專利名稱：：人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)和診斷試劑、疫苗研制領(lǐng)域，特別是涉及一種人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)及其制備方法。
背景技術(shù)：
：人巨細(xì)胞病毒(HumanCytomegalovirus,簡稱HCMV)屬皰疹病毒fi亞科，是一種DNA病毒，其感染在人群中廣泛存在，我國人群中巨細(xì)胞病毒感染相當(dāng)嚴(yán)重。婦女在妊娠初期受CMV原發(fā)感染是引起胎兒宮內(nèi)感染和發(fā)育缺損的重要原因，在孕期原發(fā)性感染HCMV的胎兒和新生兒中，80%可導(dǎo)致智力低下、畸形和死亡[MiddeldorpJM.JongsmaJ，HaarAT,etal.DetectionofimmunoglobulinMandGantibodiesagainstcytomegalovirusearlyandlateantigendbyenzyme-linkedimmunosorben1:assay.JClin.Microbiol,1984;20(4):763-771.]。HCMV也是器官移植失敗和艾滋病病人并發(fā)感染死亡的主要原因之一。對非免疫缺陷者常導(dǎo)致長期隱性感染，甚至引起感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、畸變或癌變等[HuangES.ThepathogenicityofHumanCytomegalovirus.Springer-Vellag.Berin，1993,1-45]。因此快速準(zhǔn)確的診斷HCMV病毒感染具有十分重要的意義。目前巨細(xì)胞病毒感染診斷方法有脫落細(xì)胞及組織病理檢查、病毒分離、分子雜交試驗和血清學(xué)檢查，但由于前三種方法技術(shù)設(shè)備要求高，檢測周期長的局限性，無法廣泛使用，而血清學(xué)檢查具有簡便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應(yīng)用，目前大多檢測試劑采用盒用的HCMV蛋白質(zhì)抗原主要是來源于病毒培養(yǎng)物或是重組表達(dá)的單一蛋白片段，或者由于蛋白質(zhì)抗原純度低及特異性差，造成假陽性而降低檢測特異性；或者由于單一片段抗原蛋白所含抗原決定簇較少，所識別的抗體相應(yīng)較少，易造成假陰性而降低檢測敏感性，雖然多種單一片段組合制備檢測試劑也可以避免上述問題，但必然要求多次進(jìn)行提取純化過程，而且小分子蛋白質(zhì)或多肽的提純技術(shù)要求更高，工作效率太低。另外，在全球范圍內(nèi)，目前缺乏有效治療病毒感染藥物的情況下，通過接種疫苗預(yù)防病毒感染成為一種重要的醫(yī)學(xué)干預(yù)手段，HCMV疫苗的研制也是進(jìn)行HCMV研究的重要領(lǐng)域之一，而疫苗研究的一個重要前提是其所用蛋白質(zhì)抗原應(yīng)具有高特異性、強免疫原性和盡量完整的抗原決定簇，因此開發(fā)一種多抗原決定簇串聯(lián)的重組蛋白質(zhì)技術(shù)是十分必要的。
發(fā)明內(nèi)容鑒于以上問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)及其制備方法，該發(fā)明利用重組聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,簡稱PCR)技術(shù)構(gòu)建出含有高度特異性和強免疫原性的多抗原決定簇串聯(lián)的人巨細(xì)胞病毒(H咖anCytomegalovirus,簡稱HC匿)重組蛋白質(zhì)。為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供的人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)，其如氨基酸殘基序列SEQIDNo.1所示所述的重組蛋白質(zhì)從N-末端到C-末端依次含有HCMVgp52從N-末端第261位到第380位的120個氨基酸、ppl50從N-末端第587位到第640位的54個氨基酸、pp65從N-末端第361位到425位的65個氨基酸、gB從N-末端第200位到243位的44個氨基酸及pp28從N-末端第95位到128位的34個氨基酸。其中上述重組蛋白質(zhì)的DNA序列如SEQIDNo.2所示，所述的gp52目的肽段DNA序列是gp52第781位到第1140位核苷酸，ppl50目的肽段DNA序列是第1759位到第1920位核苷酸，pP65目的肽段DNA序列是第1081位到第1275位核苷酸，gB目的肽段DNA序列是第598位到第729位核苷酸，pp28目的肽段DNA序列是第283位到第384位核苷酸。本發(fā)明提供的人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)制備方法，其基因重組及純化過程包括以下步驟(1)設(shè)計用于擴(kuò)增gp52目的DNA片段的PCR引物對(pl，p2)、用于擴(kuò)增ppl50目的DNA片段的PCR引物對(p3，p4)、用于擴(kuò)增pp65目的DNA片段的PCR引物對(p5，p6)、用于擴(kuò)增gB目的DNA片段的PCR引物對(p7，p8)和用于擴(kuò)增pp28目的DNA片段的PCR引物對(p9，pl0)，引物pl和plO分別帶有Ndel和XhoI的酶切位點，引物p2和p3順序互補，并共同對應(yīng)于gp52上述片段的3'末端和ppl50上述片段的5，末端序列，引物p4和p5順序互補，并共同對應(yīng)于卯150上述片段的3，末端和pp65上述片段的5，末端序列，引物p6和p7順序互補，并共同對應(yīng)于卯65上述片段的3，末端和gB上述片段的5'末端序列，引物p8和p9順序互補，并共同對應(yīng)于gB上述片段的3，末端和pp28上述片段的5，末端序列；(2)以病毒培養(yǎng)物為模板，以引物Pl和P2擴(kuò)增gp52片段，以引物P3和P4擴(kuò)增ppl50片段，以引物P5和P6擴(kuò)增pp65片段，以引物P7和P8擴(kuò)增gB片段，以引物P9和P10擴(kuò)增pp28片段；再以第一輪PCR擴(kuò)增得到的gp52片段和ppl50片段為模板，加入引物Pl和P4，擴(kuò)增gp52ppl50片段，以第一輪PCR擴(kuò)增得到的pp65片段和gB片段為模板，加入引物P5和P8，擴(kuò)增卯65gB片段；然后以第二輪PCR擴(kuò)增得到的gp52卯150和pp65gB片段為模板，加入引物Pl和P8，擴(kuò)增gp52ppl50pp65gB;最后以擴(kuò)增得到的片段gp52ppl50pp65gB和pp28為模板，加入引物Pl和PIO，擴(kuò)增gp52卯150卯65gBpp28，得到串聯(lián)的目的基因重組片段gp52ppl50pp65gB卯28;(3)將pET28a載體與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Ndel和Xhol雙酶切，產(chǎn)物純化后經(jīng)T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37。C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選生長的菌落，進(jìn)行PCR和DNA測序鑒定，得到正確的陽性轉(zhuǎn)化子；(4)提取陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入BL21系列中的DE3感受態(tài)菌，在含卡那霉素的LB平板上370C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)LB培養(yǎng)的表達(dá)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)后收獲菌體，經(jīng)超聲破菌、組氨酸親和柱和離子交換柱層析得到純化的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)具有高特異性、強免疫原性蛋白質(zhì)序列，可提高檢測試劑的敏感性和特異性，避免采用單一片段抗原蛋白質(zhì)時造成的假陰性而降低檢測敏感性問題，且該重組蛋白質(zhì)采取了多抗原決定簇串聯(lián)的重組蛋白質(zhì)技術(shù)，可以簡化提純過程，提高工作效率。另外，本發(fā)明提供的該重組蛋白質(zhì)在人巨細(xì)胞病毒疫苗研制領(lǐng)域也具有很好的實用價值。本發(fā)明所述的人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列(SEQIDNo.1):NH3-FAVENFLTEEPFQRGDPFDKNYVGNSGKSRGGGGGGGSLSSLANAGGLHDDGPGLDNDLMNEPMGLGGLGGGGGGGGKKHDRGGGGGSGTRKMSSGGGGGDHDHGLSSKEKYEQHKITSYAGAGAAITPTPVNPSTAPAPAPTPTFAGTQTPVNGNSPWAPTAPPGDMNPANPQYSEHPTFTSQYRIQGKLEYRHTWDRHDEGAAQGDDDVWTSGSDSDEELVTTERKTPRVTGGGAAYHRDSYENKTMOMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRRSTFREDKAPKPSKQSKKKKKPSKHHHHQQSSIM—C00H本發(fā)明所述的人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)的DNA序列(SEQIDNo.2):TTCGCCGTGGAGAATTTTCTCACCGAGGAACCTTTCCAGCGTGGCGATCCCTTCGACAAAMTTACGTCGGGAACAGCGGCAAGTCGCGTGGCGGCGGCGGTGGTGGCGGCAGCCTCTCTTCGCTGGCCAATGCCGGCGGTCTGCATGACGACGGCCCGGGTCTGGATAACGATCTCATGAACGAGCCCATGGGTCTCGGCGGTCTGGGAGGAGGTGGCGGCGGTGGCGGCAAGAAGCACGACCGCGGTGGCGGCGGTGGTTCCGGTACGCGGAAMTGAGCAGCGGTGGCGGCGGCGGTGATCACGACCACGGTCTTTCCTCCAAGGMAAATACGAGCAGCACAAGATCACCAGCTACGCTGGCGCCGGCGCTGCCATCCTCACGCCGACGCCTGTCAATCCTTCCACGGCCCCCGCTCCGGCCCCGACACCTACCTTCGCGGGTACCCAAACCCCGGTCAACGGTAACTCGCCCTGGGCTCCGACGGCGCCGTTGCCCGGGGATATGAACCCCGCCAACCCTCAGTACAGCGAGCACCCCACCTTCACCAGCCAGTATCGCATCCAGGGCAAGCTTGAGTACCGACACACCTGGGACCGGCACGACGAGGGTGCCGCCCAGGGCGACGACGACGTCTGGACCAGCGGATCGGACTCCGACGAAGAACTCGTAACCACCGAGCGCAAGACGCCCCGCGTCACCGGCGGCGGCGCCGCTTATCATAGGGACAGCTATGAAAACMMCCATGCAATTAATGCCCGACGATTATTCCAACACCCACAGTACCCGTTACGTGACGGTCAAGGATCAATGGCACAGCCGCGGCAGCACCTGGCTCTATCGTCGCTCGACGTTTCGCGAGGACAAGGCTCCGAAACCGAGCAAGCAGTCAAAAAAGAAAAAGAAACCCTCAAAACATCACCACCATCAGCAAAGCTCCATTATG具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對本發(fā)明的限定。人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)及其制備l.重組前的準(zhǔn)備根據(jù)目的片段的DNA序列，即HCMVgp52、ppl50、pp65、gB和pp28上目的肽段的cDNA序列和質(zhì)粒上的酶切位點，設(shè)計五對PCR引物(P1,P2)、(P3，P4)、(P5,P6)、(P7，P8)和(P9，PIO)。pl和p2用于擴(kuò)增gp52第781位到第1140位核苷酸，p3和p4用于擴(kuò)增ppl50第1759位到第1920核苷酸,p5和p6用于擴(kuò)增pp65第1081位到第1275核苷酸，p7和p8用于擴(kuò)增gB第598位到第729核苷酸，p9和p10用于擴(kuò)增PP28第283位到第384核苷酸；引物pl和p10分別帶有Ndel和Xhol的酶切位點，引物p2和p3順序互補，并共同對應(yīng)于gp52上述片段的3'末端和ppl50上述片段的5'末端序列，引物p4和p5順序互補，并共同對應(yīng)于ppl50上述片段的3，末端和pp65上述片段的5，末端序列，引物p6和p7順序互補，并共同對應(yīng)于pp65上述片段的3'末端和gB上述片段的5'末端序列，引物p8和p9順序互補，并共同對應(yīng)于gB上述片段的3，末端和pp28上述片段的5'末端序列。2.目的DNA片段PCR重組第一輪PCR擴(kuò)增以人巨細(xì)胞病毒培養(yǎng)物為模板，以引物P1和P2擴(kuò)增gp52目的DNA片段，以引物P3和P4擴(kuò)增ppl50目的DNA片段，以引物P5和P6擴(kuò)增pp65目的DNA片段，以引物P7和P8擴(kuò)增gB目的DNA片段，以引物P9和P10擴(kuò)增pp28目的DNA片段。第二輪PCR擴(kuò)增以第一輪PCR擴(kuò)增得到的gp52目的DNA片段和ppl50目的DNA片段為模板，加入引物Pl和P4，擴(kuò)增gp52ppl50目的DNA片段。以第一輪PCR擴(kuò)增得到的卯65目的DNA片段和gB目的DNA片段為模板，加入引物P5和P8,擴(kuò)增pp65gB目的DNA片段。第三輪PCR擴(kuò)增以第二輪PCR擴(kuò)增得到的gp52ppl50和卯65gB目的DNA片段為模板，加入引物P1和P8，擴(kuò)增gp52ppl50pp65gB目的DNA片段。第四輪PCR擴(kuò)增以第三輪擴(kuò)增得到的gp52ppl50pp65gB目的DNA片段和第一輪擴(kuò)增得到的pp28目的DNA片段為模板，加入引物Pl和PIO，擴(kuò)增gp52ppl50pp65gBpp28目的DNA片段。得到完整的目的DNA重組片段gp52ppl50pp65gBpp28。3.重組DNA片段插入表達(dá)質(zhì)粒pET28a載體與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物gp52ppl50pp65gBpp28目的DNA片段經(jīng)Ndel和Xhol雙酶切，產(chǎn)物純化后經(jīng)T4DNA連接酶與載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入克隆菌株ToplO，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落進(jìn)行PCR及DNA測序鑒定重組子。4.在大腸桿菌中表達(dá)重組抗原蛋白正確的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后提質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)BL21系列中的DE3菌株，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5小時，收集菌體經(jīng)超聲破菌、組氨酸親和柱和離子交換柱層析得到純化的重組蛋白。5.重組蛋白Western-blot驗證為驗證重組HCMV蛋白質(zhì)與抗HCMV抗血清反應(yīng)性及重組目的基因獲得表達(dá)并具有抗原性，用Western-blot法進(jìn)行了測試。陽性血清為10份用HCMV病毒培養(yǎng)物免疫兔子收獲的兔抗HCMV抗體陽性血清和30份人抗HCMV抗體陽性血清(經(jīng)ELISA法檢測證實)。陰性血清為10份對照正常兔血清和30份人抗HCMV抗體陰性血清(經(jīng)ELISA法檢測證實)。測試結(jié)果如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果顯示，用HCMV病毒培養(yǎng)物免疫兔子所得的10份兔抗HCMV抗體陽性血清和30份人抗HCMV抗體陽性血清全部與表達(dá)抗原產(chǎn)生陽性反應(yīng)，10份對照正常兔血清和30份人抗HCMV抗體陰性血清與表達(dá)抗原均產(chǎn)生陰性反應(yīng)。結(jié)果提示重組目的基因獲得表達(dá)，重組HCMV蛋白質(zhì)與全病毒蛋白質(zhì)有明顯的交叉反應(yīng)性，并具有很強的特異性，具有實際應(yīng)用意義。權(quán)利要求1.一種人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)，其特征在于，含有SEQIDNo.1所示的氨基酸殘基序列，所述的重組蛋白質(zhì)從N-末端到C-末端依次含有人巨細(xì)胞病毒gp52從N-末端第261位到第380位的120個氨基酸、pp150從N-末端第587位到第640位的54個氨基酸、pp65從N-末端第361位到425位的65個氨基酸、gB從N-末端第200位到243位的44個氨基酸及pp28從N-末端第95位到128位的34個氨基酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)，其特征在于，所述重組蛋白質(zhì)的DNA序列如SEQIDNo.2所示，其中，gp52目的肽段DNA序列是gp52第781位到第1140位核苷酸，ppl50目的肽段DNA序列是第1759位到第1920位核苷酸，pp65目的肽段DNA序列是第1081位到第1275位核苷酸，gB目的肽段DNA序列是第598位到第729位核苷酸，pp28目的肽段DNA序列是第283位到第384位核苷酸。3.—種如權(quán)利要求1所述的人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)分別將人巨細(xì)胞病毒中g(shù)p52、ppl50、pp65、gB和pp28中目的DNA片段擴(kuò)增，重組，得到gp52ppl50pp65gBpp28重組片段；(2)將pET28a載體與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Ndel和Xhol雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化，測序鑒定重組子；(3)轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，處理菌體收獲重組蛋白，經(jīng)純化后得到人巨細(xì)胞病毒重組蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，其步驟(1)具體包括以下內(nèi)容(a)設(shè)計用于擴(kuò)增gp52目的DNA片段的PCR引物對(pl，p2)、用于擴(kuò)增ppl50目的DNA片段的PCR引物對(p3，p4)、用于擴(kuò)增卯65目的DNA片段的PCR引物對(p5，p6)、用于擴(kuò)增gB目的DNA片段的PCR引物對(p7,p8)和用于擴(kuò)增pp28目的DNA片段的PCR引物對(p9，pl0)，引物pl和plO分別帶有Ndel和XhoI的酶切位點，引物p2和p3順序互補，并共同對應(yīng)于gp52上述片段的3'末端和卯150上述片段的5'末端序列，引物p4和p5順序互補，并共同對應(yīng)于卯150上述片段的3'末端和pp65上述片段的5'末端序列，引物p6和p7順序互補，并共同對應(yīng)于卯65上述片段的3，末端和gB上述片段的5'末端序列，引物p8和p9順序互補，并共同對應(yīng)于gB上述片段的3，末端和pp28上述片段的5，末端序列；(b)以人巨細(xì)胞病毒培養(yǎng)物為模板，以引物Pl和P2擴(kuò)增gp52片段，以引物P3和P4擴(kuò)增ppl50片段，以引物P5和P6擴(kuò)增pp65片段，以引物P7和P8擴(kuò)增gB片段，以引物P9和P10擴(kuò)增卯28片段；再以第一輪PCR擴(kuò)增得到的gp52片段和ppl50片段為模板，加入引物Pl和P4,擴(kuò)增gp52ppl50片段，以第一輪PCR擴(kuò)增得到的卯65片段和gB片段為模板，加入引物P5和P8，擴(kuò)增pp65gB片段；然后以第二輪PCR擴(kuò)增得到的gp52ppl50和pp65gB片段為模板，加入引物Pl和P8，擴(kuò)增gp52ppl50pp65gB;最后以擴(kuò)增得到的片段gp52ppl50pp65gB和pp28為模板，加入引物Pl和PIO，擴(kuò)增gp52ppl50pp65gBpp28片段，得到串聯(lián)的目的基因重組片段gp52ppl50pp65gBpp28。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，其步驟(2)具體為將pET28a載體與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切，產(chǎn)物純化后經(jīng)LDNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37。C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落，進(jìn)行PCR和DNA測序鑒定，得到正確的陽性轉(zhuǎn)化子。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，其步驟(3)具體為提取陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入BL21系列中的DE3感受態(tài)菌，在含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過夜，次日挑選平板上生長的菌落用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)LB培養(yǎng)的表達(dá)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)后收獲菌體，經(jīng)超聲破菌、組氨酸親和柱和離子交換柱層析得到純化的重組蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明提供一種人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)及其制備方法，涉及基因工程技術(shù)和診斷試劑、疫苗研制領(lǐng)域。本發(fā)明提供的重組蛋白質(zhì)是從N-末端到C-末端依次含有HCMVgp52從N-末端第261位到第380位的120個氨基酸、pp150從N-末端第587位到第640位的54個氨基酸、pp65從N-末端第361位到425位的65個氨基酸、gB從N-末端第200位到243位的44個氨基酸及pp28從N-末端第95位到128位的34個氨基酸。該人巨細(xì)胞病毒重組蛋白質(zhì)具有高特異性、強免疫原性蛋白質(zhì)序列，可提高檢測試劑的敏感性和特異性，且該重組蛋白質(zhì)采取了多抗原決定簇串聯(lián)的重組蛋白質(zhì)技術(shù)，可以簡化提純過程，提高工作效率。文檔編號C07K14/045GK101220085SQ200710176610公開日2008年7月16日申請日期2007年10月31日優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日發(fā)明者孔詳菊,張秀杰,健王,王志新,陳廷友申請人:北京英諾特生物技術(shù)有限公司