專利名稱：因子Ⅷ和因子Ⅷ-類似蛋白的小肽或者擬肽親合性配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有固定在基質(zhì)上的本發(fā)明化合物的診斷設(shè)備或者試劑盒，其中化合物特異性地結(jié)合在FVIII或者FVIII-相關(guān)蛋白上。在某些實(shí)施方案中，化合物直接或者經(jīng)錨定化合物和/或間隔分子固定在基質(zhì)上，所述基質(zhì)可以為聚合物材料，例如為樹脂。
在又一實(shí)施方案中，化合物在方法中用作FVIII或者FVIII-相關(guān)蛋白的標(biāo)記物。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，化合物在識別和/或純化FVIII或者FVIII-相關(guān)蛋白的方法中使用。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明化合物在疾病治療中的醫(yī)藥用途。



圖1示出如實(shí)施例3所述的用于純化先前純化的FVIII的純化輪廓圖。
圖2表明如實(shí)施例3所述的由用FVIII示蹤的含F(xiàn)BS的細(xì)胞條件培養(yǎng)基得到的FVIII的純化輪廓圖。
圖3是如實(shí)施例3所述的由純FVIII的吸附和洗脫(條帶2～6)和由用FVIII示蹤的含F(xiàn)BS的細(xì)胞條件培養(yǎng)基純化(條帶7～12)得到的餾份的SDS-PAGE照片。條帶1:分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品；條帶2:純FVIII；條帶3:用于柱的具有純FVIII的源溶液；條帶4:通過流；條帶5和6:洗脫餾分；條帶7:介質(zhì)；條帶8:用于柱的具有FVIII的介質(zhì)；條帶9:通過流；條帶10和11:用0.2M NaCl預(yù)洗滌的洗脫餾分；條帶12:用1M NaCl的洗脫餾分。
圖4是如實(shí)施例3所述的由純FVIII吸附和洗脫(條帶2-6)和由用FVIII示蹤的含F(xiàn)BS的細(xì)胞條件培養(yǎng)基純化(條帶8-12)的餾份的Western印跡照片。條帶1:純FVIII；條帶2:用于柱的具有純FVIII的源溶液；條帶3:通過流；條帶4和5:洗脫餾分；條帶6:用于柱的具有FVIII的介質(zhì)；條帶7:通過流；條帶8和9:用0.2M NaCl預(yù)洗滌的洗脫餾分；條帶10用1M NaCl的洗脫餾分。
圖5(a)示出如實(shí)施例4所述的用于純化先前純化的FVIII的純化輪廓圖。
圖5(b)是如實(shí)施例4所述的由純化先前純化的FVIII得到的餾份的SDS-PAGE照片(條帶1-4)。條帶1:純FVIII；條帶2:通過流；條帶3:洗滌餾份；條帶4:用1M NaCl洗脫的餾分。
圖5(c)示出如實(shí)施例4所述的由純化先前純化的FVIII得到的餾份的Western印跡分析照片。條帶5:純FVIII；條帶6:通過流；條帶7:用1M NaCl洗脫的餾分。
圖6(a)示出如實(shí)施例4所述的用FVIII示蹤的由含F(xiàn)BS的DMEM條件培養(yǎng)基中進(jìn)行純化的純化輪廓圖。
圖6(b)是如實(shí)施例4所述的用FVIII示蹤的由含F(xiàn)BS的DMEM條件培養(yǎng)基中進(jìn)行純化得到的餾份的SDS-PAGE照片(條帶1-4)。條帶1:粗介質(zhì)；條帶2:用于柱的源溶液；條帶3:通過流；條帶4:用1M NaCl洗脫的餾分。
圖6(c)是如實(shí)施例4所述的用FVIII示蹤的由純化含F(xiàn)BS的DMEM條件培養(yǎng)基得到的餾份的Western印跡照片。條帶5:純FVIII；條帶6:通過流；條帶7:用1M NaCl洗脫的餾分。

具體實(shí)施例方式 親合色譜法是沿用已久的強(qiáng)有力的技術(shù)，它是用于純化復(fù)雜分子如蛋白的的現(xiàn)有方法(Jack，G.W.；Beer，D.J.MethodsMoI.Biol.1996，59，187-196)。親合色譜法通過目標(biāo)分子和配體之間的強(qiáng)相互作用提供了將具有優(yōu)良選擇性的目標(biāo)蛋白與污染蛋白分離的獨(dú)特可能性，其中所述配體被固定在樹脂上。通常配體為多克隆或者單克隆抗體。單克隆抗體是優(yōu)選的，這是因?yàn)樗鼈兪菃我惶禺愋缘牟⑶铱梢跃_形成(Scopes，R.K.Protein purification:Principles and Practice.Springer，NewYork，1994)。迄今為止，小的化學(xué)配體僅僅限于用于親合分離中。然而，組合庫的應(yīng)用已經(jīng)擴(kuò)展用于肽配體的免疫親和層析工藝的專門技術(shù)(Lowe，C.R.Curr.Opin.Chem.Biol.2001，5，248-256)。基于生物學(xué)或者化學(xué)系統(tǒng)，組合方法的使用已經(jīng)形成了獨(dú)特的肽，其提供中等或者甚至高結(jié)合親合性，從而捕獲目標(biāo)蛋白和在溫和條件下洗脫它。
例如，Huang，Ping Y.等人在＂Bioorganic & MedicinalChemistry＂，Vol.4，No.5，pp.699-708，1996中描述了固定肽用于免疫親和層析純化von Willebrand因子(vWF)的應(yīng)用。多聚體vWF的純化是一種主要的挑戰(zhàn)，因?yàn)槠浞肿恿吭?.5～10百萬道爾頓的巨大尺寸范圍內(nèi)。von Willebrand因子是在凝血級聯(lián)系統(tǒng)中直接涉及的多功能血漿蛋白。在導(dǎo)致正常阻止失血的情形中，它具有突出的作用。vWF和FVIII之間的相互作用導(dǎo)致FVIII得到穩(wěn)定和運(yùn)送。兩種高親合結(jié)合位點(diǎn)確保有效捕獲(Sadler.J.E.；Mannucci.P.M.；Berntorp.E.；Bochkov.N.；Boulyjenkov.V.；Ginsburg.D.；Meyer.D.；Peake.I.；Rodeghiero.F.；Srivastava.A.Thromb.Haemost，2000，84，160-174)。
FVIII是一種在凝血級聯(lián)系統(tǒng)中起重要作用并且具有強(qiáng)治療學(xué)重要性的大而復(fù)雜的蛋白。由遺傳突變引起的體內(nèi)FVIII產(chǎn)生的缺乏可以導(dǎo)致血友病，其通過輸注純化的人類FVIII制劑進(jìn)行治療(Lee，C.Thromb.Haemo st.1999，82，516-524)。用于治療血友病患者的人類FVIII的當(dāng)前來源是血漿源FVIII和重組FVIII，后者在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(Kaufman，R.J.；Wasley，L.C；Dorner，A.J.J.Biol.Chem.1988，263，6352-6362)和小倉鼠腎(BHK)細(xì)胞(Boedeker，B.D.G.Sem.Thromb.Hemost.2001，27，385-394)中合成。除了高純度指標(biāo)之外，確保免疫學(xué)和病毒安全性是至關(guān)重要的。
存在幾種已知利用色譜技術(shù)純化人類FVIII的方法。對于所有重組FVIII制劑和對于多種血漿源FVIII產(chǎn)品，應(yīng)用免疫親和層析樹脂是常規(guī)的制造方法。包括親合色譜法的當(dāng)前制造方法使用對于FVIII特異性的單克隆抗體(mAb)(Lee，C.，Recombinant clotting factors in the treatment of hemophilia.Thromb.Haemost.1999，82，516-524)。為了制造的目的，抗FVIII的抗體通過鼠雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，然后固定在色譜樹脂上。當(dāng)前工業(yè)FVIII純化應(yīng)用mAb免疫親合步驟，該步驟對方法相關(guān)的雜質(zhì)(比如DNA和宿主細(xì)胞)提供優(yōu)良的除去作用。
然而，還存在多種與當(dāng)前利用固定的單克隆抗體的免疫親和層析方法相關(guān)的疑慮和限制。一個(gè)缺點(diǎn)是樹脂容量的限制，因?yàn)閹追N分子尺寸巨大的抗體分子將覆蓋樹脂表面的相當(dāng)大的部分。此外，抗體制備是一種冗長和昂貴的方法，抗體的純度和活性將取決于各次重復(fù)制備而變化?？贵w通過作為生產(chǎn)宿主的雜交瘤來生產(chǎn)，這使得抗體對病毒，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒可能被引入到目標(biāo)蛋白的制造工藝中的低但是非零的風(fēng)險(xiǎn)敏感。最后，抗體由載體基質(zhì)(即，樹脂)中的滲漏可以引起嚴(yán)重的產(chǎn)品污染和由于免疫原性導(dǎo)致產(chǎn)品損失。由此，存在充分的動力，以用更精確的、低本高效的方法替換當(dāng)前方法。通過在降低或者消除數(shù)種所述缺陷的免疫親和層析純化方法中提供其為化學(xué)合成的小肽或者擬肽衍生物的化合物，本發(fā)明滿足了該需求。
Pflegerl等人(J.Peptide Res.2002，59，174-182)報(bào)道了對FVIII具有高親合性的不同八肽的研制。發(fā)現(xiàn)必需的氨基酸序列是位于肽C-末端一側(cè)的WEY。
包含小肽或者擬肽衍生物的本發(fā)明化合物作為配體具有優(yōu)勢，因?yàn)樵跐B漏入產(chǎn)品中的情形中，它們不可能引起免疫應(yīng)答。同抗體相比，小肽或者擬肽衍生物還更加穩(wěn)定。另一優(yōu)點(diǎn)是它們顯著較低的生產(chǎn)成本，因?yàn)樗鼈兛梢匀菀椎卦诹己弥圃煲?guī)范(GMP)下大量無菌生產(chǎn)。小肽或者擬肽衍生物和本發(fā)明方法的應(yīng)用獲得了不使用動物來源或者人類來源的原料的純化產(chǎn)品。最后但非最不重要，在此所述的完善化學(xué)合成使得精制步驟改進(jìn)了小肽或者擬肽衍生物對它們的目標(biāo)蛋白的親合性。
因此，本發(fā)明向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供了化合物和改進(jìn)通常使用的FVIII純化方法的工藝。
如本文中所述，本發(fā)明提供了FVIII純化方法，其對于FVIII的免疫親和純化避免使用鼠單克隆抗體。本發(fā)明包括化學(xué)合成的獨(dú)特高親合性肽和擬肽，其可以替換單克隆抗體并具有同上述已知的低聚肽相比改進(jìn)的蛋白水解穩(wěn)定性。這將滿足當(dāng)前對生物學(xué)安全性的需要。此外，我們的化合物適于大規(guī)模溶液合成，因此將使得親合性配體的生產(chǎn)成本最小。
本發(fā)明包括新穎化合物，優(yōu)選二肽、三肽和擬肽，其作為配體用于檢測、鑒定、分離和純化以及標(biāo)記活性因子VIII和因子VIII-類似蛋白，所述蛋白來自含有所述蛋白的溶液中。本發(fā)明的因子VIII結(jié)合分子表現(xiàn)出顯著的穩(wěn)定性以及對于因子VIII和因子VIII類似蛋白的高親合性。除非另作說明或者指出，在此使用的術(shù)語“因子VIII和因子VIII類似蛋白”包括來源于任何動物、任何重組或者雜交的因子VIII或者任何改性的因子VIII。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述“因子VIII和因子VIII類似蛋白”的特征在于活性(通過標(biāo)準(zhǔn)一期凝血法進(jìn)行確定，例如，如Bowie，E.J.W.和C.A.Owen，Disorders of Hemostasis(Ratnoff和Forbes，eds.)pp.43-72，Grunn & Stratton，Inc.，Orlando，F(xiàn)Ia.(1984)中所述)為因子VIII天然人類形式的活性的至少10％，更優(yōu)選至少50％，最優(yōu)選至少80％。
因子VIII類似蛋白還包括任何來源的因子VIII蛋白的結(jié)構(gòu)域、片段和表位及其雜交組合物。此外，術(shù)語“因子VIII類似蛋白”進(jìn)一步包括可以用作用于研究目的的探針或者用作診斷劑的因子VIII的片段，即使所述片斷幾乎沒有或者沒有表現(xiàn)出血液凝固活性。優(yōu)選所述蛋白或者多肽包含至少50個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸。優(yōu)選的因子VIII和因子VIII類似蛋白的結(jié)構(gòu)域、表位和片段包括其輕鏈，含有結(jié)構(gòu)域A3-C1、C1-C2、A3、C1或者C2的輕鏈部分和單個(gè)結(jié)構(gòu)域A3、C1和C2?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明純化的因子VIII和因子VIII類似蛋白還包括描述在US7,122,634、US 7,041,635、US 7,012,132和US 6,866,848中的所有重組蛋白、雜交體、衍生物、突變體、結(jié)構(gòu)域、片段和表位，所有這些文獻(xiàn)的全部內(nèi)容都在此引入作為參考。除非在本文中另有說明，術(shù)語“氨基酸”包括含有至少一個(gè)氨基和至少一個(gè)酸性基團(tuán)的任何有機(jī)化合物。所述氨基酸可以是任何天然存在的化合物或者合成來源的化合物。優(yōu)選氨基酸含有至少一個(gè)伯氨基和/或至少一個(gè)羧酸基團(tuán)。術(shù)語“氨基酸”還指包含在來源于所述氨基酸化合物和通過肽鍵或者擬肽鍵鍵接在相鄰殘基上的較大分子(比如肽和蛋白)中的殘基。
本發(fā)明提供了確?？焖俜蛛x和純化商業(yè)量的可用于血友病甲治療和研究中的蛋白和相關(guān)物質(zhì)的低本高效方法。
本發(fā)明涉及包含式I的肽和/或擬肽的化合物以及它們的鹽。
(I)B-Q-X 其中 B是對FVIII和/或FVIII-類似蛋白提供親合性的二肽、三肽或者擬肽， Q不存在或者為有機(jī)間隔分子和 X不存在或者為錨定分子， 根據(jù)本發(fā)明的其它化合物包含兩個(gè)或者更多個(gè)可以彼此相同或者不同的基團(tuán)B。這些基團(tuán)B可以連接在相同的間隔物Q上，從而形成通式(B)r-Q-X所表示的化合物，r的范圍為2～4。作為選擇，它們可以通過其它間隔物Q(各個(gè)間隔物Q彼此相同或者不同)彼此連接，從而形成類型(B-Q)s-X的低聚化合物，s的范圍為2～4。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，所述基團(tuán)B本身或者基團(tuán)B和Q一起或者B和X一起或者B和Q和X一起可以形成環(huán)。任選該環(huán)可以包括選自有機(jī)二價(jià)基團(tuán)的另外的環(huán)-形成部分，所述有機(jī)二價(jià)基團(tuán)比如任選取代的亞烷基基團(tuán)、氨基酸、二肽或者三肽及其組合。
術(shù)語“擬肽”包括能夠模擬或者拮抗親本肽的生物學(xué)作用的含有非肽結(jié)構(gòu)成分的化合物。優(yōu)選所述化合物幾乎不含(或者不含)肽鍵。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及由本發(fā)明的二肽和三肽通過用一個(gè)或者多個(gè)選自以下的官能團(tuán)替換一個(gè)或者多個(gè)肽鍵衍生得到的擬肽:-CO-NR2-、-NR2-CO-、-CH2-NR2-或者-NR2-CH2-、-CO-CHR2-、-CHR2-CO-、-CR2＝CR2-和-CR2＝CR2-，其中R2為如下關(guān)于通式(II)所定義的。應(yīng)當(dāng)理解，在含有基團(tuán)-NR2-的選項(xiàng)中，取代基R2可以是各氨基酸(類肽氨基酸)的側(cè)鏈。在這種情況下，相鄰的Cα不帶有側(cè)鏈。另一方面，除了連接Cα的側(cè)鏈之外，還存在其它取代基R2。此外，如果多于一個(gè)R2存在，應(yīng)當(dāng)理解，各個(gè)R2可以相同或者彼此不同。
特別優(yōu)選的擬肽組包括含有殘基Z1-Z2-Z3(如下所定義)的那些化合物，其中(至少)Z2和Z3之間的肽鍵選自-CH2-NR2-或者-NR2-CH2-、-CR2＝CR2-和-CR2＝CR2。
“親合性”是促使它們保持聯(lián)合的原子或者分子間吸引力。這是親合色譜法的基礎(chǔ)。在本發(fā)明上下文中，如果根據(jù)以下測試方案測量與FVIII的結(jié)合，認(rèn)為肽或者擬肽對FVIII或者FVIII-類似蛋白表現(xiàn)出至少10％，優(yōu)選至少25％和最優(yōu)選至少40％的親合性。結(jié)合程度通過重現(xiàn)實(shí)施例1中所述的試驗(yàn)，利用125I-標(biāo)記的FVIII進(jìn)行測量。
優(yōu)選本發(fā)明的肽或者擬肽衍生物B(在此使用的術(shù)語“擬肽”和“擬肽衍生物”可以互換使用)可以化學(xué)鍵接到載體基質(zhì)的表面，從而形成肽包衣的載體基質(zhì)。這優(yōu)選借助于錨定分子X和/或間隔分子Q實(shí)現(xiàn)，或者如果Q和X不存在，優(yōu)選借助于化合物B的SH、N3、NH-NH2、O-NH2、NH2、-CH2-L、C≡CH、羰基或者羧基實(shí)現(xiàn)。在本文中，L包括離去基團(tuán)，比如Cl、Br或者I。
本發(fā)明還涉及所述肽包衣的載體基質(zhì)。
術(shù)語“化學(xué)結(jié)合”包括兩個(gè)(或更多個(gè))原子、或者一個(gè)(或者更多個(gè))原子和一種(或更多種)化合物或者兩種(或更多種)化合物之間的共價(jià)、離子、疏水和/或其它配合相互作用及其混合和組合。
載體物質(zhì)包括無機(jī)或者有機(jī)物質(zhì)，特別是聚合物物質(zhì)。因此，可以使用相同的聚合物物質(zhì)(即直鏈多糖)，其通常用于生物聚合物的色譜分離。特別是，產(chǎn)生親水性表面的聚合物適宜作為色譜載體物質(zhì)，即樹脂。例如，使用ToyoperalAF-Epoxy-650M樹脂。所述載體物質(zhì)還可以具有另外的錨定分子，所述錨定分子提供用于固定如根據(jù)式I的肽或者擬肽的化合物的SH、N3、NH-NH2、O-NH2、NH2、-CH2-L、C≡CH、環(huán)氧基、羰基或者羧基。
由于本發(fā)明的優(yōu)選化合物與FVIII和/或FVIII-類似蛋白相互作用的事實(shí)，包含肽或者擬肽衍生物的優(yōu)選化合物適用于診斷設(shè)備和試劑盒中。優(yōu)選診斷設(shè)備或者試劑盒包含至少一種對FVIII或者FVIII相關(guān)蛋白具有高親合性的化合物，至少一種化合物可以任選化學(xué)鍵接的載體基質(zhì)和必要時(shí)的其它試劑。
為了跟蹤本發(fā)明的化合物，優(yōu)選肽或者擬肽衍生物，與FVIII和/或FVIII-類似蛋白的反應(yīng)結(jié)果，將化合物進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記化合物存在數(shù)種可能性，即通過使用放射性標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，通過使用熒光配體進(jìn)行標(biāo)記，通過使用親和素/鏈霉親和素(avidine/steptavidine)系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記，或者如ELISA工藝中通常應(yīng)用的，通過使用引起顯色反應(yīng)的酶進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明涉及含有適于標(biāo)記、檢測、鑒定、分離和/或純化FVIII和/或FVIII-類似蛋白的肽和擬肽衍生物的化合物。
在上文和下文中給出的氨基酸縮寫表示以下氨基酸的殘基: Abu 4-氨基丁酸 Aha 6-氨基己酸 Ala 丙氨酸 Asn 天門冬酰胺 Asp 天冬氨酸 Arg 精氨酸 Bpa 對苯甲?；奖彼? Cys 半胱氨酸 Dab 2，4-二氨基丁酸 Dap 2，3-二氨基丙酸 GIn 谷氨酰胺 GIp 焦谷氨酸 GIu 谷氨酸 GIy 甘氨酸 His 組氨酸 homo-Cys 同型半胱氨酸 homo-Phe 同型苯丙氨酸 IAA 2-(吲哚-3-基)乙酸 IBA 4-(吲哚-3-基)丁酸 IPA 3-(吲哚-3-基)丙酸 Ile 異亮氨酸 Leu 亮氨酸 Lys 賴氨酸 Met 蛋氨酸 1-Nal 1-萘基丙氨酸 2-Nal 2-萘基丙氨酸 Nle 正亮氨酸 Orn 鳥氨酸 Phe 苯丙氨酸 Phg 苯基甘氨酸 4-Hal-Phe 4-鹵素-苯丙氨酸 Pro 脯氨酸 Ser 絲氨酸 Thr 蘇氨酸 Trp 色氨酸 Tyr 酪氨酸 Val 纈氨酸 此外，使用以下縮略語: Ac 乙酰基 BOC 叔丁氧羰基 tBu 叔丁基 CBZ或者Z芐氧羰基 DCCI二環(huán)己基碳二亞胺 DIPEA N-乙基二異丙基乙胺 DMF 二甲基甲酰胺 EDCIN-乙基-N，N′-(二甲基氨基丙基)-碳二亞胺 Et乙基 Fmoc 9-芴基甲氧羰基 HOBt 1-羥基苯并三唑 Me甲基 MBHA 4-甲基-二苯甲胺 Mtr 4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基-磺?；? HATU O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯； HONSu N-羥基琥珀酰亞胺 OtBu 叔丁基酯 Oct 辛?；? OMe 甲基酯 OEt 乙基酯 POA 苯氧基乙?；? Pbf 五甲基苯并呋喃基 Pmc 2，2，5，7，8-五甲基色滿(Pentamethylchroman)-6-磺?；? Sal 水楊?；? Su琥珀?；? TIPS 三異丙基硅烷 TFA 三氟醋酸 TFE 三甲基甲硅烷基溴 Trt 三苯甲基(三苯基甲基)。
如果式I化合物的結(jié)構(gòu)單元(即上述的氨基酸)可以以多種光學(xué)異構(gòu)形式存在，那么包括所有這些形式及其混合物(例如DL形式)。
此外，作為式I化合物組成部分的氨基酸可例如帶有自身已知的相應(yīng)保護(hù)基。優(yōu)選基團(tuán)為Asp和GIu的衍生物，特別是Tyr的側(cè)鏈或者衍生物的甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者芐基酯，特別是側(cè)鏈的甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者芐基酯。此外，所述化合物可以帶有一個(gè)或者多個(gè)另外的保護(hù)基，所述保護(hù)基在以下結(jié)合本發(fā)明化合物的制備進(jìn)行了描述。
此外，比如N-末端改性或者羧基-末端改性衍生物的結(jié)構(gòu)部分同樣屬于本發(fā)明的一部分。優(yōu)選基團(tuán)為氨基-末端甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-、苯基-或者芐基-基團(tuán)，氨基-末端基團(tuán)比如BOC、Mtr、CBZ、Fmoc和特別是乙?；?、苯甲酰基或者(吲哚-3-基)碳酸基團(tuán)，此外，羧基-末端甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者芐基酯，甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者芐基酰胺，并且特別是羧酰胺。
α氨基可以由適宜的保護(hù)基保護(hù)，所述保護(hù)基選自芳香氨基甲酸酯型的保護(hù)基，比如烯丙氧羰基、芐氧羰基(Z)和取代的芐氧羰基，比如對-氯芐氧羰基、對-硝基芐氧羰基、對-溴芐氧羰基、對-聯(lián)苯-異丙氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)和對-甲氧基芐氧羰基(Moz)；脂族尿烷型的保護(hù)基，比如叔丁氧羰基(Boc)、二異丙基甲氧羰基和異丙氧羰基。在此，對于α氨基保護(hù)，F(xiàn)moc是最優(yōu)選的。
可以用于形成根據(jù)本發(fā)明的肽或者擬肽的氨基酸可以屬于天然存在和非蛋白氨基酸。氨基酸和氨基酸殘基可以進(jìn)行衍生化，不過優(yōu)選N-甲基-、N-乙基-、N-丙基-或者N-芐基-衍生物。例如，如果使用甲基，酰胺鍵的N-烷基化作用會對相應(yīng)化合物的活性具有強(qiáng)烈影響(Levian-Teitelbaum，D.；Kolodny，N.；Chorev，M.；Selinger，Z.；Gilon，C.Biopolymers 1989，28，51-64，其全文在此引入作為參考)。另外，可以應(yīng)用的氨基酸的其它結(jié)構(gòu)替換物包括在側(cè)鏈上具有改性的氨基酸、β-氨基酸、氮雜-氨基酸(α-氨基酸的衍生物，其中α-CH-基團(tuán)被N-原子取代)和/或類肽-氨基酸(α-氨基酸的衍生物，其中氨基酸側(cè)鏈鍵接在氨基上，而不是α-C-原子上)或者上述變型的環(huán)化衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，還可以將天然存在的氨基酸的同型-衍生物用作結(jié)構(gòu)單元。它們是天然存在的氨基酸的衍生物，其中亞甲基基團(tuán)被插入到側(cè)鏈中，直接與Cα相鄰。類似地，還可以使用根據(jù)本發(fā)明的天然存在的氨基酸的α-甲基化衍生物。在上下文中，除非另外明確說明，殘基B、Q和X為關(guān)于式I所定義的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，式I化合物如所附權(quán)利要求2～17中任一項(xiàng)中所定義。
在另一實(shí)施方案中，優(yōu)選B由以下通式表示 Z1-Z2-Z3， 其中Q、X或者載體可以直接鍵接到殘基Z1、Z2和Z3中任一殘基上。優(yōu)選經(jīng)殘基Z1或者Z3進(jìn)行鍵接，更優(yōu)選經(jīng)殘基Z3進(jìn)行鍵接。
在該實(shí)施方案中，Z1是具有大側(cè)鏈的天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物。這意味著側(cè)鏈含有至少3個(gè)碳原子，優(yōu)選至少5個(gè)碳原子和更優(yōu)選6～25個(gè)碳原子。一個(gè)或者多個(gè)所述碳原子可以被選自N、O和S的雜原子替代。優(yōu)選Z1的側(cè)鏈含有可以為單環(huán)、雙環(huán)或者三環(huán)的環(huán)狀基團(tuán)。此外，該環(huán)狀基團(tuán)可以是飽和的、不飽和的或者芳香基團(tuán)。更優(yōu)選芳香基團(tuán)以及雙環(huán)基團(tuán)。特別優(yōu)選芳香雙環(huán)基團(tuán)。在所附權(quán)利要求4～17中對于另一實(shí)施方案詳述的特征描述了該實(shí)施方案的其它優(yōu)選化合物。
在該實(shí)施方案中，還可以優(yōu)選Z1為下式的殘基Ar-(CH2)m-(CHR1)n-(CH2)o-A1(II) 其中 A1表示選自NR2、CO、OCO、CHR2、O或者S的基團(tuán)， R1表示選自C1-4烷基、苯基、芐基和N(R2)2的基團(tuán)，其中烷基、苯基或者芐基可以帶有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自A和N(R2)2的取代基，其中兩個(gè)或更多個(gè)A和/或兩個(gè)或更多R2可以彼此相同或者不同， Ar是具有6-14個(gè)碳原子的單-、雙-或者三環(huán)芳香環(huán)系統(tǒng)的芳香基，飽和或者部分不飽和的C5-14單-或者雙環(huán)烷基，它們各自未被取代或者帶有1-3個(gè)獨(dú)立地選自A、Ar1、O-Ar1、C(O)-Ar1、CH2-Ar1、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2、Hal的取代基；或者Ar可以是Het， Hal選自F、Cl、Br或者I， Ar1是具有6-14個(gè)碳原子的單-、雙-或者三環(huán)芳香環(huán)系統(tǒng)的芳香基，優(yōu)選苯基或者萘基基團(tuán)，更優(yōu)選苯基。Ar1可以自身未被取代或者帶有1-3個(gè)獨(dú)立地選自A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2和Hal的取代基； Het表示具有5-12個(gè)環(huán)成員的飽和、部分或者完全不飽和的單-或者雙環(huán)雜環(huán)殘基，其中環(huán)成員包含1-3個(gè)N-和/或1個(gè)S-或者O-原子。
雜芳基或者單環(huán)或者雙環(huán)5員-12員雜環(huán)環(huán)基團(tuán)可以基于的雜環(huán)的實(shí)例為吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、異噁唑、噻唑、異噻唑、四唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吲哚、異吲哚、吲唑、酞嗪、喹啉、異喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、β-咔啉或者這些雜環(huán)的苯并稠合、環(huán)戊基稠合、環(huán)己基稠合或者環(huán)庚基稠合衍生物。
氮雜環(huán)還可以作為N-氧化物存在。
可以為雜芳基或者單環(huán)或者雙環(huán)5員-12員雜環(huán)環(huán)的基團(tuán)為，例如，2-或者3-吡咯基、苯基吡咯基(例如4-或者5-苯基-2-吡咯基)、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、4-咪唑基、甲基咪唑基(例如1-甲基-2-、-4-或者-5-咪唑基)、1，3-噻唑-2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、N-氧化-2-吡啶基、N-氧化-3-吡啶基或者N-氧化-4-吡啶基、2-吡嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基或者5-嘧啶基、2-吲哚基、3-吲哚基或者5-吲哚基、取代的2-吲哚基(例如1-甲基-、5-甲基-、5-甲氧基-、5-芐氧基-、5-氯-或者4，5-二甲基-2-吲哚基)、1-芐基-2-吲哚基或者1-芐基-3-吲哚基、4，5，6，7-四氫-2-吲哚基、環(huán)庚并[b]-5-吡咯基、2-喹啉基、3-喹啉基或者4-喹啉基、1-異喹啉基、3-異喹啉基或者4-異喹啉基、1-氧代-1，2-二氫-3-異喹啉基、2-喹喔啉基、2-苯并呋喃基、2-苯并噻吩基、2-苯并噁唑基或者2-苯并噻唑基，或者作為部分氫化或者完全氫化的雜環(huán)環(huán)的基團(tuán)，還例如二氫吡啶基、吡咯烷基(例如2-或者3-(N-甲基吡咯烷基)、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、四氫噻吩基、苯并二噁烷基(benzodioxolanyl)。
表示基團(tuán)Het的雜環(huán)基團(tuán)可以在碳原子和/或環(huán)氮原子上未被取代或者被單取代或者多取代，例如被相同或者不同的取代基二取代、三取代、四取代或者五取代。碳原子可以被取代，例如，被(C1-C8)-烷基取代，特別是被(C1-C4)-烷基，被(C1-C8)-烷氧基取代，特別是被(C1-C4)-烷氧基取代(上述取代基的烷基部分可以自身未被取代或者被COOR2或者N(R2)2取代)，被鹵素、硝基、N(R2)2、三氟甲基、OCF3、羥基、氧代、氰基、COOR2、氨基羰基、(C1-C4)-烷氧基羰基、苯基、苯氧基、芐基、芐氧基、四唑基取代，特別是被(C1-C4)-烷基(例如甲基、乙基或者叔丁基)、(C1-C4)烷氧基(例如甲氧基)、羥基、氧、苯基、苯氧基、芐基、芐氧基取代。硫原子可以被氧化成亞砜或者砜?；鶊F(tuán)Het的實(shí)例為1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-哌嗪基、4-取代的1-哌嗪基、4-嗎啉基、4-硫代嗎啉基、1-氧代-4-硫代嗎啉基、1，1-二氧代-4-硫代嗎啉基、全氫惡嗪-1-基(perhydroazepin-1-yl)、2，6-二甲基-1-哌啶基、3，3-二甲基-4-嗎啉基、4-異丙基-2，2，6，6-四甲基-1-哌嗪基、4-乙?；?1-哌嗪基和4-乙氧羰基-1-哌嗪基。
A表示COOR2、N(R2)2或者具有1-6個(gè)C原子的直鏈、支鏈或者環(huán)狀烷基，其可以未被取代或者被COOR2或者N(R2)2取代， m和o獨(dú)立地選自0、1、2、3和4， n為0或者1，和 R2為H、C1-4烷基、苯基或者芐基，或者在類肽-氨基酸的情形中，為氨基酸側(cè)鏈。
更優(yōu)選的基團(tuán)Z1包括蛋白原芳香氨基酸(Phe、Tyr、Trp、His)及其衍生物，特別是在其側(cè)鏈上帶有1-3個(gè)獨(dú)立地選自R6(如下所定義)的取代基的那些衍生物。所述衍生物的一般實(shí)例為Tyr(OMe)、Tyr(OBn)、Trp(Me)。更優(yōu)選的基團(tuán)Z1包括Tyr、Tyr(OMe)和Tyr(OBn)的衍生物，其中取代基連接在苯基的間位或者鄰位。其它更優(yōu)選的基團(tuán)Z1包括環(huán)己基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩丙氨酸、3-噻吩丙氨酸、苯并噻吩丙氨酸(其中雙環(huán)環(huán)系統(tǒng)可以在環(huán)系統(tǒng)的任何位置上連接在分子的剩余部分上，優(yōu)選在噻吩基環(huán)的2-或者3-位)、苯基甘氨酸、對-苯甲?；奖彼?、高苯丙氨酸、同型酪氨酸、同型色氨酸、同型組氨酸和以上關(guān)于天然氨基酸所述的它們的衍生物。
其它更優(yōu)選的基團(tuán)Z1包括以上通式(II)表示的基團(tuán)，其由以下通式(III)表示: Ar2-(CH2)m-(CHR3)n-(CH2)o-CO-(III) 其中 Ar2表示由Ar限定的芳香基團(tuán)的優(yōu)選亞組(subgroup)，包括苯基、2-羥苯基、3-羥苯基、4-羥苯基、1-萘基、2-萘基、對-苯甲?；交?、(鄰、間或者對-)聯(lián)苯基、2-吲哚基、3-吲哚基、2-硫代苯基、3-硫代苯基、2-苯并噻吩基、3-苯并噻吩基，其每一個(gè)可帶有1～3個(gè)獨(dú)立地選自A和Hal的取代基，和 其中式(III)的剩余取代基為如關(guān)于式(II)所定義的，和 R3為H、R6、-COR6、-COOR6和 R6表示H、C1-4烷基、苯基或者芐基，各自可以未被取代或者獨(dú)立地被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單取代、二取代或者三取代。
特別優(yōu)選的基團(tuán)Z1選自Ac-Trp、Trp、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、對-苯甲?；奖彼岷鸵陨贤ㄊ?III)的基團(tuán)，其中Ar表示3-吲哚基、1-萘基、2-萘基或者對-苯甲?；交?，和m＝0-3，n＝0，o＝0。
最優(yōu)選通式(III)表示的基團(tuán)Z1，其中Ar為3-吲哚基，m＝1，n＝0，o＝0。
Z2不存在或者為天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物。優(yōu)選Z2不是芳香族的。
更優(yōu)選Z2為包括Ser、Thr、Glu、Asp、Asn、Gln、Arg、Lys及其衍生物的極性氨基酸(包括，例如N-烷基化的和Cα-甲基化的極性氨基酸和具有改性側(cè)鏈長度的極性氨基酸衍生物，比如同型衍生物和Orn)。特別優(yōu)選的基團(tuán)Z2選自在生理?xiàng)l件下帶有負(fù)電荷的如上所定義的極性氨基酸，比如GIu、Asp、同型-Glu和同型-Asp。最優(yōu)選的基團(tuán)Z2為GIu或者Asp。
Z3是如以上對于Z1所定義的殘基。也就是說，Z3為天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物，或者通式(II)表示的基團(tuán)，其中 A1表示NR2、CO、CHR2、O或者S， R1表示C1-4烷基、苯基或者芐基，和N(R2)，其中烷基、苯基或者芐基帶有至少一個(gè)基團(tuán)N(R2)和任選一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自A和N(R2)2的取代基，其中兩個(gè)或更多個(gè)A和/或兩個(gè)或更多個(gè)R2可以彼此相同或者不同，和 Ar是具有6-14個(gè)碳原子的單-、雙-或者三環(huán)芳香環(huán)系統(tǒng)的芳香基團(tuán)，飽和或者部分不飽和的C5-14單-或者雙環(huán)烷基，它們各自未被取代或者被一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)獨(dú)立地選自A、O-Ar1、C(O)-Ar1、CH2-Ar1、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或Hal的基團(tuán)取代，或者Het， Hal選自F、Cl、Br或者I， Het是如以上對于Z1所定義的雜環(huán)殘基， A表示COOR2、N(R2)2或者具有1-6個(gè)C原子的直鏈、支鏈或者環(huán)狀烷基，其可以未被取代或者被COOR2或者N(R2)2取代， m和o獨(dú)立地選自0、1、2、3和4， n為0或者1，和 R2為H、C1-4烷基、苯基或者芐基，或者在類肽-氨基酸的情況下，為氨基酸側(cè)鏈。
更優(yōu)選的基團(tuán)Z3包括蛋白原芳香氨基酸(Phe、Tyr、Trp、His)及其衍生物，特別是在其側(cè)鏈上帶有1～3個(gè)獨(dú)立地選自C1-4烷基、鹵素原子或者芐基的取代基的那些衍生物。所述衍生物的一般實(shí)例為Tyr(OMe)、Tyr(OBn)、Trp(Me)。其它更優(yōu)選的基團(tuán)Z3包括環(huán)己基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、噻吩丙氨酸、苯并噻吩丙氨酸、苯基甘氨酸、對-苯甲?；彼?、高苯丙氨酸(homophenylalanine)、同型酪氨酸(homotyrosinc)、同型色氨酸(homotryptophane)、同型組氨酸(homohistidine)和如上關(guān)于天然氨基酸所述的它們的衍生物。
其它更優(yōu)選的基團(tuán)Z3包括以上通式(III)表示的基團(tuán)，其中Ar表示苯基、2-羥苯基、3-羥苯基、4-羥苯基、1-萘基、2-萘基、對-苯甲酰基苯基、聯(lián)苯基、2-吲哚基、3-吲哚基、噻吩、苯并噻吩，它們各自帶有1～3個(gè)獨(dú)立地選自A和Hal的取代基，和其中式(III)的剩余取代基如以上關(guān)于Z1所定義的。
最優(yōu)選的基團(tuán)Z3選自1-NaI、Phe、Tyr和Tyr(OMe)。本發(fā)明的二肽和三肽基團(tuán)B中的殘基Z1和Z3或者Z1和Z2以及Z2和Z3各自經(jīng)肽鍵進(jìn)行連接。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物包括選自以下殘基組合的那些二肽或者三肽基團(tuán)B: (i)Z1的更優(yōu)選實(shí)施方案與Z2和Z3的優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (ii)Z1的特別優(yōu)選實(shí)施方案與Z2和Z3的優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (iii)Z1的最優(yōu)選實(shí)施方案與Z2和Z3的優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (iv)Z2的更優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z3的優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (v)Z2的特別優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z3的優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (vi)Z2的最優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z3的優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (vii)Z3的更優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z2的優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (viii)Z3的最優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z2的優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (ix)Z1的更優(yōu)選實(shí)施方案與Z2和Z3的更優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (x)Z1的特別優(yōu)選實(shí)施方案與Z2和Z3的更優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xi)Z1的最優(yōu)選實(shí)施方案與Z2和Z3的更優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xii)Z2的更優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z3的更優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xiii)Z2的特別優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z3的更優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xiv)Z2的最優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z3的更優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xv)Z3的更優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z2的更優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xvi)Z3的最優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z2的更優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xvii)Z1的更優(yōu)選實(shí)施方案與Z2和Z3的最優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xviii)Z1的特別優(yōu)選實(shí)施方案與Z2和Z3的最優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xix)Z1的最優(yōu)選實(shí)施方案與Z2和Z3的最優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xx)Z2的更優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z3的最優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xxi)Z2的特別優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z3的最優(yōu)選實(shí)施方案的組合； (xxii)Z3的更優(yōu)選實(shí)施方案與Z1和Z2的最優(yōu)選實(shí)施方案的組合； 肽和/或擬肽序列的方向可以反轉(zhuǎn)(稱為“反式肽(retropeptide)”)。
Q為任選的有機(jī)間隔分子。
有機(jī)間隔分子在本質(zhì)上是已知的。“有機(jī)物”為除碳化物和碳酸鹽化合物的所有碳化合物，參見Beilstein′s Handbook ofOrganic Chemistry。通常，有機(jī)間隔分子是在一個(gè)或者兩個(gè)末端具有官能團(tuán)的直鏈烴。所述烴鏈可以被改性。優(yōu)選的有機(jī)間隔分子包括氨基酸或者[-NH-(CH2)x-CO]w、[-NH-(CH2CH2-O-)yCH2-CO]w、[CO-(CH2)z-CO-]、[NH-(CH2)z-NH-]、[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]或者[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]殘基及其組合。標(biāo)記w、x、y和z分別為1-8；1-5；1-6和1-6。此外，肽、糖和其它聚醚可以充當(dāng)有機(jī)間隔分子。
X為任選的有機(jī)錨定分子。
有機(jī)錨定分子是可以用于連接片斷(即化合物和樹脂)的分子或者分子基團(tuán)。所述有機(jī)錨定分子在本質(zhì)上是已知的。通常，有機(jī)錨定分子包含兩個(gè)或者更多個(gè)可以形成化學(xué)鍵的官能團(tuán)。
優(yōu)選的有機(jī)錨定分子包括天然存在或者非蛋白氨基酸或者-A1-(CH2)p-A2、-A1-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-A2、A1-CH2CH2-(OCH2CH2)y-A2、＝CR2-(CH2)p-A2、-A1-CH(NHR3)-(CH2)q-A2、＝CR2-CH(NHR3)-(CH2)q-A2、-A1-CH(COR4)(CH2)q-A2或者＝CR2-CH(COR4)-(CH2)q-A2殘基。
優(yōu)選A1為NH，還可以是CO、CHR2、O或者S，和優(yōu)選A2為SH，還可以是N3、C≡CH、NH-NH2、O-NH2、NH2、Hal1、CR5O或者羧基。
此外 R2為如上所定義的， R3為如上關(guān)于Z1所定義的， R4為-OR6或者-NHR3， R5為H、C1-4烷基或者未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基或者芐基， R6如上關(guān)于Z1所定義， p為1-20， q為1-20， y為1-6， z為1-6， Hal如上所定義， Hal1為Cl、Br或者I。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，基團(tuán)-Q-X的特征在于一個(gè)殘基選自-同型-Cys-OH、-Gly-Cys-OH、-Aha-Cys-OH、-Gly-Aha-Cys-OH及其衍生物。優(yōu)選的衍生物是含有硫醇基以及參與與相鄰殘基(優(yōu)選Z3)形成肽鍵的氮原子，和其中所述氮原子和硫醇基的硫原子通過2～14個(gè)獨(dú)立地選自C、N和O的原子的線性鏈進(jìn)行連接。優(yōu)選所述衍生物未被取代或者帶有1～3個(gè)選自如以上對于Z1所定義的R3的取代基。
此外，本發(fā)明涉及制備式I化合物及其鹽的方法。預(yù)期比如N-末端改性或者羧基-末端改性的衍生物的結(jié)構(gòu)單元屬于本發(fā)明的一部分。
所述式I化合物可具有一個(gè)或多個(gè)手性中心，并且因此可以以多種立體異構(gòu)形式存在。本發(fā)明包括所有所述立體異構(gòu)形式。
據(jù)此，本發(fā)明特別涉及其中至少一個(gè)所述殘基被提及作為優(yōu)選的式I化合物。
特別優(yōu)選給出以下式I的化合物(在此使用的結(jié)合分子B以粗體標(biāo)記，間隔物Q以斜體標(biāo)記): a)H-Trp-Glu-Tyr-Cys-OH (P1) b)Ac-Trp-Glu-Tyr-Cys-NH2 (P2) c)H-Trp-Glu-Tyr-homo-Cys-OH (P3) d)H-Trp-Glu-Tyr-Gly-Cys-OH (P4) e)H-Trp-Glu-Tyr-Aha-Cys-OH (P5) f)H-Trp-Glu-Tyr-Gly-Aha-Cys-OH (P6) g)H-D-Cys-D-Tyr-D-Glu-D-Trp-OH (P7) h)H-Trp-Glu-Phe-Cys-OH (P8) i)H-Trp-Glu-1-Nal-Cys-OH (P9) j)H-Trp-Glu-Tyr(OMe)-Cys-OH (P10) k)H-Trp-Asp-Tyr-Cys-OH (P11) l)H-Bpa-Glu-Tyr-Cys-OH (P12) m)H-1-Nal-Glu-Tyr-Cys-OH (P13) n)H-2-Nal-Glu-Tyr-Cys-OH(P14) o)IAA-Glu-Tyr-Cys-OH (P15) p)IAA-Asp-Tyr-Cys-OH (P16) q)IBA-Glu-Tyr-Cys-OH (P17) r)IBA-Asp-Tyr-Cys-OH (P18) s)IPA-Glu-Tyr-Cys-OH (P19) t)IPA-Asp-Tyr-Cys-OH (P20) u)
n＝1 (P21) n＝2 (P22)
n＝1(P23) n＝2(P24) w)
式I化合物可以被理解為非天然肽或者擬肽衍生物，并且可以部分或者完全合成，例如利用本領(lǐng)域已知的溶液或者固態(tài)合成工藝(Gysin，B.F.；Merrifield，R.B.J.Am.Chem.Soc.1972，94，3102；或者M(jìn)errifield，R.B.Angew.Chemie Int.Ed.1985，24(10)，799-810)，應(yīng)用適當(dāng)?shù)陌被蛘唪然Y(jié)構(gòu)單元合成。順序合成是在被關(guān)注的?？梢詫⑵渌袡C(jī)合成方法用于根據(jù)式I的化合物的合成中，比如描述在Houben-Weyl，Methods ofOrganic Chemistry，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart中的方法。
如果期望，所述原料還可以原位形成，無需將它們從反應(yīng)混合物中分離，而是隨后將它們進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為式I的化合物。
適宜的惰性溶劑為，例如，烴類如己烷、石油醚、苯、甲苯或者二甲苯；氯代烴如三氯乙烯、1，2-二氯乙烷、四氯甲烷、氯仿或者二氯甲烷；醇如甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇或者叔丁醇；醚如二乙醚、二異丙醚、四氫呋喃(THF)或者二噁烷；二醇醚如1，2-二甲氧基乙烷；乙酰胺如N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺或者二甲基甲酰胺(DMF)；腈如乙腈；亞砜如二甲亞砜(DMSO)；二硫化碳；羧酸如甲酸或者乙酸；硝基化合物如硝基甲烷或者硝基苯；酯如乙酸乙酯；水或者所述溶劑的混合物。
此外，式I的化合物可以由官能衍生物通過溶劑解如水解或者氫解釋放獲得。
用于溶劑解或者氫解的優(yōu)選原料是具有相應(yīng)的受保護(hù)氨基和/或羥基而不是一個(gè)或者多個(gè)游離氨基和/或羥基的那些，優(yōu)選帶有氨基保護(hù)基而不是鍵接到N原子上的H原子的那些，例如那些符合式I，但是含有NHR′基團(tuán)(其中R′為氨基保護(hù)基，例如BOC或者CBZ)而不是NH2基團(tuán)的那些。
此外，優(yōu)選給出帶有羥基保護(hù)基而不是羥基H原子的原料，例如符合式I，但是含有R″O-苯基(其中R″為羥基保護(hù)基，例如叔丁基或者芐基)而不是羥基-苯基的那些。換言之，通過保護(hù)基保護(hù)共價(jià)鍵接至芳香環(huán)上的羥基不被轉(zhuǎn)化。
此外，優(yōu)選給出帶有羧基保護(hù)基而不是羧基H原子的原料，例如符合式I，但是含有R″′O-CO基團(tuán)(其中R″′為羧基保護(hù)基，例如叔丁基或者芐基)而不是羧基的那些。換言之，通過保護(hù)基保護(hù)羧基的氧原子不被轉(zhuǎn)化。
在分子中還可以存在多于一個(gè)相同或者不同的保護(hù)基。如果存在的多于一個(gè)的保護(hù)基彼此不同，這提供了以下優(yōu)點(diǎn):它們可以選擇性地進(jìn)行裂解。
術(shù)語“氨基保護(hù)基”是已知的通用術(shù)語，涉及適于防止(阻止)氨基進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)但是容易除去的基團(tuán)。所述基團(tuán)一般為，特別是未被取代或者被取代的?；?、芳基、芳烷氧基甲基或者芳烷基。由于所述氨基保護(hù)基在期望的反應(yīng)(或者反應(yīng)順序)發(fā)生之后被除去，而且它們的類型和大小并非至關(guān)重要的；然而，優(yōu)選給出具有1～20個(gè)碳原子，特別是具有1～8個(gè)碳原子的那些。術(shù)語“?；卑ㄔ从谥?、芳脂族、芳族或者雜環(huán)羧酸或者磺酸的?；鶊F(tuán)，并且尤其是烷氧基羰基、芳氧基羰基和特別是芳烷氧基羰基。所述?；膶?shí)例為烷?；缫阴；?、丙?；投□；?；芳烷?；绫揭阴；环减；绫郊柞；蛘呒妆锦；环佳趸轷；鏟OA；烷氧基羰基如甲氧羰基、乙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、BOC、2-碘乙氧羰基；芳烷氧基羰基如CBZ(“芐氧羰基”)、4-甲氧基芐氧羰基、Fmoc；芳基磺?；鏜tr、Pbf或者Pmc。優(yōu)選的氨基保護(hù)基為BOC、Mtr、CBZ、Fmoc、芐基和乙?；?。
術(shù)語“羥基保護(hù)基”同樣是已知的通用術(shù)語，是指適用于防止羥基進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)、但是在期望的化學(xué)反應(yīng)在分子其它位置已經(jīng)進(jìn)行之后易于被除去的基團(tuán)。所述基團(tuán)一般為上述未被取代或者被取代的芳基、芳烷基或者酰基，此外還可以為烷基。羥基保護(hù)基的本性和大小并不是至關(guān)重要的，因?yàn)樗鼈冊谄谕幕瘜W(xué)反應(yīng)或者反應(yīng)序列之后會被再次除去；優(yōu)選給出具有1～20個(gè)，特別是1～10個(gè)碳原子的基團(tuán)。羥基保護(hù)基的實(shí)例尤其是芐基、對硝基苯甲?；?、叔丁基和乙?；渲刑貏e優(yōu)選芐基和叔丁基。
術(shù)語“羧基保護(hù)基”同樣是已知的通用術(shù)語，是指適用于防止羧基進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)、但是在期望的化學(xué)反應(yīng)在分子其它位置已經(jīng)進(jìn)行之后易于被除去的基團(tuán)。所述基團(tuán)一般為上述未被取代或者被取代的芳基、芳烷基或者?；?，此外還可以為烷基。羧基保護(hù)基的本性和大小并不是至關(guān)重要的，因?yàn)樗鼈冊谄谕幕瘜W(xué)反應(yīng)或者反應(yīng)序列之后會被再次除去；優(yōu)選給出具有1～20個(gè)，特別是1～10個(gè)碳原子的基團(tuán)。羧基保護(hù)基的實(shí)例尤其是芐基、叔丁基和乙?；渲刑貏e優(yōu)選芐基和叔丁基。
式I的化合物自它們的官能衍生物脫離(取決于所應(yīng)用的保護(hù)基)，例如使用強(qiáng)酸(有利地使用TFA或者高氯酸)，而且也可以使用強(qiáng)無機(jī)酸(比如鹽酸或者硫酸)、強(qiáng)有機(jī)羧酸(比如三氯乙酸)或者磺酸(比如苯磺酸或者對甲苯磺酸)。也可以存在其它惰性溶劑，但是并不總是必需的。適宜的惰性溶劑優(yōu)選為有機(jī)溶劑，例如羧酸(比如乙酸)、醚(比如四氫呋喃或者二噁烷)、酰胺(比如DMF)、鹵代烴(比如二氯甲烷)，此外還可以為醇(比如甲醇、乙醇或者異丙醇)和水。此外，上述溶劑的混合物也是適宜的。優(yōu)選過量使用TFA而不加入其它溶劑，優(yōu)選高氯酸以比例9:1的乙酸和70％高氯酸的混合物形式應(yīng)用。用于離解的反應(yīng)溫度有利地為約0～約50℃，優(yōu)選15～30℃(室溫)。
BOC、OBut、Pbf、Pmc和Mtr基團(tuán)可以，例如，優(yōu)選利用TFA在二氯甲烷中進(jìn)行離解，或者利用大約3～5N HCl在二噁烷在15-30℃下進(jìn)行離解，F(xiàn)moc基團(tuán)可以利用大約5～50％的二甲胺、二乙胺或者哌啶的DMF溶液在15-30℃下進(jìn)行離解。
三苯甲基基團(tuán)用于保護(hù)氨基酸組氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸。它們利用TFA/10％苯硫酚、TFA/苯甲醚、TFA/茴香硫醚或者TFA/TIPS/H2O進(jìn)行離解，三苯甲基基團(tuán)從所有所述氨基酸上都被離解下來。
Pbf(五甲基苯并呋喃基)基團(tuán)用于保護(hù)Arg。它利用例如TFA在二氯甲烷中進(jìn)行離解。
可氫化除去的保護(hù)基(例如CBZ或者芐基)可以例如在催化劑(例如，貴金屬催化劑，比如鈀，有利地在比如碳的載體上)存在下通過氫氣處理得到離解。在此，適宜的溶劑為如上所述的那些溶劑，特別是，例如醇(比如甲醇或者乙醇)或者酰胺(比如DMF)。氫解通常在約0～100℃的溫度和在約1～200bar的壓力下進(jìn)行，優(yōu)選在10～30℃和1～10bar下進(jìn)行。在甲醇中的5～10％Pd/C上或者使用在甲醇/DMF中的Pd/C上的甲酸銨(而不是氫)在10～30℃下，CBZ基團(tuán)的氫解可以充分完成。
將式I的堿可以利用酸轉(zhuǎn)化為相關(guān)的酸加成鹽，例如使等量的堿與酸在惰性溶劑(比如乙醇)中反應(yīng)，隨后進(jìn)行蒸發(fā)。由此，可以使用無機(jī)酸，例如硫酸、硝酸、氫鹵酸(比如，氫氯酸或者氫溴酸)、磷酸(比如正磷酸)或者氨基磺酸?？梢允褂糜袡C(jī)酸，包括脂族、脂環(huán)族、芳脂族、芳香族或者雜芳香一元或者多元羧酸、磺酸或者硫酸，例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、葡糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸或者乙磺酸、乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、萘單磺酸和萘二磺酸以及月桂基硫酸。鹽，例如苦味酸鹽，還可以用于分離和/或純化式I的化合物。
另一方面，通過與堿反應(yīng)，式I的酸可以轉(zhuǎn)化為它的一種金屬銨鹽。在此適宜的鹽為，特別是鈉、鉀、鎂、鈣和銨鹽，其它取代的銨鹽，例如二甲基-、二乙基-或者二異丙基-銨鹽，單乙醇-、二乙醇-或者二異丙酰基銨鹽，環(huán)己基銨鹽、二環(huán)己基銨鹽、二芐基亞乙基二銨鹽，此外，例如與精氨酸或者賴氨酸形成的鹽。
根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，提供了制備上述在Z2和Z3之間具有還原肽鍵的擬肽的有利方法: 為了獲得較大量的所述肽和擬肽，通常認(rèn)為在溶液中進(jìn)行合成是有利的，而不是利用固態(tài)合成方法。然而，與固態(tài)合成方法不同，在溶液中進(jìn)行的合成包括一些在溫和酸性條件下進(jìn)行的反應(yīng)步驟，這可能潛在地導(dǎo)致酸敏感保護(hù)基(比如三苯甲基保護(hù)基)的不慎離解(Zervas，L.；Photaki，I.On Cysteine andCystine Peptides.1.New S-Protecting Groups for Cysteine.Journal of the American Chemical Society 1962，84，3887-3897)。
基于以下原因，該問題對本發(fā)明的多種化合物是特別顯著的。本發(fā)明的多種化合物在C-末端含有半胱氨酸殘基，因?yàn)榘腚装彼岬牧虼蓟梢杂糜趯⒒衔锝Y(jié)合到樹脂載體上。然而，溶液態(tài)合成通常在C-末端至N-末端上進(jìn)行，從而抑制了產(chǎn)生外消旋化副反應(yīng)的問題。如果本發(fā)明化合物利用該方法實(shí)現(xiàn)，那么半胱氨酸殘基應(yīng)當(dāng)在多步反應(yīng)序列的早期階段引入。這反過來意味著半胱氨酸殘基的三苯甲基保護(hù)基必須要經(jīng)受相對大量的反應(yīng)步驟。這顯然加重了所述的三苯甲基-相關(guān)的穩(wěn)定性問題。
根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施方案，提供了使所述三苯甲基-相關(guān)的穩(wěn)定性問題最小化同時(shí)保持低外消旋化副反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的合成方法。也就是說，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，如果合成方向逆向使得半胱氨酸殘基在多步反應(yīng)順序末引入到分子中，與三苯甲基-相關(guān)的穩(wěn)定性問題可以得到有效避免。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與肽的合成相反，如果Z2和Z3之間的鍵不含有羰基，不會引發(fā)外消旋化問題。由此，本發(fā)明提供了制備根據(jù)本發(fā)明的擬肽的方法，其特征在于，在殘基Z2和Z3之間的鍵中不存在羰基，并且優(yōu)選含有半胱氨酸殘基作為錨定分子，其中所述方法在溶液中進(jìn)行，使得半胱氨酸殘基成為最后被引入的殘基。
為了例證說明的目的，以下提供了根據(jù)本發(fā)明該實(shí)施方案的擬肽P22合成的一般說明: P22的溶液相合成。該合成由其中吲哚氮被叔丁氧羰基(Boc)基團(tuán)根據(jù)文獻(xiàn)方法保護(hù)的3-吲哚乙酸(35)開始(途徑1):通過在甲醇中用SOCl2處理，將化合物35轉(zhuǎn)化為它的甲酯，隨后吲哚氮通過與二碳酸叔丁酯和DMAP在乙腈中反應(yīng)而用Boc基團(tuán)保護(hù)，從而獲得36。然后進(jìn)行皂化，得到期望的吲哚乙酸37。
途徑1.N-取代的glutamol 40的合成。

試劑和條件:(a)SOCl2、MeOH，18h；(b)Boc2O、DMAP、乙腈，4h，(兩步)；(c)LiOH、THF、MeOH、H2O，18h；(d)哌啶、DMF，1h；(e)HOBt、TBTU、DIPEA，0℃→室溫，4h，(兩步)。
向40的轉(zhuǎn)化可以利用HOBt和TBTU作為偶聯(lián)劑，通過將37偶聯(lián)到側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的glutamol 39上實(shí)現(xiàn)。通過用哌啶處理，39可以容易由市售Fmoc-Glutamol(OtBu)(37)獲得，其不需進(jìn)一步純化即可使用。39中的游離羥基官能度的保護(hù)不是必需的，反應(yīng)可以清潔地進(jìn)行，從而給出N-取代的glutamol 40。目標(biāo)化合物P22中連接谷氨酸和酪氨酸殘基的還原肽鍵由相應(yīng)的醛41和市售Tyr(tBu)OMe的還原氨基化形成(途徑2)。
途徑2.擬肽P22(指定為化合物33)的合成
試劑和條件:(a)Dess-Martin過碘烷、DCM，6h；(b)1)Tyr(tBu)OMe*HCl、MgSO4、DCM，30min；2)NaB(OAc)3H，18h，(三步)；(c)LiOH、THF、二噁烷、H2O，1.5h；(d)Cys(Trt)OtBu*HCl、HOBt、TBTU、2，4，6-三甲基吡啶，10℃→室溫，18h，(兩步)；(e)TIPS、H2O、TFA，0→95％，8h。
在醛形成期間避免堿性反應(yīng)條件是重要的，因?yàn)檫@會導(dǎo)致外消旋化。由此，通過利用Dess-Martin過碘烷氧化作用和在不存在堿下短期原位預(yù)形成亞胺，然后迅速加入還原劑，外消旋化可以得到完全避免。該方法通過三步給出期望的仲胺42。通過HPLC-MS，僅僅觀察到痕量的二烷基化副產(chǎn)品。通過皂化使42中的甲酯離解和使所得游離酸在HOBt/TBTU和弱堿2，4，6-三甲基吡啶存在下偶聯(lián)到Cys(Trt)OtBu*HCl上，得到43(兩步)。雖然應(yīng)用的半胱氨酸叔丁酯不能市場購得，但是它優(yōu)于市售的甲酯，因?yàn)樗子诤铣刹⑶以试S43的一步去保護(hù)，從而在酸性條件下獲得期望的游離擬肽P22。此外，這可以避免皂化之后光學(xué)純度的顯著損失。
就P22的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)而言，最終的去保護(hù)和純化是關(guān)鍵步驟。通過將P22懸浮在劇烈攪拌的水和TIPS(1:1)的混合物中和在8小時(shí)時(shí)間內(nèi)緩慢加入TFA至95％的最后濃度，這些步驟可以進(jìn)行而無副產(chǎn)品形成。通過該方法，副產(chǎn)品形成被大大降低，從而在醚/戊烷中沉淀之后以高產(chǎn)率和高純度獲得最終的游離擬肽P22。
本發(fā)明化合物可以按照如下所述進(jìn)行應(yīng)用。
診斷應(yīng)用:血友病甲的確切診斷通過進(jìn)行FVIII測定和測量凝固時(shí)間進(jìn)行評價(jià)。因此，將患者血漿與來自先天缺乏FVIII的患者或者來自人工排除來源(artificially depleted source)的FVIII-缺乏血漿混合。將縮短凝結(jié)時(shí)間的有效性程度與正常血漿的程度進(jìn)行對比。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用血友病血漿稀釋收集的新鮮正常人血漿和繪制凝結(jié)時(shí)間與稀釋液的曲線來形成。
雖然凝結(jié)測試仍然是用于手術(shù)前藥物篩選和用于治療監(jiān)控的最經(jīng)常進(jìn)行的測定，但是這些測試完全依賴于酶促步驟。血漿中的凝血因子通常是惰性的，第一步需要進(jìn)行蛋白水解活化。此外，這些酶促步驟不僅需要活化的凝血因子，而且還需要活化的輔因子、磷脂和鈣離子。這意味著在測定中涉及相對不穩(wěn)定的蛋白的非常復(fù)雜混合物，這可能低估實(shí)際的FVIII水平。為了克服該問題，另外評價(jià)患者中FVIII的絕對水平是重要的。這通常通過應(yīng)用不穩(wěn)定的抗-FVIII抗體的ELISA測試實(shí)現(xiàn)。這些抗體可以用本發(fā)明的肽和擬肽替換。當(dāng)用于該目的時(shí)，同當(dāng)前使用的用于ELISA測試中的不穩(wěn)定抗-FVIII抗體相比，根據(jù)本發(fā)明的肽具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。用于檢測患者血漿中總FVIII量的敏感篩選試劑盒的研制受益于肽的優(yōu)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它們具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性、更高的敏感性和更低的測定成本。
用于穩(wěn)定目的:FVIII顯示出迅速失活作用和短的半衰期。FVIII的半衰期的定義為活性雜三聚FVIII(A1/A2/A3-C1-C2)的A2亞單位的自發(fā)分解速率，其中A2亞單位與A1和A3-C1-C2亞單位經(jīng)離子相互作用微弱締合。對于活性FVIII的正常穩(wěn)定性，需要雜三聚體中存在A2。
本發(fā)明的肽和擬肽不僅對FVIII表現(xiàn)出高親合性，而且通過結(jié)合，它們還用于穩(wěn)定雜三聚體。由此，這些創(chuàng)造性的化合物與FVIII的結(jié)合可以在血友病甲治療中以有利的方式使用，從而增強(qiáng)治療期間FVIII的穩(wěn)定性和半衰期。替代治療期間FVIII的較長半衰期將緩解患者的安寧狀況(well-being)，因?yàn)檫@可以降低FVIII的輸注頻率。所述穩(wěn)定作用還可以用于有利地增強(qiáng)含F(xiàn)VIII藥物在它們給藥之前的貯存期限。
用于標(biāo)記、檢測和鑒定:本發(fā)明化合物還可以帶有標(biāo)記物基團(tuán)，比如放射性同位素或者可以進(jìn)行著色反應(yīng)的官能團(tuán)等等。本發(fā)明所述化合物與FVIII的接觸將導(dǎo)致標(biāo)記物肽或者擬肽與FVIII的結(jié)合。這反過來允許檢測，和根據(jù)具體情況定量存在于樣品中的FVIII。在治療中的應(yīng)用:除了上述穩(wěn)定作用之外，本發(fā)明化合物此外可以增強(qiáng)FVIII的生物活性。此外，本申請的化合物可能具有抑制抗體與給藥的FVIII結(jié)合的有利作用。通過使FVIII與本發(fā)明化合物在給藥之前接觸，這些有益作用可以用于治療中。本發(fā)明化合物將結(jié)合FVIII，由此形成配合物。該配合物而不是純FVIII的給藥會導(dǎo)致增強(qiáng)的生物學(xué)作用(或者，作為選擇，允許給藥更低的FVIII劑量)。此外，該配合物的給藥可能有助于降低抗體的失活作用。簡要地說，本發(fā)明化合物可以用于制造同通常的FVIII相比顯示出更高的穩(wěn)定性和優(yōu)良活性的基于FVIII的藥物。在所述常規(guī)的FVIII被抗體鈍化的情形中，所述基于FVIII的藥物還可以用于替代常規(guī)的FVIII。此外，本發(fā)明還涉及治療血友病甲的方法，包括將有效劑量的所述FVIII配合物和本發(fā)明化合物給藥至需要其的對象的步驟。在制造基于FVIII的藥物中的應(yīng)用:本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及本發(fā)明化合物用于純化粗FVIII和FVIII-類似蛋白的用途。這優(yōu)選包括本發(fā)明化合物在固體載體上的固定。更優(yōu)選，親合色譜法利用由本發(fā)明化合物涂覆的樹脂進(jìn)行。所述應(yīng)用更詳細(xì)地描述在以下實(shí)施例3～5中。
在制造診斷學(xué)和/或研究工具中的應(yīng)用:此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明化合物用于純化FVIII和FVIII-類似蛋白的結(jié)構(gòu)域、表位和片段的用途。雖然所述純化的結(jié)構(gòu)域等等可能不會表現(xiàn)出與FVIII相當(dāng)?shù)哪Y(jié)活性，不過它們可以作為研究工具等等用于診斷試劑盒中。
實(shí)施例 根據(jù)以下參數(shù)使用層析法:RT＝保留時(shí)間(分鐘)，在HPLC上，在以下系統(tǒng)中: 柱:YMC ODS A RP 5C18，250×4.6mm 洗脫液A:在水中0.1％TFA 洗脫液B:在乙腈中0.1％TFA 流速:1mL/min 梯度:10->50％B/30min。
質(zhì)譜(MS):ESI(電噴射離子化)(M+H)+ SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE):FVIII SDS-PAGE利用10％Tris-Glycine Bio-Rad ReadyGel進(jìn)行。將樣品稀釋于含有2-巰基乙醇的加樣緩沖液中并且施加到凝膠上。電泳在恒定電流(25mA/gel)下在置于冰上的Bio-Rad Mini-Protean 3裝置上進(jìn)行。電泳之后，凝膠利用標(biāo)準(zhǔn)銀染色方案進(jìn)行染色。
免疫印跡:將蛋白轉(zhuǎn)入在具有傳送阻塞(transfer block)的Bio-Rad Mini-Protean 3裝置中的硝化纖維膜上。傳送在恒定70V電壓(～250mA)下進(jìn)行4小時(shí)，同時(shí)安裝冷凍的冷卻阻塞(cooling block)。膜用在TBS中的5％脫脂奶粉，pH8.0阻斷過夜。然后，膜用在含有0.1％Tween-20的TBS pH＝7.4中的5％脫脂奶粉溶液中稀釋至1μg/mL的一抗溫育1小時(shí)。
在含有0.1％Tween-20的TBS(pH＝7.4)中將膜洗滌3次，并且用在TBS pH＝7.4，0.1％Tween-20中的5％脫脂奶粉中稀釋至1:3000的過氧化物酶-標(biāo)記的山羊抗鼠抗體(Mab C5和Mab 413)溫育1小時(shí)。用TBS，0.1％Tween-20洗滌3次之后，將膜在ECL化學(xué)發(fā)光基質(zhì)中(Pharmacia)進(jìn)行顯影和利用BioMax-XL膠片(Kodak)對化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測。
Rink-amid樹脂代表4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基樹脂，其使得例如具有C-末端-CONH2基團(tuán)的肽和擬肽衍生物能夠合成，TCP樹脂表示三苯甲基氯-聚苯乙烯樹脂。
化合物P1～P20利用Fmoc-策略，分別在TCP樹脂和用于化合物P2的Rink-amide樹脂上經(jīng)固相肽合成進(jìn)行合成(參見Fields，G.B.；Nobie，R.L.Int.J.Pept.Protein Res.1990，35，161)。
N-末端乙酰化(化合物P2)在固相下，通過在最終離解和去保護(hù)步驟之前，用NMP/Ac2O/DIPEA(91:7:2)混合物處理相應(yīng)的N-末端去保護(hù)化合物實(shí)現(xiàn)(參見以下)。
化合物P21～P25在TCP樹脂上利用Fmoc-策略連續(xù)完全合成。“還原的肽鍵”在固相上，利用氨基酸相應(yīng)的醛，經(jīng)自身已知的還原烷基化反應(yīng)形成(＂amino aldehyde＂，參見Krchnak，V.；Weichsel，A.S.；Cabel，D.；Flegelova，Z.；Lebl，M.MoI.Diversity1995，1，149)。反應(yīng)在水截留(water trapping solvent)的溶劑(比如三甲氧基甲烷)中，在室溫下進(jìn)行。形成為中間產(chǎn)物的相應(yīng)亞胺化合物的還原在非質(zhì)子溶劑(比如二氯甲烷)中，在室溫下進(jìn)行。作為還原劑，使用配位硼氫化合物，比如NaBH(OAc)3。
利用90％TFA，5％H2O和5％TIPS，肽或者擬肽從固相的離解和它們的側(cè)鏈保護(hù)基的離解同時(shí)進(jìn)行。
所有化合物都通過制備的HPLC進(jìn)行純化。
實(shí)施例1:作為對于FVIII的親合性配體的化合物的制備和pd-FVIII的結(jié)合 將肽P1～P25固定在Toyopearl AF-Epoxy-650M樹脂(TosohBiosep)上，如Jungbauer等人所述。為了進(jìn)行固定，將2.5mg各種肽溶于0.25mL固定緩沖液(0.2M碳酸氫鈉，pH10.3)中，并且將0.036g干燥樹脂粉末(相當(dāng)于0.125mL溶脹樹脂)加入其中，隨后在溫和轉(zhuǎn)動下將混合物溫育48小時(shí)。在溫育48小時(shí)之后，樹脂用固定緩沖液洗滌一次，用1M NaCl洗滌一次，然后用結(jié)合緩沖液洗滌3次，并且對125I-標(biāo)記的pd-FVIII與肽涂覆樹脂和對照樹脂的結(jié)合進(jìn)行測試。在各個(gè)記錄的試驗(yàn)中，各種肽的偶聯(lián)密度記載在表1中。在肽不存在下，在平行試驗(yàn)中，對對照0.25mL樹脂部分進(jìn)行類似地處理，并且隨后在125I-pd-FVIII結(jié)合試驗(yàn)中將其用作對照(指定為背景)。125I-pd-FVIII結(jié)合/背景的比例計(jì)算如下，使結(jié)合到固定肽的125I-pd-FVIII的量除以結(jié)合到如上所述制備的未涂覆對照樹脂的量。該比例表示微珠測定的信號/噪聲比，因?yàn)榕c肽結(jié)合的125I-pd-FVIII表示信號值，肽未涂覆樹脂結(jié)合的125I-pd-FVIII表示背景(噪聲)值。
源于血漿(pd-)的人類因子VIII(FVIII)通過以下方法從濃縮物中純化，在抗-FVIII單克隆抗體柱上進(jìn)行免疫親和層析，隨后通過離子交換色譜法，利用Resource Q HR5/5柱濃縮pd-FVIII。為了從vWf中分離FVIII，在親合性純化之前，在0.35MNaCl，0.04M CaCl2中對濃縮物進(jìn)行溫育。
可能存在于pd-FVIII制劑中的痕量vWf通過使pd-FVIII制劑通過具有抗-vWf高親合性單克隆抗體的柱被除去，其中高親合性單克隆抗體以1.4mg/ml樹脂的密度固定。
利用乳過氧化物酶珠粒和0.5mCi Na125I，10μg純化的pd-FVIII得到碘化。
在結(jié)合緩沖液(0.01M Hepes，0.1M NaCl，5mM CaCl2，0.01％Tween-80)中，對具有固定肽的樹脂進(jìn)行洗滌。隨后，在結(jié)合緩沖液將樹脂稀釋為1:7漿液并且將試樣等分入Eppendorf管中(40μl/管)。將125I-pd-FVIII(100000cpm，10μl)加入到管中，并且通過加入50μl含有4％BSA的結(jié)合緩沖液將混合物的體積調(diào)節(jié)至100μl，從而給出2％的最終BSA濃度。在旋轉(zhuǎn)器上在室溫下溫育2小時(shí)之后，在結(jié)合下將樣品洗滌4次。在各次洗滌之后，在Eppendorf微量離心機(jī)中，在5000rpm下將管離心1分鐘，將上清液除去，將樹脂再懸浮在洗滌緩沖液中，隨后在相同條件下進(jìn)行離心。四次洗滌之后，對具有丸粒而無上清液的管的放射能力進(jìn)行讀數(shù)。對不存在肽的樹脂進(jìn)行類似處理以說明與管和樹脂自身的非特異性pd-FVIII結(jié)合，并且將該對照管的放射能力認(rèn)為是背景值。因?yàn)?25I-pd-FVIII含有一些在放射性標(biāo)記期間被破壞的組分，因此將結(jié)合計(jì)算為與用抗-FVIII Mab 8860-涂覆樹脂進(jìn)行的分離試驗(yàn)中確定的最大可實(shí)現(xiàn)結(jié)合的百分比。
所有測量都一式兩份進(jìn)行。各試驗(yàn)利用兩個(gè)獨(dú)立制備的固定肽樣品進(jìn)行。存在于各個(gè)圖中的數(shù)據(jù)是四次測定的平均值:兩次測定中的重復(fù)測量利用肽在不同天數(shù)時(shí)獨(dú)立固定于其上的珠粒進(jìn)行。以上四次重復(fù)測定(在兩次獨(dú)立試驗(yàn)中重復(fù)進(jìn)行測定)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值一般小于與肽結(jié)合的125I-pd-FVIII的測量值的10％。



比較例1:制備具有錯(cuò)義序列(scrabled sequence)的比較化合物作為用于FVIII的比較配體和與pd-FVIII的結(jié)合 利用具有任意的錯(cuò)義氨基酸序列(ECYYEHWS)的肽，重復(fù)實(shí)施例1中描述的方法。隨后，按照與以上實(shí)施例1中所述的相同方式，對FVIII與帶有該錯(cuò)義肽的樹脂的結(jié)合以及FVIII與未涂覆樹脂的結(jié)合進(jìn)行研究。結(jié)果示于下表2中。
表2:125I-標(biāo)記的因子VIII與固定在

AF-Epoxy-650M上的比較化合物和與未涂覆形式的相同樹脂的結(jié)合。
a序列:ECYYEHWS；b未涂覆樹脂 實(shí)施例1中報(bào)道的結(jié)果與比較例1的結(jié)果對比表明，同錯(cuò)義肽相比，本發(fā)明化合物對FVIII表現(xiàn)出顯著更高的親合性。
實(shí)施例2:利用P15涂覆的樹脂和P22涂覆的樹脂的重組FVIII的結(jié)合

和

是分別從Bayer以及Wyeth-AyerstPharmacia and Upjohn商購獲得的FVIII重組形式。


由總量4000IU(5管形瓶)利用免疫親合色譜法，隨后利用使用具有NaCl線性梯度的Resource Q HR5/5柱的離子交換色譜來純化。純化

的濃度為130μg/ml，活性740IU/mL，和比活性5700IU/μg。

由總量5000IU(5管形瓶)利用免疫親合色譜法，隨后利用使用Resource Q HR5/5柱的離子交換色譜來純化。經(jīng)純化的

的濃度為89μg/ml，活性864IU/mL，和比活性97071U/μg。
按照與實(shí)施例1中關(guān)于pd-FVIII所述相同的方式，對

和

進(jìn)行碘化。利用與以上實(shí)施例1所述相同的方法，對蛋白結(jié)合進(jìn)行測量。這些試驗(yàn)的結(jié)果概述于下表3中。
表3重組FVIII與P15涂覆的樹脂和P22涂覆的樹脂的結(jié)合 該試驗(yàn)的結(jié)果表明，本發(fā)明化合物還對FVIII-類似蛋白如重組FVIII表現(xiàn)出高親合性。
實(shí)施例3:利用P22涂覆的樹脂進(jìn)行的活性pd-FVIII的純化 如實(shí)施例1中所述，將擬肽衍生物P22固定在Toyopearl上樹脂。使用25mg肽和360mg樹脂。將所得樹脂(～1ml)填塞到玻璃柱(Pharmacia-Biotech)中。利用Waters 650E Advanced ProteinPurification System進(jìn)行純化工藝。緩沖液A為0.01M Hepes，0.1M NaCl，5mM CaCl2，0.01％Tween-80，緩沖液B為0.01MHepes，1M NaCl，5mM CaCl2，0.01％Tween-80(pH6.8)。通過流經(jīng)UV檢測器(Waters 490 E)通過在280nm(OD280)下的光密度，對洗脫進(jìn)行監(jiān)控。然后，通過確定OD280分析洗脫餾分的蛋白含量，F(xiàn)VIII活性在一期APTT分析中利用MLA Electra-800自動凝血計(jì)時(shí)器進(jìn)行確定。來自于洗脫餾分的樣品通過10％PAGE，隨后銀染色和利用抗FVIII的單克隆抗體的Western印跡法進(jìn)行分析。
如上所述的預(yù)先通過免疫親合和離子交換色譜法純化的FVIII(0.5mg)，用0.01M Hepes，5mM CaCl2，0.01％Tween-80稀釋至最終0.1M NaCl的鹽濃度。將混合物施加到P22-柱上，隨后用緩沖液A洗滌，直至OD280重新回到背景值為止。結(jié)合的蛋白用20％緩沖液A、80％緩沖液B洗脫。所得洗脫圖形示于圖1中。
FVIII的純化從含F(xiàn)BS的SF9細(xì)胞條件培養(yǎng)基中進(jìn)行，用FVIII示蹤。如上所述的預(yù)先通過免疫親合和離子交換色譜法純化的FVIII(0.5mg)與含F(xiàn)BS的SF9細(xì)胞條件培養(yǎng)基混合，所述介質(zhì)用0.01M Hepes、5mM CaCl2、0.01％Tween-80稀釋至最終0.1MNaCl的鹽濃度。將混合物施加到柱上，隨后用緩沖液A洗滌，直至OD280重新回到背景值為止。用85％緩沖液A、15％緩沖液B進(jìn)行洗滌，從而洗脫一些結(jié)合污染的蛋白。結(jié)合的蛋白用40％緩沖液A、60％緩沖液B洗脫。所得洗脫圖形示于圖2中。
表4.在含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中進(jìn)行FVIII純化的定量參數(shù)。

在兩次純化中，都實(shí)現(xiàn)了高度滿意的柱保留和成功洗脫(圖3和4)。在從含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中純化FVIII期間，相對于FVIII過量存在于源溶液中的污染蛋白被成功除去(圖3和4，表4)。
擬肽-純化的FVIII樣品視覺上不同于以下譜帶，使用商購的純FVIII制劑作為陽性對照(條帶2，圖3，條帶2圖4):230-90kDa重鏈譜帶，由于B-結(jié)構(gòu)域的不同蛋白水解而不均質(zhì)，和～80kDa輕鏈雙重譜帶(由于不同的糖基化(glycosilation))，其通常不能再溶解，分子量～55kDa的個(gè)別蛋白水解譜帶，和分子量～45kDa的另一蛋白水解譜帶。兩種制劑都未含有可檢測量的一些源于45kDa重鏈蛋白水解譜帶的更深度蛋白水解。SDS-PAGE表明，用FVIII示蹤的由先前純化的FVIII的純化和由含F(xiàn)BS的DMEM條件培養(yǎng)基的純化的洗脫餾分具有基本上相同數(shù)目的蛋白譜帶，和譜帶之間的物質(zhì)分布基本上沒有不同于陽性對照FVIII。這些結(jié)果證實(shí)，同市售免疫親合純化的FVIII對照相比，由細(xì)胞條件培養(yǎng)基或者純背景得到的肽-純化FVIII制劑顯示出相同的SDS-PAGE和Western blot圖案。
實(shí)施例4:用P1涂覆的樹脂的FVIII的純化 如實(shí)施例1中所述，將肽P1鍵接至樹脂上。使用25mg肽和360mg樹脂。將所得樹脂(～1ml)填塞到玻璃柱(Pharmacia-Biotech)中。如關(guān)于實(shí)施例3所述對含F(xiàn)VIII的樣品進(jìn)行純化，兩次試驗(yàn)之間的唯一差異在于在本試驗(yàn)中不存在用緩沖液A的預(yù)洗脫步驟。
純化的細(xì)節(jié)概括于以下表5中:
在兩次純化中，都實(shí)現(xiàn)了高度滿意的柱保留和成功洗脫(圖5和6)。在從含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中純化FVIII期間，相對于FVIII過量存在于源溶液中的污染蛋白被成功除去(圖6，表5)。
權(quán)利要求
1.式I的化合物以及它們的鹽，
B-Q-X (I)
其中B表示Z1-Z2-Z3，
其中Z1為具有單環(huán)、雙環(huán)或者三環(huán)側(cè)鏈的天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物，所述單環(huán)、雙環(huán)或者三環(huán)側(cè)鏈具有6～25個(gè)碳原子，其中這些碳原子中的一個(gè)或者多個(gè)可以被選自N、O和S的雜原子替換，或者其中
Z1為下式的殘基
Ar-(CH2)m-(CHR1)n-(CH2)o-A1(II)
其中
A1表示選自NR2、CO、OCO、CHR2、O或者S的基團(tuán)，
R1表示選自C1-4烷基、苯基、芐基和N(R2)2的基團(tuán)，其中烷基、苯基或者芐基可以帶有一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自A和N(R2)2的取代基，其中兩個(gè)或更多個(gè)A和/或兩個(gè)或更多個(gè)R2可以彼此相同或者不同，
Ar是具有6-14個(gè)碳原子的單-、雙-或者三環(huán)芳環(huán)體系的芳香基團(tuán)，飽和或者部分不飽和的C5-14單-或者雙環(huán)烷基，它們各自未被取代或者帶有1-3個(gè)獨(dú)立地選自A、Ar1、O-Ar1、C(O)-Ar1、CH2-Ar1、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2、Hal的取代基；或者Ar可以是Het，
Hal選自F、Cl、Br或者I，
Ar1是具有6-14個(gè)碳原子的單-、雙-或者三環(huán)芳環(huán)體系的芳香基團(tuán)，優(yōu)選苯基或者萘基，更優(yōu)選苯基，Ar1可以自身未被取代或者帶有1-3個(gè)獨(dú)立地選自A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2和Hal的取代基；
Het表示具有5-12個(gè)環(huán)成員的任選取代的飽和、部分或者完全不飽和的單-或者雙環(huán)雜環(huán)殘基，該環(huán)成員包含1-3個(gè)N-和/或1個(gè)S-或者O-原子，
A表示COOR2、N(R2)2或者具有1-6個(gè)C原子的直鏈、支鏈或者環(huán)狀烷基，其可以未被取代或者被COOR2或者N(R2)2取代，
m和。獨(dú)立地選自0、1、2、3和4，
n為0或者1，和
R2為H、C1-4烷基、苯基或者芐基，或者在類肽-氨基酸的情形中，其為氨基酸側(cè)鏈；
Z2表示天然存在或者非天然氨基酸，在其側(cè)鏈上不帶有芳香基團(tuán)；
Z3表示如上對于Z1所定義的基團(tuán)，其中Z1和Z3可以彼此相同或者不同，條件是化合物內(nèi)Z1和Z3的不同位置通過在鍵合或者游離價(jià)的位置上不存在或者存在的另外的氫原子分別確定；
Q不存在或者是具有1～100個(gè)骨架原子的有機(jī)間隔分子；
X不存在或者是具有選自SH、N3、NH-NH2、O-NH2、NH2、Cl、Br、I、C≡CH、CR5O或者羧基的末端基團(tuán)的有機(jī)錨定分子，其中
R5選自H、C1-4烷基或者苯基或者芐基，該苯基或者芐基可以為未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal獨(dú)立地單、二或者三取代。
2.式I的化合物及其鹽，
B-Q-X(I)
包括:
B是提供對FVIII和/或FVIII-類似蛋白的親合性的二肽、三肽或者擬肽，
Q不存在或者為有機(jī)間隔分子，和
X不存在或者為有機(jī)錨定分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中
B為Z1-Z2-Z3，
包括:
Z1天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物，或者Ar-(CH2)m-(CHR1)n-(CH2)o-Al，
Z2不存在或者為天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物，
Z3天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物，或者Ar-(CH2)n-(CHR1)m-(CH2)o-A1，
A1NR2、CO、CHR2、O或者S，
R1C1-4烷基、苯基或者芐基，
Ar未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基，其可以為被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基，以此方式形成未被取代或者取代的聯(lián)苯基，或者Het，
HalF、Cl、Br或者I，
Het具有5-12個(gè)環(huán)成員的飽和、部分或者完全不飽和的單-或者雙環(huán)雜環(huán)殘基，該環(huán)成員包含1-3個(gè)N-和/或1個(gè)S-或者O-原子，其中雜環(huán)殘基可以被CN、Hal、OH、NH2、COOH、OA、CF3、A、NO2、Ar或者OCF3單取代或者二取代，
ACOOH、NH2或者具有1-6個(gè)C原子的、未被取代或者被COOH或者NH2取代的烷基，
m，o 0、1、2、3或者4，
n 0或者1，
由此
Z1和Z3或者Z1和Z2以及Z2和Z3可以通過酸-酰胺鍵-CO-NR2-或者-NR2-CO-，優(yōu)選通過所謂的還原肽鍵-CH2-NR2-或者-NR2-CH2-以及通過-CO-CHR2-、-CHR2-CO-、-CR2＝CH-或者-CH＝CR2-鍵進(jìn)行結(jié)合，
其中
R2為H、C1-4烷基、苯基或者芐基，或者在類肽-氨基酸的情形中，其為氨基酸側(cè)鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或者3所述的化合物，其中Q為選自以下基團(tuán)之一的有機(jī)間隔分子
[-NH-(CH2)x-CO]w、
[-NH-(CH2CH2-O-)yCH2-CO]w、
[CO-(CH2)z-CO-]、
[-NH-(CH2)z-NH-]、
[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]、
[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]、
氨基酸、肽、糖或者聚醚以及它們的組合，
其中w分別獨(dú)立地為1～8，
x為1-5，
y為1-6和
z為1-6。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或者4所述的化合物，其中X為選自以下基團(tuán)之一的有機(jī)錨定分子
天然存在或者非蛋白氨基酸、
-A1-(CH2)p-A2、
-A1-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-A2、
-A1-CH2CH2-(OCH2CH2)y-A2、
＝CR2-(CH2)p-A2、
-A1-CH(NHR3)-(CH2)q-A2、
＝CR2-CH(NHR3)-(CH2)q-A2、
-A1-CH(COR4)-(CH2)q-A2或者
＝CR2-CH(COR4)-(CH2)q-A2，
其中
A1為NR2、CO、CHR2、O或者S，
A2為SH、N3、NH-NH2、O-NH2、NH2、Hal1、C≡CH、CR5O或者羧基，
R2為如權(quán)利要求2中所定的義的，
R3為H、R6、-COR6、-COOR6，
R4為-OR6或者-NHR3，
R5為H、C1-4烷基或者未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基或者芐基，
R6為H、C1-4烷基或者未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基或者芐基，
p為1-20，
q為1-20，
y為1-6，
z為1-6，
Hal為如權(quán)利要求3中所定義的，
Hal1為Cl、Br或者I。
6.根據(jù)權(quán)利要求2～5任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于Z1為Ar-(CH2)m-(CHR3)n-(CH2)o-CO-
由此
Ar為
和m、n和。為如權(quán)利要求3中所定義的。
7.根據(jù)權(quán)利要求2～6任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，m為1、2或者3，n為0和o為0。
8.根據(jù)權(quán)利要求2～5任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
Z1為1-NaI、2-NaI、Bpa或者R7-Trp
由此
R7為H、R8、-COR8、-COOR8，
其中R8為C1-4烷基或者未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基或者芐基，
以及A和Hal為如權(quán)利要求3中所定義的。
9.根據(jù)權(quán)利要求2～8任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
R7為H或者-COR8
其中R8為甲基。
10.根據(jù)權(quán)利要求2～9任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
Z2是具有谷氨酸或者天冬氨酸側(cè)鏈的氨基酸殘基。
11.根據(jù)權(quán)利要求2～10任一項(xiàng)所述的化合物，特征還在于，
Z3是具有1-萘基丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或者O-甲基化酪氨酸側(cè)鏈的氨基酸殘基。
12.根據(jù)權(quán)利要求2～11任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
Q為[-NH-(CH2)x-CO]w，
x和w為如權(quán)利要求4中所定義的。
13.根據(jù)權(quán)利要求2～12任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
x為1或者5，w為0或者1。
14.根據(jù)權(quán)利要求2～13任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
X為-A1-CH(COR4)-(CH2)q-A2，
其中
A1為NH，
R4為OH或者NH2，
A2為SH，
和q為如權(quán)利要求5中所定義的。
15.根據(jù)權(quán)利要求2～14任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
q為1或者2。
16.根據(jù)權(quán)利要求2～15任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
X為-A1-CH(NHR3)-(CH2)q-A2，
其中
A1為CO，
R3為H
A2為SH
和q為如權(quán)利要求5中所定義的。
17.根據(jù)權(quán)利要求2～16任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
q為1。
18.根據(jù)權(quán)利要求1～17任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
氨基酸殘基可以獨(dú)立地選自α-氨基碳酸殘基、β-氨基碳酸殘基、氮雜-氨基碳酸殘基和類肽-氨基碳酸殘基。
19.根據(jù)權(quán)利要求1～18任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
氨基酸殘基選自α-氨基酸殘基。
20.根據(jù)權(quán)利要求1～19任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
殘基Z1和Z3或者Z1和Z2或者Z2和Z3分別通過酸-酰胺鍵-CO-NH-彼此結(jié)合。
21.根據(jù)權(quán)利要求1～20任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
一個(gè)或多個(gè)肽鍵可以根據(jù)權(quán)利要求2獨(dú)立地進(jìn)行改性。
22.根據(jù)權(quán)利要求1～21任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
殘基Z1和Z3或者Z1和Z2或者Z2和Z3分別通過-CHH2-NH-鍵彼此結(jié)合。
23.根據(jù)權(quán)利要求1～22任一項(xiàng)所述的化合物，其特征還在于，
肽和/或擬肽的方向被逆轉(zhuǎn)(“反式肽”)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)所述的化合物，其用于疾病的治療。
25.一種載體基質(zhì)，其表面鍵合有根據(jù)權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)所述的化合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的載體基質(zhì)，其包含無機(jī)或者有機(jī)材料，特別是聚合物材料。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或者26所述的載體基質(zhì)，其中根據(jù)權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)所述的化合物化學(xué)結(jié)合到該載體基質(zhì)的表面，例如結(jié)合在樹脂上。
28.根據(jù)權(quán)利要求25或者26所述的載體基質(zhì)，其中根據(jù)權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)所述的一種或多種化合物通過有機(jī)間隔物結(jié)合到載體基質(zhì)的表面，例如結(jié)合在樹脂上。
29.根據(jù)權(quán)利要求25或者26所述的載體基質(zhì)，其中權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)所述的一種或多種化合物通過有機(jī)錨定分子結(jié)合到載體基質(zhì)的表面，例如結(jié)合在樹脂上。
30.根據(jù)權(quán)利要求25或者26所述的載體基質(zhì)，其中權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)所述的化合物通過有機(jī)間隔物和有機(jī)錨定分子結(jié)合到載體基質(zhì)的表面，例如結(jié)合在樹脂上。
31.一種診斷設(shè)備或者試劑盒，其含有根據(jù)權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)所述的化合物，根據(jù)權(quán)利要求25～30任一項(xiàng)所述的載體基質(zhì)，和必要時(shí)的輔助工具以及任選的用于化合物標(biāo)記的另一工具。
32.根據(jù)權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)所述的化合物的用途，其用于標(biāo)記、檢測、鑒定、分離和純化FVIII或者FVIII-相關(guān)蛋白。
33.一種檢測、鑒定、分離和純化FVIII或者FVIII-相關(guān)蛋白的方法，其包括使含有FVIII或者FVIII-相關(guān)蛋白的樣品與包含已固定有根據(jù)權(quán)利要求1～22任一項(xiàng)所述的化合物的基質(zhì)，在適于FVIII或者FVIII-相關(guān)蛋白和所述化合物之間結(jié)合的條件下接觸。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中將根據(jù)權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)所述的化合物固定在載體上，該載體為聚合物材料。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或者34所述的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)所述的化合物選自由P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19、P20、P21、P22、P23、P24和P25組成的組。
36.根據(jù)權(quán)利要求33或者34所述的方法，其中該聚合物材料為樹脂。
37.根據(jù)權(quán)利要求33～35任一項(xiàng)所述的方法，其中該樣品為細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
38.根據(jù)權(quán)利要求33～35任一項(xiàng)所述的方法，其中該樣品為體液。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中該體液包括血液。
40.一種凹坑或者孔，其包含(1)根據(jù)權(quán)利要求1～23任一項(xiàng)所述的化合物，(2)包括聚合物材料的基質(zhì)，其中所述化合物被固定在該聚合物材料上。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的凹坑或者孔，其中該化合物進(jìn)一步包括標(biāo)記物。
42.根據(jù)權(quán)利要求33或者34所述的方法，其中該化合物經(jīng)與所述聚合物材料化學(xué)結(jié)合而被固定在該聚合物材料上。
43.根據(jù)權(quán)利要求33或者34所述的方法，其中肽或者擬肽經(jīng)化學(xué)結(jié)合在所述聚合物材料上的有機(jī)錨定分子被固定在該聚合物材料上。
44.根據(jù)權(quán)利要求33或者34所述的方法，其中該有機(jī)錨定分子為
-A1-(CH2)p-A2，
-A1-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-A2，
-A1-CH2CH2-(OCH2CH2)y-A2，
＝CR2-(CH2)p-A2，
-A1-CH(NHR3)-(CH2)q-A2，
＝CR2-CH(NHR3)-(CH2)q-A2，
-A1-CH(COR4)-(CH2)q-A2，
＝CR2-CH(COR4)-(CH2)q-A2
其中A1、A2、R2、R3、R4、p、q和y為如權(quán)利要求5中所定義的。
45.根據(jù)權(quán)利要求33、34或者44所述的方法，其中肽或者擬肽進(jìn)一步包含有機(jī)間隔分子。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中該有機(jī)間隔分子選自以下基團(tuán)的一種:
[-NH-(CH2)x-CO]w，
[-NH-(CH2CH2-O-)yCH2-CO]w，
[CO-(CH2)z-CO-]，
[NH-(CH2)z-NH-]，
[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]，
[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]，
或者氨基酸、肽、糖或者聚醚以及它們的組合，
其中w、x、y和z為如權(quán)利要求4中所定義的。
全文摘要
本發(fā)明涉及對因子VIII和因子VIII-類似蛋白表現(xiàn)出高親合性的化合物和它們的用途。所述化合物的特征在于通式B-Q-X，其中B表示二肽、三肽或者擬肽；Q表示間隔物和X表示錨定分子；Q和X是任選的。這些化合物可以用于涂覆固體載體物質(zhì)。所得的經(jīng)涂覆的固體載體物質(zhì)可以用于通過親合色譜法純化因子VIII。此外，本發(fā)明化合物可以用于穩(wěn)定因子VIII和用于增強(qiáng)它的活性。由此，本發(fā)明還涉及制造含有增強(qiáng)活性的藥物的穩(wěn)定因子VIII的方法。此外，本發(fā)明化合物可以用于診斷試劑盒中和作為研究工具。
文檔編號C07K5/08GK101379077SQ200680052567
公開日2009年3月4日 申請日期2006年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日
發(fā)明者塞巴斯蒂安·諾爾, 霍斯特·凱瑟勒, 夏洛特·豪澤, 愛麗克西·克倫諾夫, 伊夫?qū)帷に_恩科 申請人:夏洛特·豪澤