專利名稱：甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA和使用該cDNA的高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的甘薯擴(kuò)展蛋白(expansin)cDNA。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA，攜帶該cDNA的轉(zhuǎn)化載體，以及制備具有提高的生物量和/或種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景技術(shù)：
自從Cosgrove及其合作者發(fā)現(xiàn)了擴(kuò)展蛋白(McQueen-Mason等人，1992，Plant Cell 4，1425～1433)，人們對(duì)擴(kuò)展蛋白已經(jīng)進(jìn)行了深入研究。在早期的研究中，擴(kuò)展蛋白被認(rèn)為是細(xì)胞壁疏松酶，其至少部分介導(dǎo)植物細(xì)胞壁的pH依賴性擴(kuò)展以及細(xì)胞的生長(zhǎng)(Cosgrove，2000，Nature 407，321～326)。其后，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展蛋白是α-形式或β-形式(Shcherban等人，1995，PNAS 92，9245～9249)。
最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展蛋白除了參與調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)展外，還參與調(diào)節(jié)多種其他植物過(guò)程，其包括形態(tài)發(fā)生(Ruan等人，2001，Plant Cell 13，47～60)、果實(shí)的軟化(Rose等人，2000，Plant Physiology 123，1583～1592；Civello等人，1999，Plant Physiology 121，1273～1280)、花粉管的生長(zhǎng)(Cosgrove等人，1997，PNAS 94，6559～6564)、重力應(yīng)答根(graviresponding root)的伸長(zhǎng)(Zhang和Hasenstein，2000，Plant CellPhysiology 41，1305～1312)以及根部細(xì)胞的伸長(zhǎng)(Lee等人，2003，PlantPhysiology 131，985～997)(參見(jiàn)綜述，Lee等人2001，Cur.Opin.Plant Biol.4，527～532)。
此外，充分研究了擴(kuò)展蛋白在受淹澇的水稻(flooded rice)和番茄中的表達(dá)模式。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在番茄的芽的頂端分生組織中表達(dá)擴(kuò)展蛋白以用于早期葉原基的發(fā)端(Reinhardt等人，1998，Plant Cell 10，1427～1437)?？寺×艘环N擴(kuò)展蛋白基因(Exp1)并且發(fā)現(xiàn)該基因通過(guò)其轉(zhuǎn)化體而在番茄果實(shí)的生長(zhǎng)和成熟中發(fā)揮重要作用(Brummell等人，1999，Plant Cell，112203～2216)。擴(kuò)展蛋白mRNA在細(xì)胞壁的生長(zhǎng)速率或疏松程度剛要開(kāi)始提高時(shí)積聚，這暗示擴(kuò)展蛋白基因的表達(dá)與細(xì)胞的伸長(zhǎng)相關(guān)(Cho和Kende，1997a，Plant Cell 9，1661～1671；1997b，Plant Physiology 113，1137～1143；1998，Plant Journal 15，805-812)。已觀察到在其中過(guò)表達(dá)擴(kuò)展蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻植株與野生型相比進(jìn)一步提高了子葉長(zhǎng)度31％～97％(Choi等人，2003 Plant Cell，151386～1398)。然而，該轉(zhuǎn)基因水稻植株因?yàn)樾坌圆挥荒軌蚪Y(jié)種。
提高谷粒的產(chǎn)量是非常重要的，因?yàn)楣阮愔参锏姆N子是大部分人的主食。因?yàn)榈矸弁ǔＵ济款w谷粒的60重量％～70重量％，所以科學(xué)家已經(jīng)進(jìn)行了大量努力以增加谷粒的淀粉含量，借此提高谷粒的產(chǎn)量。
已知腺苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-AGPase)是別構(gòu)酶，其催化質(zhì)體中淀粉合成的首要關(guān)鍵步驟(即，將葡萄糖-1-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為ADP-葡萄糖和PPi)并且對(duì)于別構(gòu)調(diào)節(jié)非常敏感，其中3-磷酸甘油酸(3PGA)作為激活劑，Pi作為抑制劑。已經(jīng)將編碼這種酶的基因用于增強(qiáng)谷粒中淀粉合成的研究中。通過(guò)加入對(duì)應(yīng)于6個(gè)核苷酸的2個(gè)氨基酸殘基(酪氨酸和絲氨酸)衍生自玉米AGPase的突變體(Sh2-Rev6)變得對(duì)AGPase的抑制劑不敏感并且促進(jìn)玉米粒中的淀粉合成，從而使種子重量提高了11％～18％(Giroux等人，1996，PNAS 93，5824～5829)。該玉米突變體AGPase(Sh2r6hs)已經(jīng)降低了對(duì)抑制劑的敏感度，并且表現(xiàn)出其小亞基和大亞基間的更穩(wěn)定結(jié)合。與野生型相比，使用CaMV35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因Sh2r6hs小麥系每株植物產(chǎn)生了平均多38％的種子重量(Smidansky等人，2002，PNAS 99，1724～1729)。與野生型相比，使用胚乳特異性啟動(dòng)子(玉米泛素啟動(dòng)子)的轉(zhuǎn)基因Sh2r6hs水稻系產(chǎn)生了平均多20％的種子和植株重量(Smidansky等人，2003，Planta，216，656-664)。
因此，已經(jīng)有對(duì)能夠顯著提高生物量或種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的需要。

發(fā)明內(nèi)容
因此，考慮到現(xiàn)有技術(shù)中所存在的上述問(wèn)題，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明，并且本發(fā)明的目的是提供甘薯擴(kuò)展蛋白(IbExpansin)cDNA，使用該cDNA能夠制備高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供攜帶IbExpansin cDNA的植物轉(zhuǎn)化載體。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供包含攜帶有IbExpansin cDNA的載體的高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了分離的DNA片段，其包含SEQ IDNO.1的核苷酸序列。
優(yōu)選該DNA片段是從甘薯(Ipomoea batatas cv Jinhongmi)擴(kuò)展蛋白基因(IbExpansin)合成的cDNA。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于轉(zhuǎn)化植物的雙元載體，其包含該DNA片段。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，同樣提供了包含所述DNA片段或所述載體的微生物。
在另外一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了包含所述DNA片段或所述載體的轉(zhuǎn)基因植物。
在更進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了適合擴(kuò)增DNA片段的PCR引物，所述DNA片段包含SEQ ID NO.1的核苷酸序列，所述引物由SEQID NO5或6中所示的核苷酸序列表示。
在另外一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了甘薯擴(kuò)展蛋白基因(IbExpansin)的可讀框(ORF)，其包含SEQ ID NO.11的核苷酸序列，其范圍是SEQID NO.1的第34位核苷酸～第750位核苷酸。
在更加進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了用于轉(zhuǎn)化植物的二元載體，其包含甘薯擴(kuò)展蛋白基因(IbExpansin)的ORF。
在另外一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了包含所述ORF或所述二元載體的微生物。
在更加進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了包含所述ORF或所述二元載體的轉(zhuǎn)基因植物。
在另外一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種從所述ORF翻譯而來(lái)的分離的多肽，其包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
在最后一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于提高種子產(chǎn)量和/或生物量的方法，其包括將擴(kuò)展蛋白基因插入到二元載體中，并將該二元載體引入到植物中。


通過(guò)下面的詳細(xì)描述并結(jié)合附圖，將更清楚地理解本發(fā)明的上述和其他目的、特征和其他優(yōu)點(diǎn)，其中圖1是顯示用于克隆全長(zhǎng)甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA的初次PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的結(jié)果的圖；圖2是顯示用于克隆全長(zhǎng)甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA的再次PCR的結(jié)果的圖，其使用初次PCR的產(chǎn)物作為模板；圖3是顯示根據(jù)本發(fā)明通過(guò)PCR克隆的全長(zhǎng)甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA的圖；圖4顯示本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA的氨基酸序列與其他植物擴(kuò)展蛋白cDNA的氨基酸序列的比較；其中PcExpansm‘歐洲酸櫻桃(Prunus cerasus)’PpExpansm‘桃(Prunus persica)’PaExpansin‘歐洲甜櫻桃(Prunus avium)’CaExpansm‘辣椒(Capsicum annuum)’LeExpansin‘番茄(Lycoperson esculentum)’IbExpansin‘甘薯(Ipomoea batatas)’；圖5顯示在檢測(cè)本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白基因的表達(dá)模式中所使用的甘薯組織；其中在Northern印跡分析中所使用的甘薯組織如下

圖6顯示根據(jù)本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白基因(IbExpansin)的表達(dá)模式；其中，1FRN；2莖-FRN；3葉-FRN；4葉柄-FRN；5FRLS；6SR；7莖-SR；8葉-SR；9葉柄-SR；圖7顯示在構(gòu)建用于攜帶本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA進(jìn)入擬南芥(Arabidopsis)的二元載體的各種過(guò)程階段所得到的結(jié)果；其中，aKpnI/BamHI消化；b菌落PCR；cKpnI/BamHI消化；圖8是顯示用于攜帶本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA進(jìn)入擬南芥的pIbExpansin二元載體的結(jié)構(gòu)的示意圖；圖9顯示本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA在擬南芥轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)；其中，1大小標(biāo)記物；2WT；3Exp-1；4Exp-4；5Exp-22；圖10顯示表達(dá)本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA的擬南芥轉(zhuǎn)化體與野生型之間葉子生長(zhǎng)的比較；其中，在a中，□寬度，長(zhǎng)度40mm；圖11顯示表達(dá)本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA的擬南芥轉(zhuǎn)化體與野生型的種子；圖12顯示表達(dá)本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA的擬南芥轉(zhuǎn)化體與野生型之間種子中淀粉含量的比較；圖13顯示表達(dá)本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA的擬南芥轉(zhuǎn)化體與野生型之間種子中蛋白質(zhì)含量的比較。
具體實(shí)施例方式
為了達(dá)到這些目的，本發(fā)明的發(fā)明人取得了以下成功克隆了甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA(IbExpansin)，構(gòu)建了適合植物轉(zhuǎn)化的攜帶有所述克隆的二元載體，和將該載體轉(zhuǎn)化入擬南芥。發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因擬南芥在生物量方面有了顯著提高，并且特別是種子產(chǎn)量提高了3倍。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的DNA片段，其包含SEQID NO.1的核苷酸序列。
所述cDNA具有長(zhǎng)1,213bp的核苷酸序列，其由33bp的5’-UTR、717bp的ORF(可讀框；SEQ ID NO.11)以及463 bp的3’-UTR構(gòu)成。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的多肽，其具有從所述ORF翻譯而來(lái)的SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于轉(zhuǎn)化植物的攜帶有所述甘薯(Ipomoea batatas cv Jinhongmi)擴(kuò)展蛋白cDNA(IbExpansin)的二元載體(pIbExpansin)。
所述植物轉(zhuǎn)化載體是二元載體，其能夠在植物中穩(wěn)定表達(dá)感興趣的外源基因。
在pMBP1載體中，本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA(IbExpansin)定位在CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以使用任何其他植物轉(zhuǎn)化載體來(lái)代替pMBP1載體。
根據(jù)更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了在二元載體上攜帶有本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA(IbExpansin)的轉(zhuǎn)基因擬南芥。
所述二元載體可以通過(guò)使用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)或基因槍而引入到植物中。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，將浸花法(floral dip)(Clough和Bent，1998，Plant J.)用于轉(zhuǎn)化擬南芥。
除了擬南芥外，還可以將本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA(IbExpansin)引入到任何適合具有提高的生物量或種子產(chǎn)量的植物中。
根據(jù)另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于PCR擴(kuò)增本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA(IbExpansin)的一對(duì)引物，其分別由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所表示。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供了提高種子產(chǎn)量和/或生物量的方法，其通過(guò)將擴(kuò)展蛋白基因插入到二元載體并將該二元載體引入到植物中。如上所述，已公開(kāi)了一些擴(kuò)展蛋白家族基因，但是在本發(fā)明之前的報(bào)告中，沒(méi)有任何地方提到擴(kuò)展蛋白基因用于種子產(chǎn)量的提高的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，可將多種擴(kuò)展蛋白基因引入到植物中以提高它們的生物量和/或種子產(chǎn)量。
本發(fā)明針對(duì)甘薯(Ipomoea batatas)擴(kuò)展蛋白cDNA(IbExpansin)，如果使用該cDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化則使得植物能夠提高生物量和/或種子產(chǎn)量。因此，本發(fā)明能夠有效地用于高產(chǎn)植物的產(chǎn)生。
通過(guò)以下實(shí)施例能夠得到對(duì)本發(fā)明的更好理解，提供以下實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明，而不能解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA的克隆從甘薯的新鮮貯藏根分離總RNA，并將其用于構(gòu)建EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)文庫(kù)。使用該文庫(kù)，克隆了2,859個(gè)EST，并保存在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for biotechnology Information，NCBI)，其NCBI登記號(hào)為NO.BU690119～BU692977(You等人，2003，F(xiàn)EBSLetters 536，101～105)。其中，發(fā)現(xiàn)IbExpansin(NCBI登記號(hào)No.BU691452)為大約1kb長(zhǎng)，并將其鑒定為缺少起始密碼子ATG的部分cDNA。為了得到全長(zhǎng)IbExpansin，在存在IbExpansin-特異性引物(SEQID NO.3)和T3載體引物的情況下，使用先前存在的早期甘薯貯藏根發(fā)育的EST文庫(kù)作為模板進(jìn)行PCR。然而，在所期望的5’全長(zhǎng)大小的位置沒(méi)有見(jiàn)到的條帶(圖1)。
從在期望的全長(zhǎng)位置的瓊脂糖凝膠切下來(lái)的凝膠片中洗脫DNA片段，并將所述DNA片段作為模板進(jìn)行PCR，其利用一組基因特異性的嵌套引物(SEQ ID NO.4)和T3引物。結(jié)果，得到了具有大約350bp長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物(圖2)。
將該P(yáng)CR產(chǎn)物插入到pGEM-T Easy載體中，以進(jìn)行測(cè)序分析并鑒定IbExpansin的5’序列。
以該核苷酸序列為基礎(chǔ)，合成了分別在其末端提供有BamHI和KpnI限制性位點(diǎn)的5’和3’引物。使用這些引物進(jìn)行RT-PCR以獲得全長(zhǎng)IbExpansin(圖3)。
實(shí)施例2全長(zhǎng)IbExpansin的核苷酸序列的測(cè)序和分析通過(guò)PCR克隆了1.2kb的全長(zhǎng)cDNA，并將其插入到pGEM-T Easy載體中，接著對(duì)所述載體進(jìn)行擴(kuò)增。測(cè)序分析揭示IbExpansin為1,213bp長(zhǎng)，并且由33bp的5’-UTR、717bp的ORF和463bp的3’-UTR構(gòu)成。將該全長(zhǎng)IbExpansin cDNA保存在NCBI，其登記號(hào)為No.DQ515800)。由239個(gè)氨基酸構(gòu)成的IbExpansin氨基酸序列除了N-末端區(qū)域外都是高度保守的(圖4)，并且與番茄和胡椒的擴(kuò)展蛋白氨基酸序列具有高達(dá)78％的同源性(表1)。在表1中顯示本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA與其他植物擴(kuò)展蛋白cDNA之間氨基酸序列的同源性。
表1擴(kuò)展蛋白氨基酸序列之間的同源性

實(shí)施例3組織的Northern印跡分析1.Northern印跡通過(guò)Northern印跡利用處于不同發(fā)育階段的各種組織檢測(cè)IbExpansin的表達(dá)模式。
為了分離總RNA，將處于各種發(fā)育階段的甘薯的根、莖、葉和葉柄用作RNA源。即從以下組織中分離總RNA(圖5)處于非貯藏根階段的組織，例如根(FRN處于非貯藏根階段的須根)、莖(莖-FRN)、葉(葉-FRN)和葉柄(葉柄-FRN)；處于早期貯藏根階段的組織，例如根(處于早期貯藏根階段的須根，F(xiàn)RES)；處于貯藏根階段的組織，例如根(SR)、莖(莖-SR)、葉(葉-SR)和葉柄(葉柄-SR)；和處于晚期貯藏根階段的組織，例如根(處于晚期貯藏根階段的須根，F(xiàn)RLS)。使用4.4M的胍鹽-SDS裂解緩沖液(Chirgwin等人1979)/5.7M CsCl梯度法(Glisin等人，1974)進(jìn)行總RNA的提取。在1％瓊脂糖-甲醛凝膠上對(duì)大約20μg所提取的總RNA進(jìn)行電泳，并將其轉(zhuǎn)移到Tropilon-plusTM尼龍膜(Tropix，美國(guó))上。
通過(guò)擴(kuò)增從2.5ng的攜帶有1kb擴(kuò)展蛋白EST克隆的質(zhì)粒利用PCR得到了探針，其中所述PCR是在PCR混合物中進(jìn)行的，所述PCR混合物含有100μM除了dCTP之外的dNTP混合物、100μM的dCTP-生物素、各為10μM的載體(pBluescript II)引物T3(5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’；SEQ ID NO.7)和T7(3’-CGGGATATCACTCAGCATAATG-5’；SEQ ID NO.8)、1×PCR緩沖液和1單位的Taq聚合酶，終體積為10μl，開(kāi)始時(shí)在95℃預(yù)變性5分鐘；接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)95℃變性10秒、65℃退火30秒；以及72℃延伸30秒。
使用QIAquickTMPCR純化試劑盒(QIAGEN，德國(guó))對(duì)PCR擴(kuò)增的生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行純化，并將其以大約100ng的量加到膜上，接著在65℃雜交18個(gè)小時(shí)。使用2×SSC/1％SDS在室溫下對(duì)膜清洗兩次，每次5分鐘，接著使用0.1×SSC/1％SDS在室溫下清洗兩次，每次15分鐘，最后使用1×SSC在室溫下清洗兩次，每次5分鐘。使用Southern-starTM試劑盒(Tropix，美國(guó))進(jìn)行探針檢測(cè)。使用封閉緩沖液(1×PBS、0.2％I-BlockTMReagent和0.5％SDS)對(duì)印跡進(jìn)行處理，并使用偶聯(lián)有堿性磷酸酶的鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行標(biāo)記，接著使用CDP-StarTM(Ready-to-Use)進(jìn)行處理。將膜暴露到X-光膠片(Fujifilm，日本)，時(shí)間為10分鐘～1.5小時(shí)。
2.IbExpansin的表達(dá)模式在包括FRN、莖-FRN、葉-FRN和葉柄-FRN的處于非貯藏根階段的組織中對(duì)IbExpansin的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，其中FRN和葉柄-FRN具有最高的水平。然而，在晚期貯藏根階段的須根(FRLS)中檢測(cè)到IbExpansin顯著降低的表達(dá)水平，同時(shí)在處于貯藏根階段的莖和葉中檢測(cè)到顯著低水平(圖6)。這些表達(dá)模式強(qiáng)烈暗示IbExpansin在處于活躍伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的組織中活躍表達(dá)。
實(shí)施例4二元載體的構(gòu)建BamHI和KpnI限制性酶切位點(diǎn)在用于PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)IbExpansincDNA的引物(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)中的存在使得利用BamHI和KpnI對(duì)pGEM-T Easy載體進(jìn)行消化以從其切出cDNA成為可能。將cDNA插入到pMBP1載體中的CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子之間以構(gòu)建二元載體pIbExpansin(圖8)。通過(guò)菌落PCR和限制性酶消化對(duì)該插入進(jìn)行確認(rèn)(圖7)。
實(shí)施例5將pIbExpansin轉(zhuǎn)化入擬南芥中利用凍融法(An，G.1987，Methods in Enzymology)，將在實(shí)施例4中所構(gòu)建的pIbExpansin載體引入到根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58C1中。
在28℃對(duì)在載體上攜帶有感興趣基因的農(nóng)桿菌隨著攪拌培養(yǎng)2天，接著在剛剛開(kāi)花之前使之與擬南芥(Arabidopsis thaliana cv.columbia)的柱頭接觸以便轉(zhuǎn)化該植物。
實(shí)施例6對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選和鑒定從實(shí)施例5中所制備的擬南芥轉(zhuǎn)化體收集種子，并將其鋪在含有30mg/L卡那霉素的組織培養(yǎng)MS平板上。將推定的轉(zhuǎn)化體(T1)移植到土壤中，并用于培育T2植株，所述T2植株由于引入了單拷貝的IbExpansin cDNA而表現(xiàn)出對(duì)卡那霉素抗性的3∶1的分離比例，并從T2植株中收集純合的種子。定量分析從T2植株中隨機(jī)選擇的3個(gè)品系(Exp-1、Exp-4和Exp-22)的IbExpansin表達(dá)水平。
為了測(cè)定被轉(zhuǎn)化的擬南芥中IbExpansin的表達(dá)水平，借助Tri-Reagent(Invitrogen，美國(guó))從被轉(zhuǎn)化的擬南芥的葉子中分離總RNA和并將其在存在SuperScriptTMIII(Invitrogen，美國(guó))的情況下，利用寡聚(dT)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將擬南芥的eIF4A1基因用作內(nèi)參。同時(shí)使用IbExpansin特異性引物(5’-GTAGGATCCCATTCCTCTACCAATTCAACTGAA-3’；SEQ ID NO.5；5’-GATGGTACCACTGTCTCCACACTCAGCATT-3’；SEQ ID NO.6)和eIF4A1引物(5’-GCTCTCCCGTGGTTTCAAGGACCAGATC-3’；SEQ ID NO.9；5’-GTCTGTGAGCCAATCAACCTTACGCCTG-3’；SEQ ID NO.10)進(jìn)行RT-PCR，所述RT-PCR開(kāi)始時(shí)是在94℃預(yù)變性5分鐘；接著是進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94℃變性30秒、58℃退火30秒以及72℃延伸1分鐘；之后是最終在72℃延伸7分鐘。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)這樣所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，以檢測(cè)野生型帶中未出現(xiàn)的IbExpansin轉(zhuǎn)錄體(圖9)。
實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)分析在IbExpansin擬南芥轉(zhuǎn)化體和野生型之間進(jìn)行生長(zhǎng)模式的比較。將Exp-1、Exp-4和Exp-22以及野生型播種到土壤中，并在花柄剛剛出現(xiàn)之前，對(duì)葉子的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行比較。在葉子數(shù)目方面，Exp-1、Exp-4和Exp-22與野生型沒(méi)有不同，但生長(zhǎng)要超過(guò)野生型，因此它們的葉子在長(zhǎng)度和寬度方面都大于野生型(圖10和表2)。
表2

實(shí)施例8轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子產(chǎn)量的分析對(duì)IbExpansin擬南芥轉(zhuǎn)化體的種子大小進(jìn)行測(cè)定，并與野生型進(jìn)行比較。在這方面，使用T3代的純合種子。如在光學(xué)顯微鏡下所觀察到的，與野生型相比，Exp-1、Exp-4和Exp-22全部在種子大小方面有提高(圖11)。
實(shí)施例9轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子中淀粉含量的分析對(duì)IbExpansin擬南芥轉(zhuǎn)化體的種子中淀粉含量進(jìn)行測(cè)定，并與野生型進(jìn)行比較。在這方面，擬南芥轉(zhuǎn)化體和野生型都采用了T4代純合種子。在液氮中使用研杵和研缽將這些種子磨碎，并將1g每種磨碎的種子加入到在150mL錐形瓶中的25ml蒸餾水中。將蒸餾水中的樣品隨著攪拌煮沸3分鐘，接著在滅菌器中于135℃降解淀粉1小時(shí)。將水溶液置于室溫以將溫度降低到大約60℃。在加入100ml蒸餾水后，使用淀粉化驗(yàn)試劑盒(SIGMA)根據(jù)制造商的程序?qū)悠啡芤旱牡矸蹪舛冗M(jìn)行分析。IbExpansin擬南芥轉(zhuǎn)化體具有在一顆Exp-1種子中1.55±0.13μg的淀粉含量，在一顆Exp-4種子中具有1.48±0.03μg的淀粉含量，在一顆Exp-22種子中具有1.54±0.06μg的淀粉含量，這都在重量上超過(guò)了野生型(0.98±0.06μg)(圖12和表3)。
表3

實(shí)施例10轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子中蛋白質(zhì)含量的分析對(duì)IbExpansin擬南芥轉(zhuǎn)化體的種子中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，并與野生型進(jìn)行比較。在這方面，使用T3代的純合種子。將每種所述轉(zhuǎn)化體和野生型的T3代的100個(gè)種子在蛋白質(zhì)提取溶液(250mM蔗糖、50mMTris HCl(pH8.0)、2mM DTT、2mM EDTA和蛋白質(zhì)抑制劑混合物)中使用鉆子和塑料棒磨碎，之后在4℃于12,000rpm離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)到新管中，并使用蛋白質(zhì)化驗(yàn)試劑盒(BioRad)對(duì)上清液進(jìn)行定量分析以得到每顆種子的蛋白質(zhì)含量。發(fā)現(xiàn)所有的IbExpansin擬南芥轉(zhuǎn)化體Exp-4和Exp-22均具有比野生型高的蛋白質(zhì)含量。這通過(guò)將2μl的每種樣品上樣到12％的SDS/聚丙烯酰胺凝膠中，進(jìn)行電泳并使用考馬斯亮藍(lán)顯像而確認(rèn)(圖13和表4)。
表4

實(shí)施例11轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子產(chǎn)量的分析檢驗(yàn)IbExpansin擬南芥轉(zhuǎn)化體Exp-4每1000顆種子的重量、每棵植株的長(zhǎng)角果數(shù)目、每個(gè)長(zhǎng)角果的種子數(shù)目、種子的總數(shù)目以及種子的總重量。其結(jié)果提供在圖12和表3中。如該圖和表所示，在每1000顆種子的重量、每棵植株的長(zhǎng)角果數(shù)目、每個(gè)長(zhǎng)角果的種子數(shù)目、種子的總數(shù)目以及種子的總重量方面，IbExpansin擬南芥轉(zhuǎn)化體均優(yōu)于野生型。結(jié)果，測(cè)定的每棵IbExpansin擬南芥轉(zhuǎn)化體植株的種子產(chǎn)量為444.27±0.62mg，這比野生型的149.73±0.19mg重3倍(表5)。在表5中顯示表達(dá)本發(fā)明的甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA的擬南芥轉(zhuǎn)化體與野生型之間種子產(chǎn)量的比較。
表5轉(zhuǎn)基因IbExpansin-擬南芥的種子產(chǎn)量

1以每1,000顆種子的mg數(shù)表示所產(chǎn)生的種子的重量。
因此，本發(fā)明的IbExpansin cDNA能夠用于提高植物的生物量，特別是能夠用于提高農(nóng)作物的種子產(chǎn)量。
工業(yè)實(shí)用性正如目前為止所描述的，本發(fā)明提供了能夠用于轉(zhuǎn)化植物的IbExpansin cDNA(獲自Ipomoea batatas cv Jinhongmi的擴(kuò)展蛋白cDNA)，所得到的轉(zhuǎn)基因植物能夠以比之前高的速度生長(zhǎng)，并且大大提高了種子產(chǎn)量和/或生物量。因此，本發(fā)明能夠用于高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。
盡管為說(shuō)明目的，已經(jīng)公開(kāi)了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解可以進(jìn)行各種改進(jìn)、增加和替換，而不離開(kāi)所附權(quán)利要求中所公開(kāi)的本發(fā)明的范圍和精神。
序列表<110>高麗大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)<120>甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA和使用該cDNA的高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物<130>FAI07KR0892-C<150>KR 10-2006-0049596<151>2006-06-01<160>11<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>1213<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<400>1cattcctcta ccaattcaac tgaagcaata acaatggcgg ttcttgagct tcttctggtc 60ggagttcttg ccacgttgtc tccggtgcat ggctactggg gctggagcag cgctcgcgcc120accttctacg gcggcggtga tgcttctgga acaatgggcg gagcctgcgg gtatgggaac180ctgtatagct caggctatgg caccaacact gcggcactta gcaccgctct gttcaacaat240gggctcagct gcgggtcctg tttccagata aggtgtgtga acgaccggtc ctgcctccgc300ggcgtaatca ccgtcaccgc caccaatttc tgcccgcccg gcggctggtg cgagcccccc360aacccacact ttgatctctc tcagcctgtt ttcttgagaa ttgcccagta cagagccgga420gttgttcccg ttgcttaccg acgggtgcct tgcaggagga gtggaggaat caggttcacc480attaacggcc atgctttctt caacctggta ctagtaacca acgtgggagg ctccggcgac540gtacacgccg tgtacatcaa aggatcaaga accgggtggc aaatgatgtc cagaaactgg600ggccaaaact ggcagagcaa cgccaacctc aacggccaaa gcctctcatt ccgggtggtc660accggcgaca gccgcagcgt cgtctcctac aacgccgctc cccccggctg gtccttcggc720cagacctact ccggcgccca gttccgctag gccggaattc atcaaacacc cccatttttt780tcccgccata tatatatgat ctccaaacct atacataact aaagcctaca ccatttttac840aagtttgaaa tgcaattaaa gtcatgggga tgggaaaatg ttgatcaagt ttccggccgc900cctctctcac ttttttttct aaaagggatt ggttttgatc gaaagccctt ttggccatga960aaattggcca ttcaatcaac aagaattgaa gcagagttga agtggtagtt agttatatca 1020agattgtgct accccatgac tagcttaatt agtactgcat tatttatgtg attattatta 1080ttatgcagac aaaatgtgtc tgcataccta ccctgtggaa caacattaat ttttttttcc 1140tcgtcttctt cgtcgtcgtt tgtaattagt atagcattaa ggttaaacag ctaatgctga 1200gtgtggagac agt<210>2
<211>238<212>PRT<213>甘薯(Ipomoea batatas)<400>2MAVLELLLVG VLATLSPVHG YWGWSSARAT FYGGGDASGT MGGACGYGNL YSSGYGTNTA 60ALSTALFNNG LSCGSCFQIR CVNDRSCLRG VITVTATNFC PPGGWCEPPN PHFDLSQPVF 120LRIAQYRAGV VPVAYRRVPC RRSGGIRFTI NGHAFFNLVL VTNVGGSGDV HAVYIKGSRT 180GWQMMSRNWG QNWQSNANLN GQSLSFRVVT GDSRSVVSYN AAPPGWSFGQ TYSGAQFR<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>3gggcagaaat tggtggcggg tgacggtg<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4acaggacccg cagctgaccc cattgttg<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5gtaggatccc attcctctac caattcaact gaa<210>6
<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6gatggtacca ctgtctccac actcagcatt<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>7aattaaccct cactaaaggg<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>8cgggatatca ctcagcataa tg<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>9gctctcccgt ggtttcaagg accagatc<210>10
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>10gtctgtgagc caatcaacct tacgcctg<210>11<211>717<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<400>11atggcggttc ttgagcttct tctggtcgga gttcttgcca cgttgtctcc ggtgcatggc 60tactggggct ggagcagcgc tcgcgccacc ttctacggcg gcggtgatgc ttctggaaca120atgggcggag cctgcgggta tgggaacctg tatagctcag gctatggcac caacactgcg180gcacttagca ccgctctgtt caacaatggg ctcagctgcg ggtcctgttt ccagataagg240tgtgtgaacg accggtcctg cctccgcggc gtaatcaccg tcaccgccac caatttctgc300ccgcccggcg gctggtgcga gccccccaac ccacactttg atctctctca gcctgttttc360ttgagaattg cccagtacag agccggagtt gttcccgttg cttaccgacg ggtgccttgc420aggaggagtg gaggaatcag gttcaccatt aacggccatg ctttcttcaa cctggtacta480gtaaccaacg tgggaggctc cggcgacgta cacgccgtgt acatcaaagg atcaagaacc540gggtggcaaa tgatgtccag aaactggggc caaaactggc agagcaacgc caacctcaac600ggccaaagcc tctcattccg ggtggtcacc ggcgacagcc gcagcgtcgt ctcctacaac660gccgctcccc ccggctggtc cttcggccag acctactccg gcgcccagtt ccgctag
權(quán)利要求
1.一種分離的DNA片段，其包含SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的DNA片段，其中所述的DNA片段是來(lái)自甘薯(Ipomoea batatas cv Jinhongmi)擴(kuò)展蛋白基因(IbExpansin)的cDNA。
3.一種用于轉(zhuǎn)化植物的二元載體，其包含權(quán)利要求1所述的DNA片段。
4.一種微生物，其包含權(quán)利要求1所述的DNA片段或權(quán)利要求3所述的載體。
5.一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求1所述的DNA片段或權(quán)利要求3所述的載體。
6.一種適合擴(kuò)增DNA片段的PCR引物，所述DNA片段包含SEQ IDNO.1的核苷酸序列，所述引物由SEQ ID NO5或6中所示的核苷酸序列所表示。
7.甘薯擴(kuò)展蛋白基因(IbExpansin)的可讀框(ORF)，其包含SEQID NO.11的核苷酸序列。
8.一種用于轉(zhuǎn)化植物的二元載體，其包含權(quán)利要求7所述的甘薯擴(kuò)展蛋白基因(IbExpansin)的ORF。
9.一種微生物，其包含權(quán)利要求7所述的ORF和權(quán)利要求8所述的載體。
10.一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求7所述的ORF或權(quán)利要求8所述的載體。
11.一種由權(quán)利要求7所述的ORF翻譯而來(lái)的分離的多肽，其包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
12.一種用于提高生物量和/或種子產(chǎn)量的方法，其包括將擴(kuò)展蛋白基因插入到二元載體中，并將所述二元載體引入到植物中。
全文摘要
本發(fā)明涉及甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA和使用該cDNA的高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，具體地說(shuō)，本發(fā)明公開(kāi)了甘薯擴(kuò)展蛋白cDNA(IbExpansin)，攜帶有該cDNA的植物轉(zhuǎn)化載體以及包含該載體的轉(zhuǎn)基因植物。使用該IbExpansincDNA制備的轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)超過(guò)野生型擬南芥，借此增加了大小，并將種子產(chǎn)量提高到最高達(dá)3倍。這樣，該基因能夠用于產(chǎn)生高產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，以提高生物量和/或種子產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101082048SQ20071010224
公開(kāi)日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2007年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月1日
發(fā)明者裵貞明, 盧雪娥, 樸宣希, 郭滿燮, 申正燮, 白敬喜 申請(qǐng)人:高麗大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)