專利名稱：：白蛋白融合的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽的制作方法白蛋白融合的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2002年2月7日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547的優(yōu)先權(quán)。本文以其整體引用該申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及Kunitz結(jié)構(gòu)域肽和白蛋白融合蛋白領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于治療，預(yù)防，或改善疾病或紊亂的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽和白蛋白融合蛋白。發(fā)明背景Kunitz結(jié)構(gòu)域是形成中央反向平行0折疊和短C-末端螺旋的大約51_64個(gè)殘基的折疊結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)6,087,473,本文以其整體引用以供參考)。該特征性結(jié)構(gòu)域包含形成3個(gè)二硫鍵的6個(gè)半胱氨酸殘基，導(dǎo)致產(chǎn)生雙環(huán)結(jié)構(gòu)。N-末端區(qū)和第一P鏈之間存在活性抑制結(jié)合環(huán)。該結(jié)合環(huán)通過(guò)P2Cw殘基與最后2個(gè)P鏈之間形成的發(fā)夾環(huán)以二硫鍵結(jié)合。來(lái)自各種蛋白酶抑制劑的分離的Kunitz結(jié)構(gòu)域顯示出具有抑制活性(例如，Petersen等，Eur.J.Biochem.125:310-316,1996;Wagner等，Biochem.Biophys.Res.Comm.186:1138-1145，1992;Dennis等，J.Biol.Chem.270:25411-25417，1995)。連接的Kunitz結(jié)構(gòu)域也顯示出具有抑制活性，例如，在美國(guó)專利號(hào)6,087,473中討論。含有一個(gè)或多個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑包括組織因子途徑抑制劑(TFPI),組織因子途徑抑制劑2(TFPI-2),淀粉樣P-蛋白前體(APPP)，抑酶肽和胎盤(pán)bikunin。TFPI,即一種外源性途徑抑制劑和天然抗凝劑，含有3個(gè)串聯(lián)連接的Kunitz抑制劑結(jié)構(gòu)域。氨基末端的Kunitz結(jié)構(gòu)域抑制因子VIIa,纖溶酶，和組織蛋白酶G;第二個(gè)結(jié)構(gòu)域抑制因子X(jué)a,胰蛋白酶，和胰凝乳蛋白酶；第三個(gè)結(jié)構(gòu)域無(wú)已知活性(Petersen等，出處同上)。以前的一些研究證實(shí)了Kunitz結(jié)構(gòu)域肽對(duì)絲氨酸蛋白酶的抑制活性。在下面的段落中討論諸如血漿激肽釋放酶，纖溶酶，和嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的絲氨酸蛋白酶被Kunitz結(jié)構(gòu)域肽抑制的研究結(jié)果。血漿激肽釋放酶抑制劑激肽釋放酶是在組織和血漿中都可發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶[參見(jiàn)，例如，Markland的美國(guó)專利號(hào)6,333,402,在此以其整體引用以供參考]。血漿激肽釋放酶與接觸激活(內(nèi)源性途徑)凝血，纖維蛋白溶解，低血壓，和炎癥相關(guān)[參見(jiàn)Bhoola，K.D.，C.D.Figueroa，和K.Worthy,PharmacologicalReviews(1992)44(1)1-80]。激肽釋放酶的這些效果通過(guò)3種不同生理底物的活性介導(dǎo)i)因子X(jué)II(凝血)，ii)尿激酶原/纖溶酶原(纖維蛋白溶解)，和iii)激肽原(低血壓和炎癥)。激肽釋放酶裂解激肽原導(dǎo)致產(chǎn)生激肽，即小的高效生物活性肽。激肽通過(guò)細(xì)胞表面受體起作用，該受體稱為BK-1和BK-2，存在于包括內(nèi)皮，上皮，平滑肌，神經(jīng)，腺和造血細(xì)胞的各種細(xì)胞類型中。細(xì)胞內(nèi)異源三聚體G-蛋白連接激肽受體與包括氧化氮，腺苷酸環(huán)化酶，磷脂酶A2和磷脂酶C的第二信使途徑。激肽的重要生理活性包括(i)增加血管透性；(ii)血管舒張；(iii)支氣管痙攣；和(iv)誘導(dǎo)疼痛。因此，激肽介導(dǎo)與菌血癥(膿毒)或外傷相關(guān)的威脅生命的血管中風(fēng)和水腫，哮喘的水腫和導(dǎo)氣管反應(yīng)過(guò)強(qiáng)，與組織損傷相關(guān)的炎癥和神經(jīng)性疼痛。血漿激肽釋放酶活性不當(dāng)并導(dǎo)致激肽產(chǎn)生的后果在遺傳性血管水腫(HAE)患者中有明顯表現(xiàn)。HAE由Cl-抑制劑，即血漿激肽釋放酶的主要內(nèi)源性抑制劑的遺傳缺陷引起。HAE的癥狀包括皮膚，皮下組織和胃腸道的水腫，腹痛和嘔吐。幾乎三分之一的HAE患者由于喉頭和上呼吸道水腫引起的窒息死亡。激肽釋放酶以酶原(前激肽釋放酶)形式分泌，該酶原作為無(wú)活性分子循環(huán)直到由蛋白水解事件活化[Genebank登錄號(hào)P03952顯示了人血漿前激肽釋放酶]。體內(nèi)血漿激肽釋放酶(pKA)的一種重要抑制劑是Cl抑制劑；(參見(jiàn)Schmier,等，《HemostasisandThrombosis》第2章，"接觸活化及其異常，，，Colman，RW，JHirsh,VJMarder,和EWSalzman編，第二版，1987，J.B.LippincottCompany,Philadelphia,PA.,第27-28頁(yè))。Cl是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑且與pKA形成不可逆或幾乎不可逆的復(fù)合物。盡管牛胰腺胰蛋白酶抑制劑(也稱為BPTI,抑酶肽，或TrasylolTM)最初認(rèn)為是Ki-320pM的強(qiáng)pKA抑制劑[Auerswald，E.-A.，D.Hoerlein,G.Reinhardt,W.Schroder,和E.Schnabel,Bio.Chem.Hoppe-Seyler，(1988),369(Supplement):27-35],但是最近的報(bào)道[Berndt,等，Biochemistry,32:4564-70,1993]表明其對(duì)血漿激肽釋放酶的Ki為30nM(即，30,000pM)。G36S突變型具有超過(guò)500nM的K"Markland等[美國(guó)專利號(hào)6,333,402;5,994,125;6,057,287;和5，795，865;各文獻(xiàn)以其整體在此引用以供參考]要求保護(hù)在抑制人血漿激肽釋放酶中具有高親和力和特異性的許多衍生物。一種這類蛋白質(zhì)在患有HAE的人類患者中進(jìn)行試驗(yàn)。盡管以前表明該化合物是安全和有效的，但是作用的持續(xù)時(shí)間比期望的要短。纖溶酶抑制劑纖溶酶是纖溶酶原產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶。纖溶酶的催化區(qū)(或"CatDom")裂解肽鍵，特別是在精氨酸殘基之后的肽鍵且在賴氨酸之后的裂解程度較小，該催化區(qū)與胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，激肽釋放酶，和許多其它的絲氨酸蛋白酶具有高度同源性。纖溶酶的最大特異性由血纖蛋白的kringles結(jié)合產(chǎn)生(Lucas等，JBiologicalChem(1983)258(7)4249-56;Varadi&Patthy，Biochemistry(1983)22:2440-2446;和Varadi&Patthy,Biochemistry(1984)23:2108-2112)?；罨瘯r(shí)，裂解ARGs6廣Val562之間的鍵，使得新產(chǎn)生的游離氨基末端形成鹽橋。然而，kringles通過(guò)兩個(gè)二硫鍵保持附著到CatDom上(Colman，RW，JHirsh,VJMarder，和EWSalzman編，《HemostasisandThrombosis》，第二版,1987，LB.LippincottCompany,Philadelphia,Pa.，Bobbins,1987，出處同上)。主要負(fù)責(zé)纖維蛋白溶解的試劑是纖溶酶，即纖溶酶原的活化形式。許多物質(zhì)可活化纖溶酶原，包括活化的Hageman因子，鏈激酶，尿激酶(uPA)，組織型纖溶酶原激活劑(tPA)，和血漿激肽釋放酶(pKA)。pKA是尿激酶的酶原形式的激活劑和直接的纖溶酶原激活劑。纖溶酶在正常循環(huán)血液中檢測(cè)不到，但是纖溶酶原，即酶原以大約3(iM存在。另一含量不可測(cè)的纖溶酶原與血纖蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面的其它成份結(jié)合。正常血液含有大約2pM的纖溶酶生理抑制劑，(X2-纖溶酶抑制劑((X2-PI)。纖溶酶與Ot2-PI形成1:1的復(fù)合物?；|(zhì)或細(xì)胞結(jié)合的纖溶酶相對(duì)難以受到OC2-PI的抑制。因此，纖溶酶的活化可超出OC2-PI的中和能力而產(chǎn)生血纖蛋白原裂解狀態(tài)。一旦形成，纖溶酶可i)降解血纖蛋白凝血塊，有時(shí)過(guò)早降解凝血塊；ii)消化血纖蛋白原(凝血塊的組成材料)，通過(guò)引起從降解產(chǎn)物形成脆弱的，容易裂解的凝血塊，和通過(guò)血纖蛋白原降解產(chǎn)物抑制血小板附著/聚集而削弱止血；iii)直接與血小板相互作用以裂解糖蛋白Ib和1Ib/IIIa,防止附著到高剪切血流區(qū)的損傷內(nèi)皮上并削弱形成血小板栓塞所需的聚集反應(yīng)(Adelman等,Blood(1986)68(6)1280-1284);iv)通過(guò)蛋白水解滅活外源性凝血途徑中的酶，進(jìn)一步促進(jìn)蛋白裂解狀態(tài)。Robbins(Robbins,《HemostasisandThrombosis》第21章，Colman,R.W.,J.Hirsh,V.J.Marder,和E.W.Salzman編，第二版，1987,J.B,LippincottCompany,Philadelphia,PA)詳細(xì)綜述了纖溶酶原-纖溶酶系統(tǒng)。該出版物(即，Colman，R.W.，JHirsh，V,J.Marder,和E.W,Salzman編，《HemostasisandThrombosis》，第二版，1987，J.B.LippincottCompany,Philadelphia,PA)在此引用以供參考。if舉f^溶麻和if舉蛋^^溶席纖維蛋白溶解和纖維蛋白原溶解不當(dāng)導(dǎo)致出血過(guò)多是諸如心肺旁路的需要體外循環(huán)的手術(shù)操作中常見(jiàn)的并發(fā)癥，且也在血栓溶解療法和特別是肝臟的器官移植中遇到。以出血素質(zhì)發(fā)生率高為特征的其它臨床病癥包括肝硬化，淀粉樣變性，急性早幼粒細(xì)胞白血病和實(shí)體瘤?；謴?fù)止血需要冒著免疫反應(yīng)和接觸諸如肝炎病毒和HIV的病原體的風(fēng)險(xiǎn)輸注血漿和/或血漿產(chǎn)品o甚至大量灌注高度失血亦可抵抗稀釋。當(dāng)判斷有生命危險(xiǎn)時(shí)，用諸如c畫(huà)氨基己酸(參見(jiàn)Hoover等，Biochemistry(1993)32:10936-43)(EACA),氨曱環(huán)酸(tranexarnicacid),和抑肽酶(Neuhaus等，Lancet(1989)2(8668)924-5)的抗纖維蛋白溶是纖溶酶的直接抑制劑且是這些試劑中最有效的。由于存在血栓形成并發(fā)癥，腎臟毒性，和對(duì)于BPTI有免疫原性的可能性，這些試劑需慎重使用且通常用作"最后手段(lastresort)"(Putterman，ActaChirScand(1989)155(6-7)367)。這三種抗纖維蛋白溶解劑都缺乏靶特異性和親和性且通過(guò)未鑒定的代謝途徑與組織和器官相互作用。由于親和性低需要大劑量，由于缺乏特異性而引起副作用，和存在免疫反應(yīng)和器官/組織毒性的可能性增大了使用這些抗纖維蛋白溶解劑預(yù)防出血或作為常規(guī)手術(shù)后療法避免或減少輸血治療的爭(zhēng)議。因此，需要一種安全的抗纖維蛋白溶解劑。該試劑的必要特性有i)中和相關(guān)靶纖維蛋白溶解酶；ii)以高親和性與靶酶結(jié)合以最小化劑量；iii)對(duì)靶具有高度特異性以減小副作用；和iv)與人蛋白質(zhì)具有高度相似性以最小化可能的免疫原性和器官/組織毒性。作為被有效抗纖維蛋白溶解劑抑制的候選靶的所有纖維蛋白溶解酶都是胰凝乳蛋白酶同源的絲氨酸蛋白酶。凝血活性缺陷，纖維蛋白溶解活性升高，或兩種情況相結(jié)合可引起出血過(guò)多。在大多數(shù)出血素質(zhì)中必須控制纖溶酶的活性。據(jù)認(rèn)為在減少失血中BPTI的臨床上有益的效果由其對(duì)纖溶酶(Ki0.3nM)或血漿激肽釋放酶(Ki~100nM)或者兩種酶的抑制產(chǎn)生。Garddl[Toxicol.Pathol.(1993)21(2)190-8]綜述了通常使用的血栓溶解劑，并闡明盡管血栓溶解劑(例如，tPA)確實(shí)可開(kāi)通血管，但是出血過(guò)多是一個(gè)嚴(yán)重的安全問(wèn)題。盡管tPA和鏈激酶具有短的血漿半衰期，但是它們活化的纖溶酶在系統(tǒng)中保持較長(zhǎng)的時(shí)間，且正如所述，該系統(tǒng)可能存在纖溶酶抑制劑缺陷。因此，纖溶酶原過(guò)度活化可導(dǎo)致危險(xiǎn)的凝血無(wú)力和有害的或致命的出血。一種有效的，高特異性的纖溶酶抑制劑在這種情況下將是有用的。BPTI是一種有效的纖溶酶抑制劑。然而，已發(fā)現(xiàn)其抗原性足夠大以致于第二次使用需要進(jìn)行皮試。另外，控制出血所需的BPTI劑量相當(dāng)高且作用機(jī)制不清楚。有人認(rèn)為BPTI對(duì)纖溶酶起作用，而其他人認(rèn)為它通過(guò)抑制血漿激肽釋放酶起作用。Fraedrich等[ThoracCardiovascSurg(1989)37(2)89-91]報(bào)道了對(duì)80個(gè)心臟打開(kāi)手術(shù)患者使用大約840mg劑量的BPTI減少幾乎一半的失血，且平均輸血量減少74%。MilesInc.最近在美國(guó)引入TmsylolTM以減少手術(shù)出血[參見(jiàn)Miles關(guān)于Trasylol的產(chǎn)品宣傳冊(cè)，在此引用以供參考]。Lohmann和Marshal[RefractCornealSurg(1993)9(4)300-2]表明纖溶酶抑制劑可用于控制眼科手術(shù)中的出血。Sheridan等[DisColonRectum(1989)32(6)505-8]報(bào)道了BPTI可用于限制結(jié)腸手術(shù)中的出血。與BPTI幾乎一樣有效或者更有效但與人蛋白區(qū)幾乎相同的纖溶酶抑制劑可提供相似的治療潛力但產(chǎn)生的抗原性潛力更小。纖溶酶是血管生成中的關(guān)鍵酶。O'Reilly等[Cell(1994)79:315-328]報(bào)道了纖溶酶的38kDa片斷(缺少催化區(qū))是一種有效的轉(zhuǎn)移抑制劑，表明抑制纖溶酶在阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移中有用[Fidler&Ellis,Cell(1994)79:185-188;也參見(jiàn)Ellis等，AnnNYAcadSci(1992)667:13-31;O'Reilly等，F(xiàn)idler&Ellis,和Ellis等，在此引用以供參考]。嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制嚢性纖維變性是一種影響肺，胃腸，和生殖系統(tǒng)的遺傳性常染色體隱性疾病。在全世界有80,000例流行，CF的發(fā)病率估計(jì)為每3500人中有1例[嚢性纖維變性基金會(huì)，iJeg^o^j""wa/iepo",Bethesda，Maryland,1999年9月]。CF中的遺傳缺陷在1989年描述為在508位置缺失單個(gè)苯丙氨酸(AF508)，產(chǎn)生缺陷型嚢性纖維變性跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)，它可抑制Cr(和由此引起的Na+和水)的再吸收[Rommens，J.M.，等，"嚢性纖維變性基因的鑒定:染色體步查和跳查"，>SWe"ce245:1059,1989;Riordan，J,R.,等，"嚢性纖維變性基因的鑒定克隆和互補(bǔ)DNA",Sc/e"ce245:1066,1989;Kerem，B.,等，"嚢性纖維變性基因的鑒定遺傳分析"，Sc/e"ce245:1073,1989]。在CFTR中發(fā)現(xiàn)了非AF508的突變且可引起CF。干燥的粘液隨后可能堵塞呼吸，胃腸，和生殖系統(tǒng)中的許多通道。CF中75%以上的死亡率由呼吸并發(fā)癥引起[嚢性纖維變性基金會(huì)，ieg&^j;799S^wwa/DatoiepoW,Bethesda,Maryland,1999年9月]。盡管在cf個(gè)體中出生前存在胰腺，肝臟，和腸疾病，但是cf的肺在出生時(shí)是正常的，直到受到感染和炎癥攻擊。隨后，cf肺中的cr再吸收缺陷導(dǎo)致通過(guò)從導(dǎo)氣管取走鈉，伴隨著隨后被動(dòng)取走水引起導(dǎo)氣管分泌物干燥。然后干燥的分泌物可通過(guò)將細(xì)菌截留在非常適合于不同微生物病原體定居的環(huán)境中而干擾粘膜纖毛的清除作用[Reynolds,H.Y.,等，"粘膜綠膿假單胞菌(尸"M^mo"osawMg/"o^):患有慢性肺疾病的青年中嚢性纖維變性的征兆",JAMA236:2190,1976]。繼發(fā)的肺感染和炎癥募集并活化可釋放嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)的嗜中性粒細(xì)胞。在呼吸上皮表面嗜中性粒細(xì)胞主導(dǎo)的炎癥產(chǎn)生嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的慢性上皮負(fù)擔(dān)。CF肺內(nèi)過(guò)量的NE迅速超過(guò)內(nèi)源性抗蛋白酶。另外，NE刺激促炎介質(zhì)的產(chǎn)生并裂解補(bǔ)體受體和IgG,從而削弱宿主防止更多細(xì)菌定居的防御機(jī)制[Tosi，M.F.，等，"嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶裂解調(diào)理的假單胞菌屬(尸^^fomo"05)上的C3bi和嗜中性粒細(xì)胞上的CR1以產(chǎn)生功能重要的調(diào)理素受體錯(cuò)配"，C//"./"veW.86:300，1990]。感染因此變得更持久，且^t動(dòng)進(jìn)行的炎癥和過(guò)量水平的NE破壞導(dǎo)氣管上皮，引起支氣管擴(kuò)張，和肺功能的進(jìn)行性喪失和死亡。對(duì)患有CF的患者的一種治療方案是通過(guò)諸如妥布霉素和ciprofloxin的系統(tǒng)抗微生物劑消滅CF病原體。盡管這些特定的抗微生物劑表現(xiàn)出在清除感染和改善肺功能中有效，但是分別在7.5%和9.6%的CF患者中報(bào)道了對(duì)妥布霉素和dprofloxin具有抗生素抗性[嚢性纖維變性基金會(huì)，戶a"en/^egW77^5^"m^/Datoiepc^，Bethesda,Maryland,1999年9月]。在CF患者中60%感染綠膿假單胞菌(戶^n^/wwfl)且41%感染金黃色釀膿葡萄球菌(S.aw^M),隨著對(duì)CF使用這些抗微生物劑的增加，藥物抗性選擇壓力也增力口。在患有CF的患者中肺功能也是治療的目標(biāo)。Pulmozymes(鏈球菌DNA酶a),即一種通過(guò)水解痰中的DNA降低粘液粘彈性的重組人脫氧核糖核酸酶，在臨床試—險(xiǎn)中已表明治療8天后可增加FEV,和FVC。該變化持續(xù)6個(gè)月，并伴隨著靜脈內(nèi)抗生素使用的減少[Fuchs，H.L.,等，"煙霧化重組人脫氧核糖核酸酶對(duì)呼吸癥狀加重和嚢性纖維變性患者肺功能的效果"，iV.￡"g/.331:637-642,1994]。另一治療方案是使用蛋白酶抑制劑消除NE對(duì)彈性蛋白酶降解及其后遺癥的直接影響。中和過(guò)多的NE可恢復(fù)正常體內(nèi)平衡，保護(hù)細(xì)胞外肺基質(zhì)。肺內(nèi)正常的抗蛋白酶活性可保護(hù)彈性蛋白，通過(guò)減少嗜中性粒細(xì)胞反應(yīng)降低粘液粘度，并保護(hù)肺功能，從而降低CF的死亡率。另外，恢復(fù)補(bǔ)體介導(dǎo)的吞噬作用可允許免疫系統(tǒng)清除細(xì)菌性病原體，導(dǎo)致肺感染的發(fā)生率，持續(xù)時(shí)間，和嚴(yán)重性降低。例如，在CF的大鼠模型中，用od抗胰蛋白酶治療7天后細(xì)菌數(shù)與安慰劑組中的85±21相比減少到0.2士0.4[Cantin,A.和Woods,D,"慢性綠膿假單胞菌肺感染模型中煙霧化的Prolastin抑制細(xì)菌增殖"，爿m7A，>"0〃160:1130-1136,1999]。本發(fā)明小結(jié)本發(fā)明涉及含有與白蛋白融合的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽的蛋白質(zhì)。這些融合蛋白本文統(tǒng)稱為"本發(fā)明的白蛋白融合蛋白"。本發(fā)明的這些融合蛋白表現(xiàn)出體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)和/或在溶液中的治療活性延長(zhǎng)。本發(fā)明包含治療性白蛋白融合蛋白，組合物，藥用組合物，劑型和試劑盒。本發(fā)明還包含編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有這些核酸的載體，用這些核酸和載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和使用這些核酸，載體，和/或宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供含有Kunitz結(jié)構(gòu)域肽或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白。用于該白蛋白融合蛋白的合適的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽包括DX-890，DX-88,DX-1000，和DPI-14。Kunitz結(jié)構(gòu)域肽部分任選可通過(guò)接頭與白蛋白部分隔開(kāi)。本發(fā)明的另一目的是提供包含白蛋白融合蛋白以抑制絲氨酸蛋白酶的組合物和方法，該絲氨酸蛋白酶的非限制性例子包括血漿激肽釋放酶，纖溶酶和嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶。本發(fā)明的另一方面是提供含有至少兩個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域肽或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白，其中至少一個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域肽或片斷或變異體具有諸如抑制纖溶酶，激肽釋放酶，或人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的功能活性。本發(fā)明還有另一方面是提供含有Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白具有白蛋白活性，與未融合狀態(tài)下的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期相比，該白蛋白活性可延長(zhǎng)諸如DX-8卯，DX-88,DX-1000,和DPI-14的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期。本發(fā)明還有另一方面是提供含有Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白，其中本發(fā)明的白蛋白融合蛋白在生理學(xué)pH下溶解度增加。本發(fā)明的另一方面是提供含有Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白，其中Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體與白蛋白N-末端或與白蛋白片斷或變異體的N-末端融合。作為選擇，本發(fā)明還提供了含有Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體的白蛋白融合蛋白，其中Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體與白蛋白C-末端或與白蛋白片斷或變異體的C-末端融合。本發(fā)明還提供了含有白蛋白融合蛋白和藥用上可接受的載體的組合物。本發(fā)明的另一目的是提供治療患有嚢性纖維變性，嚢性纖維變性相關(guān)性疾病或紊亂，或可用包含DX-890和/或DPI-14的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽調(diào)節(jié)的疾病或紊亂的患者的方法。該方法包含施用有效量的白蛋白融合蛋白的步驟，該白蛋白融合蛋白含有包含DX-890和/或DPI-14的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體。本發(fā)明的另一目的是提供治療患有遺傳性血管性水腫，遺傳性血管性水腫相關(guān)的疾病或紊亂，或可用諸如DX-88的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽調(diào)節(jié)的疾病的患者的方法。該方法包含施用有效量的白蛋白融合蛋白的步驟，其中該白蛋白融合蛋白含有包含DX-88的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供治療患有癌癥，癌癥相關(guān)的疾病，出血，或可用諸如DX-1000的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽調(diào)節(jié)的疾病的患者的方法。該方法包含施用有效量的白蛋白融合蛋白的步驟，其中該白蛋白融合蛋白含有包含DX-1000的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體。本發(fā)明的另一目的是提供含有編碼白蛋白融合蛋白的多核苷酸序列的核酸分子，以及含有該核酸分子的載體。本發(fā)明還提供了制備白蛋白融合蛋白的方法，其中該方法包括(a)提供在生物體中可表達(dá)的含有編碼白蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸；(b)在該生物體中表達(dá)該核酸以形成白蛋白融合蛋白；和(c)純化該白蛋白融合蛋白。附圖的簡(jiǎn)要描述圖1:DX-890和DX-8卯-HAS融合蛋白的Ki測(cè)量。圖2:^I-DX-890(左側(cè))和125I-DX-890-HAS融合蛋白(右側(cè))的血漿清除率曲線。圖3:在SE-HPLC(Superose-12)上的正常小鼠血漿中的125I-DX890。圖4:正常小鼠血漿中125I-HAS-DX890的SE-HPLC(Superose-12)圖譜。圖5:1251標(biāo)記的DX-890和HSA-DX-8卯在兔中的血漿清除率。圖6:兔血漿樣品的SEC分析。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及白蛋白融合的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽。本發(fā)明還涉及雙功能(或多功能)融合蛋白，其中白蛋白與兩個(gè)(或多個(gè))Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，任選不同的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽偶連。具有不同Kunitz結(jié)構(gòu)域肽的該雙功能(或多功能)融合蛋白與僅包含一種類型的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽的白蛋白融合蛋白相比預(yù)期具有改進(jìn)的藥物抗性譜。某些情況下可能需要抑制兩種或多種蛋白酶且融合多個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域允許一種化合物可用于抑制兩種或多種蛋白酶。作為選擇，可融合兩個(gè)或多個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域針對(duì)相同的蛋白酶以便增加每克的抑制劑活性。具有兩個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域的抑制劑的一種有用的形式是K1::SA::K2，其中Kq和&是Kunitz結(jié)構(gòu)域且SA是血清白蛋白或其主要部分。該雙功能(或多功能)融合蛋白與僅包含一種類型的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽的白蛋白融合蛋白相比也可表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。另外，可將化學(xué)實(shí)體共價(jià)附著到本發(fā)明的融合蛋白上以增強(qiáng)生物學(xué)活性或調(diào)節(jié)生物學(xué)活性。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白預(yù)期可延長(zhǎng)Kunitz結(jié)構(gòu)域肽的體內(nèi)半衰期。所述白蛋白融合肽的體外或體內(nèi)半衰期比缺少該連接的白蛋白的肽的半衰期延長(zhǎng)2倍，或5倍，或更多。另外，至少部分由于該肽的半衰期增加，預(yù)期本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可減少該治療肽的給藥安排頻率。與缺少連接白蛋白的治療肽的給藥安排頻率(thefrequencyofthedosingschedule)相比，該給藥安排頻率減少至少四分之一或者至少一半。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可延長(zhǎng)該肽的儲(chǔ)存期(shelflife),和/或穩(wěn)定該肽和/或其在溶液中(或在藥用組合物中)的體外和/或體內(nèi)活性?？勺鳛橹委焺┑倪@些白蛋白融合蛋白預(yù)期可減少這樣的需要，即需要用大量過(guò)量的載體蛋白(例如未融合的白蛋白)配制蛋白質(zhì)溶液以防止由諸如非特異性結(jié)合的因素引起的蛋白質(zhì)損失。本發(fā)明還包含編碼白蛋白融合蛋白的核酸分子以及含有這些核酸的載體，用這些核酸載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和使用這些核酸，載體，和/或宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的方法。本發(fā)明還包括修飾成含有本發(fā)明的核酸分子，任選修飾成表達(dá)由該核酸分子編碼的白蛋白融合蛋白的轉(zhuǎn)基因生物。白蛋白術(shù)語(yǔ)人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)在本文中可交換使用。術(shù)語(yǔ)"白蛋白，，和"血清白蛋白，，范圍更寬，且包含人血清白蛋白(和其片斷和變異體)以及來(lái)自其它物種的白蛋白(和其片斷和變異體)。本文使用的"白蛋白"統(tǒng)指具有白蛋白的一種或更多種功能活性(例如，生物學(xué)活性)的白蛋白蛋白質(zhì)或氨基酸序列，或白蛋白片斷或變異體。具體地說(shuō)，"白蛋白"是指人白蛋白或其片斷(參見(jiàn)EP201,239，EP322,094,WO97/24445,W095/23857),特別是本文SEQIDNO:18和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO01/79480的表1和SEQIDNO:18所示的人白蛋白的成熟形式或來(lái)自其它脊推動(dòng)物的白蛋白或其片斷，或這些分子的類似物或變異體或其片斷。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白中使用的人血清白蛋白蛋白質(zhì)參照SEQIDNO:18含有一組或兩組下列點(diǎn)突變組Leu-407突變成Ala,Leu-408突變成Val，Val-409突變成Ala，和Arg-410突變成Ala;或Arg-410突變成Ala,Lys-413突變成Gin,和Lys-414突變成Gln(參見(jiàn)，例如，國(guó)際公開(kāi)號(hào)W095/23857,本文以其整體在此引用以供參考)。在一些實(shí)施方案中，含有一組或兩組上述點(diǎn)突變組的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白對(duì)酵母Yap3p蛋白水解裂解的穩(wěn)定性/抗性增強(qiáng)，使得在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組白蛋白融合本文使用的足以延長(zhǎng)或延續(xù)該治療性蛋白的體內(nèi)半衰期，治療活性，或儲(chǔ)存期的白蛋白部分是指與非融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期，治療活性，或儲(chǔ)存期相比在長(zhǎng)度或結(jié)構(gòu)上足以穩(wěn)定，延長(zhǎng)或延續(xù)該白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的體內(nèi)半衰期，治療活性或儲(chǔ)存期的白蛋白部分。該白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含上述HA序列的全長(zhǎng)，或者可包含能夠穩(wěn)定或延長(zhǎng)該治療活性的其一個(gè)或多個(gè)片斷。該片斷可具有10個(gè)或更多個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度或者可包括HA序列的大約15,20，25，30，50，或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸或者可包括部分或全部的HA特異性結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常HA的變異體。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分也可以是本文所述的治療性蛋白質(zhì)的變異體。術(shù)語(yǔ)"變異體"包括插入，缺失和取代，包括保守的或非保守的取代，其中該變異基本上不改變一種或多種白蛋白的親瘤性(oncotic)，有用的配體結(jié)合和非免疫原性特性，或給治療性蛋白賦予治療活性的活性位點(diǎn)，或活性結(jié)構(gòu)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可包括人白蛋白的天然存在的多態(tài)性變異體和人白蛋白的片斷，例如在EP322,094中公開(kāi)的那些片斷(即HA(Pn)，其中n是369至419)。該白蛋白可來(lái)自于任何脊推動(dòng)物，特別是任何哺乳動(dòng)物，例如人，奶牛，綿羊，或豬。非哺乳動(dòng)物白蛋白包括，但不限于，雞和鮭魚(yú)。該白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可與治療性蛋白部分來(lái)自于不同的動(dòng)物。一般來(lái)說(shuō)，HA片斷或變異體有至少100個(gè)氨基酸長(zhǎng)，例如，至少150個(gè)氨基酸長(zhǎng)。HA變異體由HA的至少一個(gè)完整結(jié)構(gòu)域組成或任選包含HA的至少一個(gè)完整結(jié)構(gòu)域，例如結(jié)構(gòu)域l(SEQIDNO:18的氨基酸1-194)，2(SEQIDNO:18的氨基酸195-387)，3(SEQIDNO:18的氨基酸388-585)，l+2(SEQIDNO:18的1-387),2+3(SEQIDNO:18的195-585)或l+3(SEQIDNO:18的氨基酸1-194+SEQIDNO:18的氨基酸388-585)。各結(jié)構(gòu)域本身由兩個(gè)同源性亞結(jié)構(gòu)域，即1-105,120-194，195-291，316-387,388-491和512-585組成，具有包含殘基Lys106至Glul19,Glu292至Val315和Glu492至Ala511的亞結(jié)構(gòu)域間的彈性接頭區(qū)。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含HA的至少一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域或其保守修飾。如果該融合蛋白以亞結(jié)構(gòu)域?yàn)榛A(chǔ)，任選可使用一些或全部相鄰接頭與治療性蛋白半分子相連。白蛋白融合蛋白本發(fā)明一般涉及白蛋白融合蛋白和治療，預(yù)防，或改善疾病或紊亂的方法。本文使用的"白蛋白融合蛋白"是指由至少一個(gè)分子的白蛋白(或其片斷或變異體)與至少一個(gè)分子的治療性蛋白(或其片斷或變異體)融合形成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白包含互相結(jié)合，例如互相通過(guò)遺傳融合(即該白蛋白融合蛋白通過(guò)翻譯核酸產(chǎn)生，在該核酸中編碼全部或部分治療性蛋白的多核苷酸與編碼全部或部分白蛋白的多核苷酸在閱讀框內(nèi)連接)的治療性蛋白的至少一個(gè)片斷或變異體和人血清白蛋白的至少一個(gè)片斷或變異體。治療性蛋白質(zhì)和白蛋白蛋白質(zhì)，即白蛋白融合蛋白的一個(gè)部分可稱為白蛋白融合蛋白的"部分"，"區(qū)域"，或"半分子"。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)和血清白蛋白蛋白質(zhì)，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的生物活性和/或治療活性片斷和血清白蛋白蛋白質(zhì)，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的生物活性和/或治療活性變異體和血清白蛋白蛋白質(zhì)，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，白蛋白融合蛋白的該血清白蛋白蛋白質(zhì)組件是血清白蛋白的成熟部分。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)和血清白蛋白的生物活性和/或治療活性片斷，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)和血清白蛋白的生物活性和/或治療活性變異體，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在某些實(shí)施方案中，白蛋白融合蛋白的該治療性蛋白質(zhì)部分是治療性蛋白質(zhì)的成熟部分。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的生物活性和/或治療活性片斷或變異體和血清白蛋白的生物活性和/或治療活性片斷或變異體，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含治療性蛋白質(zhì)的成熟部分和血清白蛋白的成熟部分，或任選由其組成的白蛋白融合蛋白。該白蛋白融合蛋白包含HA作為N-端部分，和治療性蛋白質(zhì)作為C-末端部分。作為選擇，也可使用包含HA作為C-端部分，和治療性蛋白質(zhì)作為N-末端部分的白蛋白融合蛋白。在另一實(shí)施方案中，該白蛋白融合蛋白具有與白蛋白N-末端和C-末端都融合的治療性蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在N-和C-末端融合的治療性蛋白質(zhì)是相同的治療性蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，在N-和C-末端融合的治療性蛋白質(zhì)是不同的治療性蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，在N-和C-末端融合的治療性蛋白質(zhì)是可用于治療或預(yù)防相同疾病，紊亂或癥狀的不同治療性蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，在N-和C-末端融合的治療性蛋白質(zhì)是可用于治療或預(yù)防本領(lǐng)域已知通常在患者中同時(shí)發(fā)生的疾病或紊亂的不同治療性蛋白質(zhì)。除了白蛋白部分與治療性蛋白部分的N-末端和/或C-末端融合外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白也可通過(guò)將目的治療性蛋白或肽插入HA的內(nèi)部區(qū)域產(chǎn)生。例如，在HA分子的蛋白質(zhì)序列內(nèi)，在a-螺旋的末端和開(kāi)始之間存在許多環(huán)和轉(zhuǎn)角，它們通過(guò)二硫鍵穩(wěn)定。從HA的晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定的環(huán)(PDB標(biāo)識(shí)符1A06,1BJ5，1BKE，1BM0,1E7E至1E7I和1U0R)大部分從該分子的主體延伸出去。這些環(huán)用于插入，或內(nèi)部融合治療性活性肽，特別是那些需要二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)揮功能的肽，或者治療性蛋白質(zhì)，以便基本上產(chǎn)生具有特定生物學(xué)活性的白蛋白分子。可插入肽或多肽以產(chǎn)生本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的人白蛋白結(jié)構(gòu)中的環(huán)包括Val54-Asn61，Thr76-Asp89，Ala92-Glu100，Glnl70-Ala176，His247-Glu252，Glu266-Glu277，Glu280-His288,Ala362-Glu368，Lys439-Pro447，Val462-Lys475,Thr478-Pro486，和Lys560-Thr566。在其它實(shí)施方案中，將肽或多肽插入成熟人白蛋白的Val54-Asn61,Glnl70-Ala176,和/或Lys560-Thr566環(huán)中(表l)(SEQIDNO:18)。插入的治療性蛋白質(zhì)可來(lái)自任一來(lái)源，包括篩選特異性生物學(xué)活性的噬菌體展示和合成肽文庫(kù)，或者來(lái)自具有所需功能的分子的活性部分。另外，含有用作治療性蛋白質(zhì)的候選物的包含Kunitz結(jié)構(gòu)域肽的隨機(jī)肽文庫(kù)可在特定環(huán)內(nèi)或者通過(guò)將該隨機(jī)化肽插入HA分子的特定環(huán)中產(chǎn)生，其中提供了氨基酸的許多(例如，5xl0"組合。通過(guò)下列方法之一可在HA或HA的結(jié)構(gòu)域片斷上產(chǎn)生該文庫(kù)(a)隨機(jī)突變HA或HA結(jié)構(gòu)域片斷的一個(gè)或多個(gè)肽環(huán)內(nèi)的氨基酸。以該方式可突變環(huán)內(nèi)的一個(gè)，一個(gè)以上或全部殘基；(b)用長(zhǎng)度Xn(其中X是氨基酸且n是殘基數(shù)目)的隨機(jī)肽取代，或插入進(jìn)HA或HA結(jié)構(gòu)域片斷的一個(gè)或多個(gè)環(huán)(即，內(nèi)部融合)；(c)除了(a)和/或(b)夕卜的N-,C-或N-和C-末端肽/蛋白融合。結(jié)構(gòu)域片斷也可使得該HA或HA結(jié)構(gòu)域片斷具有多功能。插入人血清白蛋白環(huán)中的肽的非限制性例子有DX-8卯(人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)，DPI-14(人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑)，DX-88肽(人血漿激肽釋放酶抑制劑，表2)，和DX-1000(人纖溶酶抑制劑，表2)或其肽片斷或肽變異體。更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及白蛋白融合蛋白，它含有插入人血清白蛋白環(huán)中的至少7，至少8,至少9,至少10,至少11,至少12，至少13，至少14，至少15，至少20，至少25，至少30,至少35，或至少40個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽片斷或肽變異體。本發(fā)明還涉及這樣的白蛋白融合蛋白，它含有與人血清白蛋白N-末端融合的至少7,至少8，至少9,至少10，至少11,至少12,至少13,至少14,至少15，至少20,至少25,至少30,至少35，或至少40個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽片斷或肽變異體。本發(fā)明還涉及這樣的白蛋白融合蛋白，它含有與人血清白蛋白C-末端融合的至少7，至少8,至少9,至少10，至少11，至少12,至少13，至少14，至少15，至少20,至少25，至少30，至少35，或至少40個(gè)氨基酸的肽片斷或肽變異體。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可具有一個(gè)來(lái)自HA的區(qū)域和一個(gè)來(lái)自治療性蛋白質(zhì)的區(qū)域。然而，可使用各蛋白質(zhì)的多個(gè)區(qū)域來(lái)制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白。同樣，可使用一個(gè)以上的治療性蛋白質(zhì)來(lái)制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白。例如，治療性蛋白質(zhì)可與HA的N-末端和C-末端都融合。在該構(gòu)型中，治療性蛋白質(zhì)部分可以是相同或不同的治療性蛋白質(zhì)分子。雙功能白蛋白融合蛋白的結(jié)構(gòu)可表示為X-HA-Y或Y-HA-X或X-Y-HA或HA-X-Y或HA-X-Y-HA或HA-Y-X-HA或HA-X-X-HA或HA-Y-Y-HA或HA-X-HA-Y或X-HA-Y-HA或多種組合或在HA序列的任何位置內(nèi)插入X和/或Y。涉及諸如Kunitz結(jié)構(gòu)域的治療性蛋白質(zhì)"X"，和治療性肽"Y"的其它實(shí)施方案涉及將HA分隔成部分1和2。本發(fā)明的融合蛋白可具有形式X-HA(部分l)-Y-HA(部分2)和HA(部分l)-Y-HA(部分2)-X。其它實(shí)施方案涉及兩個(gè)治療性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域"X"和"Z，，和治療性肽"Y",產(chǎn)生具有下列形式的融合蛋白X-HA(部分l)-Y-HA(部分2)-Z和Z-HA(部分1)-Y-HA(部分2)-X?？筛鶕?jù)功能，半衰期，等以各種比率制備雙或多功能白蛋白融合蛋白。雙或多功能白蛋白融合蛋白也可制備成通過(guò)HA另一端的蛋白質(zhì)或肽將融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分靶向靶器官或細(xì)胞類型。作為對(duì)融合蛋白的已知治療性分子的另一選擇，可通過(guò)篩選將一般6,8,12,20或25或XJ其中X是氨基酸(aa)且n等于殘基數(shù)目)的隨機(jī)化氨基酸與HA或HA結(jié)構(gòu)域片斷的N-,C-或N-和C-末端融合構(gòu)建的文庫(kù)獲得該肽，且其中允許氨基酸的所有可能的組合。該方案的具體優(yōu)勢(shì)在于可在HA分子上原位選擇該肽，因此該肽的特性是選擇的而不會(huì)與通過(guò)任何其它方法產(chǎn)生然后連接到HA上的肽的情況一樣可能被修改。與折疊恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)域，例如HA末端的Kunitz結(jié)構(gòu)域的連接不必進(jìn)行該選擇。原位選擇對(duì)于沒(méi)有二硫鍵或單個(gè)二硫鍵環(huán)的肽可能是重要的。另外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可包括融合部分之間的接頭肽以便在半分子之間提供更大的物理間隔且因此最大化治療性蛋白質(zhì)部分的可接近性，例如與其關(guān)連受體的結(jié)合。該接頭肽可由氨基酸組成以便具有彈性或更具有剛性。因此，如上所述，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可具有下列通式R2-R1;Rl-R2;R2-R1-R2;R2-L-R1-L-R2;R1-L畫(huà)R2;R2-L畫(huà)R1;或R1-L隱R2-L-R1，其中Rl是至少一個(gè)治療性蛋白，肽或多肽序列(包括其片斷或變異體)，且不必是相同的治療性蛋白，L是接頭且R2是血清白蛋白序列(包括其片斷或變異體)。舉例性的接頭包括(GGGGSV(SEQIDNO:—)或(GGGS)"SEQIDNO:—)或(GGS)n,其中N是大于或等于1的整數(shù)且其中G表示甘氨酸，S表示絲氨酸。在某些實(shí)施方案中，含有治療性蛋白的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白與未融合白蛋白的相同治療性蛋白的儲(chǔ)存期或體內(nèi)半衰期或治療活性相比具有延長(zhǎng)的儲(chǔ)存期或體內(nèi)半衰期或治療活性。儲(chǔ)存期一般是指在溶液或在某種其它貯存劑型中治療性蛋白的治療活性穩(wěn)定而無(wú)過(guò)度的治療活性損失的時(shí)間期限。許多治療性蛋白質(zhì)在其未融合狀態(tài)下是非常不穩(wěn)定的。如下所述，這些治療性蛋白質(zhì)的一般儲(chǔ)存期在摻入本發(fā)明的白蛋白融合蛋白時(shí)顯著延長(zhǎng)。具有"延長(zhǎng)"或"延期"儲(chǔ)存期的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白相對(duì)于在相同貯存和處理?xiàng)l件下的標(biāo)準(zhǔn)品表現(xiàn)出更高的治療活性。該標(biāo)準(zhǔn)品可以是未融合的全長(zhǎng)治療性蛋白。當(dāng)白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分是類似物，變異體，或者是改變的或不包括該蛋白的完整序列時(shí)，治療活性的延長(zhǎng)任選與該類似物，變異體，改變肽或不完整序列的未融合同等物相比較。作為例子，與標(biāo)準(zhǔn)品在給定時(shí)間點(diǎn)比較時(shí)，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白保留比在相同貯存和處理?xiàng)l件下的標(biāo)準(zhǔn)品的治療活性高大約100%的治療活性，或高大約105%，110%，120%，130°/。，150%或200%的治療活性。然而，應(yīng)注意該治療活性取決于該治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，且可能低于100%。儲(chǔ)存期也可按相對(duì)于貯存開(kāi)始時(shí)的治療活性標(biāo)準(zhǔn)化的，貯存后的治療發(fā)明的白蛋白融合蛋白可保留相同條件下同等未融合治療性蛋白質(zhì)治療活性的超過(guò)大約50%的治療活性，大約60%,70%，80%,或90%或更高的治療活性。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白相對(duì)于相同貯存和處理?xiàng)l件下的未融合治療性蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品表現(xiàn)出更高的可溶性。治療性蛋白質(zhì)如上所述，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白包含通過(guò)遺傳融合互相結(jié)合的至少治療性蛋白質(zhì)的片斷或變異體和至少人血清白蛋白的片斷或變異體。本文使用的"治療性蛋白質(zhì)，，是指Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，其非限制性的例子包括DX-890，DPI-14，DX-88或DX-1000,或其具有一種或多種治療和/或生物學(xué)活性的片斷或變異體。Kunitz結(jié)構(gòu)域是形成中央反向平行卩折疊和短C-末端螺旋的大約51-64個(gè)殘基的折疊結(jié)構(gòu)域。該特征性結(jié)構(gòu)域含有6個(gè)半胱氨酸殘基，形成3個(gè)二硫鍵，產(chǎn)生雙環(huán)結(jié)構(gòu)。在N-末端區(qū)和第一個(gè)P鏈之間存在活性抑制結(jié)合環(huán)。該結(jié)合環(huán)通過(guò)P2C14殘基與最后兩個(gè)卩鏈之間形成的發(fā)夾環(huán)形成二硫鍵。Kunitz結(jié)構(gòu)域是如下通式的從大約51個(gè)氨基酸至大約64個(gè)氨基酸的多肽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>在Cs和C55,Cw和C38,和C30和C5!之間形成二硫鍵。(^4-(:38二硫鍵常見(jiàn)于天然Kunitz結(jié)構(gòu)域，但在人工Kunitz結(jié)構(gòu)域中可去掉。如果C,4變成另一氨基酸類型，那么(338也改變成非半胱氨酸，反之亦然。可將任一多肽融合到氨基末端。X廠X4可包含0至4個(gè)氨基酸。X6-Xu可包含8或9個(gè)氨基酸。如果Xw不存在，那么Xu是Gly。X26a,X26b，和X26c中每一個(gè)都可以不存在；即，X5-X3o可包含16，17,18，或19個(gè)氨基酸。X33是Phe或Tyr。X39-Xso可包含12,13,14,或15個(gè)氨基酸；即，X42a,X42b,和X42c中的每一個(gè)都可以不存在。X45是Phe或Tyr。X56-X58可包含0至3個(gè)氨基酸。其它半胱氨酸可存在于位置50,53,54或58。任何多肽可融合到羧基末端。表3顯示了21個(gè)已知的人Kunitz結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。表3:21個(gè)已知的人Kunitz結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表1中的任一結(jié)構(gòu)域都可改造成具有特異性生物學(xué)作用(例如抑制特定的蛋白酶)并與HA融合。因此本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可至少含有治療性蛋白質(zhì)的片斷或變異體。變異體包括突變體，類似物，和模擬物，以及同源物，包括內(nèi)源性或天然存在的相關(guān)物。表現(xiàn)出"治療活性"的多肽或"治療上有活性"的蛋白質(zhì)是指具有與諸如本文所述的或者本領(lǐng)域已知的一種或多種治療性蛋白質(zhì)的治療性蛋白質(zhì)相關(guān)的一種或多種已知生物學(xué)和/或治療活性的多肽。作為非限制性例子，"治療性蛋白質(zhì)"是用于治療，預(yù)防或改善疾病，癥狀或紊亂的蛋白質(zhì)。本文使用的"治療活性"或"活性"是指其效果與人體所需的治療結(jié)果一致的活性，或者指在非人哺乳動(dòng)物或在其它物種或生物體中所需的效果。治療活性可在體內(nèi)或體外測(cè)量。例如，可在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定所需效果。用于本領(lǐng)域所述的許多治療性蛋白質(zhì)的該體外或細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法通常是可獲得的。有用的測(cè)定法的例子包括，但不限于，特別是本文作為參考文獻(xiàn)引用的，表4的參考文獻(xiàn)和出版物中所述的，和本文實(shí)施例所述的那些測(cè)定法?？蓽y(cè)量本發(fā)明的融合蛋白表現(xiàn)出的活性，例如，通過(guò)在體外測(cè)定法，例如本文所述的那些測(cè)定法中容易完成。使用這些測(cè)定法時(shí)，可測(cè)定這樣的參數(shù)，即與治療性蛋白(或其片斷或變異體)未融合到白蛋白上時(shí)相比，該融合蛋白表現(xiàn)的相對(duì)生物學(xué)和/或治療活性。相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的治療性蛋白可通過(guò)連接一個(gè)或多個(gè)寡糖基團(tuán)進(jìn)行修飾。稱為糖基化的該修飾可顯著影響蛋白質(zhì)的物理特性且在蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，分泌，和定位方面是重要的。該修飾在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355，547和WOO1/79480中進(jìn)行了詳細(xì)描述，本文引用以供參考?？尚揎椣鄳?yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的治療性蛋白，及其類似物和變異體以改變一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的糖基化，該改變可由對(duì)其核酸序列的改造，通過(guò)表達(dá)它們的宿主細(xì)胞，或者由于其表達(dá)的其它條件引起。例如，通過(guò)消除或?qū)胩腔稽c(diǎn)，例如，通過(guò)取代或缺失氨基酸殘基，例如用谷氨酰胺取代天冬酰胺，可產(chǎn)生糖基化異構(gòu)體，或者通過(guò)在不能糖基化它們的宿主細(xì)胞，例如在大腸桿菌或糖基化缺陷型酵母中表達(dá)該蛋白質(zhì)可產(chǎn)生未糖基化的重組蛋白。這些方法的例子在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO01/79480中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述，本文引用以供參考，且它們是本領(lǐng)域已知的。表4提供了相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白質(zhì)的非窮舉性列表。"治療性蛋白質(zhì)X"欄公開(kāi)了治療性蛋白質(zhì)分子，下面的插入語(yǔ)包含科學(xué)命名和商標(biāo)名稱，它包含治療性蛋白質(zhì)分子或其片斷或變異體，或任選由其組成。本文使用的"治療性蛋白質(zhì)X"可指單個(gè)的治療性蛋白質(zhì)分子(亦可從CAS和Genbank登錄號(hào)獲得的氨基酸序列限定)，或者指與該欄公開(kāi)的給定治療性蛋白質(zhì)分子相關(guān)的整組治療性蛋白質(zhì)。與各條目相關(guān)的信息分別以其整體引用以供參考，特別是對(duì)于其中所述的氨基酸序列。"PCT/專利參考文獻(xiàn)"欄提供了相應(yīng)于描述該治療性蛋白質(zhì)分子的專利和/或公開(kāi)的專利申請(qǐng)的美國(guó)專利號(hào)，或PCT國(guó)際公開(kāi)號(hào)。在"PCT/專利參考文獻(xiàn)"欄中引證的各專利和/或公開(kāi)的專利申請(qǐng)以其整體在此引用以供參考。具體地說(shuō)，各引證的"PCT/專利參考文獻(xiàn)"的序列表中描述的特定多肽的氨基酸序列，在例如，各引證的"PCT/專利參考文獻(xiàn)"的詳細(xì)描述中描述的這些氨基酸序列的變異體(突變，片斷，等)，在例如，各引證的"PCT/專利參考文獻(xiàn)"的詳細(xì)描述中描述的治療適應(yīng)征，和在各引證的"PCT/專利參考文獻(xiàn)"的詳細(xì)描述，和更具體地說(shuō)，在實(shí)施例中描述的用于特定多肽的活性測(cè)定法均在本文中引用以供參考。"生物學(xué)活性"欄描述了與治療性蛋白質(zhì)分子相關(guān)的生物學(xué)活性。在"相關(guān)出版物"欄中引證的各參考文獻(xiàn)以其整體，特別是關(guān)于在該文獻(xiàn)中描述(例如，參見(jiàn)方法部分)"優(yōu)選適應(yīng)征(indication)Y"欄描述了可用治療性蛋白質(zhì)X或含有治療性蛋白質(zhì)X部分的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白治療，預(yù)防，診斷，或改善的疾病，紊亂，和/或情況。表4:選定的治療性蛋白質(zhì)列表<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白具有與治療性蛋白質(zhì)的治療活性和/或生物學(xué)活性相應(yīng)的治療活性和/或生物學(xué)活性，該治療性蛋白質(zhì)相應(yīng)于表4相應(yīng)行中所列的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分。(參見(jiàn)，例如，表4的"生物學(xué)活性"和"治療性蛋白質(zhì)X"欄)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療活性蛋白部分是參考序列的片斷或變異體且具有表4"生物學(xué)活性"欄公開(kāi)的相應(yīng)治療蛋白質(zhì)的治療活性和/或生物學(xué)活性。多肽和多核苦酸片斷和變異體^錄本發(fā)明還涉及表4所述治療性蛋白質(zhì)，白蛋白，和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的片斷。即使從蛋白質(zhì)的N-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸導(dǎo)致修改或喪失了該治療性蛋白質(zhì)，白蛋白，和/或白蛋白融合蛋白的一種或多種生物學(xué)功能，但是仍然可保留其它的治療活性和/或功能活性(例如，生物學(xué)活性，多聚化能力，結(jié)合配體的能力)。例如，當(dāng)從N-末端去掉完整多肽的不超過(guò)大多數(shù)的殘基時(shí)，一般可保留N-末端缺失的多肽誘導(dǎo)和/或結(jié)合抗體的能力，該抗體可識(shí)別該多肽的完整或成熟形式。缺失了完整多肽的N-末端殘基的具體多肽是否保留該免疫學(xué)活性可通過(guò)本文所述或者本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法容易測(cè)定。大量缺失N-末端氨基酸殘基的突變體可保留一些生物學(xué)或免疫原性活性也不是不可能的。事實(shí)上，由少到6個(gè)氨基酸殘基組成的肽通?？烧T發(fā)免疫反應(yīng)。因此，相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白的片斷，包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)以及從對(duì)照多肽(例如表4公開(kāi)的治療性蛋白質(zhì))的氨基酸序列的氨基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)殘基的多肽。本發(fā)明還包含編碼這些多肽的多核苦酸。另外，相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的血清白蛋白多肽的片斷，包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)以及從對(duì)照多肽(即，血清白蛋白)的氨基酸序列的氨基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)殘基的多肽。本發(fā)明還包含編碼這些多肽的多核苦酸。另外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的片斷包括全長(zhǎng)白蛋白融合蛋白以及從該白蛋白融合蛋白的氨基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)殘基的多肽。本發(fā)明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。另外，如上所述，即使從對(duì)照多肽(例如，治療性蛋白質(zhì)和/或血清白蛋白)的N-末端或C-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸導(dǎo)致修改或喪失了該蛋白質(zhì)的一種或多種生物學(xué)功能，但是仍然可保留其它的功能活性(例如，生物學(xué)活性，多聚化能力，結(jié)合配體的能力)和/或治療活性。例如，當(dāng)從C-末端去掉完整或成熟多肽的不超過(guò)大多數(shù)的殘基時(shí)，一般可保留C-末端缺失的多肽誘導(dǎo)和/或結(jié)合抗體的能力，該抗體可識(shí)別該多肽的完整或成熟形式。缺失了對(duì)照多肽的N-末端和/或C-末端殘基的具體多肽是否保留治療活性可通過(guò)本文所述和/或本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法容易測(cè)定。本發(fā)明還提供了從相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白質(zhì)(例如，在表4中提及的治療性蛋白質(zhì))的氨基酸序列的羧基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)殘基的多肽。本發(fā)明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。另外，本發(fā)明還提供了從相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白(例如，血清白蛋白)的氨基酸序列的羧基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)殘基的多肽。本發(fā)明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。另外，本發(fā)明還提供了從本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的羧基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)殘基的多肽。本發(fā)明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。另外，可聯(lián)合任意的上述N-或C-末端缺失以產(chǎn)生N-和C-末端缺失的對(duì)照多肽(例如，表4中提及的治療性蛋白質(zhì)，或血清白蛋白(例如，SEQIDNO:18,表l)，或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白)。本發(fā)明還提供了從氨基和羧基末端都缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。本發(fā)明還包含編碼這些多肽的多核苦酸。本申請(qǐng)還涉及含有與本文所述的對(duì)照多肽序列(例如，治療性蛋白質(zhì)，血清白蛋白或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白)至少60%,80%,85%,90%，95°/0，96%,97%,98%或99%相同的多肽的蛋白質(zhì)，或其片斷。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及含有與上述具有N-和C-末端缺失的氨基酸序列的對(duì)照多肽至少80%，85%,90%，95%,96%，97%,98%或99%相同的多肽的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的其它多肽片斷是包含氨基酸序列，或任選由其組成的片斷，該氨基酸序列表現(xiàn)出治療性蛋白或血清白蛋白的多肽序列的治療活性和/或功能活性(例如生物學(xué)活性)，該多肽序列的氨基酸序列是片斷。其它多肽片斷有生物學(xué)活性片斷。生物學(xué)活性片斷是表現(xiàn)出與本發(fā)明的多肽的活性相似，但不必相同的活性的那些片斷。該片斷的生物學(xué)活性可包括改進(jìn)所需的活性，或者降低不需要的活性。史^謬"變異體"是指不同于對(duì)照核酸或多肽，但保留其基本特性的多核苷酸或核酸。一般來(lái)說(shuō)，變異體與對(duì)照核酸或多肽總體上非常相似，且在許多區(qū)域相同。本文使用的"變異體"是指在序列上分別不同于治療性蛋白(例如，參見(jiàn)表4的"治療性蛋白X"欄)，白蛋白，和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白，但是保留本文它處所述或者本領(lǐng)域已知的其至少一種功能和/或治療特性(例如，在表4"生物學(xué)活性"欄中公開(kāi)的治療活性和/或生物學(xué)活性)的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分，或白蛋白融合蛋白。一般來(lái)說(shuō)，變異體與相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白，相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白，和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列總體上非常相似，且在許多區(qū)域相同。本發(fā)明還包含編碼這些變異體的核酸。本發(fā)明還涉及包含一種氨基酸序列，或任選由其組成的蛋白質(zhì)，該氨基酸序列與例如，相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白(例如，在表4的參考文獻(xiàn)中公開(kāi)的氨基酸序列，或其片斷或變異體)，相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白(例如，表l，或其片斷或變異體)，和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列至少60%,80%，85%,90%，95%,96%,97%，98%,99%或100%相同。還提供了這些多肽的片斷(例如，本文公開(kāi)的那些片斷)。本發(fā)明包含的其它多肽是由這樣的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下(例如，在大約45攝氏度下在6X氯化鈉/種檬酸鈉(SSC)中與結(jié)合DNA的濾膜雜交，接著在0.2XSSC,0.1%SDS中在大約50-65才聶氏度下洗滌一次或多次)，在高度嚴(yán)格條件下(例如，在大約45攝氏度下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與結(jié)合DNA的濾膜雜交，接著在0.1XSSC,0.2%SDS中在大約68攝氏度下洗滌一次或多次)，或者在本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它嚴(yán)格雜交條件下(參見(jiàn)，仿H口，Ausubel，F(xiàn).M.等，編,1989Cwre"f尸rotoco/A/o/ecw/arB/o/ogV，Greenpublishingassociates,Inc.,andJohnWiley&SonsInc.，NewYork,第6.3.1-6.3.6和2.10.3頁(yè))與編碼本發(fā)明的氨基酸序列的核酸分子的互補(bǔ)序列雜交。本發(fā)明還包含編碼這些多肽的多核苷酸。具有與本發(fā)明的查詢(query)氨基酸序列至少例如，95%相同的氨基酸序列的多肽，是指除了所述多肽序列在每100個(gè)查詢氨基酸序列的氨基酸中包含多達(dá)5個(gè)氨基酸改變外，所述多肽的氨基酸序列與該查詢序列相同。換句話說(shuō)，為了獲得具有與查詢氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的多肽，可插入，缺失，或用另一氨基酸取代所述序列的多達(dá)5%的氨基酸殘基。對(duì)照序列的這些改變可在對(duì)照氨基酸序列的氨基-或羧基末端位置，或者在那些末端位置之間的任何位置發(fā)生，可單獨(dú)散布在對(duì)照序列的殘基中，或者在對(duì)照序列內(nèi)以一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組存在。實(shí)際上，任何具體多肽與例如，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白或其片斷(例如該白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分或該白蛋白融合蛋白的白蛋白部分)的氨基酸序列是否具有至少60%，80%,85%,90%,95%，96。/。，97%，98%或99%的相同性可使用已知的計(jì)算機(jī)程序按常規(guī)測(cè)定。該程序和使用它們的方法在例如，本文作為參考文獻(xiàn)引用的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO01/79480(第41-43頁(yè))中描述，且是本領(lǐng)域熟知的。本發(fā)明的多核苷酸變異體可在編碼區(qū)，非編碼區(qū)，或兩者中都含有改變。多核苷酸變異體包括那些含有這樣的改變的變異體，即該改變產(chǎn)生沉默取代，添加，或缺失，但不改變所編碼的多肽的特性或活性。由于遺傳密碼的筒并性可通過(guò)沉默取代產(chǎn)生該核苷酸變異體。多肽變異體包括小于50，小于40,小于30，小于20，小于IO，或5—50,5-25,5-10，1-5,或1-2個(gè)氨基酸以任意組合取代，缺失，或添加的那些變異體。多核苷酸變異體可因?yàn)楦鞣N原因而產(chǎn)生，例如，為了優(yōu)化特定宿主的密碼子表達(dá)(將人mRNA中的密碼子改變成諸如酵母或大腸桿菌的微生物宿主優(yōu)選的那些密碼子)。在另一實(shí)施方案中，可優(yōu)化編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸用于在酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。在還有另一實(shí)施方案中，可優(yōu)化編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的多核苷酸用于在酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。在還有另一實(shí)施方案中，可優(yōu)化編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸用于在酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分蛋白質(zhì)的野生型多核苷酸雜交。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的密碼子優(yōu)化的多核苷酸在本文所述的嚴(yán)格雜交條件下不與編碼該白蛋白的野生型多核苷酸雜交。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的密碼子優(yōu)化的多核苷酸在本文所述的嚴(yán)格雜交條件下不與編碼該治療性蛋白質(zhì)部分或該白蛋白部分的野生型多核苷酸雜交。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的多核苷酸不包含該治療性蛋白質(zhì)天然存在的序列，或者任選不由其組成。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸不包含該白蛋白天然存在的序列，或者任選不由其組成。在另一實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸不包含該治療性蛋白質(zhì)部分或該白蛋白部分的天然存在的序列，或者任選不由其組成。在另一實(shí)施方案中，該治療性蛋白質(zhì)可選自通過(guò)生物淘選(biopanning)的隨機(jī)肽文庫(kù)，因?yàn)檫@將沒(méi)有天然存在的野生型多核苷酸。天然存在的變異體稱為"等位基因變異體"，且是指占據(jù)生物染色體給定基因座的基因的一些可選擇的形式之一。(GenesII，Lewin,B.，編，JohnWiley&Sons,NewYork(1985))。這些等位基因變異體可在多核苦酸和/或多肽水平上改變且包含在本發(fā)明中。另外，通過(guò)誘變技術(shù)或通過(guò)直接合成也可產(chǎn)生非天然存在的變異體。使用蛋白質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)的已知方法，可產(chǎn)生變異體以改良或改變本發(fā)明多肽的特性。例如，可從本發(fā)明的多肽的N-末端或C-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸而基本上不喪失生物學(xué)功能。參見(jiàn)，例如，Ron等(J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(KGF變異體)和Dobeli等，J.Biotechnology7:199-216(1988)(干擾素y變異體)。另外，大量證據(jù)證實(shí)了變異體通常保留與天然存在的蛋白質(zhì)相似的生物學(xué)活性(例如Gayle及其同事(J.Biol.Chem.268:22105-22111(1993)(IL-la變異體))。另外，即使從多肽的N-末端或C-末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸導(dǎo)致修改或喪失了一種或多種生物學(xué)功能，但是仍然可保留其它的生物學(xué)活性。例如，當(dāng)從N-末端或C-末端去掉分泌形式的小于大多數(shù)的殘基時(shí)，很可能保留缺失變異體誘導(dǎo)和/或結(jié)合可識(shí)別該分泌形式的抗體的能力。缺失了蛋白質(zhì)的N-或C-末端殘基的具體多肽是否保留該免疫學(xué)活性可通過(guò)本文所述或者本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法很容易地測(cè)定。因此，本發(fā)明還包括具有功能活性(例如，生物學(xué)活性和/或治療活性)的多肽變異體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有功能活性(例如，諸如在表4"生物學(xué)活性"欄中公開(kāi)的生物學(xué)活性和/或治療活性)的白蛋白融合蛋白的變異體，該功能活性相應(yīng)于治療性蛋白質(zhì)的一種或多種生物學(xué)和/或治療活性，該治療性蛋白質(zhì)相應(yīng)于該白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分。該變異體包括根據(jù)本領(lǐng)域已知的一般規(guī)則選擇的缺失，插入，倒位，重復(fù)，和取代以便對(duì)活性具有很小影響。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的變異體具有保守取代。"保守取代"是指在組內(nèi)的交換，例如脂肪族或疏水氨基酸Ala,Val，Leu和Ile的取代；羥基殘基Ser和Thr的取代；酸性殘基Asp和Glu的取代；酰胺殘基Asn和Gin的取代，堿性殘基Lys，Arg，和His的取代；芳香殘基Phe,Tyr，和Trp的取代，小的氨基酸Ala，Ser,Thr，Met,和Gly的取代。關(guān)于如何制備表型沉默的氨基酸取代的指導(dǎo)在例如，Bowie等，"翻譯蛋白質(zhì)序列中的信息對(duì)氨基酸取代的耐受性"，Science247:1306-1310(1990)中提供，其中作者指出有兩個(gè)主要的策略可用于研究氨基酸序列對(duì)于改變的耐受性。按作者所述，蛋白質(zhì)具有驚人的氨基酸取代耐受性。作者還指出在該蛋白質(zhì)的某些氨基酸位置很可能允許進(jìn)行氨基酸改變。例如，大多數(shù)隱蔽(buried)(蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi))的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而一般很少有表面?zhèn)孺湹奶匦员Ｊ?。另外，有耐受性的保守氨基酸取代包含脂肪族或疏水氨基酸Ala,Val,Leu和Ile的取代；羥基殘基Ser和Thr的取代；酸性殘基Asp和Glu的取代；酰胺殘基Asn和Gln的取代，堿性殘基Lys,Arg,和His的取代；芳香殘基Phe，Tyr，和Trp的取代，小體積氨基酸Ala,Ser，Thr,Met,和Gly的取代。除了保守氨基酸取代外，本發(fā)明的變異體包括(i)含有一個(gè)或多個(gè)非保守氨基酸殘基的取代，其中取代的氨基酸殘基可以是或者不是遺傳密碼編碼的殘基，或(ii)含有一個(gè)或多個(gè)具有取代基團(tuán)的氨基酸殘基的取代的多肽，或(iii)與另一化合物，例如增加多肽穩(wěn)定性和/或可溶性的化合物(例如，聚乙二醇)融合或化學(xué)連接的多肽，(iv)含有添加氨基酸的多肽，例如，IgGFc融合區(qū)肽。根據(jù)本文的教導(dǎo)該變異體多肽認(rèn)為在本領(lǐng)域的一支術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。例如，含有用其它帶電或中性氨基酸取代帶電氨基酸的氨基酸取代的多肽變異體可產(chǎn)生具有改進(jìn)特性，例如更少聚集的蛋白質(zhì)。由于聚集體的免疫原性活性，藥用配制品的聚集同時(shí)降低了活性且增加了清除率。參見(jiàn)Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967);Robbins等，Diabetes,36:838-845(1987);Cldand等，Crit.Rev.TherapeuticDrugCarrierSystems10:307-377(1993)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含本文所述的治療性蛋白質(zhì)和/或人血清白蛋白，和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列的片斷或變異體，或任選由其組成，其中該片斷或變異體與對(duì)照氨基酸序列相比具有1-5,5-10，5-25,5-50,10-50或50-150個(gè)氨基酸殘基的添加，取代，和/或缺失。在某些實(shí)施方案中，該氨基酸取代是保守的。本發(fā)明還包含編碼這些多肽的核酸。本發(fā)明的多肽可由通過(guò)肽4定或修飾的肽4建，即肽等配物(peptideisosteres)互相連接的氨基酸組成，且可含有20個(gè)基因編碼的氨基酸以外的氨基酸。該多肽可通過(guò)天然加工，例如翻譯后加工，或者通過(guò)本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行修飾。該修飾在基礎(chǔ)課文和在更詳細(xì)的專著，以及在多巻的研究作品中進(jìn)行了充分的描述。修飾可在包括肽主鏈，氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端的多肽的任何位置發(fā)生?？深A(yù)料到在給定多肽的一些位點(diǎn)可存在相同或各種程度的相同類型的修飾。另外，給定多肽可含有許多類型的修飾。多肽可以是分支的，例如，由于遍在蛋白化作用，且它們可以是環(huán)狀的，含有或不含分支。環(huán)狀，分支，和分支環(huán)狀的多肽可由翻譯后的天然加工產(chǎn)生或者可通過(guò)合成方法制備。修飾包括乙?；；珹DP-核糖基化，酰胺化，黃素的共價(jià)連接，血紅素半分子的共價(jià)連接，核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接，脂類或脂類衍生物的共價(jià)連接，磷脂酰肌醇的共價(jià)連接，交聯(lián)，環(huán)化，二硫鍵形成，脫曱基化，形成共價(jià)交聯(lián)，形成半胱氨酸，形成焦谷氨酸，曱?；?，Y-羧基化，糖基化，GPI錨形成，羥基化，碘化，甲基化，十四烷基化，氧化，PEG化，蛋白水解加工，磷酸化，異戊二烯化，外消旋，硒化，硫酸化，轉(zhuǎn)移-RNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸添加，例如精胺?；捅樵诘鞍谆?。另外，可將化學(xué)實(shí)體共價(jià)連接到白蛋白融合蛋白上以增強(qiáng)或調(diào)節(jié)特定功能或生物學(xué)活性，例如，通過(guò)在CurrentOpinionsinBiotechnology,10:324(1999)中公開(kāi)的方法。另外，可將靶向?qū)嶓w共價(jià)連接到本發(fā)明的白蛋白融合蛋白上以便將特定功能或生物學(xué)活性靶向某些細(xì)胞或階段特異性類型，組織類型或解剖結(jié)構(gòu)。針對(duì)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白，可定位該試劑的作用。另外，該靶向可降低所需的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的劑量，因?yàn)橥ㄟ^(guò)在所需位點(diǎn)積聚本發(fā)明的白蛋白融合蛋白，可達(dá)到更高的局部濃度。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可通過(guò)使用交聯(lián)劑以及通過(guò)在配體是蛋白質(zhì)時(shí)將編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白，或其功能性部分的核苷酸序列克隆到與配體核苷酸序列相鄰，并作為融合蛋白表達(dá)該連接物的重組DNA技術(shù)與靶向部分連接。本發(fā)明包含的另一翻譯后修飾包括，例如，N-連接的或O-連接的糖鏈，N-末端或C-末端的加工，將化學(xué)半分子連接到氨基酸主鏈上，化學(xué)修飾N-連接或O-連接的糖鏈，和由于原核宿主細(xì)胞表達(dá)而添加或缺失N-末端曱硫氨酸殘基。該白蛋白融合蛋白還可用4企測(cè)標(biāo)記，例如酶，熒光，同位素或親和性標(biāo)記^"飾以允許4企測(cè)和分離該蛋白質(zhì)。該《務(wù)飾的例子在例如，本文作為參考文獻(xiàn)引用的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO01/79480(第105-106頁(yè))中提供，且是本領(lǐng)域熟知的。功能活性"具有功能活性的多肽"是指能夠表現(xiàn)出與治療性蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)，前體蛋白，和/或成熟形式相關(guān)的一種或多種已知功能活性的多肽。該功能活性包括，但不限于，生物學(xué)活性，酶抑制，抗原性[與抗多肽的抗體結(jié)合或與多肽竟?fàn)幗Y(jié)合的能力]，免疫原性(產(chǎn)生與本發(fā)明的特定多肽結(jié)合的抗體的能力)，與本發(fā)明的多肽形成多聚體的能力，和與多肽的受體或配體結(jié)合的能力。"具有生物學(xué)活性的多肽"是指在有或無(wú)劑量依賴性的具體生物學(xué)試驗(yàn)中測(cè)量時(shí)表現(xiàn)出與包括成熟形式的本發(fā)明的治療性蛋白的活性相似，但不必相同的活性的多肽。如果存在劑量依賴性，與本發(fā)明的多肽相比在給定活性下的劑量依賴性與該肽不必相同，而是基本上相似。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白具有與未融合到白蛋白上的治療性蛋白(或其片斷或變異體)相關(guān)的至少一種生物學(xué)和/或治療活性?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的或按常規(guī)改良的測(cè)定法，以及本文所述的測(cè)定法來(lái)測(cè)定本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物學(xué)活性)。具體地說(shuō)，可使用表4"相關(guān)出版物"欄引用的測(cè)定法測(cè)定白蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物學(xué)活性或治療活性)。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用在其表4相應(yīng)行中引用的測(cè)定法按常規(guī)測(cè)定相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分的治療性蛋白質(zhì)的片斷的活性。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用本領(lǐng)域已知的和/或下面實(shí)施例部分所述的測(cè)定法按常規(guī)測(cè)定相應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的白蛋白的片斷的活性。另外，本文所述的(見(jiàn)實(shí)施例和表4)或者本領(lǐng)域已知的測(cè)定法可按常規(guī)用于測(cè)量本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和其片斷，變異體和衍生物誘發(fā)與本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白部分和/或白蛋白部分相關(guān)的生物學(xué)活性和/或治療活性(體外或體內(nèi))的能力。其它方法將是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。融合蛋白的表達(dá)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可作為重組分子從酵母，諸如細(xì)菌的微生物，或人或動(dòng)物細(xì)胞系中分泌產(chǎn)生。任選的是，該多肽可從宿主細(xì)胞中分泌。為了表達(dá)本文舉例的白蛋白融合蛋白，與酵母啟動(dòng)子，WO90/01063中舉例的HAS/MFa-7融合蛋白前導(dǎo)序列，酵母爿Z)///終止子，丄^72選擇標(biāo)記和美國(guó)專利號(hào)5,637,504中舉例的去整合(disintegration)載體pSAC35聯(lián)合，成功使用了WO95/33833中舉例的i/5P/50基因分裂的酵母菌抹，或WO00/44772[rHA加工]中舉例的PM77基因分裂的酵母菌抹(用于減少/消除白蛋白融合蛋白的O-連接的糖基化)，或WO95/23857中舉例的E4"基因分裂的酵母菌林。預(yù)期可用于本發(fā)明的其它酵母菌株，啟動(dòng)子，前導(dǎo)序列，終止子，標(biāo)記和載體在本文作為參考文獻(xiàn)引用的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和在WO01/74980(第94-99頁(yè))中描述，且是本領(lǐng)域熟知的。本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)化后表達(dá)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的細(xì)胞，任選酵母細(xì)胞。除了轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞本身外，本發(fā)明還涉及在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的這些細(xì)胞的培養(yǎng)物，任選單克隆(克隆同源的)培養(yǎng)物，或從單克隆培養(yǎng)物產(chǎn)生的培養(yǎng)物。如果該多肽是分泌型的，那么該培養(yǎng)基可含有該多肽，含有該細(xì)胞，或者如果它們被過(guò)濾或離心掉的話不含該細(xì)胞。許多表達(dá)系統(tǒng)是已知的且可以使用，包括細(xì)菌(例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)，酵母(例如啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)，乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)和巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris))，絲狀真菌(例如曲霉屬)，植物細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)月包和昆蟲(chóng)細(xì)月包。目的蛋白可按常規(guī)方法生產(chǎn)，例如從插入宿主染色體或者在游離質(zhì)粒中的編碼序列產(chǎn)生?？捎媚康牡鞍拙幋a序列以任何常規(guī)方法，例如電穿孔五"2^wo/.194,182中公開(kāi)。成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的細(xì)胞可通過(guò)熟知技術(shù)來(lái)鑒定。例如，可生長(zhǎng)導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建體所得的細(xì)胞以產(chǎn)生目的多肽。使用諸如Southern(1975)JMo/.98,503或Berent等(1985)腸tec/z.3，208所述的方法收獲細(xì)胞并裂解，檢查其DNA成份中是否存在該DNA。作為選擇，可使用抗體檢測(cè)上清中是否存在該蛋白質(zhì)。有用的酵母質(zhì)粒載體包括pRS403-406和pRS413-416且一般可從StratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037,USA獲得。質(zhì)粒pRS403,pRS404，pRS405和pRS406是酵母整合質(zhì)粒(YIps)且插入了酵母選擇標(biāo)記ifZS3，77eP7，丄5^/2和W^3。質(zhì)粒pRS413-416是酵母著絲粒質(zhì)粒(YCps)。用于在酵母中表達(dá)的制備白蛋白融合蛋白的載體包括pPPC0005,pScCHSA,pScNHSA,和pC4:HSA,它們于2001年4月11日在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209保藏且在本文作為參考文獻(xiàn)引用的臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO01/79480中描述。預(yù)期用于在酵母中表達(dá)白蛋白融合蛋白的另一載體是pSAC35載體，它在Sleep等，BioTechnology8:42(19卯)中描述，本文以其整體引用以供參考。質(zhì)粒pSAC35屬于US5,637,504中所述的去整合類載體。接。例如，可將互補(bǔ)同聚物片斷到需要插入載體DNA中的DNA片斷上。然后該載體和DNA片斷通過(guò)互補(bǔ)同聚物尾之間的氫4定連接形成重組DNA分子。含有一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)的合成接頭提供了連接該DNA片斷與載體的另一方法。通過(guò)核酸內(nèi)切酶的限制性消化產(chǎn)生的DNA片斷用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理，該酶用其3'5，-核酸外切活性去掉伸出的，Y-單鏈末端，并用其聚合活性補(bǔ)上3'-凹(recessed)端。因此這些活性的聯(lián)合產(chǎn)生平端DNA片斷。然后將該平端片斷與摩爾數(shù)大量過(guò)剩的接頭分子在諸如噬菌體T4DNA連接酶的能夠催化平端DNA分子連接的酶存在的條件下溫育。因此，該反應(yīng)產(chǎn)物是在其末端攜帶多聚體接頭序列的DNA片斷。然后用合適的限制性酶裂解這些DNA片斷并與已經(jīng)用能產(chǎn)生與該DNA片斷匹配的末端的酶裂解的表達(dá)載體連接。含有各種限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的合成接頭可從許多商業(yè)來(lái)源以商品獲得。例如，如果制備HA變異體，修飾根據(jù)本發(fā)明的DNA的所需方法是使用Saiki等(1988)Sc/e"ce239,487-491公開(kāi)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在該方法中，需要酶促擴(kuò)增的DNA側(cè)翼是兩個(gè)特異性寡核苷酸引物，該引物本身?yè)饺霐U(kuò)增的DNA中。該特異性引物可含有限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，它可用于使用本領(lǐng)域已知的方法克隆進(jìn)表達(dá)載體中。預(yù)期用于實(shí)施本發(fā)明的作為表達(dá)該白蛋白融合蛋白的宿主的酵母舉例性的屬有畢赤氏酵母屬(Pichia)(以前分類為漢遜氏酵母屬(Hansenula)),糖酵母屬(Saccharomyces)，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)，曲霉屬(Aspergillus),假絲酵母屬(Candida),球擬酵母屬(Torulopsis),有孢圓酵母屬(Tomlaspora)，裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)，固嚢酵母屬(Citeromyces)，尸ac/yw/e"，4矣合并唐酵母屬(Zygosaccharomyces),德、巴利氏酵母屬(Debaromyces)，木霧屬(Trichoderma),頭孑包屬(Cephalosporium)，腐質(zhì)霉屬(H謹(jǐn)icola),白霉屬(Mwco。，鏈孢霉屬(Neurospora)，K2/rcwz'a，梅奇酵母屬(Metschunikowia),纟工冬孑包屬(Rhodosporidium)，丄ewco5/on'd/"w，J5o^yooycz^，鎖扭卩酵母屬(Sporidiobolus),擬內(nèi)孑包霉屬(Endomycopsis)，等。屬包括選自由糖酵母屬，裂殖糖酵母屬，克魯維氏酵母屬，畢赤氏酵母屬和有孢圓酵母屬組成的組中的那些屬。糖酵母屬種的例子有啤酒糖酵母，意大利糖酵母(S.italicus)和魯氏糖酵母(S.rouxii)。其它種的例子，和轉(zhuǎn)化它們的方法在本文作為參考文獻(xiàn)引用的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO01/79480(第97-98頁(yè))中描述。轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母的方法在EP251744，EP258067和WO90/01063中有一般性教導(dǎo)，它們都在本文中作為參考文獻(xiàn)引用。用于啤酒糖酵母的合適的啟動(dòng)子包括與PGW基因，04"或04Z^0基因，CTC/,尸i7(95,7TP/，爿￡>///,甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，丙糖磷酸異構(gòu)酶，磷酸葡糖異構(gòu)酶，葡萄糖激酶，a-交配因子信息素，[一種交配因子信息素]的基因相關(guān)的那些啟動(dòng)子，戶朋/啟動(dòng)子，GLT2啟動(dòng)子，GPD/啟動(dòng)子，和包含部分5，調(diào)控區(qū)與其它啟動(dòng)子的部分5，調(diào)控區(qū)或與上游活化位點(diǎn)的雜合體的雜合啟動(dòng)子(例如，EP-A-258067的啟動(dòng)子)。用于粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)的方l更可調(diào)啟動(dòng)子有Maundrell(1990>/歷o/.C7zem.265,10857-10864所述的來(lái)自nmt基因的硫胺素抑制型啟動(dòng)子和Hoffman&Winston(1990)Ge""z'"124,807-816所述的葡萄糖抑制型jbpl基因啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母屬用于表達(dá)外源性基因的方法在例如，Cregg等(1993)和許多Phillips專利(例如，US4857467，本文作為參考文獻(xiàn)引用)中教導(dǎo)，且畢赤氏酵母屬表達(dá)試劑盒可從InvitrogenBV，Leek，Netherlands,和InvitrogenCorp.,SanDiego,California以商品形式買(mǎi)到。合適的啟動(dòng)子包括AOXI和AOX2。Gleeson等(1986)J.Gen.Microbiol,132,3459-3465包含關(guān)于漢遜氏酵母屬載體和轉(zhuǎn)化的信息，合適的啟動(dòng)子是MOXl和FMD1;同時(shí)EP361991，F(xiàn)leer等(1991)和來(lái)自Rhone-PoulencRorer的其它出版物教導(dǎo)了如何在克魯維氏酵母屬種中表達(dá)外源性蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)可以是含有合適的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺香化信號(hào)的真核基因的3，側(cè)翼序列。合適的3'側(cè)翼序列可以是例如，該基因天然連接的所用表達(dá)調(diào)控序列的那些序列，即與啟動(dòng)子相應(yīng)。另外，它們也可以不同，其中任選使用啤酒糖酵母^D/f/基因的終止信號(hào)。所需白蛋白融合蛋白開(kāi)始可用分泌前導(dǎo)序列表達(dá)，該前導(dǎo)序列可以是在選定酵母中有效的任何前導(dǎo)序列。在啤酒糖酵母中有用的前導(dǎo)序列包括來(lái)自交配因子a多肽(MFoc-l)的前導(dǎo)序列和EP-A-387319的雜合前導(dǎo)序列。該前導(dǎo)序列(或信號(hào))可在成熟白蛋白釋放進(jìn)周?chē)囵B(yǎng)基前被酵母裂解。另外，該前導(dǎo)序列包括在JP62-096086(授權(quán)號(hào)為911036516)中公開(kāi)的啤酒糖酵母轉(zhuǎn)化酶0St/C2),酸性磷酸酶(PH05)，MFa-l的前序列，0葡聚糖酶(BGL2)和殺傷毒素；糖化糖酵母(S.diastaticus)葡糖淀粉酶II;卡爾斯伯糖酵母(S.Carlsbergensis)a-半乳糖苷酶(MEL1);乳克魯維氏酵母(K.lactis)殺傷毒素；和假絲酵母屬(Candida)葡糖淀粉酶的那些前導(dǎo)序列。,jg和合^^:產(chǎn)冷蛋冷廚合蛋4的^它才法本發(fā)明包括編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸，以及含有這些多核苷酸的載體，宿主細(xì)胞和生物體。本發(fā)明還包括通過(guò)合成和重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的方法。該多核苷酸，載體，宿主細(xì)胞，和生物體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法分離和純化。用于本發(fā)明的載體可以是，例如，噬菌體，質(zhì)粒，粘粒，微型染色體，病毒或逆轉(zhuǎn)錄載體?？捎糜诳寺『?或表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的載體是在需要復(fù)制和/或表達(dá)該多核苷酸的宿主細(xì)胞中能夠復(fù)制和/或表達(dá)該多核苷酸的載體。一般來(lái)說(shuō)，多核苦酸和/或載體可用于真核或者原核的任何細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，人(例如，HeLa),猴(例如，Cos),兔(例如，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞)，大鼠，倉(cāng)鼠(例如，CHO,NSO和幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)或小鼠細(xì)胞(例如，L細(xì)胞)，植物細(xì)胞，酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞(例如，大腸桿菌)。參見(jiàn)，例如，RAusubel等,Cwrew/7Votoco/s/"Mo/ecw/arA'o/ogy，GreenePublishingAssociatesandWiley-Interscience(1992)和Sambrook等(1989)中用于各種類型的宿主細(xì)胞的合適載體的例子。然而，應(yīng)注意當(dāng)使用復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，病毒增殖一般僅在互補(bǔ)型宿主細(xì)胞中發(fā)生?？墒褂煤羞@些多核苷酸的宿主細(xì)胞大量表達(dá)該蛋白質(zhì)用于例如，藥品，診斷試劑，疫苗和治療劑。該蛋白質(zhì)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的或者本文描述的方法進(jìn)行分離和純化。編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可與含有選擇標(biāo)記的載體連接用于在宿主中增殖。一般來(lái)說(shuō)，可將質(zhì)粒載體導(dǎo)入諸如磷酸鈣沉淀的沉淀物或者含有帶電脂類的復(fù)合物中。如果該載體是病毒，可使用合適的包裝細(xì)胞系體外包裝，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。該多核苷酸插入片斷應(yīng)與表達(dá)該多核苷酸的宿主細(xì)胞相容的合適啟動(dòng)子可操作地連接。該啟動(dòng)子可以是強(qiáng)啟動(dòng)子和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括噬菌體XPL啟動(dòng)子，大腸桿菌/ac，化p，p/2o^和toc啟動(dòng)子，SV40早期和晚期啟動(dòng)子和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs啟動(dòng)子，僅列舉幾個(gè)例子。其它合適的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。該表達(dá)構(gòu)建體還含有轉(zhuǎn)錄起始，終止位點(diǎn)，和在轉(zhuǎn)錄區(qū)用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。該構(gòu)建體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子的編碼部分可包含在開(kāi)始處的翻譯起始密碼子和在需要翻譯的多肽末端合適位置的終止密碼子(TAA，TGA或TAG)。正如所述，該表達(dá)載體可包含至少一個(gè)選擇標(biāo)記。該標(biāo)記包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氬葉酸還原酶，G418，谷氨酰胺合酶，或新霉素抗性，和用于培養(yǎng)大腸桿菌和其它細(xì)菌的四環(huán)素，卡那霉素，或氨芐青霉素抗性基因。合適宿主的代表性例子包括，但不限于，諸如大腸桿菌，鏈霉菌(Streptomyces)屬和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella)細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞；諸如酵母細(xì)胞(例如，啤酒糖酵母或巴斯德畢赤氏酵母(ATCC保藏號(hào)201178))的真菌細(xì)胞；諸如果蠅S2和SpodopteraSf9細(xì)胞的昆蟲(chóng)細(xì)胞；諸如CHO,COS，NSO,293,和Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞；和植物細(xì)胞。用于上述宿主細(xì)胞的合適培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可與指導(dǎo)本發(fā)明的蛋白質(zhì)定位到原核或真核細(xì)胞特定區(qū)室和/或指導(dǎo)從原核或真核細(xì)胞分泌本發(fā)明蛋白質(zhì)的信號(hào)序列融合。例如，在大腸桿菌中，人們可能希望指導(dǎo)該蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)壁膜間隙?？扇诤媳景l(fā)明的白蛋白融合蛋白以指導(dǎo)該多肽表達(dá)進(jìn)細(xì)菌壁膜間隙的信號(hào)序列或蛋白質(zhì)(或其片斷)的例子包括，但不限于，pe/j5信號(hào)序列，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)信號(hào)序列，MBP,owpj信號(hào)序列，周質(zhì)大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素B-亞基的信號(hào)序列，堿性磷酸酶信號(hào)序列。用于構(gòu)建融合蛋白指導(dǎo)蛋白質(zhì)定位的一些載體是商業(yè)上可獲得的，例如可從NewEnglandBiolabs獲得的pMAL系列載體(特別是pMAL-p系列)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸可與WW果膠酸裂合酶信號(hào)序列融合以提高該多肽在革蘭氏陰性細(xì)菌中的表達(dá)和純化效率。參見(jiàn)，美國(guó)專利號(hào)5,576,195和5,846,818，本文以其整體引用其內(nèi)容以供參考。可與本發(fā)明的白蛋白融合蛋白融合以介導(dǎo)其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌的信號(hào)肽的例子包括，但不限于，MPIF-1信號(hào)序列(例如，GenBank登錄號(hào)AAB51134的氨基酸l畫(huà)21)，stanniocalcin信號(hào)序歹'J(MLQNSAVLLLLVISASA,SEQIDNO:一_);和共有信號(hào)序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG,SEQIDNO:—)?？捎糜谂c桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合的合適的信號(hào)序列是gp67信號(hào)序列(例如，GenBank登錄號(hào)AAA72759的氨基酸1-19)。使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作為選擇標(biāo)記的載體分別可在藥物曱硫氨酸sulphoximine或氨曱蝶呤存在的條件下擴(kuò)增?；诠劝滨０泛厦傅妮d體的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可利用谷氨酰胺合酶陰性的細(xì)胞系(例如，鼠骨髓瘤細(xì)胞系，NSO)。谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)也可通過(guò)提供另一抑制劑防止內(nèi)源性基因的作用而在表達(dá)谷氨酰胺合酶的細(xì)胞(例如，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞)中起作用。谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)及其元件在PCT公開(kāi)號(hào)WO87/04462;WO86/05807;WO89/01036;WO89/10404;和WO91/06657中詳細(xì)描述，本文以其整體引用以供參考。另外，谷氨酰胺合酶表達(dá)載體也可從LonzaBiologies,Inc.(Portsmouth,NH)獲得。使用GS表達(dá)系統(tǒng)在鼠骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)和生產(chǎn)單克隆抗體在Bebbington等，Ao々ec/z"o/ogv10:169(1992)和在Biblia和Robinson所o&c/z"o/.11:1(1995)中描述，本文引用以供參考。本發(fā)明還涉及含有諸如在本文中所述的載體構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，且還涉及含有使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)與一個(gè)或多個(gè)異源性調(diào)控區(qū)(例如，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)可操作地相連的本發(fā)明的核苷酸序列的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，來(lái)源于人的細(xì)胞)，或低等真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞，或者該宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞?？蛇x擇能夠控制插入的基因序列表達(dá)，或以所需的特定方式修飾和加工該基因產(chǎn)物的宿主菌抹。在某些誘導(dǎo)劑存在時(shí)可提高從某些啟動(dòng)子的表達(dá)；因此可控制該遺傳工程多肽的表達(dá)。另外，不同宿主細(xì)胞具有特征性和特異性的蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后加工和修飾(例如，磷酸化，裂解)的機(jī)制?？蛇x擇合適的細(xì)胞系以確保表達(dá)的外源性蛋白質(zhì)的所需修飾和加工。通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，陽(yáng)離子脂類介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，感染，或其它方法可實(shí)現(xiàn)將本發(fā)明的核酸和核酸構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。該方法在許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，例如Davis等，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)中描述。特別可預(yù)期的是本發(fā)明的多肽事實(shí)上可通過(guò)不含重組載體的宿主細(xì)胞表達(dá)。除了涉及含有本文討論的載體構(gòu)建體的宿主細(xì)胞外，本發(fā)明還涉及改造為缺失或取代內(nèi)源性遺傳物質(zhì)(例如，用相應(yīng)于治療性蛋白的白蛋白融合蛋白取代相應(yīng)于治療性蛋白的編碼序列)，和/或包含遺傳物質(zhì)(例如，可包含異源性多核苦酸序列，例如相應(yīng)于治療性蛋白的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白)的脊推動(dòng)物來(lái)源，特別是哺乳動(dòng)物來(lái)源的原代，傳代，和永生化宿主細(xì)胞。與內(nèi)源性多核苷酸可操作地相連的遺傳物質(zhì)可活化，改變，和/或擴(kuò)增內(nèi)源性多核苷酸。另外，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)通過(guò)同源重組可操作地連接異源性多核芬酸(例如，編碼白蛋白融合蛋白，或其片斷或變異體的多核苷酸)和/或異源性調(diào)控區(qū)(例如，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)與編碼治療性蛋白的內(nèi)源性多核苷酸序列(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,641,670，1997年6月24日公開(kāi)；國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO96/29411;國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO94/12650;Koller等，Ato/.爿o^.S"L/iSJ86:8932-8935(1989);和Zijlstra等，Atowre342:435-438(1989),各文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容以其整體引用以供參考)。有利的是，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可通過(guò)包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽(yáng)離子交換色譜法，磷酸纖維素色譜法，疏水相互作用色譜法，親和色譜法，羥基磷灰石色譜法，疏水電荷相互作用色譜法，和凝集素色譜法的熟知方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化。在一些實(shí)施方案中，可使用高效液相色鐠法("HPLC")純化。在某些情況下，治療性蛋白質(zhì)具有低可溶性或者僅在低或高pH下或者僅在高或低鹽條件下可溶。治療性蛋白與HAS的融合很可能提高該治療性蛋白質(zhì)的可溶性特征。在一些實(shí)施方案中，使用一種或多種上述色譜法純化本發(fā)明的白蛋白融合蛋白。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白使用一種或多種下列色譜柱純化Q瓊脂糖FF柱，SP瓊脂糖FF柱，Q瓊脂糖高效柱，藍(lán)色瓊脂糖FF柱，藍(lán)色柱，苯基瓊脂糖FF柱，DEAE瓊脂糖FF,或曱基柱。另外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可使用在國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO00/44772中所述的方法純化，本文以其整體引用以供參考。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地改良其中所述的方法用于純化本發(fā)明的白蛋白融合蛋白。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可從包括例如，細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲(chóng)，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原核或真核宿主通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的產(chǎn)物中回收。依賴于重組生產(chǎn)方法采用的宿主，本發(fā)明的多肽可被糖基化或者非糖基化。另外，在某些情況下由于宿主介導(dǎo)的加工，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白也可包含起始修飾的曱硫氨酸殘基。因此，本領(lǐng)域熟知在所有真核細(xì)胞中任何蛋白質(zhì)在翻譯后一般高效切除翻譯起始密碼子編碼的N-末端甲硫氨酸。盡管在大多數(shù)原核生物中也有效切除大多數(shù)蛋白質(zhì)上的N-端曱硫氨酸，但是對(duì)于某些蛋白質(zhì)，依賴于與N-末端曱硫氨酸共價(jià)連接的氨基酸的特性，該原核切除加工失效。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和結(jié)合治療性蛋白或其片斷或變異體的抗體可與諸如肽的標(biāo)記序列融合以有利于純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，該標(biāo)記的氨基酸序列是六組氨酸肽，例如在pQE載體(QIAGEN，Inc.，9259EtonAvenue,Chatsworth,CA,91311)中提供的標(biāo)記，以及其它標(biāo)記，其中許多是商業(yè)上可獲得的。按Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)所述，例如，六組氨酸給融合蛋白提供了方便的純化方法。用于純化的其它肽標(biāo)記包括，但不限于，"HA"標(biāo)記，它相應(yīng)于來(lái)自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell37:767(1984))和"FLAG"標(biāo)記。另外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可與諸如細(xì)胞毒素的治療性半分子，例如細(xì)胞抑制劑或殺細(xì)胞劑，治療劑或放射性金屬離子，例如a-放射體，例如213Bi相連接。該試劑的例子在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和在WO01/79480(第107頁(yè))中提供，本文引用以供參考。白蛋白融合蛋白也可附著到固相支持物上，該固相支持物具體用于肽的免疫測(cè)定和純化，與本發(fā)明的白蛋白融合蛋白結(jié)合或相連。該固相支持物包括，但不限于，玻璃，纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的化學(xué)修飾衍生物，它可提供進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)，例如多肽的可溶性，穩(wěn)定性和循環(huán)時(shí)間增加，或免疫原性降低(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,179,337)。WO01〃9480(第109-111頁(yè))中提供了涉及使用聚乙二醇的實(shí)施例，本文引用以供參考。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的存在和數(shù)量可使用ELISA,即本領(lǐng)域已知的熟知免疫測(cè)定法來(lái)測(cè)定。多肽的使用本文鑒定的各多肽可用于許多方法。下面的描述應(yīng)認(rèn)為是舉例性的且利用了已知的技術(shù)。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可用于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類的各種紊亂(disorder)的治療，預(yù)防和/或預(yù)后。該紊亂包括，但不限于，本文在表4標(biāo)題為"生物學(xué)活性，，下描述的那些紊亂。例如，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可用作絲氨酸蛋白酶，纖溶酶，人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和/或激肽釋放酶的抑制劑。白蛋白融合蛋白也可用于測(cè)定生物學(xué)樣品中的多肽水平。例如，放射標(biāo)記的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可用于體內(nèi)的多肽成像。測(cè)定法的例子在例如，本文作為參考文獻(xiàn)引用的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO0179480(第112-122頁(yè))中提供且是本領(lǐng)域熟知的。用于體內(nèi)蛋白質(zhì)成像的標(biāo)記包括，但不限于通過(guò)X-射線照相術(shù)，核磁共振(NMR),電子自旋馳豫(relaxation)(ESR),正電子發(fā)射斷層照像(PET),或計(jì)算機(jī)X-射線斷層術(shù)(CT)可檢測(cè)的那些標(biāo)記。對(duì)于X-射線照相術(shù)，合適的標(biāo)記包括諸如鋇或銫的放射性同位素，它們發(fā)射可檢測(cè)的射線但對(duì)受試者無(wú)明顯傷害。用于NMR和ESR的合適標(biāo)記包括具有可檢測(cè)的特征性自旋的那些標(biāo)記，例如氘，通過(guò)標(biāo)記給表達(dá)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的細(xì)胞系提供的營(yíng)養(yǎng)成分可將它摻入白蛋白融合蛋白的。通過(guò)將用合適的可檢測(cè)成像半分子，例如放射性同位素(例如，131I，112In，99mTc，(131I，125I，123I,121I),碳("C)，硫("S)，氚(3印，銦(115，11,113mIn，112In，mIn),和锝("Tc,99mTc)，鉈(加Ti)，鎵(、，67Ga),釔(，d),鉬("Mo)，氙('"Xe),氟("F,153Sm,177Lu,159Gd,149Pm，140La，175Yb，166Ho,90Y,47Sc，186Re,188Re,142Pr,1()5Rh,97Ru)，不透射線物質(zhì)，或核磁共振可檢測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記的白蛋白融合蛋白導(dǎo)入(例如，腸胃外，皮下或腹膜內(nèi))哺乳動(dòng)物中用于檢查免疫系統(tǒng)疾病。本領(lǐng)域應(yīng)明白受試者的大小和所用的成像系統(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷圖像所需的成像半分子的量。對(duì)于人受試者所用的放射性同位素半分子，注射的放射性量一般范圍是從大約5至20毫居里(millicuries)的99mTc。然后標(biāo)記的白蛋白融合蛋白在存在一種或多種受體，配體或底物(相應(yīng)于用于制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)的受體，配體或底物)的體內(nèi)位置(例如，器官，細(xì)胞，細(xì)胞外空間或基質(zhì))優(yōu)先積累。作為選擇，如果白蛋白融合蛋白包含治療性抗體的至少一個(gè)片斷或變異體，那么標(biāo)記的白蛋白融合蛋白可在存在相應(yīng)于治療性抗體(用于制備本發(fā)明的融合蛋白)結(jié)合的那些多肽/表位的體內(nèi)位置(例如，器官，細(xì)胞，細(xì)胞外空間或基質(zhì))優(yōu)先積累。體內(nèi)腫瘤成像在S.W.Burchiel等，"放射性標(biāo)記的抗體及其片斷的免疫藥物動(dòng)力學(xué)，，(見(jiàn)r"附or7wag/"g:TTzei^d/oc/ze/w'ca/o/Ca"cer第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes編，MassonPublishingInc.(1982))中描述。其中所述的方法可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地進(jìn)行改良用于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白也可用于產(chǎn)生抗體，該抗體又可用于測(cè)量治療性蛋白，白蛋白，和/或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白在重組細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)，作為評(píng)估宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一個(gè)方法，或者用于測(cè)量在生物學(xué)樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)。另外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可用于檢測(cè)本文所述的生物學(xué)活性。轉(zhuǎn)基因生物本發(fā)明還包括表達(dá)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的轉(zhuǎn)基因生物。轉(zhuǎn)基因生物是將重組，外源性或克隆的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)其中的遺傳修飾的生物。該遺傳物質(zhì)通常稱為轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因的核酸序列可包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列和對(duì)于所編碼的蛋白質(zhì)最佳表達(dá)和分泌所必需的其它核酸序列，例如內(nèi)含子。該轉(zhuǎn)基因可設(shè)計(jì)成指導(dǎo)所編碼的蛋白質(zhì)以有利于其從生物或者從該生物產(chǎn)生的產(chǎn)物，例如，從該生物的奶，血液，尿，卵，毛發(fā)或種子中回收的方式表達(dá)。該轉(zhuǎn)基因可由與靶動(dòng)物種相同物種或者不同物種的基因組產(chǎn)生的核酸序列組成。該轉(zhuǎn)基因可在正常情況下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該具體核酸序列的基因組位置或者在該轉(zhuǎn)基因的正常位置整合。術(shù)語(yǔ)"生殖細(xì)胞系轉(zhuǎn)基因生物"是指將遺傳改變或遺傳信息導(dǎo)入種系細(xì)胞，從而賦予該轉(zhuǎn)基因生物能將該遺傳信息傳遞給后代的能力的轉(zhuǎn)基因生物。如果該后代事實(shí)上具有某些或者全部該改變或遺傳信息，那么它們也是轉(zhuǎn)基因生物。該改變或遺傳信息對(duì)于接受者所屬的生物物種可以是外源的，僅對(duì)特定的個(gè)體接受者是外源的，或者可以是該接受者已經(jīng)具有的遺傳信息。對(duì)于最后一種情況，改變的或?qū)氲幕蚩刹煌谔烊换蜻M(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)基因生物可以是轉(zhuǎn)基因人，動(dòng)物或植物。轉(zhuǎn)基因可通過(guò)包括轉(zhuǎn)染，電穿孔，顯微注射，胚胎干細(xì)胞中的基因靶向和重組病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的各種不同的方法產(chǎn)生(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)4,736,866;美國(guó)專利號(hào)5,602,307;Mullins等(1993)Hypertension22(4):630-633;Brenin等(1997)Surg.Oncol,6(2)99-110;Tuan(纟扁)，/ecomZ,W(3"GeweExpr&w/ow/Vofoco/s,MethodsinMolecularBiologyNo.62，HumanaPress(1997))。將核酸片斷導(dǎo)入重組受體哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法可通過(guò)支持多個(gè)核酸分子共轉(zhuǎn)化的任何方法進(jìn)行。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的詳細(xì)方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易獲得的，包括在美國(guó)專利號(hào)5,489,743和美國(guó)專利號(hào)5,602,307中公開(kāi)的內(nèi)容。另一信息在本文作為參考文獻(xiàn)引用的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO01/79480(第151-162頁(yè))中提供。編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的構(gòu)建體可用作基因治療方法的一部分用于傳遞治療上有效劑量的白蛋白融合蛋白。將核酸體內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞的一個(gè)方法是通過(guò)使用含有編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的核酸的病毒載體。用病毒載體感染細(xì)胞具有這樣的優(yōu)勢(shì)，即大部分靶細(xì)胞可接受該核酸。另外，病毒載體內(nèi)編碼的分子，例如通過(guò)病毒載體包含的cDNA，可在吸收病毒載體核酸的細(xì)胞中有效表達(dá)。所述白蛋白融合蛋白的血漿半衰期延長(zhǎng)甚至可基因治療補(bǔ)償可能的低水平表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺伴隨病毒載體可用作重組基因傳遞系統(tǒng)用于體內(nèi)轉(zhuǎn)移編碼白蛋白融合蛋白的外源性核酸分子。這些載體用于將核酸有效傳遞進(jìn)細(xì)胞，且轉(zhuǎn)移的核酸穩(wěn)定整合進(jìn)宿主的染色體DNA中。該載體，使用它們的方法，及其優(yōu)點(diǎn)，和非病毒傳遞方法的例子在本文作為參考文獻(xiàn)引用的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO01〃9480(第151-153頁(yè))中詳細(xì)描述。用于編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的基因的基因傳遞系統(tǒng)可通過(guò)許多方法中的任一種導(dǎo)入患者。例如，該基因傳遞系統(tǒng)的藥用制品可通過(guò)例如，靜脈內(nèi)注射全身性導(dǎo)入，且該蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)主要由基因傳遞載體，控制受體基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列引起的細(xì)胞型或組織型表達(dá)，或其結(jié)合提供的特異性轉(zhuǎn)染發(fā)生。在其它實(shí)施方案中，重組基因的起始傳遞更局限于完全定向地導(dǎo)入動(dòng)物。例如，該基因傳遞載體可通過(guò)插管(參見(jiàn)美國(guó)專利5，328，470)或通過(guò)立體定位注射(例如，Chen等(1994)PNAS91:3054-3057)導(dǎo)入?；蛑委煒?gòu)建體的藥用制品可基本上由在可接受的稀釋劑中的基因傳遞系統(tǒng)組成，或者可包含包埋該基因傳遞載體的緩釋基質(zhì)。如果該白蛋白融合蛋白從重組細(xì)胞，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體完整地生產(chǎn)，那么該藥用制品可包含產(chǎn)生該白蛋白融合蛋白的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。其它基因治療方法在本文作為參考文獻(xiàn)引用的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO01〃9480(第153-162頁(yè))中描述。藥用或治療組合物本發(fā)明的白蛋白融合蛋白或其配制品可通過(guò)包括腸胃外(例如，皮下或肌內(nèi))注射或靜脈內(nèi)輸注的任何常規(guī)方法給藥。該治療可由單次劑量或一段時(shí)間內(nèi)的多次劑量組成。另外，該單次或多次劑量比未融合白蛋白的治療性蛋白以更低的頻率給藥。盡管單獨(dú)施用本發(fā)明的白蛋白融合蛋白是可能的，但是與一種或多種可接受的載體一起作為藥用配制品存在是可取的。該載體在與該白蛋白融合蛋白具有相容性和對(duì)其接受者無(wú)害的意義上必須是"可接受的"。一^:來(lái)說(shuō)，該載體是無(wú)菌和無(wú)熱原的水或鹽水。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白特別非常適合于在諸如無(wú)菌無(wú)熱原水，鹽水或其它等滲溶液的含水載體中配制，因?yàn)樗鼈冊(cè)谌芤褐械膬?chǔ)存期延長(zhǎng)。例如，本發(fā)明的藥用組合物可預(yù)先以水溶液形式配制好，例如在配藥前幾周或幾月或更長(zhǎng)的時(shí)間期限前配制好。含有該白蛋白融合蛋白的配制品可考慮該白蛋白融合蛋白在含水配制品中的儲(chǔ)存期延長(zhǎng)后制備。如上所述，許多這類治療性蛋白質(zhì)的儲(chǔ)存期在與HA融合后顯著增加或延長(zhǎng)。如果氣溶膠給藥是合適的，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可使用標(biāo)準(zhǔn)方法配制成氣溶膠。術(shù)語(yǔ)"氣溶膠"包括能夠吸入細(xì)支氣管或鼻通道的任何氣體攜帶的懸浮相的本發(fā)明白蛋白融合蛋白。具體地說(shuō)，氣溶膠包括可在測(cè)定劑量的吸入器或噴化器，或在噴霧器中產(chǎn)生的氣體攜帶的懸浮相的本發(fā)明白蛋白融合蛋白小滴。氣溶膠還包括懸浮于空氣或其它載體氣體中的本發(fā)明化合物的干粉組合物，例如，它可通過(guò)從吸入器裝置吹入給藥。該配制品可按常規(guī)以單位劑量形式存在且可通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任一方法制備。該方法包括將白蛋白融合蛋白與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體混合的步驟。一般來(lái)說(shuō)，該配制品可通過(guò)將活性成份與液體載體或細(xì)分的固體載體或兩者均勻和充分混合來(lái)制備，然后，如果需要，整形該產(chǎn)品。適合于腸胃外給藥的配制品包括可含有抗氧化劑，緩沖劑，抑菌劑和導(dǎo)致該配制品適合于目的接受者的溶質(zhì)的含水和不含水的無(wú)菌注射溶液；和包含懸浮劑和增稠劑的含水和不含水的無(wú)菌懸液。該配制品可在單位劑量或多劑量容器，例如密封安瓿，小瓶或注射器中存在，且可在凍干(冷凍干燥)條件下貯存，使用前僅需要臨時(shí)加入無(wú)菌液體載體，例如注射水。臨時(shí)注射溶液和懸液可從無(wú)菌粉末制備。由于本發(fā)明的許多白蛋白融合蛋白表現(xiàn)出血清半衰期延長(zhǎng)，因此與該治療性蛋白的非融合型標(biāo)準(zhǔn)配制品相比，該配制品劑量可含有更低摩爾濃度或更低劑量的治療性蛋白部分。作為例子，當(dāng)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)治療性蛋白質(zhì)區(qū)域時(shí)，可根據(jù)相對(duì)于該治療性蛋白效力的該白蛋白融合蛋白的效力，同時(shí)考慮與天然治療性蛋白相比該白蛋白融合蛋白的血清半衰期和儲(chǔ)存期延長(zhǎng)來(lái)計(jì)算該劑量形式。例如，在由全長(zhǎng)HA與全長(zhǎng)治療性蛋白融合組成的白蛋白融合蛋白中，按單位的等價(jià)劑量可表現(xiàn)出更大的試劑重量，但是可減少給藥頻率。本發(fā)明的配制品或組合物可與提及該白蛋白融合蛋白成份儲(chǔ)存期延長(zhǎng)的說(shuō)明書(shū)或包裝插頁(yè)包裝在一起，或者與其一起包含在試劑盒中。例如，該說(shuō)明書(shū)或包裝插頁(yè)可說(shuō)明推薦的貯存條件，例如時(shí)間，溫度和光照，并考慮本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的儲(chǔ)存期延長(zhǎng)。該說(shuō)明書(shū)或包裝插頁(yè)也可說(shuō)明本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的具體優(yōu)點(diǎn)，例如便于貯存以便用于需要在野外，受控制的醫(yī)院的戶外，臨床或辦公室條件下使用的配制品。如上所述，本發(fā)明的配制品可以是含水形式且可在低于理想環(huán)境下貯存而不明顯損失治療活性。本發(fā)明還提供了通過(guò)給受試者施用在藥用上可接受的載體中的有效量的本發(fā)明白蛋白融合蛋白或編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的多核苷酸("白蛋白融合蛋白多核苷酸")來(lái)治療和/或預(yù)防疾病或紊亂(例如，本文公開(kāi)的任何一種或多種疾病或紊亂)的方法。施用的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的有效劑量可通過(guò)描述了諸如生物學(xué)半衰期，生物可利用率和毒性的參數(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，包括使用來(lái)自諸如在表4中參考文獻(xiàn)描述的常規(guī)體外和體內(nèi)研究的數(shù)據(jù)，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來(lái)測(cè)定。該白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可按與良好醫(yī)學(xué)實(shí)踐一致的方式，并考慮個(gè)體患者的臨床情況(特別是單獨(dú)用白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸治療的副作用)，給藥位點(diǎn)(thesiteofdelivery),給藥方法，給藥時(shí)間表，和醫(yī)師已知的其它因素進(jìn)行配制和給藥。因此本文使用的"有效量"可按該考慮進(jìn)行測(cè)定。例如，測(cè)定給藥的物質(zhì)的有效量依賴于許多因素，包括，例如，該物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，動(dòng)物的年齡和體重，需要治療的確切病癥及其嚴(yán)重性，和給藥途徑。治療的頻率依賴于許多因素，例如每個(gè)劑量施用的多核苦酸構(gòu)建體量，以及受試者的健康狀況和病史。給藥的精確量，次數(shù)，和給藥時(shí)間選擇可由主治醫(yī)師或獸醫(yī)確定。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和多核苷酸可施用給任何動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物包括人類，狗，貓，小鼠，大鼠，兔，綿羊，牛，馬和豬，特別優(yōu)選人。作為一般性建議，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可以比未融合的治療性肽劑量更低或給藥頻率更少。治療上有效的劑量可指足以導(dǎo)致癥狀改善，疾病穩(wěn)定，延長(zhǎng)患者存活，或改善生活質(zhì)量的化合物的量。白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可通過(guò)口服，直腸，腸胃外，腦池內(nèi)，陰道內(nèi)，腹膜內(nèi)，局部(作為粉末，軟膏，凝膠，滴劑或皮膚膏藥)，口頰，或者作為口腔或鼻內(nèi)噴霧給藥。"藥用上可接受的載體"是指無(wú)毒性固體，半固體或液體填充物，膠嚢材料或任何配制輔劑。本文使用的術(shù)語(yǔ)"腸胃外"是指包括靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，胸骨內(nèi)，皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注的給藥方式。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸還適合于通過(guò)緩釋系統(tǒng)給藥，例如在本文作為參考文獻(xiàn)引用的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO01/79480(第129-130頁(yè))中所述的那些系統(tǒng)。對(duì)于腸胃外給藥，在一個(gè)實(shí)施方案中，該白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸一般可通過(guò)將它以所需純度，以單位劑量的可注射形式(溶液，懸液，或乳劑)，與藥用上可接受的載體，即在所用劑量和濃度下對(duì)接受者無(wú)毒性且與該配制品的其它成份相配伍的載體混合來(lái)配制。例如，該配制品任選不包括氧化劑和已知對(duì)該治療劑有害的其它化合物。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可單獨(dú)或者與其它治療劑聯(lián)合給藥?？膳c本發(fā)明的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合給藥的白蛋白融合蛋白和/或多核苷酸試劑包括但不限于，化療劑，抗生素，類固醇和非類固醇抗炎劑，常規(guī)免疫治療劑，和/或在本文作為參考文獻(xiàn)引用的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/355,547和WO01/79480(第132-151頁(yè))中所述的治療性處理。聯(lián)合可以是同時(shí)，例如作為混合物，分開(kāi)但同時(shí)進(jìn)行或并行；或者依次給藥。它包括該聯(lián)合試劑作為治療性混合物一起給藥的情況，且也包括該聯(lián)合試劑分開(kāi)但同時(shí)給藥的操作，例如，通過(guò)分開(kāi)的靜脈內(nèi)路線進(jìn)入相同個(gè)體中。"聯(lián)合"給藥還包括先給予一種化合物或試劑，接著再給第二種的分開(kāi)給藥。適用于本發(fā)明的藥用組合物包括這樣的組合物，其中包含有效量的活性成份以達(dá)到其計(jì)劃目的。本發(fā)明還提供了一種藥品包或試劑盒，它包含一個(gè)或多個(gè)容器，其中填充了含有本發(fā)明白蛋白融合蛋白的藥用組合物的一種或多種成份。任選與該容器相聯(lián)的是按控制藥品或生物學(xué)產(chǎn)品制造，使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)指定形式的說(shuō)明書(shū)，該說(shuō)明書(shū)反映了該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)制造，使用或銷售用于人類給藥。按照本發(fā)明的該一般性描述，相信本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用前面的描述和下面的說(shuō)明性實(shí)施例能夠作出和利用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的改變并實(shí)施所要求保護(hù)的方法。因此下面的工作實(shí)施例，具體指出了本發(fā)明的不同實(shí)施方案，且不以任何方式構(gòu)成對(duì)該公開(kāi)內(nèi)容的其它方法的限制。實(shí)施例實(shí)施例1:構(gòu)建N-末端和C-末端白蛋白-(GGShGG接頭克隆載體重組白蛋白表達(dá)載體pDB2243和pDB2244以前已經(jīng)在專利申請(qǐng)WO00/44772中描述。重組白蛋白表達(dá)載體pAYE645和pAYE646以前已經(jīng)在英國(guó)專利申請(qǐng)0217033.0中描述。^"飾質(zhì)粒pDB2243以1更以這樣的方式在白蛋白多肽的C-末端導(dǎo)入編碼14個(gè)氨基酸多肽接頭N-GGSGGSGGSGGSGG-C((GGS)4GG，"N，，和"C"表示多肽序列的方向)(SEQIDNO:—)的DNA序列，該方式隨后使得另一多肽鏈在C-末端插入到(GGS)4GG接頭上以產(chǎn)生一般構(gòu)型為白蛋白-(GGS)4GG-多肽的C-末端白蛋白融合蛋白。同樣，修飾質(zhì)粒pAYE645以便以這樣的方式在白蛋白多肽的N-末端導(dǎo)入編碼(GGS)4GG多肽接頭的DNA序列，該方式隨后使得另一多肽鏈以N-末端插入到(GGS)4GG接頭上以產(chǎn)生一般構(gòu)型為多肽-(GGS)4GG-白蛋白的N-末端白蛋白融合蛋白。質(zhì)粒pDB2243在Sleep，D,,等(1991)Bio/Technology9,183-187和在專利申請(qǐng)WO00/44772中描述，它包含酵母尸朋7啟動(dòng)子和酵母v4D//7終止子以提供合適的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子序列。質(zhì)粒pDB2243用BawHI完全消化，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，最后再連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2566。通過(guò)退火合成寡核苷酸JH033A和JH033B合成雙鏈合成寡核苷酸接頭Bsu36I/HindlII接頭。J腦3A5，-TTAGGCTTAGGTGGTTCTGGTGGTTCCGGTGGTTCTGGTGGATCCGGTGGTTAATA畫(huà)3，(SEQIDNO:一)JH033B5，-AGCTTATTAACCACCGGATCCACCAGAACCACCGGAACCACCAGAACCACCTAAGCC-3，(SEQIDNO:—)將退火的Bsu36I/HindlH接頭連接進(jìn)Hindm/Bsu361切割的pDB2566中以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2575X,它包含在其C-末端有(GGS)4GG肽接頭的白蛋白編碼區(qū)。含有酵母啟動(dòng)子和酵母jD///終止子提供合適的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子序列的質(zhì)粒pAYE645在英國(guó)專利申請(qǐng)0217033.0中描述。質(zhì)粒pAYE645用限制性酶消化完全并用限制性酶HindIII部分消化，分離含有酵母啟動(dòng)子3，端和rHA編碼序列的DNA片斷。用4/n////,7dIII消化在專利申請(qǐng)WO00/44772中描述的質(zhì)粒pDB2241并分離含有酵母/^^7啟動(dòng)子5'端和酵母爿Z)//7終止子的DNA片斷。然后將來(lái)自pAYE645的4/7IW,'"dmDNA片斷克隆進(jìn)4/7n/歷"dmpDB2241載體DNA片斷上以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2302。將質(zhì)粒pDB2302用Pacl/Xhol消化完全并分離6.19kb片斷，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，并再連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2465。將質(zhì)粒pDB2465用Clal線形化，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，并再連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2533。質(zhì)粒pDB2533用Blnl線形化，凹端用T4DNA聚合酶和dNTPs平端化，并再連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2534。質(zhì)粒pDB2534用BmgBI/5gffl消化完全，分離6.96kbDNA片斷并連接到一個(gè)雙《連寡核香酸接頭，即VC053/VC054和VC057/VC058上以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2540,或連接到VC055/VC056和VC057/VC058上以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2541。VC0S3(SEQIDNO:—VC054(SEQEDNO:_)VC055(SEQIDNO:_)VC056(SEQIDNO:)VC057CTCAATACTTGCAACAATGTCCATTCGAAGATCAC-3'(SEQIDNO:)VC058AAAGCCTTGAAGTTTTCCTCACCTAGGT-3'(SEQIDNO:)雙鏈合成寡核苷酸接頭BglII/Agel接頭通過(guò)退火合成寡核苷酸JHO:55A和JH035B來(lái)合成。JH035A5'-GATCTTTGGATAAGAGAGGTGGATCCGGTGGTTCCGA-3，(SEQIDNO:JH035B5'-CCGGTGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCACCACAA陽(yáng)3'(SEQIDNO:一)將退火的Bg氾"gel接頭連接進(jìn)5g/II"gel切割的pDB2540上以產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2573X,它包含在其N-末端具有(GGS)4GG肽接頭的白蛋白編碼區(qū)。實(shí)施例2:未融合的DPI-14的平衡抑制常數(shù)DPI-14的氨基酸序列是EAVREVCSEQAETGPCIAFFPRWY過(guò)反向翻譯過(guò)程可從該多肽序列產(chǎn)生一個(gè)DNA序列。在畢赤氏酵母屬中表達(dá)DPI-14并使用離子交換色譜，疏水相互作用色譜，和超濾從發(fā)酵肉湯上清中提取。DPI-14抑制人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(HNE)的平衡抑制常數(shù)(Ki)測(cè)定為15土2pM，對(duì)于[HNEh57土7pM。使用實(shí)施例15所述的方法進(jìn)行IQ測(cè)量。實(shí)施例3:構(gòu)建N-末端和C-末端白蛋白-DPI-14融合蛋白在5，或3'末端提供該DNA序列以編碼DPI-14編碼區(qū)，白蛋白編碼區(qū)或前導(dǎo)序列之間的連接序列以適合于N-末端DPI-14-(GGS)4GG-白蛋白或C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DPI-14融合蛋白。從重疊的寡核苦酸構(gòu)建N-末端BglII-BamHIDPI-14cDNA(表5)和C-末端BamHI-HindIIIDPI-14cDNA(表6)。實(shí)施例4:構(gòu)建N-末端DPI-14-(GGS、GG-白蛋白表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒pDB2573X用BglII和BamHI消化完全，分離6.21kb的DNA片斷并用小牛腸磷酸酶處理，然后與0.2kb的BglII/BamHIN-末端DPI-14cDNA連接以產(chǎn)生pDB2666。N-末端DPI-14-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的DNA和氨基酸序列分別在表7和表8中顯示。通過(guò)"分解(disintegration)"在EP-A-286424中一般性公開(kāi)和由Sleep,D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質(zhì)粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2666分離NotlN-末端DPI-14-(GGS)4GG-rHA表達(dá)序列盒，純化并連接進(jìn)已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產(chǎn)生兩個(gè)質(zhì)粒；第一個(gè)(pDB2679)含有與LEU2相同表達(dá)方向的Notl表達(dá)序列盒，而第二個(gè)(pDB2680)含有與LEU2相反方向的Notl表達(dá)序列盒。pDB2679和pDB2680都是較好的目的融合蛋白生產(chǎn)質(zhì)粒。實(shí)施例5:構(gòu)建C-末端白蛋白-(GGS、GG-DPI-14表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒pDB2575X用HindIII部分消化，然后用BamHI消化完全。分離所需的6.55kbDNA片斷并與0.2kbBamHI/Hind111C末端DPI-14cDNA連接以產(chǎn)生pDB2648。C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DPI-14融合蛋白的DNA和氨基酸序列分別在表9和表10中顯示。通過(guò)"分解"在EP-A-286424中一般性公開(kāi)和由Sleep,D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質(zhì)粒pSAC354是供合適的酵母載體序列。從pDB2648分離NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DPI-14表達(dá)序列盒，純化并連接進(jìn)已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產(chǎn)生含有與LEU2相同表達(dá)方向的Notl表達(dá)序列盒的pDB2651。實(shí)施例6:構(gòu)建C-末端白蛋白-(GGS、GG-DX-1000表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒pDB2575X用HindIII部分消化，然后用BamHI消化完全。分離所需的6.55kbDNA片斷并與表11所示的0.2kbBamHI/HindlllC末端DX-1000cDNA連接以產(chǎn)生pDB2648X-1000。通過(guò)"分解，，在EP-A-286424中一般性公開(kāi)和由Sleep,D.,等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質(zhì)粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2648X-1000分離NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX1000表達(dá)序列盒，純化并連接進(jìn)已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產(chǎn)生含有與LEU2相同表達(dá)方向的Notl表達(dá)序列盒的pDB2651X-1000。實(shí)施例7:構(gòu)建N-末端和C-末端白蛋白-DX-8卯融合蛋白產(chǎn)生基礎(chǔ)克隆DX-890的氨基酸序歹'J是EACNLPIVRGPCIAFFPRWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYCGVP(SEQIDNO:—)。通過(guò)反向翻i爭(zhēng)過(guò)程從該多肽序列產(chǎn)生DNA序列。在5，或3，端提供該DNA序列以編碼DX-890編碼區(qū)，白蛋白編碼區(qū)或前導(dǎo)序列之間的連接序列以適合于N-末端DX-890-(GGS)4GG-白蛋白或C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-890融合蛋白。從重疊的寡核苷酸構(gòu)建N-末端BglII-BamHIDX-890cDNA(表12)和C-末端Bamffl-HindIIIDX-890cDNA(表13)。實(shí)施例8:構(gòu)建N-末端DX-89(KGGSV3G-白蛋白表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒pDB2573X用Bglll和BamHI消化完全，分離6.21kb的DNA片斷并用小牛腸磷酸酶處理，然后與0.2kb的BglII/BamHIN-末端DX-890cDNA連接以產(chǎn)生pDB2683。N-末端DX-8卯-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的DNA和氨基酸序列分別在表14和表15中顯示。通過(guò)"分解"在EP-A-286424中一般性公開(kāi)和由Sleep,D.,等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質(zhì)粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2683分離NotlN-末端DX-890-(GGS)4GG-rHA表達(dá)序列盒，純化并連接進(jìn)已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產(chǎn)生含有與LEU2相反方向的Notl表達(dá)序列盒的pDB2684。實(shí)施例9:構(gòu)建C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-890表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒pDB2575X用HindIII部分消化，然后用BamHI消化完全。分離所需的6.55kbDNA片斷并與0.2kbBamHI/Hindl11C末端DX-890cDNA連接以產(chǎn)生pDB2649。C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-8卯融合蛋白的DNA和氨基酸序列分別在表16和表17中顯示。通過(guò)"分解，，在EP-A-286424中一般性公開(kāi)和由Sle印，D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質(zhì)粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2649分離NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-890表達(dá)序列盒，純化并連接進(jìn)已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產(chǎn)生兩個(gè)質(zhì)粒；第一個(gè)pDB2652含有與LEU2相同表達(dá)方向的Notl表達(dá)序列盒，而第二個(gè)pDB2653含有與LEU2相反方向的Notl表達(dá)序列盒。實(shí)施例10:發(fā)酵生產(chǎn)融合蛋白按WO00/44772中所述在發(fā)酵培養(yǎng)物中表達(dá)DX-8卯-HSA融合蛋白。除了在洗脫緩沖液中需要額外的200mMNaCl外，按WO00/44772中所述使用標(biāo)準(zhǔn)HA純化SP-FF(Pharmacia)條件從發(fā)酵培養(yǎng)物上清純化DX-890-HSA融合蛋白。實(shí)施例11:酵母轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)條件按SleepD.,等(2001)Yeast18,403-421所述將在WO95/23857,WO95/33833和WO94/04687中公開(kāi)的酵母菌林轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。將轉(zhuǎn)化子涂布到緩沖型基本培養(yǎng)基(BMM,Kerry-Williams,S.M.等(1998)Yeast14,161-169所述)上并在3(TC下培養(yǎng)直到生長(zhǎng)至足夠用于進(jìn)一步分析。實(shí)施例12:DX-890樣品的KJ則量按照形成可逆復(fù)合物的緊密結(jié)合抑制模型(1:1化學(xué)計(jì)量法)測(cè)定DX-8卯或DX-890-HAS抑制HNE的平衡抑制常數(shù)(KO。在30。C下在50mMHEPES,pH7.5,150mMNaCl,和0.1%TritonX-100中測(cè)定hNE的抑制。所有反應(yīng)(總體積二200^L)在微量滴定板(Costai^3789)上進(jìn)行。hNE用各種濃度的添加抑制劑培養(yǎng)24小時(shí)。從相對(duì)底物水解率測(cè)定剩余酶活性。通過(guò)添加N-曱氧基琥珀酰-八&-八13-1"0^31-7-氨基-甲基香豆素作為底物開(kāi)始水解反應(yīng)。該底物的酶促裂解釋放曱基香豆素半分子，伴隨著樣品熒光增強(qiáng)。在360nm激發(fā)光和460nm發(fā)射光下監(jiān)測(cè)底物水解率。通過(guò)對(duì)公式1的非線性回歸分析擬合剩余百分活性與抑制劑濃度的繪圖以測(cè)定平衡解離常數(shù)。其中%八=百分活性I=DX-890E=HNE濃度Ki=平衡抑制常數(shù)在相同時(shí)間測(cè)量天然DX-890的Kj作為陽(yáng)性對(duì)照。DX-8卯和DX-890-HAS融合蛋白對(duì)人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(HNE)的K;彼此相似(圖1)。用來(lái)自搖瓶酵母培養(yǎng)物或者來(lái)自發(fā)酵罐的上清中的DX-8卯-HAS融合蛋白可見(jiàn)相似的結(jié)果。兩種上清都由Aventis或Dyax供應(yīng)。該結(jié)果表明與HAS融合不影響DX-890作為HNE抑制劑的效力。實(shí)施例13:DX-88與HASN末端的融合DX-88是來(lái)自人LACI第一Kunitz結(jié)構(gòu)域的一個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域，它以K廣40pM抑制人血漿激肽釋放酶。DX-88的血清半衰期不超過(guò)1小時(shí)。DX-88在臨床試驗(yàn)中通常用于治療遺傳性血管性水腫(HAE)。初步數(shù)據(jù)表明DX-88是安全有效的。HAE是發(fā)病以陣發(fā)式復(fù)發(fā)的病癥，且具有長(zhǎng)效形式可允許預(yù)防性治療代替反應(yīng)性治療。可獲得準(zhǔn)備用于與HA的N末端融合的DX-88的DNA序歹'J。在5，或3，端提供該DNA序列以編碼DX-88編碼區(qū)，白蛋白編碼區(qū)或前導(dǎo)序列之間的連接序列以適合于N-末端DX-SS-(GGS)4GG-白蛋白(表")。質(zhì)粒pDB2573X用BglII和BamHI消化完全，分離6.21kb的DNA片斷并用小牛腸磷酸酶處理，然后與0.2kb的BglII/BamHIN-末端DX-88cDNA連接以產(chǎn)生pDB2666-88。N-末端DX-88-(GGS)4GG-白蛋白融合蛋白的DNA和氨基酸序列分別在表19和表20中顯示。通過(guò)"分解"在EP-A-286424中一般性公開(kāi)和由Sleep,D.,等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質(zhì)粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2666-88分離NotlN-末端DX-88-(GGS)4GG-rHA表達(dá)序列盒，純化并連接進(jìn)已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產(chǎn)生兩個(gè)質(zhì)粒；第一個(gè)pDB2679-88含有與LEU2相同表達(dá)方向的Notl表達(dá)序列盒，而第二個(gè)pDB2680-88含有與LEU2相反方向的Notl表達(dá)序列盒。實(shí)施例14:構(gòu)建C-末端白蛋白-(GGS、GG-DX-88表達(dá)質(zhì)粒按實(shí)施例5所述，質(zhì)粒pDB2575X用HindIII部分消化，然后用BamHI消化完全。分離所需的6.55kbDNA片斷并與0.2kbBamHI/HindlllC末端DX-88cDNA連接(表21)以產(chǎn)生pDB2648-88。C-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-88融合蛋白的DNA和氨基酸序列分別在表22和表23中顯示。通過(guò)"分解"在EP-A-286424中一般性公開(kāi)和由Sleep,D.，等(1991)Bio/Technology9,183-187所述的質(zhì)粒pSAC35提供合適的酵母載體序列。從pDB2648-88分離NotlC-末端白蛋白-(GGS)4GG-DX-88表達(dá)序列盒，純化并連接進(jìn)已用小牛腸磷酸酶處理的Notl消化的pSAC35中，產(chǎn)生含有與LEU2相同表達(dá)方向的Notl表達(dá)序列盒的pDB2651-88。實(shí)施例15:在小鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)按WO00/44772中所述在發(fā)酵培養(yǎng)物中表達(dá)DX-890-HSA融合蛋白。除了在洗脫緩沖液中需要額外的200mMNaCl外，按WO00/44772中所述使用標(biāo)準(zhǔn)HA純化SP-FF(Pharmacia)條件從發(fā)酵培養(yǎng)物上清純化DX-8卯-HSA融合蛋白。通過(guò)SEC-HPLC從滲濾殘留物純化大約10mg的rHA-DX-8卯融合蛋白并通過(guò)SCS-PAGE和RP-HPLC方法鑒定為大約92%是單體形式。該物質(zhì)用于隨后進(jìn)行125I放射標(biāo)記和體內(nèi)血漿清除試驗(yàn)。對(duì)于小鼠試驗(yàn)，在尾靜脈注射動(dòng)物且在注射后大約0,7,15,30和90分鐘，4小時(shí)，8小時(shí)，16小時(shí)，24小時(shí)時(shí)處死4只動(dòng)物，對(duì)于天然DX-890不超過(guò)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，因?yàn)槠浜芸赡馨胨テ谳^短。記錄注射時(shí)間和取樣時(shí)間。處死時(shí)，將0.5ml的樣品收集進(jìn)抗凝劑(0.02mlEDTA)中。離心細(xì)胞并與血漿分離。將血漿分成兩個(gè)等分試樣，一個(gè)冷凍且一個(gè)在4。C下貯存用于即時(shí)分析。分析包括對(duì)所有樣品進(jìn)行Y計(jì)數(shù)。另外，對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的兩個(gè)血漿樣品(N二2)進(jìn)行分析，即，對(duì)0，和30分鐘的125I-DX-890,和0，30分鐘，和24小時(shí)的125I-DX-890-HAS融合蛋白。使用帶有在線(in-line)放射檢測(cè)器的SEC-HPLC瓊脂糖-12柱分析血漿級(jí)份(fractions)。結(jié)果表明DX-890與HAS融合將其p(清除)半衰期顯著提高約5倍(圖2)。另外，似乎DX-890-HSA-融合蛋白在小鼠血漿中比DX-8卯更穩(wěn)定(圖3和4)。實(shí)施例16:在兔中的藥物動(dòng)力學(xué)試-瞼通過(guò)碘標(biāo)記蛋白質(zhì)并測(cè)量放射性標(biāo)記從兔循環(huán)中的清除率來(lái)測(cè)量DX-8卯和DX-890-HAS的藥物動(dòng)力學(xué)特性。使用生碘(iodogen)方法用碘-125碘標(biāo)記兩種DX-890制品。碘標(biāo)記后，通過(guò)大小排阻層析(SEC)從未結(jié)合的標(biāo)記中純化兩種標(biāo)記的蛋白質(zhì)制品。合并具有最高放射性的SEC柱級(jí)份。通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)鑒定純化的放射性標(biāo)記的制品的比活并通過(guò)使用帶有在線放射檢測(cè)器的瓊脂糖-12柱通過(guò)SEC鑒定其純度。新西蘭白兔(約2.5Kg)用于清除率測(cè)定，一只動(dòng)物分別用于兩種標(biāo)記的蛋白質(zhì)制品。將放射性標(biāo)記的制品通過(guò)耳靜脈注射進(jìn)動(dòng)物中。在大約O，7，15,30,和90分鐘的早期時(shí)間點(diǎn)和在4,8,16，24，48,72，96，144，168,和192小時(shí)的晚期時(shí)間點(diǎn)對(duì)每只動(dòng)物在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集一個(gè)血液樣品。將樣品(大約0.5ml)收集進(jìn)抗凝劑(EDTA)試管中。通過(guò)離心分離細(xì)胞與血漿/血清成份。將血漿成份分成兩個(gè)等分試樣。一個(gè)血漿等分試樣在-70。C貯存且另一個(gè)等分試樣在4。C下保持用于即時(shí)分析。樣品分析包括用于清除率測(cè)定的放射計(jì)數(shù)和用于體內(nèi)穩(wěn)定性的SEC層析。兔清除率試驗(yàn)的結(jié)果在圖5和6和在表24中總結(jié)。HSA-DX-890融合蛋白顯示出體內(nèi)循環(huán)特性相對(duì)于未修飾的DX-890顯著改進(jìn)。對(duì)該融合蛋白的血漿清除率大量減小以致于一天后的放射性標(biāo)記的相對(duì)循環(huán)水平HSA-DX-890融合蛋白比未修飾的蛋白高100倍(圖5)。對(duì)該數(shù)據(jù)的筒單雙指數(shù)匹配表明清除率曲線的a和p部分都大量增加(表24)。具體地說(shuō)，Tv2(3的值增加超過(guò)20倍，從未修飾蛋白質(zhì)的大約165分鐘(2.75小時(shí))到HSA-DX-890融合蛋白的大約3500分鐘(~60小時(shí)，~2.5天)。另夕卜，與該曲線的緩慢清除部分相關(guān)的總物質(zhì)部分對(duì)于融合蛋白幾乎是未修飾的DX-890的2倍(表24)。表24在兔中的清除時(shí)間<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>最后，融合蛋白相對(duì)于未修飾的DX-890表現(xiàn)出體內(nèi)穩(wěn)定性提高(圖6)。對(duì)來(lái)自用125I-DX-890注射的兔的血漿進(jìn)行SEC分析(圖6,A部分)表明標(biāo)記與更高分子量的血漿成份(更早的洗脫峰)相當(dāng)迅速地相關(guān)聯(lián)。另外，與高分子量物質(zhì)相關(guān)的總殘留循環(huán)標(biāo)記的相對(duì)比例隨著注射后時(shí)間的增加而增加(比較30分鐘和4小時(shí)時(shí)的洗脫分布圖)。相反，對(duì)來(lái)自注射了125I-HSA-DX-8卯的兔的血漿樣品進(jìn)行SEC分析(圖6，B部分)表明幾乎全部循環(huán)標(biāo)記與注射液中可見(jiàn)的HSA-DX-890峰值相關(guān)且該標(biāo)記與該峰值在至少72小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定相關(guān)。實(shí)施例17:用于制備雙重融合的HSA的載體載體pDB2300Xl是pDB2575X的修飾形式，其中靠近rHA基因5，端有Bg/II/Bamffl序列盒且靠近3，端有5^EI/Kp"I序列盒。包含該基因的Notl序列盒在表25中顯示，其中顯示了該DNA，編碼的氨基酸序列和有用的限制性位點(diǎn)。在表25各行中，驚嘆號(hào)后面的各內(nèi)容是注釋，編號(hào)和分開(kāi)該DNA序列以便于理解該設(shè)計(jì)。實(shí)施例18:將第一種情況的DX890加入pDB2300Xl中將表12所示的DNA導(dǎo)入已經(jīng)用BglII和BamHI切割的pDB2300Xl中以制備新載體pDB2300X2。表26顯示了pDB2300X2的Notl序列盒的DNA，編碼的氨基酸序列和有用的限制性位點(diǎn)。實(shí)施例19:將第二種情況的DX8卯加入。DB2300X2中將表27所示的DNA導(dǎo)入已經(jīng)用BspEI和Kpnl切割的pDB2300X2中以制備新載體pDB2300X3。盡管該DNA編碼與表12的DNA相同的氨基酸序列，但是改變了許多密碼子以減少兩個(gè)DX890-編碼區(qū)之間的重組可能性。表28顯示了該構(gòu)建體的DNA,編碼的氨基酸序列和有用的限制性位點(diǎn)。編碼的氨基酸序列在表29中顯示。該蛋白質(zhì)按與本發(fā)明的其它構(gòu)建體相同的方式表達(dá)。表103的蛋白質(zhì)，即"Dx890-HA-Dx890",具有~16%的DX890的HNE-中和活性但是血清壽命時(shí)間長(zhǎng)得多。因此代表HNE抑制的曲線下面積比凈果露的DX890高得多。實(shí)施例20:DX1000::(GGS)4GG::HSA將表30所示的DNA導(dǎo)入已經(jīng)用和SawHI切割的pDB2573X中以構(gòu)建pDX1000。表31顯示了該編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。該蛋白質(zhì)的表達(dá)基本上與本發(fā)明的其它HA融合蛋白相同。實(shí)施例21:DX-88::(GGS、GG::HSA::(GGSy3G::DX-88按與編碼DX-8卯-HSA-DX-890的基因的構(gòu)建體相似的方式，將表18的DNA插入已經(jīng)用Bg/II和BawHI切割的pDB2300Xl中以制備新載體中以產(chǎn)生含有兩種情況的編碼DX-88的DNA的pDB2300X88b。表32的DNA基本上不同于表18的DNA以便不可能發(fā)生重組。實(shí)施例22:多個(gè)白蛋白融合蛋白可修飾本文所述的N-末端融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pDB2540以便在C-末端導(dǎo)入單一Bsu361;該新質(zhì)粒稱為pDB2301X。來(lái)自pDB2301X的Notl表達(dá)序列盒的DNA序列如下pDB2540+腸361Not工1GCGGCCGCccgtaatgcggtatcgtgaaagcgaaaaaaaaactaacagtagataagacag61atagacagatagagatggacgagaaacagggggggagaaaaggggaaaagagaaggaaagNarl121aaagactcatctatcgcagataagacaatcaaccctcatGGCGCCtccaaccaccatccg<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>28B1catttcacccaattgtagatatgctaactccagcaa'tgagttgatgaatctcggtg亡gtaMot工2941ttttatgtcctcagaggacaacacctgttgtaatcgttcttccacacggatcGCGGCCGC可將編碼多肽的DNA插入BglII和Agel位點(diǎn)之間以表達(dá)N-末端白蛋白融合蛋白，或者插入Bs11361和HindlII(不是單一的且因此需要部分HindIII消化)位點(diǎn)之間以表達(dá)C-末端白蛋白融合蛋白，或者插入兩種位點(diǎn)對(duì)之間以制備聯(lián)合N-和C-末端白蛋白融合蛋白。可任選插入多肽間隔區(qū)。來(lái)自修飾的pDB"40的Notl表達(dá)序列盒的DNA序列預(yù)期如下pDB2540+2xGS接頭611211612413013S14214B1541S〇l"1721781NotlGCGGCCGCccatagacagatcsctagggacgaaagagct仁taagaggcttggacacatatatgcacttatgtaatgcggtagagatggacctatcgcagacaagcgctcggtgcaatgggtttgaacactgcccggggtctccgggttaggcaaaatttggtcccgttatatcgtgaaaggagaaacaggcaccgttagcagtgccaattgcattgcacctttttt333CggctcagtaaattggagttccgaaaaaaaaactaacagtaNai:工aaccctcatG33cgcttgsccgscaaatcatgcacccgacaaaaaacgaggggctttcggtgccactgcagataaagagcttcccatacaGCGCCtccaagaatacg仁ctgccactaset己tagcacag仁ctttggsaatgtggcttatcgataagacagccaccatccggctcgcctttscgaggtcacagtgtgataat:gtgcctacttgtccgtggattaggtgactscgcca_gga_ctccaattagcHind:[工工ttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacctaattctaacaagcaaagatgaagtgggtt841ttcategtetccattttg亡tcttc^ttctcctctg,cttact:>......................融合蛋白前導(dǎo)序列-..Bgl工工ctAGATCTttggataagaga901短10211081i:ui120112611381BajnK工ggtGGATCCggtggttccggtggttctggtggttccggtggtgaegcteacaagtccgaa>>.........:......GS:接頭'.................〉1>>.....rHA........>Age工gtcgctcACCGGTtcaaggacctaggtgaggaaaacttcaaggct匕tggtettgatcget>..............rHA合成基因連續(xù)到堿基2739ttcgctcaatsccgaattcgcscsccttgtgacgacaacc仁tccacgacacca_ta_cttct:ac仁仁gcaacactasgscttggttgtgctaacaaacttgccacgraagaaacacgctccsgaatgtccattctgttgctgacgttgtgtactaagattggt仁cttcttgaagattgttgttcgaagatcacggaatctgctggttgetaectagaccagaagasgtac亡t:gtttegctaagatcaag仁tggttgsgagaaacsatgtttcttttgaegtcataegaaattgegstsca^ggccaacgasgttcaagtccttggtgtactgcttagsagacactgct仁tcscc14411501156116B11741180118S119211981204121012161"2122已123"2401gaatgttgtcgacgaaggtaggtgaaagaggaattcgctgcacggtgactaaccaagacttctcactgtagctgacttcgttgggtatgtttgagattggcacgaatgttt仁gatcaagcttgttggttatctagaaactccatgtgctgtgtttctctgaagctgctgaaggcttcttcctttcaaggcaagtttctaatgttggaatgctatctcttcttgctgaagtttgaatctaatcttgtacgactaagacctaacgctaaggtaaaactgtgagatacactaactgatagagtctttggwgttsaggctgctttgggc仁gtcgttggttacttgctgatgaccaagttgaagtgaaaacgatggacg仁仁仁gtatacgctagacgaaacCacctttcgatgaaattgttcgaagaaggtcccacggttctaaggtccgtcgtt■caccaagtgtcgacgaaacttgttt^ttgcagattgaeigtgctagattg仁gacttgactaagagctgactgaatgttgtggaaatgccagaagaactacgagacacccagttggaaaagtttcaagccatcaattgggtgcaagtctccatgttgtaagc仁tgaaccaattgtactgaattacgttccaacaaagttggagtgcttccttctcaaagattaggttcacactggctaagtactgacttgccctgaagctaaactactccgtgttgtgctgctgg匕cgaagaaatacaagttccccasctttacccagaagctgtgtgttttctttggttaaaggaattcaatgaattgagacccaaaggcttgaatgttgtcatctgtgaaatctttggctggacgtcttctgtct仁gttgtgctgacccaccaaaacgctggttgaagtctaagagaatgcgctgaaact246125212581270127612S21288129413001ttcaccttccactgc仁t仁gggtcstggatg2641tgtttcgctgEcoRVacgctGATATCtgtaccttgttgaattggtcaagcacaagatt仁cgctgctttcgttgaatccgaaaaggaagtgttgtasagaaggtaagaagtt:ggtcgctgcttccc...........rHA合成基因......aggctgatgasttgaaggctBsu36Iaagc仁gCCTTAGGcttaggtBspE工Kpn工ggttctagtggt丁CCGGAggttctggtGGTACCggtggttHind工工工aatAAGCTTaattcttatgatttatgatttttattattaaataagttataaaaaaaataagtgtatacaaattttaaagtgactcttaggttttaaaacgaaaattcttattcttgagtaactctttcc仁gt:aggt:caggttgctttctcagg仁atagcatgaggtcgctc仁tattgaccagcaaatgcctgcaaatcgctccccatttcacccaattgttgagttga仁gaatctcggtgtgtattttatgtcctcagagSphlacacctctaccgGCATGCcgagatatgctaactccagcasgacaacacctgttgtaatcg30S1ttc仁tccacacggatcGCGGCCGC可將編碼多肽的DNA插入BglII和BamHI位點(diǎn)之間以表達(dá)N-末端白蛋白融合蛋白，或者插入單一的BspEI和Kpnl位點(diǎn)之間以表達(dá)C-末端白蛋白融合蛋白，或者插入兩種位點(diǎn)對(duì)之間以制備聯(lián)合N-和C-末端白蛋白融合蛋白。通過(guò)使用本文所述的BglII-BamHIDPI-14cDNA和BamHI-HindlllDX-890cDNA可最筒單地例證這點(diǎn)。通過(guò)將這些cDNAs連接進(jìn)合適的位點(diǎn)，可構(gòu)建具有下列DNA序列的DPI-14-(GGS)4GG-rHA-(GGS)4GG-DX-890融合蛋白。Not工1GCGGCCGCccgtaatgcggtatcgtgaaagcgaaaaaaaaactaacagtagataagacag"atagacagatagagatgqacgagaaacagggggggagaaaagg3gaaaagagaaggaaag1213014214B1721csctagggacgaaagagctttaagaggcttstgeacttatetttaaaegetgttgaasaaccatatgttacetategcagacaagcgctcggtgcaatgggtttgaacactgcccggggtcteegggttaggtcccgttatcaccgttagcagtgccaattcegggaggagcagagtagcaggctcagtaaattggagttcsacgcttgsctgcacccgscgggcttteggtgccactgcaGCGCCtccaaatagcacagtagatcaggtcggctgggsaactttggaaatgtggct亡atcccaccatccgactgccggctgctcgcctttacgaggtcacag匕gtgataatgtgcctactttaggtgactacgccsggsctccaattsgc781Hind工工IttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacctaattctsscssgesssgatgaagtgggttBgl工工841t;tcatcgtctccattctgttct仁gttctcctctgct仁actctAGATCTttgga仁aagaga>.......................融合蛋白前導(dǎo)序列........................9019S11021gaagctgttagagasgtttgttctgascaagctgaaactggtccatgtattgetttctte>>DPI—14達(dá)堿基1060:ccasgatggtacttcgatgttactgaaggtaagtgcgcgcca仁tcttctacggtggttgtggtggtaacagasacaacttcgatactgaagaatactgtatggctgtttgtggttctg匚t>............................DP工-14............................>:>10B11141120113211S2117411S0120412101216122212341252125B12"1ggtGGATCCggtggttccggtggttctggtggt仁ccggtggtgacgctcacaagtccgaa》................GS接—頭.................>1》...rHA合成基因'Age工gtcgctcACCGGTtcaaggacctaggtgaggaaaacttcaaggctttggtcttgatcgct>rHA合成基因連續(xù)到堿基2877..............ttcgctcaatcacaccttgtatggctgac仁gacgacaaccgaatgttgtcgacgaaggtaggtgaaagaggaattcgctgcaeggtgacttctcactgtagctgacttcgttgggtatgtcacgaatgttttgttggttaccatgtgctgsccccagtcttgtttctctgttcsccttccacttgcs3csctaagacttgtcggtgataagttgtgctaacaaacttgccacgctccsgaaagctgctgaaggc仁tcttcctttcaaggcaagtttctaatgttggaatgctatctcttc仁tgctgaagttcttgtacgactaagacctaaegctaaggtaaaactgtgatgggtaaggtsagattacttctgatagagtctttggsagtacgct:GATATstgtccsttctgttgctgacgttgtgtact:aagsttggttcttcttgaagattgttgttctaaggctgetcgctaagcaattgggctgCcgttggttacttgct:ga仁gaccaagttgaagtgaaaacgatggacgtttgttttcgatgaaattgttcgaagaaggtcccacggttctaaggtccgtcg仁tcaccaagtgtCTgtaccttggaagatcacggaatctgctggttgetsectgaaagasacgaagtscttgt仁tcgctaagstgtttgttgcagattgaagtgctagattgtg&cttgsctsagagctgac仁gaatgttgtggaastgccagaagaactacgagacacccagttcaagecatcaattgggtgcaagtctccatgttgtaagcttgaaccaattacg仁tccsstcaagttggttgagagaaacaatgtttcttttgacgtca仁aegaaattgegtgettecttctcaa^gsttaggfttcacactggctaagtaaaaagccat仁ctgacttgeectgaagctaaactactccgtgttgtgctgctgg.tcgaagaaatacsagttccccaact仁tacccagaagcct匕tggttaacasgtccttgctscggtga^gtgtactgcttgct仁tcaccccca_a_aggcttgaatgttgtg仁仁ggaaaagatctttggctggacgtc仁tctgtct仁gttgtgctgaccca_ggttgaagtcta^gsgaa_tggeaegssaagcsgssg3ccscgctgaaacttaagaagcaa<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>但是由于前24個(gè)氨基酸構(gòu)成本文所述的該融合蛋白的前導(dǎo)序列，因此分泌產(chǎn)物的氨基酸序列如下-1eaveevcseq51eycravcgsa101faqylqqcpf151vatlretyge201fhdweetflk251cllpkldelr301efaevsklvt351eccekpllek40]_lgmfla'eyar451fkp:lveep，501sri、;lgkvgsk551ctes:lvnrrpsoi丁alvelvkhk651aasqaalglg701cvlfpyggcqaetgpc工affggsggsggsgedhvklvnevmadccakqepkylye工arrhdegkassakqdltkvhteccshc工aevendrhpdyswllcckhpeakrmcfsa;levdetpkatkeqlkagsggsggsgggkignkfysekpjwyfdvteggsggdahksetefaktcvadernecfl/3hkpyfyapsl:lfrlkcaslqkfhgdllecaddempadlpslalrlaktyettqlgeykfqnapcasdylswyvpkefnaetvmddfaafvesggeacnlp工ecreycgvpkcapffyggcvahrfkdlgeesaencdkslddnpnlprla/fakrykaaftgerafkawavradlakyiceadfveskdvclekccaaadpllvrytkkvplnglcvlhekftfhadictlkcckaddketwgpc工affpgg艦則fdteewfkalvliahtlfgdklc了rp￡vdvmctaeccqaadkaaarlsqrfpkanqdsissklkKNTAEAKDVFhecyakvfdegvstptlvevtpvsdrvtkcsekerqikkqcfaeegkklvrwafdavkgk實(shí)施例23:DPI-14-(GGS、GG-HSA融合蛋白的氨基酸序列表33顯示了DPI14通過(guò)含有(GGS)4GG的接頭與HSA融合的氨基酸序列。使用本文所述的方法和載體可簡(jiǎn)單地構(gòu)建編碼給定序列的基因。DPI-14是HNE的有效抑制劑且與HAS的融合產(chǎn)生具有更長(zhǎng)血清殘留時(shí)間的分子。表1:來(lái)自GenBank登錄號(hào)AAN17825的成熟HSA的氨基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLOHKDDNP肌PRIjVRPEVDVMCTAFHDNEETFIjKKYLYE工ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHC工AEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYKTTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQISICEIjFEQIjGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTAL/VELAAKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASRAALGL(SEQIDNO:1S)表2:DX-1000和DX-88的氨基酸序列DX-1000(SEQ工DNO:DX-88(SEQ工DNO:表5:N-末端Bg/II-B"mHIDPI-14cDNA的DNA序列TCTGCTGGTGGATCC(SEQIDNO:_)表6:C-末端"flmHI-/^"dnDPI-14cDNA的DNA序列表7:N-末端DPI-14-(GGS、GG-白蛋白融合蛋白編碼區(qū)的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>表8:N-末端DPI-14-(GGS、GG-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>表9:C-末端白蛋白-(GGSXiGG-DPI-14融合蛋白編碼區(qū)的DNA序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage74</formula>裊10:C-末端白蛋白-(GGSVGG-DPI-14融合蛋白的氨基酸序列謹(jǐn)KSEVAHRFKD1jGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFE;DHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE1SICDK:SLHTLFGDKLCTVATTiRErYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAraDNEETFLKKYLYE工ARRHPYFYAPEliLiFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLIjPKLDELRDEGKASRADLAKY工CENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLiPSLAADFVESKDVCKNYAGNRNNFDTEEYCMAVCGSA(SEQIDNO:表11:C-末端BamHI-HindIIIDX-1000cDNA的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表12:N隱末端Sg/II-^amHIDX-8卯cDNA的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表13:C-末端五w"HI-歷mflnDX-890cDNA的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表14:N-末端DX-890-(GGS、GG-白蛋白融合蛋白編碼區(qū)的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>表15:N-末端DX-890-(GGSVnrT-白備白融合蛋白的氨基酸序列EC3KKLVAASQAALGL(SEQIDNO:表16:C-末端白蛋白-(GGS、GG-DX-890融合蛋白編碼區(qū)的DNA序列TOCTCA/TCGGTTTAAAGATTTGGGA口AAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTMATTAGTGATGXATTTGCAAAAACATG丁GTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCAXACCCTTTTTGGAGACAAAT丁ATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATCGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACGAGAAATGAATGCTTCTTGCTGACAACCCAAACCTCCCCCACCvGAGGTTGCACTGCTTTTCATGAGAATTTTTOAAAAAATACTTATA丁GAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTT丁A丁GCCCCGGAACTCCTTTTCTTTCCTAAAAGGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTCCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATCAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTCCCAAACAGAGGCCAGTCTCCTTCAAAGCA丁GGGCAG丁AGCTCGCCTGAGCGTTTGCAGAAGT丁TCCAAGTTAGTGACAGAGTCCACACGGAATCCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATCTGCTCATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTA丁ATCAAGMTCGA丁CTCCAGTAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTCGAAAAA丁CCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGA丁GCCTGCTCATTAGCTGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGG'CAAAGGATGTCTTCCTGGGCAtGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCC:AAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTG.CTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTT,GTGGVM3AGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAgactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaam:GCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTAGGTGGTTCTGGTGGTTCCGGTGGTTCTGGTGGATCCGGTGGTGAAGCCTGTAACTTGCCAATTGTTAGAGGTCCATGTATTGC丁TTCTTCCCAAGATGGGCTTTCGATGCTGTTAAGGGTAAGTGTGTTTTGTTCCCATATGGTGGTTGTCAAGGTAACGGTAACAAGTTCTACTCTGAAAAGGAATGTAGAGAATACTGTGGTGTTCCA(SEQID'NO:)表17:C-末端白蛋白-(GGSVGG-DX-890融^茶白的氨泉酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATIiRETYGEMADCCAKQEPERNECFL<QHKDDNP肌PRUVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYE工ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASIiQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEE7VEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADliAKYICENGDSISSKLKECCEKPliEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKP1>VEEPQNLIKQNCELFEQIjGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCABDYIiSWLNQIvCVXHEKTPVSDRVTKCCTESLVWHRPCFSALEVDETYVPKEFMAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGSGGSGGSGGEACNLPIVRGPCIAFFPIWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYC(SEQIDNO:_)表18:N-末端Bg/II-丑amfflDX-88cDNA的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>裊19:N-末端DX-88-(GGShGG-白蛋白融合蛋白編碼區(qū)的DNA序列GAAGCTATGCACTCTTTCTCTGCTTTCAAGGCTGACGACGGTCCGTGCAGAGCTGCTCACCCAAGATGGT丁CTTCAACATCTTCACGCGACAATGCGAGGAGTTCATCTACGGTGGTTGTGAGGGTAACCAAAACAGATTCGAGTCTCTAGAGGAGTGTAAGAAGATGTCTACTAGAGACGGT(SEQIDNO:_)表20:DX-88::HSA的氨基酸序列eamhsfcafkaddgpcraahpr^ffniftrqceefiyggcegngnrfes:lEECKKMCTRDGGSGGSGGSGGSGGDAHKSEVAHRFKDLiGEENFKALA/IilAFAQYIjQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSIjHT1jFGDKLC丁VA1TjRETYGEMADCCAKQEPERNECFI^HKDDMPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFIjKKYLYEIARRHPYFYAPEKLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACIjIjPKLDEIjRDEGKASSAKQRLKCASIjGKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEE7VEVSKLVTDIjTKVHTECChgdjl;lecaddRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPI/LEKSHC工AEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLiLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLi工KQNCELFEQIjGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNL/3KVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYXSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCctes:lvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadicti;sekerqikkqTALTVELVKHKPKATKEH(SEQIDNO:表21:C-末端BamHI-HindlllDX-88cDNA的DNA序列GGATCCGGTGGTGAAGCTATGCACTCTTTCTGTGCTTTCAAGGCTGACGACGGTCCGTGCAGAGCTGCTCACCCAAGATGGTTCTTCAACATCTTCACGCGACAATGCGAGGAGTTCATCTACGGTGGTTGTGAGGGTAACCAAAACAGATTCGAGTCTCTAGAGTGTAAGATGTGTACTAGAGACTAATAAGCTT(SEQIDNO:_〉表22:HSA::〖GGS)4rTrT::Dy-WgatgcaCSCagt3aggttgetcateggtttgat仁tggaagsst仁cgcc仁tggtgttg3仁tgcctttgett3tct仁cagcagtgttttcatgtasssttagtaacttttgcaa^aatgtgttgetgatgaggetsattgtgactC￡Lcttcatc仁ttttggagac仁tstgc3ca_gttgcaisetcttcgttatggtstggetgact:gctgtgescctg巧sa±ga^tgcttcttgcasetcccccg^Lttggtgagaccagsggttgatatgtgcactgettttgacgaagagtttttg仁5LCttsgaasttgccagacatcctttttatgccccggaaetccttttctttgetW3&ggtata^ELgetgettttgastgttgcgc仁getgatgetgcctgcc仁g仁tgaagetcgatgaacttegggatgaagggsaggc仁tegtctgrccasscagetcsag亡gtgccagtetctttggagaaagagetttcgcatgggesgtagetcgcctgagecagagatttcccgetgagtttgcagssgtttecsaggtggatcttseegtcacggaa仁gctgcest，gatctgcttgaatgtgetg紅gacagggcggaccttgccaagt己tatetgtaatCMgattegatetecctggaatgctgtcctttgtectgcsttgccgs3gtgsstgatgagcctgc仁gacttgteattsgetgetga^tttt3ttagtgatgtttgctdtgetgsggesgatgtcctgtttta^tgsa仁&tgesagaaggcc仁gsttct狗ctgctgctgagacttgccaaggsa_deca_ctetag巧tgctgtgccgetgcagatcctesttgct3tgccttcgaitgastttcctcttgtggagcctcagttsELtCtgtgagctttttgagcagct仁仁scttccsg33仁cta_tt3gttcgttscdCCaagcccgtgactactcttg仁agaggtcteaagsggagtgggcagetgttgtestcctgaagc，atgccct9tgaatatCt3tecgtggtcctgcagtt3tg仁gtg"gC3t333acgccaiagtagagtc3CCtgctgctecttggtgaggcgatgctttteagetctggaagtcgattscgttccctttgetttcsecttcgcagattgcctttctgagateaagactgcacttgttgagetcgtgC3C.cccaaggcagagC33ctggetgttatggstgatt匕cgcagettttgtagagsagtgctgcaaggetgacgataaggagtgctttgccgaggagsascttgttgetgc3agtgetgccttsggcggtgg仁tctggtggttec.ggtggttctggtggatecggtggtGAAGCTATGCACTCTTTCTGTGCTTTCAAGGCTGACGACGGTCCGTGCAGAGCTGCTCACCCAAGATGGTTCTTCAACATCTTCACGCGACAATGCGAGGAGTTCATCTACGGTGGTTGTGAGGGTAACCAAAACAGATTCGAGTCTCTAGAGGAGTGTAAGAAGATGTGTACTAGAGAC(SEQ工DNO:一表23:表22中編碼的成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL工AFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLiQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDE!jRDEGKASSAKQRIiKCASIjQKFGERAFKAWAVARIiSQRFPKAEFAEVSKLVTDIuTKVHTECCHGDLLECADDRAI)LAKY工CENQDS工SSKLKECCEKPLIjEKSHC工AEVENDEMPADIiPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLiYEYARRHPDYSWlaLLRLAKTYETTIuEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ肌IKQNCEIaFEQLGEYKFQNALAVRYTKKVPQVSTPTLiVEVSRNU3KVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC丁ESl;VNRRPCFSALEVDETYVPKEF船ETFTFHADICTIjSEKERQIKKQTAIiVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAAS。AAIiGLGGSGGSGGSGGSGGEAMHSFCAFKADDGPCRAAHPRWFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRJD(SEQ.IDNO:_)具有2xGS接頭的pDB2300Xl的Notl序列盒j--1GCGGCCGCccgtaatgcggtatcgtgaaagcgaaaaaaaaactaacagtagataagacag!Notl.，..Slatagacagatagagatggacgagaaac:agggggggagaaaaggggaaaagagaaggaaag;121aaagactcatctatcgcagataagacaatcssccctcstGGCGCCtccasccaccatccgINarl,..181cactagggaccaAGCGCTcgcaccgttagcAfe工.-actGCCGGCtNgoM工V241301361421gsaagagc仁ttaagaggc仁tggacacatstgtgcaatgggtttgaacactaccaatagttttgccaagacgcattgcaccttttttaaaCcgacaaatcataxactctatTGCACccgacgaatacgtctgccactaactatagcacagtagatcaggtcBsgl.gctcgcctttacgaggtcactg仁gcctsct4B1atgcacttatgcccggggtcccgggaggagaaaaaacgagggctgggaaatgtccgtgga541ctttaaacgctccgggttagcagagtaGCAgggcttTCGgctttggaaatttaggtgactBcgl.........6D1tgttgaaaaagcaaaatttgggctcagtaatgCCActgcagTGGcttatcacgccaggacBstX工........6￡ILtgcgggagtggcgggggcaaacacacccgcgataaagagcgcgatgaatataaaaggggg721ccsatgttacgtcccgttatattggagttcttcccatacaaaCTTAAGagtccaattageAflII.781ttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacctaattctaacaagcaaagHindI工I(1/2)12345678101112131415MKWVFIVSIFLiFSsatgtgggttttcateg仁Ctecatttt3ttcttgttc仁CCtct1618192021222324252S27282930ASRSDKRGGSGGSgettsctctAGATCTgstaagagaggtGGAggttecBamHI..31323334353S3738394041."4345GGSGGSGGDAHKSEVggtggttcttec的tggtgacgetCSCtecgaagtc"4748495051525354555S57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aattctaacaagcaaag!UndI工I(1/2)Signalsequence--------------------------------------------12345S78S101112131415MKWVF工VS工IjFLFSS829atgsagtgggttttcategtctecattttgttcttgttctectctSignalsequence------------------->----------------1617IS1520212223242S26272S2930AYSRSIaDKREACNLP874gettactctAGATCTttggataagagagaagectgtaacttgccaXba工，-,(1/2)continued--------------------------------------------313233"3536373B334041*4243"4S.IVRGPC工AFFPRWAFattgttagaggtccatgtattgetttcttcccaagatggget仁tcDX890continued---------------------'---------------二-------"474849505152535556575859SODAVKGKCVIjFPYGGC964gatgetgttaagggtaagtgtgttttgttcCCAtatggTGGttgtPf1MI.........Nde工.…continued--------------------------------------------SI6263"6567S370717273747SQGNGNKFYSEKECRE1009caaggt貼cggtaacaagttctactctgaaaaggaatgtagagaacontinued--->Liinker--------------------------------7S777379BOBl82838485BS878889$0YCGVPGGSGGSGGSG1054tactgtggtgttccaggtGGATCCggtggttecggtggttctggtBamHI..Linker------->rHA-------------->3192333495S7S893GSGGDAHKSggttecggtggtgacgetcacaagtectoresidue100101102103104105evahkfgaagtcgetcACCGGTtcAgel...10S107109110111112113工工4KDIjGEENFK1144aaggaCCTAGGtgaggaaaacttcaagAvr工工.12112212312412512612712812911B9ttcgetcaatacttgcaacaatg匕cca115116u7118119120AIivIi工Agetttggtct仁gateget130131132133134135FEDHVKttcgaagatCACGTCaagBmgB工*-13613713813914014114214314414514s147:ub149150vevtefaictCvad1234ttggtcga3gttSLCCttcgetsettgtgttgetgac1511521531541551561571581601611S21S4165ESAENCKSHTFG1279gaatctgetgaatg匕gacsagtecttgc3csecttgttcggt1s616716b1631701*71172173174175176177178179180DKCTVATETYGE1324gataagttgtgtgttget3CCttgrgss3CCtacggtgaa181182184185186187188189iso131192193134195MADCCAKQEPEEC1369atggetgactgttgtgetsagc&sgasCCSgaaag這gaatg仁1961"1982002012022032042052ds20720b209210QHKDDNPNPRv1414ttcttgCSCgacgacCC3ttgCC3ttSgt仁21121221321421521S217218219220221222223224225RPEVDVMCTAFHDNEsgaCC3gaagttgscgtcstgtgtgetttcC3Cgacgas22622722B22923023123223323423523623723B240etfkky工arh1504gaattc匕tgaagaAGTtgtacgaaattgetagaC3C<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>2179222422694S1452453IiEKttggaaasg4S64S7468KVF3sggttttc4814B24B3Ij工ktTGATCAagBell…，454CtgtDgatQ455C470E485N33CAget471FttcCtgt4S7Aget472Ksag487Egaa458Aget473PCC34B8ttg459'"O4S1DPHgeicccacac47447S476IiVEttggtcgaa4B9490491FEQttcgaacaa4S24S3464ECYgaatgttac477478479EPQgaaccsch￡l492493494IiGEttgggtgaa4S5Aget480495tac2314235949S497KFaagttcQv43BQ513Stec4"514TAcc500Aget515P501ttg516Tact502ttg517503Vgtt518VGtt504REgaaXcml,50SYTtacact520521gtcTCTXba工507508503KKVaagasggtcS22523524AGAaacttg(2/2》S10P525Gggt240452S527KVsaggtc528Gggt529stct530K531C532Ctgt533Ksi3g534H53S536PEccagaa53753B539AKRgetaagaGAS40MBsml,2449Bsm工541542543544S45S4S547548549550551552553554555Ccatgtgetgaagattacttgtecgtcgttttgaaccaattg匕gt249455S557VLgttttg558HC3C555Egaa560KaaG561TACc5S2PCC3563VGTC564Stct565566DRgataga567568569570VTKCgtCACcaaGTGtDra工工I......25392584571572CTtgtactS8S587gaaGTC573Sga_a588GAC574Stct589gaa575S76577LVNttgGTTAACHpa工...590T3Ct591592tscgtt5785S3P579RagaKaag580581PCccatgt595596EFgaattc582ttc5975白3Stct5S8get584get599E585lattgS00actSail.2S29601S02FTttC3CCS03FttcS04Hesc605AgetSOSS07DIGATATCEcoRV,.608C609T￡lccS10SllIjSttgtecS12E613KaagS14EgaaS15aga26742719S17QIcaaat仁631532PKccaS18KaagAgetS19K634Tset620QcatsKaag621622TAactget。6EQS23ttg。Sttg624VgttKaagS2SEIigaattgAVgetgtc527VgtcMatgS28KDgatHC3CDgatS30KaagFttc<image>imageseeoriginaldocumentpage91</image>!BsgIct;gcac1450!Bcg工gcaxmnnrmtcg1_5'68!Bara:iGRGCYc1620!PBt工CTGCAg1!Afl工工Ct仁aag1763!Hind工工工Aagctt2801!BglHAgatct594固e工CAtatg1995!BamH工Ggatcc11072$!AgeIAccggt11136iAvr工工Cctagg11149!BmgB;rCACgtc11225$11520iEar工CTCTTCNnim11923IPvu工工CAGctg12006!Bcl工Tgs仁ca12270$12366!Bsm工GAATGCN12444!PshA工GACNNnngtc1250812513125291Hpa工GTTaac125541Sal工Gtcgac12587JEcoRVGATatc12"41Bsu36工CCtnagg128S5!BspEITccgga12890!P:flFIGACNnngtc129B0!TthlllIGACNmigtc129801Acc65工Ggtacc13cm!KprilGGTACC:i3091(Ps丄工TTiV-—￡Si3143i!SpillGCATCci32903101G7GGCCGCccNot::....gtsatgcggtatcgtgaasgcgsaaaaaaasctaacagtsgstsagscagatagacagstagagatggacgagaaacagggggggagaaaaggggaaaagagaaggaaag121aaagsctcatctatcgcagataagacaatcaaccctcatGGCGCCtccaaccaccatccgNarl>..181cactagggaccaAGCGCTcgcaccgttagcaacgcttgactcacaaaccaactGCCGGCtAfe工..WgoMIV2413C14214815"g:sasgagcttggacacatatctttaaacgcgtgcastgggtttgaacactaccsatsgttttgccssgaccaaaggsgfcctatsctctatTGCACccgacBsg工gaatacgtct:agatcaggtcgctcgccttttgtgcctactgcccggggtcccgggaggagaaaasacgagggctgggasstgtccgtggatccgggttagcagagtaGCAs的cttTCGgctttggaaatttaggtgactBcg工.........，601tgttgaaaaagcaaaa仁t仁gggctcag仁aatgCCActgcagTGGcttatcacgccaggacBstX工........PSt工..，661tgcgggagtggcgggggcsaacacacccgcgataasgagcgcgatgaatataassggggg721ccaatgttacgtcccgttatattggagttcttcccatscaaaCTTAAGagtccssttagc'Afm."7B1ttcatcgccaataaaaaaacAAGCTTaacctaattctaacaagcaaagHind工工I(1/2)一丁"123457B1011121314ISMKWVF工VS工FLFSStgggttttca_tcgtctecttgttcttgttctectct:信號(hào)序列]ei^e>第.一種情況161718IS2021222324252627282530ASRSIiDKREACPgettctAGATCTttggstgectgtBgll工，.3132333435373839404142434445工VRGPCIFFRWF5"gt仁sgaggtCC3tg仁sttgetttc仁tcaga仁gggetttc47484950525354555S575已59SOAVKGKCV1;.FP*YGGc9"gatgc仁gtt的tsagtS匕gt匕ttcCCAGGttg仁速,SI6263"65S667S869707172737475GGNGNKFYSEKECREcaaggtaacggtaacasgttc匕actctgaaaaggsatgtsgagas!---接頭_>151929394!GSGGggttecggtggt10S107108109KDLG11"saggaCCTAGGtAvr工:i:.,.121122123124FA<2Y1185ttcgetcastac13613713B139:lvnE1234ttggtcsacgaa151152153154ESAE12"gaatctgetgas1661S7168165DKLC….......…rHA基因959S37SB100DAHKSEgacgetcacaagtecgaa11D111112113114115EENFKAgaggaaaacttcaagget12512S12712B129130:lqqcpfttgcaacastgtccattc140141142143144145V丁EFAKgttaccgaa仁tcgetaag155156157158155ISONCDKSLaactgtgacaagtecttg170171172173174175TVATLR直到密碼子.679101102103104ICSVAHRFgtcgetCACCGGTtcIIS117118119120viattgg仁cttgget131132133.134EDHVgasgatgtcaag14714B149ISOtcvadaxt.tststtgetg&c1611"1S5HTIjFCSCsecttgt:tc，17S177ETyGE767778798081828384b587888SYCGVPGGSGGSGGSL0S4tactgtggtgttccaggtGGATCCggtggttecggtggttct:BamHI..9-G9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage94</formula>2044406Stct407Ksag408Dgac409Vgtt410Ctgt411K412413414get415Egsa416Aget417Kssg418Dgac419Vgtc420Fttc20B9421ttg422Gggt423Matg424Ftt:c425LttgYtsc427EYt￡LCAget43DRagaRsga432Hcac433PCC￡L434Dgac435tsc2134"6Stec437Vgtt438Vgtc439ttgI*ttg441Littg442Ragattg444Aget"5K446T3CC447Yt3C448EgssTact450T217S451ttg452Egaa453K454Ctgt455Ctgt456Aget457Aget458Aget459DgacPCCS4s:1H4S2EgaaCtgt464YtacAget2224KaagVgtt4￡BFttc469Dgat470EgasFttc472Kssg473P474ttg47SVgtc47SE477Egaa478PCC3479Q480481ttg4823tC4B3K4844854BSCtgt487Egsaitittg489Fttc490Egaa432ttg4S3Ggg仁494Egaa495tax2314KFttc498Qcaa499500Aget501ttg502ttg503Vgtt504Rsgs505YtscSOSTact507Kaag50Baag509Vgtc510Pcca_511512VgtcS3_3Stec514T515pCCS516Tset517ttg518Vgtt519Egss520Vgtc521Stct522RagaN524ttg525Gggt2404Ka_3g527VgtcS28Gggt529StctKaag531Ctgt532CtgtKaag534HC3C535PccaEgas537Aget538KaagR540atg2449541PCC3542Ctgt543Aget544E545DgatYtsc547Iittg548Stec549VgtcS50Vgtt5S1tt95525S3Q554ttg555Ctgt2494556Vgtt557t仁g5S8Hcac559EgaaKaagTa_cc562PCC3S63VgtcStctDgat56SagaVgtcTsec569Kaag570Ctgt2539571Ctgt572T3Ct573Egaa574Stct575ttg57SVgtt577MS78R579Raga580PCC3581Ctgt582FttcS83Stct584AgetS65Littg2S8458SEg&s5B7Vgtc588DgacSB9Egas590TElCt591Ytac592V593CCS594Kaa_g5"EgEL3Fttc5S7Msac538Agc仁593EgasSOOTSC仁601Ftt:c602T3CC603Fttc604H605getSOSDgat607axeS08Ctg仁609Tsec610ttgSllStec.612EKaag"4EgaaS15Raga2574SISQ617KaagKa巧620Q621Tac仁622Aget623ttg624Vgt匕625ES2Sttg€27Vgtc628KHC5LC630K271327"280S28542855294430343079311白631"2633<S34S35。6。7638639'640641S42643"4645KATKEQKAVMDDFCC33sggetsetsaggasaaggetgtcatggstgatttc647S50651SS3654S57S58S60AAFVEKCCKADDKETgetgetttcgttgaa3叩tg仁tgtaaggetga_tgataagsetSSI6S3664"56"668663671S72673674675CFAEEGKKVAASQAtgtttcgetgaa_gasggtsa>gaagttggtcgetgettecget接頭576677S78S79680681S82SB3SB468S68768S630ALrGGGSGGSGGSGGgecTTAGGCttsggtggttctgs仁tec柳ggtTCCGGA郇Bsu36工BspE工..DX-(第-二個(gè)編碼區(qū)！)--—至結(jié)^>—S326936947007017027D3704705SGGSGGEACNPIVRsgtggt的ctecggtggtgagget仁gcsatcttCCtategtccgt70S707708709711712713714715716717718719720GPC工AFFPRWAFDAVggcccttgcgecttttttcctcgttgggectttgacgecgtc72172272372472572S7277287"730"1732733734735KGKCVLiFPYGGCQGggctgcg匕cC仁ttttcctggctgccagaat73673773873974174274374574774B749750GNKSEKEcREYcG仁ttt3t9巧9巧tgccgtgagtattgc751Vgtc752PcctGGTACCKpn工.-.taatAAGCTTa終止子終止子Hind工工I(2/2)attc仁tatgatttatgatttttattattaaataagTTM"AAaaaaaataagtGTATACaaattttasagtPsi工..，Bst217I31783238329B33563418gactcttaggttgetttetcageaaatgeetgagttga仁gttcttccacattttaaaacgaaaattcttaaggtatagcatgaggtcgettgeaastegetccccatttcaatctcggtgtgtattttatcggatCGCGGCCGCNotl......ttct仁gagtaactctttcctgtaggtcaggcttattgaccacacc匕ctaccgGCATGCcgSphl..acccsattgtagatatgetaactccagcaagtectcsgaggacaacacctgttgtaatcg(SEQ.IDNO:_J.129:DX890::(GGS)4GG::HA::(GGS)4GG::DX8卯的氨基酸序列EACNLPIVRGPC工AFFPRWAFDAVKGKCVLFPYGGCQGNGNKFYSEKECREYCGVPGGSGGSGGSGGSGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKA!LVIj工A闊Y<formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula>表30:N-末端BglII-BamHlDX-1000cDNA的DNA序別<formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula>表31:DXlOOO::(GGS)4GG::HA的氨基酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula>表32:N-末端BwEI-Kp"IDX-88cDNA-第二個(gè)編碼區(qū)的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>權(quán)利要求1.一種白蛋白融合蛋白，它含有Kunitz結(jié)構(gòu)域肽或其片斷或變異體，和白蛋白，或其片斷或變異體。2.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結(jié)構(gòu)域肽或其片斷或變異體具有功能性活性。3.根據(jù)權(quán)利要求2的白蛋白融合蛋白，其中該功能性活性包含抑制絲氨酸蛋白酶。4.根據(jù)權(quán)利要求2的白蛋白融合蛋白，其中該功能性活性包含抑制纖溶酶。5.根據(jù)權(quán)利要求2的白蛋白融合蛋白，其中該功能性活性包含抑制人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶。6.根據(jù)權(quán)利要求2的白蛋白融合蛋白，其中該功能性活性包含抑制激肽釋放酶。7.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，它含有DX-890或其片斷或變異體和白蛋白或其片斷或變異體。8.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，它含有DPI-14或其片斷或變異體和白蛋白或其片斷或變異體。9.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，它包含DX-88或其片斷或變異體和白蛋白或其片斷或變異體。10.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，它包含DX-1000或其片斷或變異體和白蛋白或其片斷或變異體。11.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白包含至少兩個(gè)Kimitz結(jié)構(gòu)域融合肽或其片斷或變異體。12.根據(jù)權(quán)利要求11的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域融合肽或其片斷或變異體分別具有功能性活性。13.根據(jù)權(quán)利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域融合肽之一的功能性活性包含抑制絲氨酸蛋白酶。14.根據(jù)權(quán)利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域融合肽之一的功能性活性包含抑制纖溶酶。15.根據(jù)權(quán)利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域融合肽之一的功能性活性包含抑制人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶。16.根據(jù)權(quán)利要求12的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域融合肽之一的功能性活性包含抑制激肽釋放酶。17.根據(jù)權(quán)利要求11的白蛋白融合蛋白，其中至少兩個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域肽或其片斷或變異體具有不同的氨基酸序列。18.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，它包含選自由DX-890,DX-88，DX-1000,或DPI-14組成的組中的肽的至少一個(gè)片斷或變異體和白蛋白或其片斷或變異體，其中所述的白蛋白片斷或變異體具有白蛋白活性且所述的肽片斷或變異體具有功能性活性。19.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述的白蛋白活性具有與未融合狀態(tài)的肽或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期相比延長(zhǎng)選自由DX-890，DX-88，DX-IOOO，或DPI-14組成的組中的肽，或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期的能力。20.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，它還包含一個(gè)或多個(gè)額外的白蛋白半分子。21.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白包含選自由DX-890，DX-88,DX-IOOO，或DPI-14組成的組中的一個(gè)或多個(gè)半分子，或其片斷或變異體，或一個(gè)或多個(gè)額外的白蛋白半分子。22.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述的融合蛋白還包含化學(xué)半分子。23.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體與白蛋白的N-末端或者與白蛋白的片斷或變異體的N-末端融合。24.根據(jù)權(quán)利要求23的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結(jié)構(gòu)域肽含有DX-8卯，DPI-14,DX-88,或DX-IOOO。25.權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結(jié)構(gòu)域肽或其片斷或變異體，與白蛋白的C-末端，或白蛋白的片斷或變異體的C-末端融合。26.根據(jù)權(quán)利要求24的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結(jié)構(gòu)域肽包含DX-890,DPI-14，DX-88，或DX-IOOO。27.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中所述的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽包含第一肽，或其片斷或變異體，和第二肽，或其片斷或變異體，且其中所述的肽，或其片斷或變異體不同于所述的第二肽，或其片斷或變異體。28.根據(jù)權(quán)利要求27的白蛋白融合蛋白，其中所述的第一肽，或其片斷或變異體，和所述的第二肽，或其片斷或變異體選自由DX-890,DX-88,DX-1000,或DPI-14組成的組中。29.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體通過(guò)接頭與該白蛋白或白蛋白的片斷或變異體分開(kāi)。30.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白包含如下通式R2-R1;Rl-R2;R2-R1隱R2;R2-L-R1-L-R2;Rl-L-R2;R2-L-R1;或R1-L-R2畫(huà)L-R1，其中Rl是選自由DX-890,DX-88,DX-1000,或DPI-14組成的組中的至少一個(gè)肽，或其片斷或變異體，L是肽接頭，R2是白蛋白。31.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中融合到白蛋白，或其片斷或變異體上的該Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體的體外生物學(xué)活性比未融合狀態(tài)的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體的體外生物學(xué)活性更高。32.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中與白蛋白，或其片斷或變異體融合的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體的可溶性比處于相同貯存，處理或生理學(xué)條件下的未融合狀態(tài)的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽，或其片斷或變異體的可溶性更高。33.根據(jù)權(quán)利要求30的白蛋白融合蛋白，其中與白蛋白，或其片斷或變異體融合的至少一個(gè)肽，或其片斷或變異體的體內(nèi)生物學(xué)活性比未融合狀態(tài)的至少一個(gè)肽，或其片斷或變異體的體內(nèi)生物學(xué)活性更高。34.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白是非糖基化的。35.根據(jù)權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白在酵母中表達(dá)。36.根據(jù)權(quán)利要求35的白蛋白融合蛋白，其中該酵母是糖基化缺陷型。37.根據(jù)權(quán)利要求36的白蛋白融合蛋白，其中該酵母是蛋白酶缺陷型。38.根據(jù)權(quán)利要求l的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。39.根據(jù)權(quán)利要求38的白蛋白融合蛋白，其中該白蛋白融合蛋白通過(guò)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。40.—種組合物，它含有權(quán)利要求1-39任一項(xiàng)的白蛋白融合蛋白和藥用上可接受的載體。41.一種治療患者疾病或紊亂的方法，包含施用權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白的步驟。42.—種治療患有可由DX-890和/或DPI-14調(diào)控的嚢性纖維化或嚢性纖維化相關(guān)性疾病或紊亂的患者的方法，包括施用有效量的權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白的步驟，其中所述的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽是DX-8卯或DPI-14,或其片斷或變異體。43.—種延長(zhǎng)DX-890和/或DPI-14，或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期的方法，包含將DX-8卯和/或DPI-14，或其片斷或變異體融合到白蛋白，或白蛋白的片斷或變異體上的步驟，以便與未融合狀態(tài)下的DX-890和/或DPI-14，或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期相比足以延長(zhǎng)DX-890和/或DPI-14，或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期。44.一種治療患有可通過(guò)DX-88調(diào)控的遺傳性血管性水腫或遺傳性血管性水肺相關(guān)性疾病或紊亂的患者的方法，包括施用有效量的權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白的步驟，其中所述的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽是DX-88,或其片斷或變異體。45.—種延長(zhǎng)DX-88,或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期的方法，包含將該DX-88，或其片斷或變異體融合到白蛋白或白蛋白的片斷或變異體上的步驟，以便與未融合狀態(tài)下的DX-88,或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期相比足以延長(zhǎng)DX-88，或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期。46.—種治療患有可通過(guò)DX-1000調(diào)控的癌癥，癌癥相關(guān)性疾病，出血或紊亂的患者的方法，包括施用有效量的權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白的步驟，其中所述的Kunitz結(jié)構(gòu)域肽是DX-lOOO，或其片斷或變異體。47.—種延長(zhǎng)DX-IOOO，或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期的方法，包含將DX-IOOO，或其片斷或變異體融合到白蛋白或白蛋白的片斷或變異體上的步驟，以便與未融合狀態(tài)下的DX-1000,或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期相比足以延長(zhǎng)DX-IOOO,或其片斷或變異體的體內(nèi)半衰期。48.—種核酸分子，它包含編碼權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白的多核苷酸序列。49.含有權(quán)利要求48的核酸分子的載體。50.含有權(quán)利要求48的核酸分子的宿主細(xì)胞。51.—種藥用組合物，它包含有效量的權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白和藥用上可接受的載體或賦形劑。52.—種制備權(quán)利要求1的白蛋白融合蛋白的方法，該方法包括(a)提供在生物中可表達(dá)的含有編碼白蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸；(b)在該生物中表達(dá)該核酸以形成白蛋白融合蛋白；和Cc)純化該白蛋白融合蛋白。53.權(quán)利要求52的方法，其中該白蛋白融合蛋白包含在糖基化缺陷型酵母菌抹中表達(dá)的DX-890和/或DPI-14白蛋白融合蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及包含與白蛋白或其片斷或變異體融合的諸如Kunitz結(jié)構(gòu)域肽(包括，但不限于其片斷和變異體)的絲氨酸蛋白酶抑制肽的蛋白質(zhì)。這些融合蛋白在本文中統(tǒng)稱為“本發(fā)明的白蛋白融合蛋白”。這些融合蛋白表現(xiàn)出在溶液中的儲(chǔ)存期延長(zhǎng)和/或治療活性延長(zhǎng)。本發(fā)明包含治療性白蛋白融合蛋白，組合物，藥用組合物，劑型和試劑盒。本發(fā)明還包含編碼本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有這些核酸的載體，用這些核酸和載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和使用這些核酸，載體，和/或宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的方法。本發(fā)明還涉及抑制嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，激肽釋放酶，和纖溶酶的組合物和方法。本發(fā)明還涉及治療囊性纖維變性和癌癥的組合物和方法。文檔編號(hào)C07K14/76GK101166762SQ03807516公開(kāi)日2008年4月23日申請(qǐng)日期2003年2月7日優(yōu)先權(quán)日2002年2月7日發(fā)明者托馬斯·韋默,斯科特·M·基,漢斯-彼得·豪澤,瓦爾·羅姆伯格,羅伯特·C·拉德納,達(dá)里爾·斯利普,阿瑟·C·利申請(qǐng)人:達(dá)爾塔生物技術(shù)有限公司;戴克斯公司