列。
術(shù)語"有效連接"是指兩條或更多條多核苷酸(例如DNA)區(qū)段之間的 功能關(guān)系。通常，其是指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與^L轉(zhuǎn)錄序列的功能關(guān)系。例如， 如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列刺激或調(diào)控編碼序列在適當(dāng)宿主細(xì)胞或其他表 達(dá)體系中的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列與該編碼序列是有效連接的。 一般，與被轉(zhuǎn)錄序列有效連接的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列將在物理上與被轉(zhuǎn)錄序列毗鄰，即它們是順式作用的。然而， 一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列如增強(qiáng)子不必 與待由它們?cè)鰪?qiáng)轉(zhuǎn)錄的編碼序列在物理上毗鄰或緊靠。
術(shù)語"載體"旨在表示能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與^目連的另 一多核苷酸的多核苷酸分
子。 一種類型的載體是"質(zhì)粒"，其指額外的DNA區(qū)段可連接在其中的環(huán) 形雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可 以被連接進(jìn)病毒基因組中。某些載體能夠在其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制 (例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體 (例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)能夠在引入宿主細(xì)胞后整合進(jìn)宿主細(xì)胞的 基因組中，從而隨宿主基因組一起復(fù)制。另外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們 有效連接的基因的表達(dá)。這類基因在本文中稱作"重組表達(dá)栽體"(或簡(jiǎn)單 地稱作"表達(dá)載體")。通常，重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)栽體常為質(zhì)粒 形式。在本i兌明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換^f吏用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常使用 的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括提供等價(jià)功能的其他形式的表達(dá)載體， 如病毒載體(例如復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"(或簡(jiǎn)單地稱作"宿主細(xì)胞")是指其中引入了重 組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，這類術(shù)語旨在不僅指該特定的主題細(xì)胞， 而且指該細(xì)胞的后代。因?yàn)樵陔S后的世代中可由于突變或環(huán)境的影響發(fā)生 某些修飾，所以事實(shí)上這些后代與親本細(xì)胞可能不同，但是仍然包括在本 文使用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"的范圍內(nèi)。
術(shù)語"受試者，，包括人和非人動(dòng)物。非人動(dòng)物包括所有的脊推動(dòng)物，例 如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類、綿羊、犬、牛、雞、兩棲動(dòng)物 和爬行動(dòng)物。除非另有說明，術(shù)語"患者，，或"受試者"在本文中可互換使用。 術(shù)語"治療"包括施用化合物或藥劑，以預(yù)防或延遲疾病(例如腫瘤) 的癥狀、并發(fā)癥或生物化學(xué)指標(biāo)的出現(xiàn)，減輕癥狀或阻止或抑制疾病、狀 況或病癥的進(jìn)一步發(fā)展。治療可以是預(yù)防性的(以預(yù)防或延遲疾病的發(fā)生， 或預(yù)防其臨床或亞臨床癥狀的顯現(xiàn))，或是疾病顯現(xiàn)后癥狀的治療性阻抑 或減輕。
短語"信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑"或"信號(hào)途徑"(例如PARI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)是指至少一種生物化學(xué)反應(yīng)，但是更通常表示一系列生物化學(xué)反應(yīng)，其由細(xì) 胞與刺激性化合物或藥劑的相互作用引起。因此，刺激性化合物(例如凝 血酶)與細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致"信號(hào)"，所述信號(hào)通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳遞， 最終引起細(xì)胞應(yīng)答。
附圖概述


圖1顯示小鼠抗-hPARl抗體克隆4E7J14丄16和6E11.H6.A9的可變 區(qū)核苷酸序列(SEQ ID NOS:l-4)。加下劃線的殘基指出CDR區(qū)。其他殘 基表示構(gòu)架區(qū)。
圖2顯示小鼠抗-hPARl抗體克隆4E7.J14.L16和6E11.H6.A9可變區(qū) 的M酸序列(SEQ ID NOS:5-8)。加下劃線的序列表示CDR區(qū)，其他序 列部分表示構(gòu)架區(qū)。
圖3顯示由凝血酶刺激的HUVEC細(xì)胞的IL-8分泌被小鼠抗-hPARl 抗體克隆4E7J14丄16或6E11.H6.A9抑制。
圖4闡述了在鈣流(FlipR)測(cè)定法中測(cè)量的克隆4E7.J14的強(qiáng)拮抗劑活性。
圖5闡述了在鈣流(FlipR)測(cè)定法中測(cè)量的克隆6Ell.H6的強(qiáng)拮抗劑活性。
發(fā)明詳述
介紹
分子。在小鼠中產(chǎn)生的該抗-hPARl抗體或在體外創(chuàng)建的該嵌合抗-hPARl 抗體能夠與人PAR1多肽特異結(jié)合。另外，發(fā)現(xiàn)這些抗體能夠抑制PARI 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的活動(dòng)，例如凝血酶介導(dǎo)的白介素分泌。因此，這些抗體可 用作大量疾病或病癥的治療性或預(yù)防性藥劑，所述疾病或病癥由PARI信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性介導(dǎo)或與:M目關(guān)，例如腸易激綜合征或肝纖維化。以下的小節(jié) 提供了制造和使用本發(fā)明組合物的指導(dǎo)。2. 人PARI的拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子 a.綜述
本發(fā)明提供了特異結(jié)合人PARI的抗體或抗原結(jié)合分子。這些抗 -hPARl藥劑能夠拮抗PARI介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，例如PARI介導(dǎo)的白 介素分泌，如下文實(shí)施例中所述。制備單克隆或多克隆抗體的一般方法是 本領(lǐng)域公知的。見例如Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998; Kohler & Milstein, Nature 256:495-497， 1975; Kozbor等， Immunology Today 4:72， 1983;和Cole等,pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985。
優(yōu)選本發(fā)明的抗-hPARl抗體是單克隆抗體，如以下實(shí)施例中描述的 抗-hPARl抗體克隆4E7,J14丄16或克隆6E11.H6.A9。這兩個(gè)舉例的抗 -hPARl單克隆抗體的可變區(qū)的多核苷酸序列和氨基酸序列分別顯示在圖 1和圖2中。單克隆抗體是指來自單個(gè)克隆的抗體?？墒褂蒙a(chǎn)單克隆抗 體的任何技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的抗-hPARl抗體，例如B淋巴細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)化 或致癌性轉(zhuǎn)化。 一種制備雜交瘤的動(dòng)物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。小鼠中的雜交瘤生 產(chǎn)是一種已非常完善的操作程序。如以下的實(shí)施例中所闡述的，可通過用 hPARl多肽或其片段、融合蛋白或變體免疫非人動(dòng)物(例如小鼠)產(chǎn)生單 克隆抗-hPARl抗體。然后將分離自該動(dòng)物的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合， 產(chǎn)生生產(chǎn)抗體的雜交瘤?？赏ㄟ^在ELISA測(cè)定法中使用hPARl多肽或融 合蛋白篩選雜交瘤，獲得單克隆小鼠抗-hPARl抗體。免疫方案和分離用 于融合的經(jīng)免疫的脾細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。融合配偶體(例如鼠骨 髓瘤細(xì)胞)和融合步驟也是本領(lǐng)域公知的，例如上引文Harlow & Lane。
SEQ ID NOS:5-8中顯示了下文實(shí)施例中描述的示范性小鼠抗-PARl 抗體(克隆4E7J14丄16和6E11.H6.A9 )的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基# 列?？寺?E7J14丄16的重鏈可變區(qū)的CDR序列為DYYMN(CDRl; SEQ ID NO:21)、 VIDPHNGRSRYNQMFKG (CDR2; SEQ ID綠22)和 DDGPSHWYFDV (CDR3; SEQ ID NO:23)。其輕鏈可變區(qū)的CDR序列為RSSQNIVHSNGNTYLE (CDR1; SEQ ID NO:24)、 KVSNRFS (CDR2; SEQ ID NO:25)和FQGSHVPFT (CDR3; SEQ ID NO:26)?？寺?6E11.H6.A9的重鏈可變區(qū)的CDR序列為DHTFH (CDR1; SEQ ID NO:27) 、 YIFPRDGSTKYNEKFKG (CDR2; SEQ ID NO:28)和 HYYGSFEY (CDR3; SEQ ID NO:29)。其輕鏈可變區(qū)的CDR序列為 RSSQSLVHSNGNTYLH (CDR1; SEQ ID餘30)、 KVSNRFS (CDR2; SEQ ID NO:31)和SQSTHLPLT (CDR3; SEQ ID NO:32)。
典型的完整抗體主要通過位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)內(nèi) 的氨基酸殘基與靶標(biāo)抗原相互作用。通常，本發(fā)明的抗-hPARl抗體的重 鏈CDR序列或輕鏈CDR序列中至少一個(gè)與抗-PARl抗體克隆 4E7.J14.L16或6E11.H6.A9的相應(yīng)CDR序列相同。本發(fā)明這些抗-hPARl 抗體中的一些與參照抗體具有相同的結(jié)合特異性，因此與參照抗體竟?fàn)?PARI N-端束綽配體內(nèi)的表位，例如氨基酸序列 SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)或其片段(例 如前述氨基酸序列中的8、 9、 10、 11、 12、 13、 14或15個(gè)連續(xù)氨基酸) 內(nèi)的表位。本發(fā)明的一些抗-hPARl抗體在其重鏈和輕鏈可變區(qū)內(nèi)的所有 CDR序列分別與抗-PARl抗體克隆4E7,J14丄16或6E11.H6.A9的相應(yīng) CDR序列相同。因此，這些抗-hPARl抗體可具有分別與SEQIDNO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23相同的三條重鏈CDR序列，和分別與 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26相同的三條輕鏈CDR 序列。它們也可以具有分別與SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29相同的三條重鏈CDR序列，和分別與SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32相同的三條輕鏈CDR序列。
本發(fā)明的一些抗-hPARl抗體具有分別與小鼠抗體克隆4E7,J14丄16 或6E11.H6.A9的相應(yīng)可變區(qū)序列相同的完整重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。在 一些其他的實(shí)施方案中，除了相同的CDR序列以外，抗體在可變區(qū)的構(gòu) 架部分中含有與小鼠抗-PARl抗體克隆4E7,J"丄16或6E11.H6.A9的相 應(yīng)氨基酸殘基不同的氨基酸殘基(例如下文所述的一些人源化抗-hPARl抗體)。然而，這些抗體通常在整個(gè)可變區(qū)序列上與小鼠抗-PARl抗體克 隆4E7,J14丄16或克隆6E11.H6.A的相應(yīng)可變區(qū)序列基本(例如75%、 85%、 90%、 95%或99%)同一。
本發(fā)明的抗-hPARl抗體可以是含有兩條重鏈和兩條輕鏈的完整抗 體。它們也可以是完整抗體的抗原結(jié)合分子或單鏈抗體。本發(fā)明的抗 -hPARl抗體包括在非人動(dòng)物中生產(chǎn)的抗體(例如小鼠抗-hPARl抗體克隆 4E7,J14丄16或6E11.H6.A)。它們也包括修飾的抗體，其為小鼠抗-hPARl 抗體克隆4￡7.^4丄16或6￡11.116丄的修飾形式。通常，該修飾的抗體是 重組抗體，其具有相對(duì)于示例的小鼠抗體的特性而言相似或改進(jìn)的特性。 例如，可以通過刪除恒定區(qū)并用不同的恒定區(qū)替換來修飾在下文實(shí)施例中 示例的小鼠抗-hPARl抗體，所述不同的恒定區(qū)可導(dǎo)致抗體的提高的半衰 期(例如血清半衰期)、穩(wěn)定性或親和力。例如可通過構(gòu)建表達(dá)載體創(chuàng)建 修飾的抗體，所述表達(dá)載體包含被移植到具有不同特性的來自不同抗體的 構(gòu)架序列上的來自小鼠抗體的CDR序列，(Jones等1986， Nature 321， 522-525)。這樣的構(gòu)架序列可得自公眾DNA數(shù)據(jù)庫(例如來自 www.kabatdatabase.com )。
一些修飾的抗體是嵌合抗體，其含有部分人免疫球蛋白序列(例如恒 定區(qū))和部分非人免疫球蛋白序列(例如小鼠抗-hPARl抗體克隆 4E7,J14丄16或6E11.H6.A的小鼠抗-hPARl抗體可變區(qū)序列)。 一些其他 的修飾的抗體為人源化抗體。人源化抗體一般具有引入其中的來自非人來 源的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。人源化非人抗體的方法是本領(lǐng)域公知的，例 如U.S. Pat. Nos. 5,585,089和5,693,762; Jones等，Nature 321: 522-25， 1986; Riechmann等，Nature 332: 323-27， 1988;和Verhoeyen等，Science 239: 1534-36， 1988。這些方法可容易地用于產(chǎn)生本發(fā)明的人源化抗-hPARl抗 體，其通過用來自非人抗-hPARl抗體的至少一部分CDR替代人抗體的相 應(yīng)區(qū)域進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗-hPARl抗體的每條 免疫球蛋白鏈中的所有三個(gè)CDR均來自小鼠抗-hPARl抗體克隆 4E7,J14丄16或6E11.H6.A 5，其凈皮移植進(jìn)相應(yīng)的人構(gòu)架區(qū)中。上述抗-hP AR1抗體在可變區(qū)和恒定區(qū)二者中均可以經(jīng)受非關(guān)鍵性氨 基酸的替代、添加或缺失而不會(huì)喪失結(jié)合特異性或效應(yīng)子功能，或不會(huì)出 現(xiàn)不能容忍的親合力降低。通常，摻入這類改變的抗體顯示出與它們來源 自的參照抗體(例如小鼠抗-hPARl抗體克隆4E7,J14丄16或6E11.H6.A) 具有實(shí)質(zhì)上的序列同一性。例如，本發(fā)明的一些抗-hPARl抗體的成熟輕 鏈可變區(qū)與示例的小鼠抗-hPARl抗體的成熟輕鏈可變區(qū)的序列具有至少 75%或至少85%的序列同一性。類似地，該抗體的成熟重鏈可變區(qū)通常顯 示出與示例的抗-hPARl抗體的成熟重鏈可變區(qū)序列具有至少75%或至少 85%的序列同一性。 一些修飾的抗-hPARl抗體具有與示例的小鼠抗 -hPARl抗體相比相同的特異性和提高的親和力。通常，修飾的抗-hPARl 抗體的親和力在參照小鼠抗-hPARl抗體的2、 5、 10或50倍內(nèi)。
b.嵌合和人源化的抗-hPARl抗體
本發(fā)明的一些抗-hPARl抗體是嵌合(例如小鼠/人)抗體，其由來自 非人抗-hPARl抗體拮抗劑的區(qū)域與人抗體的區(qū)域一起組成。例如，嵌合 H鏈可包含本文示例的小鼠抗-PAR1抗體的重鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合區(qū)(例 如SEQ ID NO:5或7)，其與人重鏈恒定區(qū)的至少一部分連接。該嵌合重 鏈可與嵌合L鏈組合，所述嵌合L鏈含有示例性小鼠抗-hPARl抗體的輕 鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合區(qū)(例如，SEQIDNO:6或8)，其與人輕鏈恒定區(qū) 的至少一部分連接。
本發(fā)明的嵌合抗-hPARl抗體可根據(jù)下文實(shí)施例中的公開內(nèi)容以及本 領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)。例如，可用限制性酶消化編碼鼠抗-hPARl抗體或 抗原結(jié)合分子的重鏈或輕鏈的基因，以去除鼠Fc區(qū)，并用編碼人Fc恒定 區(qū)的基因的等價(jià)部分替代。適用于表達(dá)重組抗體，尤其是表達(dá)人源化抗體 的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)，例如 Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed.， 2001);和Brent等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed.， 2003)，構(gòu)建表達(dá)嵌合基因的 載體，所述嵌合基因編碼抗-hPARl免疫球蛋白鏈。人恒定區(qū)序列可選自多種參照來源，包括但不僅限于Kabat等，S叫uences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991中所列的那些。本 領(lǐng)域也已教導(dǎo)了通過DNA重組生產(chǎn)嵌合抗體的更具體教導(dǎo)，例如 Robinson等，國(guó)際專利申請(qǐng)PC1YUS86/02269; Akira等，歐洲專利申請(qǐng) 184,187; Taniguchi， M.，歐洲專利申請(qǐng)171,496; Morrison等，歐洲專利 申請(qǐng)173,494; Neuberger等，國(guó)際申請(qǐng)WO 86/01533; Cabilly等美國(guó)專利 No. 4，816，567; Cabilly等，歐洲專利申請(qǐng)125,023; Better等，Science 240:1041-1043， 1988; Liu等，PNAS 84:3439-3443, 1987; Liu等，J. Immunol. 139:3521-3526， 1987; Sun 等，PNAS 84:214-218， 1987; Nishimura等，Cane. Res. 47:999-1005， 1987; Wood等，Nature 314:446-449， 1985; Shaw等，J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559， 1988。
可對(duì)具有來自非人抗體的完整可變區(qū)的嵌合抗體進(jìn)一步人源化，以降 低該抗體在人中的免疫原性。這通常如下完成將Fv可變區(qū)(構(gòu)架區(qū)或 非-CDR區(qū))中的某些序列或氣基酸殘基替為來自人Fv可變區(qū)的等價(jià)序列 或氨基酸殘基。這些被額外替代的序列或氨基酸殘基通常不直接參與抗原 結(jié)合。更通常如下進(jìn)行非人抗體的人源化僅用非人抗體(例如本文示例 的小鼠抗-PARl抗體)的CDR替換人抗體中的CDR。在一些情況下，隨 后將人構(gòu)架區(qū)中的一些額外的殘基替成來自非人供體抗體的相應(yīng)殘基。為 了改進(jìn)與抗原的結(jié)合，常需要這些額外的移植。這是因?yàn)閮H具有移植自非 人抗體的CDR的人源化抗體與非人供體抗體相比，可能具有不夠完善的 結(jié)合活性。因此，除CDR以外，在本發(fā)明的人源化抗-hPARl抗體的人構(gòu) 架區(qū)內(nèi)通常一些氨基酸殘基可能被替換為來自非人供體抗體(例如本文示 例的小鼠抗體)的相應(yīng)殘基。通過CDR替代生產(chǎn)人源化抗體的方法，包 括選擇用于替換的構(gòu)架區(qū)殘基的標(biāo)準(zhǔn)，是本領(lǐng)域公知的。例如，除了涉及 生產(chǎn)嵌合抗體的上述技術(shù)夕卜，在例如Winter等，UK Patent Application GB 2188638A (1987)， U.S. Patent 5,225,539; Jones等，Nature 321:552-525， 1986; Verhoeyan等，Science 239:1534, 1988;和Beidler等，J. Immunol.Ul"053-4060， 19幼中提供了制造人源化抗體的其它教導(dǎo)。也可以使用如 題為"Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes."的WO 94/10332中所述的寡核普酸定點(diǎn) 誘變進(jìn)行CDR替代。
本發(fā)明的嵌合或人源化的抗-hPARl抗體可以是單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)的 免疫球蛋白。例如，單價(jià)嵌合抗體是二聚體(HL),其由通過二硫鍵與嵌合 的L鏈結(jié)合的嵌合的H鏈形成，如上所述。二價(jià)嵌合抗體是四聚體(H2 L2)， 其由通過至少一個(gè)二硫鍵結(jié)合的兩個(gè)HL 二聚體形成。多價(jià)嵌合抗體基于 鏈的聚集。
c.人抗-hPARl抗體
除了嵌合的或人源化的抗-hPARl抗體以外，還包括在本發(fā)明中的是 完全人抗體，其顯示相同的結(jié)合特異性和相當(dāng)?shù)幕蚋玫慕Y(jié)合親合力。例 如，人抗-hPARl抗體可具有相對(duì)于參照非人抗-PARl抗體(例如小鼠抗 -hPARl抗體克隆4E7J14丄16或6E11.H6.A )而言相同或更好的結(jié)合特征 (例如結(jié)合特異性和/或結(jié)合親合力)。參照非人抗體可以是含有SEQ ID NO:5的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)序列的小鼠抗 -PARI抗體。其還可以是含有SEQ ID NO:7的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)序列的小鼠抗-PARl抗體。與嵌合的或人源的化抗體 相比，本發(fā)明的人抗-hPARl抗體施用給人受試者時(shí)具有進(jìn)一步降低的抗 原性。
可使用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生人抗-hPARl抗體。例如，美國(guó)專利申 請(qǐng)系列號(hào)10/778，726(公開號(hào)No. 20050008625 )中已公開了下述體內(nèi)方法 在抗體中用人可變區(qū)替換非人抗體可變區(qū)，同時(shí)相對(duì)于非人抗體的結(jié)合特 征而言維持相同的或提供更好的結(jié)合特征。該方法依賴于表位引導(dǎo)的、完 全人抗體對(duì)非人參照抗體可變區(qū)的替換。得到的人抗體一般在結(jié)構(gòu)上與參 照非人抗體無關(guān)，但是與參照抗體結(jié)合相同抗原上的相同表位。簡(jiǎn)言之， 如下實(shí)現(xiàn)系列表位引導(dǎo)的互補(bǔ)性置換法在存在報(bào)告分子體系時(shí)，在細(xì)胞 中建立"竟?fàn)幷?，，和的如下文庫之間對(duì)有限量抗原的結(jié)合竟?fàn)?，其中所述?br> 29庫由參照抗體的各種雜種("受試抗體")組成，所述報(bào)告分子體系將響應(yīng)
受試抗體與抗原的結(jié)合。竟?fàn)幷呖梢允菂⒄湛贵w或其衍生物，如單鏈Fv 片段。竟?fàn)幷咭部梢允桥c參照抗體結(jié)合相同表位的抗原的天然或人工配 體。竟?fàn)幷叩奈ㄒ灰笫瞧渑c參照抗體結(jié)合相同的表位，并且其與參照抗 體竟?fàn)幗Y(jié)合抗原。受試抗體具有共同的一個(gè)來自非人參照抗體的抗原結(jié)合 V-區(qū)，而另一個(gè)V-區(qū)隨機(jī)選自不同的來源，如人抗體全文庫(repertoire library)。來自參照抗體的共同V-區(qū)發(fā)揮向?qū)ё饔?，使受試抗體以相同的 方向定位于抗原的相同表位上，從而導(dǎo)致偏向于對(duì)參照抗體的最高抗原結(jié) 合保真度(fidelity)的選擇。
可使用許多類型的報(bào)告分子體系檢測(cè)受試抗體和抗原之間期望的相 互作用。例如，可以將互補(bǔ)的報(bào)告分子片段分別與抗原和受試抗體相連， 從而只有當(dāng)受試抗體與抗原結(jié)合時(shí)才發(fā)生通過片段互補(bǔ)而致的報(bào)告分子 活化。當(dāng)受試抗體-和抗原-報(bào)告分子片段融合物與竟?fàn)幷吖脖磉_(dá)時(shí)，報(bào)告 分子的活化將取決于受試抗體與竟?fàn)幷呔範(fàn)幍哪芰?，所述能力與受試抗體 對(duì)抗原的親和力成比例?？墒褂玫钠渌麍?bào)告分子體系包括美國(guó)專利申請(qǐng)系 列No. 10/208,730 (公開號(hào)20030198971 )中公開的自抑制的報(bào)告分子再活 化體系(RAIR)中的再活化因子(reactivator)，或美國(guó)專利申請(qǐng)系列No. 10/076,845 (公開號(hào)20030157579)中公開的竟?fàn)幮曰罨w系。
使用系列表位引導(dǎo)的互補(bǔ)性置換體系進(jìn)行選擇，鑒定表達(dá)竟?fàn)幷摺⒖?原和報(bào)告分子組分以及單個(gè)受試抗體的細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，各受試抗體 與竟?fàn)幷咭粚?duì)一地竟?fàn)幗Y(jié)合有限量的抗原。才艮告分子的活性與受試抗體所 結(jié)合的抗原量成比例，所述抗原量又與受試抗體對(duì)抗原的親和力和受試抗 體的穩(wěn)定性成比例。最初相對(duì)于作為受試抗體表達(dá)時(shí)的參照抗體的活性， 以受試抗體的活性為基礎(chǔ)選擇受試抗體。第一輪選擇的結(jié)果是一組"雜種" 抗體，其中每個(gè)雜種抗體都由相同的來自參照抗體的非人V-區(qū)和來自文庫 的人V-區(qū)組成，并均與參照抗體一樣結(jié)合抗原上的相同表位。在第一輪選 出的雜種抗體中 一個(gè)或多個(gè)將具有與參照抗體相當(dāng)或更高的抗原親和力。
在第二個(gè)V-區(qū)置換步驟中，將第一步選出的人V-區(qū)用作向?qū)?，用于從具有多種多樣的關(guān)連(cognate)人V區(qū)的文庫中選擇剩余的非人參照抗體 V區(qū)的人類置換物。在第一輪中選擇的雜種抗體也可以用作第二輪選擇的 竟?fàn)幷?。第二輪選擇的結(jié)果是一組完全人抗體，其在結(jié)構(gòu)上與參照抗體不 同，但是其與參照抗體竟?fàn)幗Y(jié)合相同的抗原。 一些選擇的人抗體與參照抗 體結(jié)合相同抗原上的相同表位。在這些選擇的人抗體中， 一個(gè)或多個(gè)將與 參照抗體相比以相當(dāng)或更高的親和力結(jié)合相同的表位。
使用上文作為參照抗體描述的小鼠或嵌合抗-hPARl抗體之一，可容 易地使用本方法產(chǎn)生人抗體，所述人抗體以相同的結(jié)合特異性和相同或更 好的結(jié)合親合力結(jié)合人PAR1。另外，這樣的人抗-hPARl抗體也可商業(yè)得 自定制生產(chǎn)人抗體的7^司，例如KaloBios， Inc. (Mountain View, CA)。為 了獲得對(duì)特定表位具有與初始非人抗體(例如小鼠抗-PARl抗體)相同或 更好的親和力的人抗體，KaloBios, Inc. technologies使用人"受體"抗體文 庫。然后產(chǎn)生定向的或表位聚焦的人抗體文庫，該文庫中的人抗體與非人 抗體結(jié)合同一表位，盡管具有不同的親和力。然后在表位聚焦文庫中選擇 與初始非人抗體相比具有相似或更高親和力的抗體。然后進(jìn)一步分析鑒定 到的人抗體的親和力和序列身份。
d.其他類型的抗-hPARl抗體
本發(fā)明的抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子還包括單鏈抗體、雙特異性 抗體和多特異性抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是單鏈抗體。單 鏈抗體在單條穩(wěn)定折疊的多肽鏈中含有來自重鏈和輕鏈二者的抗原結(jié)合 區(qū)。由此，單鏈抗體通常保持單克隆抗體的結(jié)合特異性和親和力，但是比 起經(jīng)典的免疫球蛋白具有相當(dāng)小的尺寸。對(duì)某些應(yīng)用而言。本發(fā)明的抗 -hPARl單鏈抗體與完整的抗-hPARl抗體相比可以提供許多有利的特性。 這些特性包括例如從身體中更快的清除、對(duì)診斷性成像和治療而言更大的
組織透過率、和與基于小鼠的抗體相比免疫原性的顯著降低。使用單鏈抗 體的其他可能益處包括在高通量篩選方法中增強(qiáng)的篩選能力和非腸胃外
應(yīng)用的潛能。
可使用本領(lǐng)域已描述的方法制備本發(fā)明的單鏈抗-hPARl抗體。這類技術(shù)的示例包括描述于美國(guó)專利Nos. 4,946,778和5,258,498; Huston等， Methods in Enzymology 203:46-88， 1991; Shu等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999， 1993;和Skerra等，Science 240:1038-1040， 1988中的技術(shù)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了下述抗-hPARl抗體，其通過衍生 化或連接至另一功能性分子而產(chǎn)生結(jié)合多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)或耙標(biāo)表位的雙特 異性或多特異性分子。該功能性分子包括另一肽或蛋白質(zhì)(例如細(xì)胞因子、 細(xì)胞毒性劑、免疫刺激或抑制劑、Fab'片段或如上所述的其他抗體結(jié)合片 段)。例如，抗-hPARl抗體或其抗原結(jié)合部分可與另一個(gè)或多個(gè)結(jié)合分 子如另一抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物功能性連接(例如通過化學(xué)偶 聯(lián)、遺傳融合、非共價(jià)結(jié)合或其他方式)。因此，本發(fā)明的雙特異性和多 特異性抗-hPARl抗體包含至少一個(gè)單克隆抗-hPARl抗體或其抗原結(jié)合 片段，并具有對(duì)人PAR1的第一結(jié)合特異性和針對(duì)第二乾標(biāo)表位的第二結(jié) 合特異性。第二靶標(biāo)表位可以是Fc受體，例如人FqRI或人Fey受體。 因此，本發(fā)明包括能夠與表達(dá)FcyRl、 FcyR或FcsR的效應(yīng)細(xì)胞(例如單 核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞(PMN))和表iiA PARI的靶細(xì)胞(例如 癌細(xì)胞)二者結(jié)合的雙特異性和多特異性分子。這些多特異性(例如雙特 異性或多特異性)分子將人PARl-表達(dá)細(xì)胞靶向效應(yīng)細(xì)胞，并引發(fā)Fc受 體介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性，如對(duì)人PARl-表達(dá)細(xì)胞的吞噬、抗體依賴型細(xì)胞 介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、細(xì)胞因子釋放或超氧陰離子的產(chǎn)生。
可以通過本領(lǐng)域已描述的方法制造本發(fā)明的雙特異性和多特異性抗 -hPARl分子。這些方法包括化學(xué)技術(shù)(見例如Kranz等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807， 1981) 、 polydoma技術(shù)(見例如美國(guó)專利No. 4,474,893 ) 或重組DNA技術(shù)。也可以通過使用本領(lǐng)域已知和本文所述的方法將組分 結(jié)合特異性(例如抗-FcR和抗-hPARl結(jié)合特異性)偶聯(lián)，制備本發(fā)明的 雙特異性和多特異性分子。例如，可獨(dú)立地產(chǎn)生雙特異性和多特異性分子
的各個(gè)結(jié)合特異性，然后使之彼此綴合。當(dāng)結(jié)合特異性是蛋白質(zhì)或肽時(shí)， 可使用多種偶聯(lián)或交聯(lián)劑用于共價(jià)綴合。交聯(lián)劑的實(shí)例包括蛋白A、碳二
32亞胺、N-琥珀酰亞胺-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)、 N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡咬
二硫基)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-l-
羧酸酯(磺基-SMCC )。當(dāng)結(jié)合特異性是抗體(例如兩個(gè)人源化抗體)時(shí)，
它們可通過兩條重鏈C-端鉸鏈區(qū)的巰基成鍵而綴合?？稍诰Y合前修飾鉸鏈 區(qū)以含有奇數(shù)個(gè)(例如一個(gè))巰基殘基。
可通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、放射免疫測(cè)定法(RIA)或 Western印跡測(cè)定法驗(yàn)證雙特異性和多特異性分子與其特異把標(biāo)的結(jié)合。 這些測(cè)定法一般通過使用對(duì)目的復(fù)合物特異的標(biāo)記試劑(例如抗體)來檢 測(cè)尤其感興趣的蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的存在。例如，可使用例如酶聯(lián)抗體或 抗體片段檢測(cè)FcR-抗體復(fù)合物，其中所述酶聯(lián)抗體或抗體片段識(shí)別并特異 結(jié)合該抗體-FcR復(fù)合物。或者，可使用多種其他免疫測(cè)定法中的任何一種 檢測(cè)復(fù)合物。例如，可對(duì)抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記，并在放射免疫測(cè)定(RIA) 中4吏用(見例如Weintraub, B.， Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 )。可通過例如4吏用，計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或通過》文 射自顯影的手段檢測(cè)該放射性同位素。
本發(fā)明的抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子還包括具有駝科支架的單結(jié) 構(gòu)域抗原結(jié)合單位。駝科動(dòng)物包括駱駝、美洲駝和羊駝。駝科動(dòng)物生產(chǎn)缺 乏輕鏈的功能性抗體。重鏈可變(VH)結(jié)構(gòu)域自發(fā)折疊并獨(dú)立地作為抗原結(jié) 合單位發(fā)揮功能。與經(jīng)典的抗原結(jié)合分子(Fab)或單鏈可變區(qū)(scFv)中六個(gè) CDR相比，其結(jié)合表面僅涉及三個(gè)CDR。駝科抗體能夠達(dá)到與常規(guī)抗體 相當(dāng)?shù)挠H合力?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的方法，例如Dumoulin等，Nature Struct. Biol. 11:500—515， 2002; Ghah削di等，F(xiàn)EBS Letters 414:521-526， 1997;和Bond等，J Mol Biol. 332:643-55， 2003，生產(chǎn)基于駝科支架的抗 -PARI分子，其具有本文示例的小鼠抗-PARl抗體的結(jié)合特異性。
e.特異結(jié)合hPARl的非抗體配體
本發(fā)明的抗-PARl抗體或抗原結(jié)合分子還包括單抗體，其為使用纖連 蛋白m型結(jié)構(gòu)域(FN3)支架的小抗體模擬物。纖連蛋白是在細(xì)胞外基質(zhì)形成和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用中起關(guān)鍵作用的大蛋白。其由三類(I、 II和III)
小結(jié)構(gòu)域的許多個(gè)重復(fù)組成。FN3自身是免疫球蛋白超家族的一大亞家族 (FN3家族或s-型免疫球蛋白家族)的范例。FN3家族包括細(xì)胞粘附分子、 細(xì)胞表面激素和細(xì)胞因子受體、陪伴蛋白和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。FN3 支架發(fā)揮有效構(gòu)架的作用，其上可以嫁接用于特異建造功能(specific building functions)的環(huán)。人纖連蛋白中存在15個(gè)FN3重復(fù)單位。通常， 本發(fā)明的這類抗原結(jié)合分子利用人纖連蛋白的第十個(gè)FN3單位作為支架。 其為小的單體，并且不具有二硫鍵?？墒褂帽绢I(lǐng)域例如Koide等，J. Mol. Biol. 284: 1141-1151， 1998; Koide等，Proc. Natl Acad. Sci. USA 99:1253—1258， 2002;和Batori等，Protein Eng. 15:1015-20， 2002中所述的方 法，制備基于FN3的抗原結(jié)合分子，其顯示與本文中示例的小鼠抗-PARl 抗體相同的結(jié)合特異性。也參見美國(guó)專利Nos. 6,818,418和7,115,396。
本發(fā)明的一些其他抗原結(jié)合分子使用來自A-結(jié)構(gòu)域的支架。A-結(jié)構(gòu)域 以多結(jié)構(gòu)域串的形式存在于若干種細(xì)胞表面受體中。該家族的結(jié)構(gòu)域結(jié)合 許多已知的靶標(biāo)，包括小分子、蛋白質(zhì)和病毒。截短分析顯示靶標(biāo)通常與 多個(gè)A-結(jié)構(gòu)域接觸，其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地結(jié)合獨(dú)特的表位。通過將多個(gè) 結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合產(chǎn)生的親合力(avidity)是一種提高親和性和特異性的有力 途徑?？墒褂美鏕liemann等，Biol. Chem. 379:951-964， 1998; Koduri等， Biochemistry 40:12801—12807， 2001和Silverman等，Nat Biotechnol. 23:1556-61,2005中所述的方法產(chǎn)生這類結(jié)合PARI的抗原結(jié)合分子，其具 有本文示例的小鼠抗-PARl抗體的結(jié)合特異性。
已開發(fā)了以類似于抗體的方式靶向和結(jié)合靶標(biāo)的其他化合物。這些"抗 體模擬物"中的某些使用非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)支架作為抗體可變區(qū)的備 選蛋白質(zhì)構(gòu)架。
例如，Ladner等(美國(guó)專利No. 5,260,203 )描述了具有下述結(jié)合特異 性的單多肽鏈結(jié)合分子，所述結(jié)合特異性與聚集的但是分子分離的抗體的 輕鏈和重鏈可變區(qū)的結(jié)合特異性類似。該單鏈結(jié)合分子含有通過肽接頭連 結(jié)的抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)二者的抗原結(jié)合位點(diǎn)，并會(huì)折疊成與兩個(gè)肽抗體相似的結(jié)構(gòu)。單鏈結(jié)合分子展示了超過常規(guī)抗體的若干優(yōu)點(diǎn)，包括更小 的尺寸、更大的穩(wěn)定性和更容易被修飾。
Ku等(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(14):6552-6556 (1995))公開了 基于細(xì)胞色素b562的抗體的備選方案。Ku等(1995)產(chǎn)生了一個(gè)文庫，其 中細(xì)胞色素b562的兩個(gè)環(huán)被隨機(jī)化，然后選擇針對(duì)牛血清白蛋白的結(jié)合。 發(fā)現(xiàn)突變體個(gè)體和抗-BSA抗體相似地選擇性地與BSA結(jié)合。
Beste等(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96(5):1898-1903 (1999))公開了 基于脂籠蛋白支架的抗體模擬物(Anticalin⑧)。脂籠蛋白由卩桶組成，在該 蛋白質(zhì)的末端具有四個(gè)超變環(huán)。Beste (1999)對(duì)環(huán)進(jìn)行隨機(jī)誘變并選擇例如 與熒光素的結(jié)合。三個(gè)變體顯示與熒光素的特異結(jié)合，其中一個(gè)變體顯示 與抗-熒光素抗體相似的結(jié)合。其他分析揭示所有被隨機(jī)化的位置都是可變 的，說明Anticalin⑧將適合用作抗體的備選方案。
Anticalins⑧是小的單鏈肽，通常在160和180個(gè)殘基之間，其提供了 超過抗體的若干優(yōu)點(diǎn)，包括降低的生產(chǎn)成本、提高的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和降低的 免疫反應(yīng)。
Hamilton等(美國(guó)專利No. 5,770,380 )公開了使用calixarene的剛性 非肽有機(jī)支架的合成抗體模擬物，其中該支架與用作結(jié)合位點(diǎn)的多個(gè)可變 肽環(huán)結(jié)合。相對(duì)于彼此，這些肽環(huán)均在幾何學(xué)上從calixarene的同側(cè)射出。 由于該幾何學(xué)的確定性，所有的環(huán)均可用于結(jié)合，提高了對(duì)配體的結(jié)合親 合力。然而，與其他抗體模擬物相比，基于calixarene的抗體模擬物并不 絕對(duì)地由肽組成，因此，其較不容易被蛋白酶攻擊。該支架不是純由肽、 DNA或RNA組成，意味著該抗體模擬物在極端環(huán)境條件下相對(duì)穩(wěn)定并且 具有長(zhǎng)壽命。另外，因?yàn)榛赾alixarene的抗體模擬物相對(duì)較小，其較不 可能引起免疫原性應(yīng)答。
Murali等(Cell. Mol. Biol. 49(2):209-216 (2003))討論了將抗體簡(jiǎn)化為 更小的肽模擬物的方法，他們將所述肽模擬物稱作"抗體樣結(jié)合性肽模擬 物"(ABiP)，其也可用作抗體的備選方案。
3.用于生產(chǎn)抗-hPARl抗體的多核苷酸、載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明提供了基本純化的多核苷酸(DNA或RNA)，其編碼下述多 肽，所述多肽包含上述抗-hPARl抗體鏈或抗原結(jié)合分子的區(qū)段或結(jié)構(gòu)域。 本發(fā)明的一些多核苷酸包含SEQIDNO:l或3中所示的重鏈可變區(qū)的核苷 酸序列，和/或SEQ ID NO:2或4中所示的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。本 發(fā)明的一些其他多核苷酸包含下述核苷酸序列，其與SEQ ID NOS:l-4中 所示核苷酸序列之一基本同一 (例如至少65%、 80%、 95%或99%)。從 適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體表達(dá)時(shí)，由這些多核苷酸編碼的多肽能夠顯示抗原結(jié)合能 力。
本發(fā)明中還提供了如下多核苷酸，其編碼下文實(shí)施例中所述的小鼠抗 -hPARl抗體的重鏈或輕鏈的至少一個(gè)CDR區(qū)，并通常編碼所有三個(gè)CDR 區(qū)。 一些其他多核苷酸編碼小鼠抗-hPARl抗體重鏈和/或輕鏈可變區(qū)序列 的全部或幾乎全部。例如，這些多核苷酸中的一些編碼SEQIDNO:5或7 中所示重鏈可變區(qū)的^J^酸序列和/或SEQ ID NO:6或8.中所示的輕鏈可 變區(qū)的M^列。因?yàn)槊艽a簡(jiǎn)并，這些免疫球蛋白M^列之每一個(gè) 均可以由多種核酸序列編碼。
本發(fā)明的多核苷酸能夠僅編碼抗-hPARl抗體的可變區(qū)序列。它們也 可編碼抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)二者。本發(fā)明核酸的一些多核苷酸序列編碼 下述成熟的重鏈可變區(qū)序列，其與SEQ ID NO:5或7中所示成熟重鏈可變 區(qū)序列基本同一 (例如至少80%、 90%或99% )。 一些其他多核苷酸序列 編碼下述成熟的輕鏈可變區(qū)序列，其與SEQ ID NO:6或8中所示成熟輕鏈 可變區(qū)序列基本同一。 一些多核苷酸序列編碼下述多肽，其包含示例的小 鼠抗-PARl抗體之一的重鏈和輕鏈二者的可變區(qū)。 一些其他的多核苷酸編 碼兩條多肽區(qū)段，所述區(qū)段分別與所述小鼠抗體之一的重鏈和輕鏈的可變 區(qū)基本同一。
可通過從頭固相DNA合成或通過PCR誘變編碼抗-hPARl抗體或其 結(jié)合片段的現(xiàn)有序列(例如下文實(shí)施例中所述的序列)，生產(chǎn)多核苷, 列。核酸的直接化學(xué)合成可以通過本領(lǐng)域已知的方法完成，例如Narang 等，Meth. Enzymol. 68:90， 1979的磷酸三酯方法；Brown等，Meth.
36Enzymol. 68:109， 1979的鱗酸二酯方法；Beaucage等，Tetra. Lett" 22:1859， 1981的二乙基亞磷酰胺法；和美國(guó)專利No. 4,458,066的固體支持物方法。 可按例如 PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.)， Freeman Press, NY， NY， 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis等(Ed.)， Academic Press, San Diego， CA， 19卯；Mattila等，Nucleic Acids Res. 19:967， 1991 ;和 Eckert等，PCR Methods and Applications 1:17， 1991中所述，通過PCR向 多核苷酸序列引入突變。
本發(fā)明中還提供了生產(chǎn)上述抗-hPARl抗體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。 可使用多種表達(dá)載體表達(dá)編碼抗-PARl抗體鏈或結(jié)合片段的多核苷酸?；?于病毒的和非病毒的表達(dá)載體均可用于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中生產(chǎn)抗體。 非病毒載體和體系包括質(zhì)粒、附加型載體(通常具有表達(dá)蛋白質(zhì)或RNA 的表達(dá)盒)和人工染色體(見例如Harrington等，Nat Genet 15:345， 1997)。例如，適用于在哺乳動(dòng)物(例如人)細(xì)胞中表達(dá)抗-hPARl多核 苷酸和多肽的非病毒載體包括pThioHis A、 B & C， pcDNA3.1/His, pEBVHisA、 B&C(Invitrogen，SanDiego，CA)， MPSV栽體和大量本々頁 域已知用于表達(dá)其他蛋白質(zhì)的其他載體。有用的病毒載體包括基于逆轉(zhuǎn)錄 病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰滲病毒的載體，基于SV40、乳頭狀瘤病 毒、HBP EB病毒、痘苗病毒載體和Semliki Forest病毒(SFV)的載體。 見Brent等，同上引文；Smith, Anrni. Rev. Microbiol. 49:807， 1995;和 Rosenfeld等，Cell 68:143， 1992。
表達(dá)載體的選擇取決于預(yù)期要在其中表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。通常，表 達(dá)載體含有與編碼抗-hPARl抗體鏈或片段的多核苷酸有效連接的啟動(dòng)子 和其他調(diào)節(jié)序列(例如增強(qiáng)子)。在一些實(shí)施方案中，使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 防止插入的序列在誘導(dǎo)條件以外的其它條件下表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括例 如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動(dòng)子或熱激啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)化的生物的培養(yǎng) 物可在非誘導(dǎo)條件下擴(kuò)增，不使該群體偏向于表達(dá)產(chǎn)物可以被宿主細(xì)胞更 好地耐受的編碼序列。除了啟動(dòng)子以外，為了抗-hPARl抗體鏈或片段的有效表達(dá)，也可能需要或期望其他調(diào)節(jié)元件。這些元件通常包括ATG起 始密碼子和鄰近的核糖體結(jié)合位點(diǎn)或其他序列。另外，可通過包含適于所
使用的細(xì)胞體系的增強(qiáng)子來增強(qiáng)表達(dá)的效率(見例如Scharf等，Results Probl. Cell Differ. 20:125， 1994;和Bittner等，Meth. Enzymol.， 153:516， 1987)。例如，SV40增強(qiáng)子或CMV增強(qiáng)子可用于提高在哺乳動(dòng)物宿主細(xì) 胞中的表達(dá)。
表達(dá)載體也可以提供分泌信號(hào)序列位置，從而與插入的抗-hPARl抗 體序列編碼的多肽形成融合蛋白。插入的抗-hPARl抗體序列更通常在包 含在栽體中之前與信號(hào)序列連接。要用于接受編碼抗-hPARl抗體輕鏈和 重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列的載體有時(shí)也編碼恒定區(qū)或其部分。這類載體允許 將可變區(qū)表達(dá)為與恒定區(qū)的融合蛋白，從而導(dǎo)致完整抗體或其片段的生 產(chǎn)。通常，這類恒定區(qū)是人的。
用于包含并表達(dá)抗-hPARl抗體鏈的宿主細(xì)胞可以是原核的或真核 的。大腸桿菌(E. coli)是適用于克隆和表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的一種原核宿 主。其他適合使用的微生物宿主包括芽孢桿菌(bacilli)如枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)和其他腸桿菌(enterobacteriaceae)如沙門氏菌 (Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和多種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。 在這些原核宿主中也可以制造表達(dá)載體，其通常含有與宿主細(xì)胞兼容的表 達(dá)控制序列(例如復(fù)制起點(diǎn))。另外，可存在任何數(shù)量的公知啟動(dòng)子，例 如乳糖啟動(dòng)子體系、色氨酸(trp)啟動(dòng)子體系、p-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子體系或來 自于噬菌體X的啟動(dòng)子體系。啟動(dòng)子通?？刂票磉_(dá)(任選地與操縱基因序 列一起)，并具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列等等，用于起始和完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。 其他微生物如酵母也可用于表達(dá)本發(fā)明的抗-hPARl多肽。也可以與桿狀 病毒載體組合使用昆蟲細(xì)胞。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)本發(fā)明 的抗-hPARl多肽。例如，它們可以是表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白基因的雜交瘤 細(xì)胞系(例如實(shí)施例中所述的骨髓瘤雜交瘤克隆)或載有外源表達(dá)載體的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(例如下文示例的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞)。這些包括任何正常的非永生化的動(dòng)物或人細(xì)胞，或正?；虍惓５挠郎膭?dòng)物或人細(xì)胞。 例如，已開發(fā)了能夠分泌完整免疫球蛋白的大量合適的宿主細(xì)胞系，包括
CHO細(xì)胞系、多種Cos細(xì)胞系、Hela細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化的B-細(xì) 胞和雜交瘤。哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)多肽的用途一般在例如 Winnacker， From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y.， N.Y.， 1987中討 論。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的表達(dá)載體可包含表達(dá)控制序列，例如復(fù)制起 點(diǎn)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(見例如Queen等，Immunol. Rev. 89:49-68， 1986 )， 和必需的加工信號(hào)位點(diǎn)，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、多聚腺苷 酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。這些表達(dá)載體通常含有來自哺乳動(dòng)物基因或來 自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子可以是組成型的、細(xì)胞種類特異 的、階段特異的，和/或可調(diào)控或可調(diào)節(jié)的。有用的啟動(dòng)子包括，但不限于 金屬硫蛋白啟動(dòng)子、組成型腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、地塞米松誘導(dǎo)型 MMTV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、MRP polIII啟動(dòng)子、組成型MPSV啟動(dòng) 子、四環(huán)素誘導(dǎo)型CMV啟動(dòng)子(例如人立即早期CMV啟動(dòng)子)、組成 型CMV啟動(dòng)子，和本領(lǐng)域已知的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合。
引入含有目的多核苷酸序列的表達(dá)載體的方法因細(xì)胞宿主的類型而 異。例如，原核細(xì)胞通常使用氯化鈣轉(zhuǎn)染，而其他細(xì)胞宿主可以使用磷酸 4丐處理或電穿孔(一般見Sambrook等上引文)。其他方法包括例如電穿 孔、磷酸釣處理、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、注射和顯微注射、生物轟擊方法、 病毒體、免疫脂質(zhì)體、多聚陽離子:核酸綴合物、棵DNA、人工病毒體、 與皰滲病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP22融合(Elliot and O'Hare， Cell 88:223， 1997)、試 劑增強(qiáng)的DNA攝取，和離體轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了重組蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期、高產(chǎn)量生產(chǎn)， 通常期望穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可使用如下本發(fā)明的表達(dá)載體制備穩(wěn)定表達(dá) 抗-hPARl抗體鏈或結(jié)合片段的細(xì)胞系，所述本發(fā)明的表達(dá)載體含有病毒 復(fù)制起點(diǎn)或內(nèi)源表達(dá)元件和可選擇標(biāo)記基因。引入載體后，可允許細(xì)胞在 富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，之后將其移至選擇培養(yǎng)基?？蛇x擇標(biāo)記的目的 是賦予對(duì)選擇的抗性，其存在使得成功表達(dá)引入序列的細(xì)胞能夠在選擇培 養(yǎng)基中生長(zhǎng)?？墒褂眠m合該細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖有抗性的、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
4. 抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子的特性
一旦上述抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子被合成，或在宿主細(xì)胞中從 表達(dá)載體表達(dá)，或在雜交瘤中內(nèi)源表達(dá)后，它們可以被容易地純化，例如 從培養(yǎng)基和宿主細(xì)胞中純化。通常，抗體鏈被表達(dá)為帶有信號(hào)序列，并因 此被釋放至培養(yǎng)基。然而，如果抗體鏈不能由宿主細(xì)胞天然分泌，則可通 過用溫和去污劑處理來釋放抗體鏈。然后可通過常規(guī)方法純化抗體鏈，所 述常規(guī)方法包括硫酸銨沉淀、利用固定化的靼標(biāo)的親和層析、柱層析、凝 膠電泳等等。這些方法是公知的，并在本領(lǐng)域中常規(guī)使用，例如Scopes, Protein Purification, Springer畫Verlag， NY， 1982;和Harlow & Lane上引 文。
例如，可在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)選擇的表達(dá)本發(fā)明抗-hPARl抗體的雜交瘤， 用于單克隆抗體純化?？蛇^濾上清液并通過4吏用蛋白A- sepharose或蛋白 G- sepharose柱進(jìn)行親和層析而濃縮?？赏ㄟ^凝膠電泳和高效液相色鐠檢 查從柱中洗脫的IgG進(jìn)行分析，以確保純度?？蓪⒃摼彌_溶液更換為PBS， 并通過OD280讀數(shù)測(cè)定濃度?？蓪慰寺】贵w等分并儲(chǔ)存于-8(TC 。
無論其制備方法如何，本發(fā)明的抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子都特 異結(jié)合hPARl或其抗原性片段。當(dāng)抗體結(jié)合hPARl或其抗原性片段的解 離常數(shù)為^HM，優(yōu)選^100nM，最優(yōu)選SlnM時(shí)，存在特異結(jié)合。可如下 檢測(cè)抗體結(jié)合hPARl的能力直接標(biāo)記目的抗體，或可不標(biāo)記抗體而使 用多種夾心分析測(cè)定方式間接檢測(cè)結(jié)合。見例如上引文Harlow & Lane。 具有這類結(jié)合特異性的抗體更可能具有下文實(shí)施例中討論的小鼠或嵌合 抗-hPARl抗體顯示的有利特性。通常，本發(fā)明的抗-PARl抗體或抗原結(jié) 合分子以至少1 x 107 M"、 108 M-1、 109 M"或10ie M"的平衡結(jié)合常數(shù)(Ka) 結(jié)合PAR1多肽或抗原片段。另外，它們也具有約lxlO-3 s"、 lxl(TV1、 1 x 10-5 s"或更低的動(dòng)態(tài)解離常數(shù)(kd),并以下述親和力結(jié)合人PAR1，與 結(jié)合非特異性抗原(例如BSA)的親和力相比所述親和力至少大兩倍。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子阻斷或竟?fàn)巺⒄湛?hPARl抗體對(duì)hPARl多肽的結(jié)合。參照抗-hPARl抗體可具 有SEQ ID NOS:5和6或SEQ ID NOS:7和8中所示的重鏈和輕鏈可變區(qū) 序列，例如下文實(shí)施例中所述的小鼠抗-PARl抗體或其嵌合抗體。這些可 以是上文所述的完全人抗-hPARl抗體。它們也可以是與參照抗體結(jié)合相 同表位的其他小鼠、嵌合或人源化抗-hPARl抗體。能夠阻斷或竟?fàn)巺⒄?抗體與hPARl的結(jié)合的能力表明，所測(cè)試的抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分 子結(jié)合參照抗體所定義的相同或相似表位，或結(jié)合與參照抗-hPARl抗體 所結(jié)合的表位足夠接近的表位。這類抗體特別可能具有針對(duì)參照抗體所確 定的有利特性?？赏ㄟ^例如竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定法測(cè)定阻斷或竟?fàn)巺⒄湛贵w的能 力。通過竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定法，檢查所測(cè)試的抗體抑制參照抗體對(duì)共同抗原(例 如PAR1多肽)或該抗原上表位的特異結(jié)合的能力。如果過量的受試抗體 實(shí)質(zhì)性地抑制參照抗體的結(jié)合，則該受試抗體與參照抗體竟?fàn)帉?duì)抗原或表 位的特異結(jié)合。實(shí)質(zhì)性抑制表示受試抗體通常使參照抗體的特異結(jié)合減少 至少10%、 25%、 50%、 75%或90%。
存在大量已知的竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定法，可用于評(píng)價(jià)受試抗-hPARl抗體或 抗原結(jié)合分子與參照抗-hPARl抗體對(duì)人PAR1結(jié)合的竟?fàn)?。這些方法包 括例如固相直接或間接放射免疫測(cè)定法(RIA)、固相直接或間接酶免疫測(cè)定 法(EIA)、夾心竟?fàn)帨y(cè)定法(見Stahli等，Methods in Enzymology 9:242-253， 1983 );固相直接生物素-親和素EIA (見Kirkland等，J. Immunol. 137:3614-3619， 1986);固相直接標(biāo)記測(cè)定法、固相直接標(biāo)記夾心測(cè)定法 (見上引文Harlow & Lane);使用1-125標(biāo)記的固相直接標(biāo)記RIA (見 Morel等，Molec. Immunol, 25:7-15， 1988 );固相直接生物素-親和素 EIA(Cheung等，Virology 176:546-552， 1990); 和直接標(biāo)記的 RIA(Moldenhauer等，Scand. J. Immunol. 32:77-82， 19卯)。通常，這樣的 測(cè)定法涉及使用與固體表面結(jié)合的純化的抗原或帶有該抗原的細(xì)胞、未標(biāo) 記的受試抗-hPARl抗體和標(biāo)記的參照抗體。通過測(cè)定存在受試抗體時(shí)與 固體表面或細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記的量，測(cè)量竟?fàn)幰种?。通常，受試抗體過量存 在。通過竟?fàn)帨y(cè)定法鑒定的抗體(竟?fàn)幙贵w)包括與參照抗體結(jié)合相同表位的抗體，和結(jié)合下述鄰#位的抗體，所述鄰a位與參照抗體結(jié)合的 表位足夠接近，從而發(fā)生空間位阻。
為了確定受試抗-PARl抗體或抗原結(jié)合分子和參照抗-PARl抗體是 否結(jié)合獨(dú)特的表位，則可使用可商業(yè)獲得的試劑(例如來自Pierce, Rockford， IL的試劑)將各抗體生物素化?？墒褂肞ARI多肽包被的ELISA 平板以及使用未標(biāo)記的單克隆抗體和生物素化的單克隆抗體進(jìn)行竟?fàn)幯?究?？墒褂面溍褂H和素-堿性磷酸酶探針檢測(cè)生物素化的MAb結(jié)合。為了 測(cè)定純化的抗-PARl抗體的同種型，可進(jìn)行同種型ELISA。例如，可在4°C 用1照/ml抗人IgG將微量滴定板的孔包被過夜。在用1% BSA封閉后， 將平板與1照/ml或更少的單克隆抗-hPARl抗體或純化的同種型對(duì)照在 室溫下反應(yīng)1到2個(gè)小時(shí)。然后將孔與人IgGl或人IgM-特異的堿性磷酸 酶綴合的探針反應(yīng)。然后將平板顯色并分析，從而可以確定純化的抗體的 同種型。
為了證明單克隆抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子對(duì)表達(dá)hPARl多肽的 肝細(xì)胞的結(jié)合，可使用流式細(xì)胞術(shù)。簡(jiǎn)言之，可將表達(dá)hPARl的細(xì)胞系 (在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng))與多種濃度的抗-hPARl抗體在含0.1% BSA 和10%胎牛血清的PBS中混合，并在37。C孵育1小時(shí)。洗滌后，在與初 級(jí)抗體染色相同的條件下，將細(xì)胞與熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體反應(yīng)?？?通過FACScan設(shè)備分析樣品，所述設(shè)備使用光散射和側(cè)向散射特性對(duì)單 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行門控(gate)。(除了或代替)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)，(還)可使用基于 熒光顯微術(shù)的備選測(cè)定法?？扇缟纤鰧?duì)細(xì)胞染色并通過熒光顯微鏡檢 查。
可通過免疫印跡進(jìn)一步測(cè)試本發(fā)明的抗-hPARl抗體與hPARl多肽或 抗原性片段的反應(yīng)性。簡(jiǎn)言之，可以制備純化的hPARl多肽或融合蛋白， 或來自表達(dá)PARI的細(xì)胞的細(xì)胞提取物，并對(duì)其進(jìn)行十二烷基》危酸鈉聚丙 烯酰胺凝膠電泳。電泳后將分離的抗原轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用10%胎牛 血清封閉，并用要測(cè)試的單克隆抗體探測(cè)。可使用抗人IgG堿性磷酸酶檢 測(cè)人IgG結(jié)合，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem. Co" St. Louis， MO)顯色。
5. 治療性應(yīng)用和藥物組合物
本文所述的抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子可通過抑制PARI信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)活性用于許多治療性或預(yù)防性應(yīng)用中。在治療性應(yīng)用中，對(duì)已經(jīng)受到疾 病或狀況影響的受試者施用包含抗-hPARl拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子 (例如人源化的抗-hPARl抗體)的組合物，所述疾病或狀況由PARI信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)、引起或與^目關(guān)。該組合物以足夠抑制、部分停止、或可檢 測(cè)地減緩狀況*及其并發(fā)癥的量含有抗體或抗原結(jié)合分子。
在預(yù)防性應(yīng)用中，對(duì)尚未患有PARl-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)病癥的患者施用含 有抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子的組合物。更確切地說，它們被施用給 下述患者，所述患者有患這類病癥的風(fēng)險(xiǎn)，或具有發(fā)生這類病癥的素質(zhì)。 這些應(yīng)用允許增強(qiáng)患者的抗性，或延緩由PAR1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的病癥的發(fā) 展。
大量疾病狀況是由反常的或異常高的PARl-介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 所介導(dǎo)的。異常高的PARl-介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可由例如以下引起受 體暴露于異常高濃度的活化蛋白酶(例如凝血酶)或異常高的PARI細(xì)胞 表面表達(dá)水平。PARI的抑制有助于治療血栓形成和血管增生病癥，以及 抑制癌癥的i^A。見例如Darmoul，等，Mol Cancer Res (2004) 2(9):514-22 和Salah， et al， Mol Cancer Res (2007) 5(3):229-40。還發(fā)現(xiàn)抑制PARI在預(yù) 防或抑制慢性腸道炎性病癥(包括炎性腸病(IBD)、腸易激綜合征(IBS)和 潰瘍性結(jié)腸炎)和纖維變性病癥(包括肝纖維化和肺纖維化)中的用途。 見例如Vergnolle，等，J Clin Invest (2004) 114(10):1444; Yoshida， et al， Aliment Pharmacol Ther (2006) 24(Suppl 4):249; Mercer，等，Ann NY Acad Sci (2007) 1096:86-88; Sokolova and Reiser, Pharmacol Ther (2007) PMID:17532472。
可以被本發(fā)明的抗-PARl抗體或抗原結(jié)合分子抑制或預(yù)防的癌癥包 括但不僅限于上皮癌，包括癌(carcinomas);膠質(zhì)瘤、間皮瘤、黑色素 瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、白血病、'淋巴瘤、前列腺癌和伯基特淋巴瘤(Burkitt，slymphoma)、頭頸癌、 結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、食管癌、胃癌、胰腺 癌、肝膽管癌、膽嚢癌、小腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、陰 莖癌、尿道癌、睪丸癌、子宮頸癌、陰道癌、子宮癌、卵巢癌、甲狀腺癌、 甲狀旁腺癌、腎上腺癌、胰腺內(nèi)分泌癌、類癌、骨癌、皮膚癌、成視網(wǎng)膜 細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(另外的癌癥見 CANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita， V.T.等eds 1997))。還發(fā)現(xiàn)抑制PARI在預(yù)防或抑制下述疾病狀況中的用途，所述疾病狀 況可由反常的或異常高的PARI表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)或不由其介 導(dǎo)。例如，抑制PARl可以用于預(yù)防或抑制缺血-再灌注損傷，包括心肌、 腎、腦和腸的缺血-再灌注損傷。見例如Strande，等，Basic Res, Cardiol (2007) 102(4):350-8; Sevastos，等，Blood (2007) 109(2):577陽583; Junge，等， Proc Natl Acad Sci USA. (2003) 100(22): 13019-24和Tsuboi，等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2007) 292(2):G678-83。抑制PARI細(xì)胞 內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也可以用于抑制細(xì)胞的單純皰疹病毒(HSV1和HSV2)感染。見Sutherland，等，J Thromb Haemost (2007) 5(5): 1055-61。本發(fā)明提供了包含抗-hPARl抗體或抗原結(jié)合分子的藥物組合物，所 述抗體或抗原結(jié)合分子與可藥用載體配制在一起。該組合物可額外含有適 用于治療或預(yù)防給定病癥的其他治療劑。藥物載體可以增強(qiáng)或穩(wěn)定所述組 合物，或利于組合物的制備?？伤幱幂d體包括生理學(xué)相容的溶劑、分敉介 質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。本發(fā)明的藥物組合物可通過本領(lǐng)域已知的各種方法施用。施用途徑和 /或模式根據(jù)期望的結(jié)果變化。優(yōu)選施用是靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皿內(nèi)或皮下， 或施用至靼位點(diǎn)附近?？伤幱幂d體應(yīng)當(dāng)適用于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃 外、脊推或表皮施用(例如通過注射或輸注)。根據(jù)施用的途徑，可將活 性化合物(即抗體、雙特異性和多特異性分子)包在下述材料中，所述材 料保護(hù)化合物免受酸和可能使化合物失活的其他天然條件的作用。在一些實(shí)施方案中，組合物是無菌的并且是流體?？衫缤ㄟ^使用包衣料如卵磷脂、在*體的情況下通過維持所需的顆粒大小和通過使用表 面活性劑，維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，優(yōu)選組合物中包含等滲劑， 例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯化鈉?？赏ㄟ^在組合物中包含 延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)導(dǎo)致可注射組合物的長(zhǎng)期吸收。 可根據(jù)本領(lǐng)域公知和常規(guī)使用的方法制備本發(fā)明的藥物組合物。見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed.， 2000;和Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed.， Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。優(yōu)選在 GMP條件下制造藥物組合物。通常，在本發(fā)明的藥物組合物中使用治療 有效劑量或生效劑量的抗-hPARl抗體。可以通過本領(lǐng)域"t支術(shù)人員已知的 常規(guī)方法將抗-hPARl抗體配制成可藥用的劑型。調(diào)整給藥方案，以提供 最佳期望應(yīng)答(例如治療性應(yīng)答)。例如，可施用單個(gè)大丸劑(bolus)，可 在一段時(shí)間施用幾個(gè)分劑量，或可根據(jù)治療情勢(shì)的緊迫性所示，成比例地 降低或提高劑量。為了施用的便利和劑量的一致性，將腸胃外組合物配制 為單位劑型是特別有利的。本文使用的單位劑型是指適于作為單個(gè)劑量給 予待治療的受試者的、物理分離的單位；每個(gè)單位含有與所需藥物載體組 合的預(yù)定量的活性化合物，所述預(yù)定量經(jīng)計(jì)算可以產(chǎn)生期望的療效?？筛淖儽景l(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際給藥水平，從而獲得如下 活性成分量，針對(duì)具體患者、組合物和施用模式而言所述量能有效地達(dá)到 所期望的治療反應(yīng)，但是對(duì)患者沒有毒性。所選擇的給藥水平取決于多種 藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括使用的本發(fā)明具體組合物或其酯、鹽或酰胺的 活性，施用的途徑，施用時(shí)間，使用的具體組合物的排泄率，治療的持續(xù) 時(shí)間，與使用的該具體組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料，治 療的患者的年齡、性別、體重、狀況、 一般健康和先前藥物史，和類似的 因素。醫(yī)生或獸醫(yī)可以將藥物組合物中使用的本發(fā)明抗體的起始劑量定在 ^f氐于達(dá)到期望療效所需的水平，然后逐漸提高劑量，直到達(dá)到期望的療效。 本發(fā)明組合物的有效劑量一般因許多不同的因素而異，包括有待治療的特定疾病或狀況、施用手段、耙位點(diǎn)、患者的生理學(xué)狀態(tài)(無論患者是人或 是動(dòng)物)、施用的其他藥物，和治療是預(yù)防性的或是治療性的。需要滴定
治療劑量，以最優(yōu)化安全性和功效。對(duì)抗體施用而言，劑量范圍在約0.0001 到100mg/kg宿主體重，更通常在0.01到5 mg/kg宿主體重。例如，劑量 可以是1 mg/kg體重或10 mg/kg體重或在1-10 mg/kg的范圍內(nèi)。示例性 治療方案需要每?jī)芍苁┯靡淮?，或每個(gè)月一次，或每3到6個(gè)月一次。
抗體通常多次施用。單次給藥之間的間隔可以是每周、每月或每年。 間隔也可以是不規(guī)則的，如由測(cè)量患者中抗-hPARl抗體的血液水平來指 示。在一些方法中，調(diào)整劑量以達(dá)到1-1000 jag/m，的血漿抗體濃度，在一 些方法中達(dá)到25-300照/ml的血漿抗體濃度?；蛘?，可以以持續(xù)釋放制劑 形式施用抗體，在該情況下需要頻度較低的施用。劑量和頻率根據(jù)抗體在 患者中的半衰期而變化。人源化抗體一般顯示比嵌合抗體和非人抗體更長(zhǎng) 的半衰期。施用的劑量和頻率可根據(jù)治療是預(yù)防性的或是治療性的而變 化。在預(yù)防性應(yīng)用中，在一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間段中以相對(duì)不頻繁的間隔施用相對(duì)低 的劑量。 一些患者可以在其剩余生命中持續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中， 有時(shí)需要以相對(duì)短的間隔施用相對(duì)高的劑量，直到疾病的發(fā)展減速或終 止，優(yōu)選直到患者顯示部分或完全的疾病癥狀改善。此后，可對(duì)該患者施 用預(yù)防性方案。
實(shí)施例
提供以下的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不限制其范圍。本發(fā)明的其 他變體方案對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見的，并包括在后附權(quán)利 要求書中。
實(shí)施例1:開發(fā)小鼠抗-hPARl拮抗劑抗體
該實(shí)施例描述了小鼠抗-hPARl拮抗劑抗體的開發(fā)。用人PAR1 (AA #27-102) /硫氧還蛋白融合蛋白免疫Bc12 Wehi22小鼠。免疫在18天中進(jìn) 行8次。從外周淋巴結(jié)中分離B-細(xì)胞并與FO骨髓瘤細(xì)胞(ATCC， Manassas，VA)融合。通過ELISA針對(duì)hPARl/硫氧還蛋白融合蛋白篩選抗體生產(chǎn)。 總計(jì)獲得了 IO個(gè)克隆，其生產(chǎn)特異識(shí)別hPARl的抗體。使用細(xì)胞ELISA 在HT29細(xì)胞(PARI陽性)和colo50細(xì)胞(PARI陰性)上分析hPARl 抗體與細(xì)胞表面PAR1的結(jié)合。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞與雜交瘤培養(yǎng)物上清液一起
孵育，然后與HRP-綴合的抗小鼠IgG孵育。添加TMB底物(KPL， Gaithersburg，MD)， 20分鐘后用硫酸(2N)酸化孔，并在450 nm處測(cè)量顏 色。結(jié)果顯示10個(gè)克隆中的5個(gè)雜交瘤克隆能夠結(jié)合該細(xì)胞表面受體。
自每個(gè)細(xì)胞結(jié)合陽性克隆純化單克隆抗體(mAb)。簡(jiǎn)言之，在G蛋白 樹月旨(Amersham Biosciences, Piscataway， NJ)上純4匕無血清的^^t培養(yǎng)基。 另外，通過有限稀釋對(duì)10個(gè)產(chǎn)抗體的克隆進(jìn)行亞克隆，并通過ELISA和 細(xì)胞ELISA針對(duì)PARI結(jié)合評(píng)價(jià)得到的克隆。還如下所述針對(duì)功能性評(píng) 價(jià)功能性亞克隆。
使用hPARl-依賴性鈣流測(cè)定法篩選功能性hPARl拮抗劑抗體。已知 凝血酶切割PARI的N-端結(jié)構(gòu)域，去除約15個(gè)氨基酸。剩余的N-端結(jié)構(gòu) 域(稱作束縛配體)負(fù)責(zé)起始PARI介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。凝血酶對(duì)PAR-1 的該切割導(dǎo)致細(xì)胞中快速和瞬時(shí)的鈣流，其能夠使用可商業(yè)獲得的試劑 (Molecular Devices)測(cè)量。具體地，在HT-29、 HCT-116和DU145細(xì)胞上 評(píng)價(jià)純化的抗體抑制凝血酶處理后的鈣流的能力。將FlipR染料(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中的細(xì)胞用G蛋白純化的抗體預(yù)孵育1小時(shí)，并 用多種濃度的凝血酶誘導(dǎo)Ca"+流。該結(jié)果表明，來自兩個(gè)克隆(4￡7.114& 6E11.H6)之每個(gè)的亞克隆顯示強(qiáng)拮抗劑活性。還使用DU145和HCT116 細(xì)胞二者對(duì)功能性克隆進(jìn)行FlipR測(cè)定。兩種細(xì)胞系均證實(shí)了功能性抗體 拮抗劑的活性。
為了評(píng)價(jià)拮抗劑的機(jī)制，還檢查了凝血酶切割后抗體結(jié)合PARI受體 的能力。用凝血酶完全切割PARl/硫氧還蛋白。中和凝血酶后，添加等份 的全長(zhǎng)PARl/硫氧還蛋白。將抗體與G蛋白結(jié)合，并使用固定化的抗體免 疫沉淀經(jīng)切割的/全長(zhǎng)的PARI融合蛋白混合物。分離樹脂、洗滌并通過 SDS-PAGE鑒定捕獲的蛋白質(zhì)。評(píng)價(jià)的克隆中三個(gè)能夠結(jié)合與硫氧還蛋白融合蛋白鄰近的PARI部分，包括兩個(gè)功能性克隆4E7和6E11。 PARI 的該結(jié)構(gòu)域代表了凝血酶切割后留在細(xì)胞表面上的束縛配體。該結(jié)果還表 明下述抗體在FlipR測(cè)定法中效力差得多，所述抗體封閉PARI的凝血酶 切割，但是不能結(jié)合束縳配體。因此，似乎結(jié)合束繂配體對(duì)功能活性而言 是必需的但不是充分的。
通過RT-PCR克隆了兩條功能性重鏈(VH)和輕鏈(VL)的區(qū)域。用于鑒 定兩個(gè)克隆(4E7,J14丄16 & 6E11.H6,A9)的重鏈和輕鏈可變區(qū)的引物序列 相同并且見如下。用于VH的引物為(1)
HV1:GGGTCTAGACACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT (SEQ ID NO:33) 和 (2) H- 恒 定 區(qū)
GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC (SEQ ID NO:34)。 用 于 VL 的引物為 (1) LV5: GGGTCTAGACACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGDNA (SEQ ID NO:35) 和 (2)L- 恒 定 區(qū)
GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG (SEQ ID隱36)。
簡(jiǎn)言之，分離總RNA。用針對(duì)任一重鏈或輕鏈可變區(qū)的信號(hào)序列的正 向引物，和針對(duì)重鏈CH1區(qū)或輕鏈K恒定區(qū)的反向引物進(jìn)行RT-PCR。 將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pCR II或pcDNA3.1/V5-His-TPOP-TA載體中用于測(cè) 序。然后測(cè)定這些抗體克隆的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的多核苷^f列(圖 1)。圖2顯示這些可變區(qū)的相應(yīng)M酸序列。圖2中還指出根據(jù)Kabat 等上引文的編號(hào)系統(tǒng)推出的CDR區(qū)和構(gòu)架區(qū)。
實(shí)施例2:產(chǎn)生嵌合的抗-hPARl抗體
該實(shí)施例描述了嵌合的抗-hPARl抗體的產(chǎn)生和表征。該嵌合抗體含 有來自上述小鼠抗-hPARl抗體的可變區(qū)和來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)。
為了產(chǎn)生嵌合抗體，用下述引物對(duì)針對(duì)人PARI克隆的小鼠抗體的可 變區(qū)進(jìn)行再次PCR，所述引物被設(shè)計(jì)用于克隆進(jìn)盒載體。然后將所述可變 區(qū)分別克隆進(jìn)盒載體，所述盒載體含有與人免疫球蛋白前導(dǎo)序列、J-區(qū)段和剪接-供體信號(hào)的讀框內(nèi)融合。然后將該序列轉(zhuǎn)移進(jìn)含有人免疫球蛋白恒定區(qū)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，在重鏈上進(jìn)行新霉素選擇、在輕鏈上進(jìn)行
dhfr選擇、并使用甲氨喋呤進(jìn)行基因擴(kuò)增。
將嵌合IgGl重鏈和k輕鏈的DNA質(zhì)粒共同電穿孔進(jìn)SP2/0骨髓瘤細(xì)
胞中。用遺傳霉素選擇細(xì)胞，然后在含有遺傳霉素和甲氨喋呤的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)和擴(kuò)增。使細(xì)胞適應(yīng)用于抗體純化的無血清培養(yǎng)基。純化從轉(zhuǎn)染
的SP2/0細(xì)胞分泌的嵌合IgGl抗體?？膳c小鼠抗-hPARl抗體類似地在FlipR測(cè)定法中檢查純化的嵌合IgGl抗體的拮抗劑活性。該測(cè)試可揭示嵌合抗-hPARl抗體顯示與小鼠IgGl抗體類似的拮抗劑活性。
實(shí)施例3:抗-hPARl抗體抑制凝血酶介導(dǎo)的IL-8分泌該實(shí)施例描述了抗-hPARl拮抗劑抗體對(duì)凝血酶介導(dǎo)的自HUVEC的IL-8分泌的抑制。將細(xì)胞與凝血酶接觸過夜，這導(dǎo)致分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的IL-8提高。在凝血酶處理前1小時(shí)添加抗體。通過ELISA測(cè)量的結(jié)果顯示于圖3中。如圖中所示，兩種小鼠抗-hPARl抗體均能夠抑制自凝血酶處理的HUVEC的IL-8分泌的提高。
應(yīng)當(dāng)理解本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于舉例說明的目的，鑒于其，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以被提示多種修飾或改變，且所述修飾或改變包括在本申請(qǐng)的精神和范圍和后附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文中引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)?zhí)卮藶樗械哪康亩暾夭⑷胱鳛閰⒖肌?br> 49
權(quán)利要求
1.與人PAR1的表位特異結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合分子，其中該表位包含氨基酸序列SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE(SEQ IDNO38)，且其中該抗體或抗原結(jié)合分子是PAR1拮抗劑。
2. 4又利要求1的抗體或抗原結(jié)合分子，其包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的重鏈互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)序列；或SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的輕鏈CDR序列。
3. 權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合分子，其包含分別為SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列； 和分別為SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的輕鏈CDRl、 CDR2和CDR3序列。
4，權(quán)利要求l的抗體或抗原結(jié)合分子，其包含SEQIDNO:27、SEQID NO:28或SEQ ID NO:29的重鏈互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)序列；或SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31,或SEQ ID NO:32的輕鏈CDR序列。
5. 權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合分子，其包含分別為SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列； 和分別為SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的輕鏈CDRl、 CDR2和CDR3序列。
6. 權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合分子，其包含(i)與SEQ ID NO:5具 有至少85%同一性的重鏈可變區(qū)^酸序列和與SEQ ID NOA具有至少 85%同一性的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，或(ii)與SEQ ID NO:7具有至少 85。/。同一性的重鏈可變區(qū)M酸序列和與SEQ ID NO:8具有至少85%同 一性的輕鏈可變區(qū)JlJ^酸序列。
7. 權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合分子，其包含(i) SEQ ID NO:5的重 鏈可變區(qū)氨基酸序列和SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，或(ii) SEQ ID NO:7的重鏈可變區(qū)^J^酸序列和SEQ ID NO:8的輕鏈可變區(qū)氨 基酸序列。
8. 權(quán)利要求l的抗體或抗原結(jié)合分子，其為小鼠抗體。
9. 權(quán)利要求l的抗體或抗原結(jié)合分子，其為單克隆抗體。
10. 權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合分子，其為嵌合抗體。
11. 權(quán)利要求10的抗體或抗原結(jié)合分子，其包含人重鏈恒定區(qū)和人輕 鏈恒定區(qū)。
12. 權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合分子，其為人源化的抗體。
13. 權(quán)利要求l的抗體或抗原結(jié)合分子，其為人抗體。
14. 權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合分子，其為單鏈抗體。
15. 權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合分子，其為Fab片段。
16. 權(quán)利要求l的抗體或抗原結(jié)合分子，其為具有來自人纖連蛋白III 型結(jié)構(gòu)域的支架的單抗體。
17. 分離的或重組的多核苷酸，其編碼與人PAR1的表位特異結(jié)合的 抗體或抗原結(jié)合分子，其中該表位包含氨基酸序列 SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)，且其中該抗 體或抗原結(jié)合分子為PARI拮抗劑。
18. 權(quán)利要求17的多核苷酸，其中該抗體或抗原結(jié)合分子是人抗體。
19. 權(quán)利要求17的多核苷酸，其中該抗體或抗原結(jié)合分子包含(i)分別 為SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重鏈CDR1、 CDR2 和CDR3序歹'h和分別為SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26 的輕鏈CDR1 、 CDR2和CDR3序列；或(ii)分別為SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重鏈CDR1 、 CDR2和CDR3序列；和分別為 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的輕鏈CDR1、 CDR2 和CDR3序列。
20. 權(quán)利要求17的多核苷酸，其中該抗體或抗原結(jié)合分子包含(i)與 SEQ ID NO:5的成熟區(qū)具有至少90%同一性的成熟重鏈可變區(qū)序列，和與 SEQ ID NO:6的成熟區(qū)具有至少90%同一性的成熟輕鏈可變區(qū)序列；或(ii) 與SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的成熟重鏈可變區(qū)氨基酸序列，和 與SEQ ID NO:8具有至少卯％同一性的成熟輕鏈可變區(qū)#^酸序列。
21. 權(quán)利要求17的多核苷酸，其中該抗體或抗原結(jié)合分子包含(i)與 SEQ ID NO:5的成熟區(qū)相同的成熟重鏈可變區(qū)序列，和與SEQ ID NO:6 的成熟區(qū)相同的成熟輕鏈可變區(qū)序列；或(ii)與SEQ ID NO:7的成熟區(qū)相 同的成熟重鏈可變區(qū)序列，和與SEQ IDNO:8的成熟區(qū)相同的成熟輕鏈可 變區(qū)序列。
22. 權(quán)利要求17的多核苷酸，其為DNA。
23. 分離的宿主細(xì)胞，其包含(l)編碼權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合分 子的重鏈的重組DNA區(qū)段，和(2)編碼該抗體或抗原結(jié)合分子的輕鏈的第 二重組DNA區(qū)段;其中所述DNA區(qū)段分別與第一和第二啟動(dòng)子有效連接， 并能夠在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)。
24. 權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中該抗體或抗原結(jié)合分子是人單克隆 抗體。
25. 權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中該抗體或抗原結(jié)合分子包含(i)分別 為SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重鏈CDR1、 CDR2 和CDR3序列；和分別為SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26 的輕鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列；或(ii)分別為SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重鏈CDR1 、 CDR2和CDR3序列；和分別為 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的輕鏈CDR1、 CDR2 和CDR3序列.
26. 權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中該抗體或抗原結(jié)合分子包含(i)與 SEQ ID NO:5的成熟區(qū)具有至少卯％同一性的成熟重鏈可變區(qū)序列，和與 SEQ ID NO:6的成熟區(qū)具有至少90%同一性的成熟輕鏈可變區(qū)序列；或(ii) 與SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的成熟重鏈可變區(qū)#^酸序列，和 與SEQ ID NO:8具有至少90%同一性的成熟輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
27. 權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中該抗體或抗原結(jié)合分子包含(i)與 SEQ ID NO:5的成熟區(qū)相同的成熟重鏈可變區(qū)序列，和與SEQ ID NO:6 的成熟區(qū)相同的成熟輕鏈可變區(qū)序列；或(ii)與SEQ ID NO:7的成熟區(qū)相 同的成熟重鏈可變區(qū)序列，和與SEQ ID NO:8的成熟區(qū)相同的成熟輕鏈可變區(qū)序列。
28. 權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其為非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
29. 藥物組合物，其包含與人PAR1的表位特異結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合分子，其中該表位包含氨基酸序列SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)，且其中該抗體或抗原結(jié)合分子為PARI拮抗劑。
30. 權(quán)利要求30的藥物組合物，包含下述抗體，所述抗體包含分別為SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列；和分別為SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的輕鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列。
31. 權(quán)利要求30的藥物組合物，包含下述抗體，所述抗體包含分別為SEQIDNO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列；和分別為SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的輕鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列。
32. 改善疾病狀況的癥狀的方法，所述疾病狀況由通過PARI的異常細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所介導(dǎo)，所述方法包括對(duì)有需要的受試者施用與人PARI表位特異結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合分子，其中所述表位包含氨基酸序列SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)，且其中所述抗體或抗原結(jié)合分子是PARI拮抗劑。
33. 權(quán)利要求32的方法，包括施用抗體，所述抗體包含分別為SEQ IDNO:21、 SEQIDNO:22和SEQIDNO:23的重鏈CDRl、 CDR2和CDR3序列；和分別為SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的輕鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列。
34. 權(quán)利要求32的方法，包括施用抗體，所述抗體包含分別為SEQ IDNO:27、 SEQIDNO:28和SEQIDNO:29的重鏈CDRl、 CDR2和CDR3序列；和分別為SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的輕鏈CDR1、 CDR2和CDR3序列。
35. 權(quán)利要求32的方法，其中由通過PAR1的異常細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所介導(dǎo)的疾病狀況是慢性腸道炎性病癥。
36. 權(quán)利要求32的方法，其中由通過PAR1的異常細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所 介導(dǎo)的疾病狀況是纖維變性病癥。
37. 權(quán)利要求32的方法，其中由通過PAR1的異常細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所 介導(dǎo)的疾病狀況是過表達(dá)PAR1的癌癥。
38. 權(quán)利要求32的方法，其中由通過PAR1的異常細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所 介導(dǎo)的疾病狀況是缺血-再灌注損傷。
全文摘要
本發(fā)明提供特異識(shí)別并拮抗人PAR1受體的抗體或抗原結(jié)合分子。本發(fā)明還提供編碼這些分子的多核苷酸和載體，和含有所述多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101516398SQ200780034441
公開日2009年8月26日 申請(qǐng)日期2007年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月18日
發(fā)明者M·納索弗, S·B·科恩 申請(qǐng)人:Irm責(zé)任有限公司