專利名稱：：細(xì)胞因子蛋白質(zhì)家族的制作方法細(xì)胞因子蛋白質(zhì)家族
背景技術(shù)：
：多細(xì)胞生物的細(xì)胞分化由激素和多肽生長因子控制。這些可擴(kuò)散的分子使得細(xì)胞能夠彼此交流并彼此相呼應(yīng)地行動以形成組織和器官、以及修復(fù)和再生損壞的組織。激素和生長因子的實(shí)例包括尤其是類固醇激素、甲狀旁腺激素、促濾泡激素、干擾素、白細(xì)胞介素、血小板來源的生長因子、表皮生長因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。激素和生長因子通過和受體蛋白結(jié)合影響細(xì)胞代謝。某些受體是膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，它們在細(xì)胞外與激素或生長因子結(jié)合，并在細(xì)胞內(nèi)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如第二信使系統(tǒng)連接。其它類型的受體是可溶性細(xì)胞內(nèi)分子。細(xì)胞因子一般刺激造血細(xì)胞譜系細(xì)胞的增殖或分化，或參與機(jī)體的免疫和炎癥應(yīng)答機(jī)制。影響血細(xì)胞生成的細(xì)胞因子的實(shí)例有刺激紅細(xì)胞發(fā)育的紅細(xì)胞生成素(EPO);刺激巨核細(xì)胞譜系的細(xì)胞發(fā)育的血小板生成素(TPO);和刺激中性粒細(xì)胞發(fā)育的粒細(xì)胞集落剌激因子(G-CSF)。這些細(xì)胞因子可用于恢復(fù)貧血癥、血小板減少癥及中性粒細(xì)胞減少癥患者或接受癌癥化療的患者的正常血細(xì)胞水平，細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成和免疫應(yīng)答中有重要作用，并可以影響淋巴細(xì)胞的發(fā)育。人II類細(xì)胞因子家族包括干擾素-a(IFN-a)亞型、干擾素-P(IFN-p)、干擾素-y(IFN-y)、IL-10、IL-19(美國專利5，985，614)、MDA—7(Jiang等，Oncogene11，2477—2486，(1995))、IL-20(Jiang等，Oncogene11，2477-2486，(1995))、IL-22(Xie等，J.Biol.Chem.275，31335-31339，(2000))和AK-155(Knappe等，J.Virol.74，3881-3887(2000))。大多數(shù)細(xì)胞因子通過與I類或II類細(xì)胞因子受體結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。人II類細(xì)胞因子受體家族的成員包括千擾素-aRl(IFN-aRl)、干擾素-y-R2(IFN-y-R2)、干擾素，R1(IFN，Rl)、干擾素-yR2(IFN-yR2)、IL-10R(Liu等，J.Im畫o1.152,182卜1829'(1994))、CRF2-4(Lutfalla等，Genomics16，366-373，(1993))、IL—20Rp(Blumberg等，Cell,104，9一19，(2001))(又稱作zcytor7(美國專利5，945，511)和CRF2-8(Kotenko等，Oncogene19，2557-2565,(200))、IL-20叩(Blumberg等，同上，(2001))(又稱作DIRS1(PCTW099/46379))、IL-22RA1(IL-22受體al，提交HUGO要求批準(zhǔn))(又稱作IL-22R(Xie等，J.Biol.Chem.275，31335—31339，(2000))、zcytor11(美國專利5，965，704)和CRF2-9(Kotenko等，Oncogene,19，2557-2565，(2000))及組織因子。II類細(xì)胞因子受體典型地是異二聚體，由兩個(gè)不同的受體鏈，即a和P受體亞基組成(Stahl等，Cell,74，587-590，(1993))。一般地，a亞基是主要的細(xì)胞因子結(jié)合蛋白，而[J亞基是形成高親和結(jié)合位點(diǎn)以及進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。IL-20受體是一個(gè)例外，其中的兩個(gè)亞基均是IL-20結(jié)合所必需的(Blumberg等，同上(2001))。II類細(xì)胞因子受體可以通過受體的細(xì)胞外部分中大約200個(gè)氨基酸(D200)的保守細(xì)胞因子結(jié)合域來鑒定。該細(xì)胞因子結(jié)合域由兩個(gè)III型纖連蛋白(FnIII)域(各大約有100個(gè)氨基酸)組成(BazanJ.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，6934-6938(1990);Thoreau等，F(xiàn)EBSLett.282，16-31(1991))。每個(gè)FnIII域都含有保守的Cys、Pro和Trp殘基，這些殘基決定了7個(gè)P鏈的特征性折疊方式，其類似于免疫球蛋白的恒定區(qū)(Uze等，J.InterferonCytokinRes.15,3-26(1995))。II類細(xì)胞因子受體家族的保守結(jié)構(gòu)元件使得可以基于一級氨基酸序列同源性l定該家族的新成員。使用該方法，先前我們已經(jīng)成功地鑒定到兩個(gè)II類細(xì)胞因子受體家族新成員，zcytor7(美國專利5,945,511)(又稱作IL—22Ra(Blumberg等，同上(2001))和zcytorll(美國專利5，965，704)(又稱作IL-22R(Blumberg等，同上(2001))。由于細(xì)胞因子在生物學(xué)應(yīng)答的調(diào)節(jié)中的重要作用，因此鑒定ii類細(xì)胞因子受體家族的其它新成員是有意義的。il-22，又稱作il-tif(il-10相關(guān)的t細(xì)胞來源的可誘導(dǎo)因子)(Du匪tier等，J.Immunology164，1814-1819，(2000))，是新近描述的IL-10同系物。小鼠的IL-22最初被鑒定為在體外T細(xì)胞和肥大細(xì)胞中IL-9謙導(dǎo)的基因(D聽utier等，J.I畫nology,164,1814-1819，(2000))。注射IL-22后在小鼠肝中觀察到急性期反應(yīng)物誘導(dǎo)活性，并且在注射脂多糖(LPS)后快速誘導(dǎo)了il-22的表達(dá)，這提示IL-22參與體內(nèi)的炎癥應(yīng)答(Dumoutier等，Proc.Natl.Acad.Sci,USA，97，10144-10149(2000))。白細(xì)胞介素是介導(dǎo)免疫學(xué)應(yīng)答(包括炎癥)的細(xì)胞因子家族。白細(xì)胞介素介導(dǎo)多種炎性病理。t細(xì)胞是免疫應(yīng)答的中樞，其產(chǎn)生許多細(xì)胞因子和針對抗原的獲得性免疫。t細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子被劃分為1型和2型(Kelso，A.，Immun.CellBiol.76:300—317，1998)。1型細(xì)胞因子包括il-2、ifn-y、lt-a，其參與炎癥應(yīng)答、病毒免疫、細(xì)胞內(nèi)寄生物免疫和同種異體移植排斥。2型細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，其參與體液應(yīng)答、蠕蟲免疫和過敏反應(yīng)。l型和2型共有的細(xì)胞因子包括IL-3、GM-CSF和TNF-a。有一些證據(jù)提示產(chǎn)生1型和2型的T細(xì)胞群體偏好向不同類型的發(fā)炎組織中遷移。從治療的角度出發(fā)，干擾素尤其有意義(關(guān)于干擾素的綜述見DeMaeyer和DeMaeyer-Guignard，"干擾素，，，《細(xì)胞因子手冊》(TheCytokineHandbook),第3版，Thompson(編)，第491-516頁(AcademicPressLtd.1998)和Walsh,Biopharmaceuticals:BiochemistryandBiotechnology,第158-188頁(JohnWiley&Sons1998))。干擾素顯示出多種生物學(xué)活性，可用于治療某些自身免疫疾病(尤其是癌癥)和增強(qiáng)對感染劑(包括病毒、細(xì)菌、真菌和原生生物)的免疫應(yīng)答。迄今，已經(jīng)鑒定到6種形式的干擾素，它們分為兩個(gè)大組。所謂的"i型"干擾素包括干擾素a、干擾素p、干擾素(o、干擾素3、干擾素t。目前，干擾素y和干擾素a的一個(gè)亞類是僅有的ii型干擾素。i型干擾素被認(rèn)為來源于相同的祖先基因，保留了充分相似的結(jié)構(gòu)以致可以通過相同的細(xì)胞表面受體起作用。人干擾素a/(5受體的a鏈包含n端細(xì)胞外域，其具有ii類細(xì)胞因子受體的特征。千擾素y與i型干擾素或ii型干擾素a亞型沒有顯著的同源性，但與i型干擾素有許多相同的生物學(xué)活性。對于人而言，至少有16個(gè)非等位基因編碼不同亞型的干擾素a,而干擾素p和(0僅由單個(gè)基因編碼。i型干擾素基因成簇排列在9號染色體的短臂中。與人類的典型結(jié)構(gòu)基因不同，干擾素a、干擾素(J和干擾素co缺少內(nèi)含子。編碼人干擾素y的單個(gè)基因位于第12號染色體上并含有3個(gè)內(nèi)含子。迄今，干擾素T僅在牛和綿羊中有過描述，而干擾素5僅在豬中有過描述。臨床醫(yī)師借助干擾素的多種活性利用該蛋白治療多種疾病。例如，一種形式的干擾素a已被50多個(gè)國家批準(zhǔn)用于治療醫(yī)學(xué)疾病，如多毛細(xì)胞白血病、腎細(xì)胞癌、基層細(xì)胞癌、惡性黑素瘤、aids相關(guān)的卡波西肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、非何杰金氏淋巴瘤、喉乳頭狀瘤、蕈樣肉芽腫病、尖銳濕疣、慢性乙型肝炎、丙型肝炎、慢性丁型肝炎、慢性非甲非乙/丙型肝炎。美國藥品和食品管理局已經(jīng)批準(zhǔn)使用干擾素P治療多發(fā)性硬化、神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病。干擾素7被用于治療慢性肉芽腫性疾病，干擾素在其中增強(qiáng)患者的免疫應(yīng)答以破壞感染性細(xì)菌、真菌和原生生物病原體。臨床研究還指出，干擾素y可以用于治療aids、利什曼病和瘤型麻風(fēng)。已證實(shí)的細(xì)胞因子家族的體內(nèi)活性說明其它細(xì)胞因子、細(xì)胞因子激動劑和細(xì)胞因子拮抗劑的巨大臨床潛力和需求。本發(fā)明通過提供刺激造血細(xì)胞譜系的細(xì)胞的新細(xì)胞因子以及相關(guān)的組合物和方法來滿足這些需求。發(fā)明詳述在詳細(xì)闡述本發(fā)明之前，定義如下術(shù)語可能有助于本發(fā)明的理解。術(shù)語"親和標(biāo)簽"在本文中用于指可以和第二多肽結(jié)合以便于該第二多肽的純化或檢測或?yàn)榈诙嚯暮偷孜锏慕Y(jié)合提供位點(diǎn)的多肽片斷。原則上，可以獲得其抗體或其它特異性結(jié)合劑的任何肽或蛋白質(zhì)均可以用作親和標(biāo)簽。親和標(biāo)簽包括多聚組氨酸序列段、A蛋白(Nilsson等，EMBOJ.4:1075，1985;Nilsson等，MethodsEnzymol.198:3，1991)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Smith和Johnson等，Gene67:31，1988)、Glu-Glu親和標(biāo)簽(Grusse廳yer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:7952-4，1985)、P物質(zhì)、FlagTl(Hopp等，Biotechnology6;1204-10，1988)、鏈霉親和素結(jié)合肽、或其它抗原性表位或結(jié)合域。一般參見Ford等,ProteinExpressionandPurification2:95-107，199L編碼親和標(biāo)簽的DNA可從供應(yīng)商(例如PharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)處獲得。術(shù)語,位變體"在本文中用于指占據(jù)相同的染色體座位的兩個(gè)或多個(gè)不同基因形式中的任一個(gè)。等位變異可以通過突變自然產(chǎn)生，并可以在群體內(nèi)導(dǎo)致表型多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中沒有改變)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語等位變體在本文中也用于指由等位基因變體編碼的蛋白質(zhì)。術(shù)語嚷基端"和繁基端"在本文中用于指多肽內(nèi)的位置。在上下文允許的情況下，參考多肽的特定序列或部分，這些術(shù)語用于指鄰近或相對的位置。例如，在一個(gè)多肽中位于參考序列羧基端的某個(gè)序列指該序列位于該參考序列的羧基端近側(cè)的位置，但不一定位于完整多肽的羧基端。術(shù)語"互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對"是指不相同的部分，這些部分在適當(dāng)?shù)臈l件將形成通過非共價(jià)方式連接的穩(wěn)定對。例如，生物素和親和素(或鏈霉親和素)是互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對的典型成員?；パa(bǔ)物/反互補(bǔ)物對的其它實(shí)例包括受體/配體對、抗體/抗原(或半抗原或表位)對、有義/反義多核苷酸對等。當(dāng)期望隨后使互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對解離時(shí)，優(yōu)選該互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對具有小于109\T的結(jié)合親和力。術(shù)語"多核苷酸分子的互補(bǔ)分子"是指與參考序列相比具有互補(bǔ)堿基序列并取向相反的多核苷酸分子。例如，序列5，ATGCACGGG3，與5，CCCGTGCAT3，互補(bǔ)。術(shù)語1f并核苷酸序列"是指包括一個(gè)或多個(gè)筒并密碼子(與編碼多肽的參考多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。筒并密碼子含有不同的核苷酸三聯(lián)體，但編碼相同的氨基酸殘基(例如，GAU和GAC三聯(lián)體均編碼Asp)。術(shù)語"表達(dá)載體"用于指包含編碼目的多肽的區(qū)段的線性或環(huán)狀DNA分子，其中所述的多肽編碼區(qū)段在該DNA分子中與幫助其轉(zhuǎn)錄的其它區(qū)段可操作地連接。這些其它區(qū)段包括啟動子和終止序列，并還可以包括一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子、多腺苦酸化信號等。表達(dá)載體一般來源于質(zhì)?；虿《綝NA，或可以含有兩者的元件。術(shù)語"分離的"當(dāng)應(yīng)用于多核苷酸時(shí)是指該多核普酸已經(jīng)離開其天然遺傳環(huán)境并因此不含有其它無關(guān)或不需要的編碼序列，而且它以適合在遺傳工程化蛋白質(zhì)制備系統(tǒng)中使用的形式存在。該分離的分子是從其天然環(huán)境中被分離出來的那些分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離的DNA分子不含有原來與之相連接的其它基因，但可以包括天然存在的5，和3，非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。相連區(qū)域的鑒定對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是明顯的(參見例如，Dynan和Tijan，Nature316:774-78，1985)。"分離的"多肽或蛋白質(zhì)是在非其天然環(huán)境的條件下，例如離開血液和動物組織存在的多肽或蛋白質(zhì)。在優(yōu)選形式中，分離的多肽基本上不含有其它多肽，尤其是動物來源的其它多肽。優(yōu)選提供高度純化形式，即純度大于95%、更優(yōu)選純度大于99%的多肽。在上下文中，術(shù)語"分離的"不排除存在其它可能的物理形式(如二聚體)或其它可能的糖基化或衍生形式的相同多肽。術(shù)語,生"當(dāng)指細(xì)胞時(shí)表示細(xì)胞正在經(jīng)歷新的異常增殖，尤其是在增殖不受控制和進(jìn)行性發(fā)展的組織中，從而導(dǎo)致贅生物的產(chǎn)生。贅生性細(xì)胞可以是惡性的，例如侵入性的和轉(zhuǎn)移性的，或是良性的。術(shù)語，操作地連接的"當(dāng)指DNA區(qū)段時(shí)表示這些區(qū)段按一定方式排列以致它們可以協(xié)調(diào)地為其預(yù)期的目的發(fā)揮作用，例如在啟動子中起始轉(zhuǎn)錄并前行通過編碼區(qū)段到達(dá)終止子。術(shù)語，向進(jìn)化同源物"(ortholog)是指從一個(gè)物種獲得的多肽或蛋白質(zhì)，其是來自不同物種的多肽或蛋白質(zhì)的功能對應(yīng)物。定向進(jìn)化同源物之間的序列差異是物種形成的結(jié)果。"平行進(jìn)化同源物"(paralog)是生物體產(chǎn)生的不同的但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)。平行進(jìn)化同源物被認(rèn)為起源于基因重復(fù)。例如，a珠蛋白、p珠蛋白和肌紅蛋白彼此是平行進(jìn)化同源物。"多核苷酸"是指從5，向3，末端閱讀的脫氧核糖核普酸或核糖核香酸堿基的單鏈或雙鏈多聚物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以從天然來源分離、體外合成或通過天然和合成的分子的組合來制備。多核苷酸的大小表示為堿基對(縮寫"bp")、核苷酸("nt")或千堿基("kb")。在上下文允許的情況下，后兩個(gè)術(shù)語可以描述單鏈或雙鏈的多核苷酸。當(dāng)該術(shù)語應(yīng)用于雙鏈分子時(shí)，其用于指整個(gè)長度，并且應(yīng)理解為相當(dāng)于術(shù)語誠基對"。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，雙鏈多核苷酸的兩條鏈可以在長度上稍有差異而且它們的末端可以因酶促切割而是交錯(cuò)的；因此在雙鏈多核苷酸分子中可能并非所有的核苷酸都是配對的。"多肽"是指通過肽鍵連接的氨基酸殘基的多聚物，它們可以是天然產(chǎn)生的或合成產(chǎn)生的。少于約10個(gè)氨基酸殘基的多肽通常被稱作肽"。術(shù)語"啟動子"在本文中用于表示其所在領(lǐng)域認(rèn)可的含義，指含有為RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始提供條件的DNA序列的基因部分。啟動子序列通常，但并不總是，存在于基因的5'非編碼區(qū)。"蛋白質(zhì)"是指包含一個(gè)或多個(gè)多肽鏈的大分子。蛋白質(zhì)還可以包含非肽成分，如糖基。糖和其它非肽取代基可以由產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞添加至蛋白質(zhì)上，并且它們將隨細(xì)胞類型的不同而不同。蛋白質(zhì)在本文中以其氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)來定義；諸如糖基等這樣的取代基一般不作詳細(xì)說明，但可以存在。術(shù)語"受體"是指與生物活性分子(即配體)結(jié)合并介導(dǎo)配體對細(xì)胞的作用的細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)。膜結(jié)合受體的特征在于包含細(xì)胞外配體結(jié)合域和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)域(典型地參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo))的多個(gè)肽的結(jié)構(gòu)。配體與受體的結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象改變，引起效應(yīng)域和細(xì)胞內(nèi)的其它分子之間發(fā)生相互作用。該相互作用又導(dǎo)致細(xì)胞代謝的改變。與受體-配體相互作用聯(lián)系的代謝事件包括基因轉(zhuǎn)錄、磷酸化、去磷酸化、環(huán)AMP產(chǎn)生的增加、細(xì)胞鈣動員、膜脂動員、細(xì)胞粘著、肌醇脂的水解和磷脂的水解。受體一般可以是膜結(jié)合的、細(xì)胞質(zhì)的或細(xì)胞核的；單體(例如促甲狀腺激素受體、p腎上腺素受體)或多體(例如PDGF受體、生長激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、紅細(xì)胞生成素受體和IL-6受體)。術(shù)語"分泌信號序列"是指編碼如下多肽("分泌肽")的DNA序列，所述多肽作為更大多肽的一個(gè)成分指導(dǎo)該更大多肽通過合成它的細(xì)胞的分泌途徑。該更大多肽通常在運(yùn)輸通過分泌途徑的過程中被切割而除去分泌肽。術(shù)語"拼接變體"在本文中用于指基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA的多種可選擇形式。拼接變異通過利用存在于轉(zhuǎn)錄的RNA分子中的、或較少情況下單獨(dú)轉(zhuǎn)錄的RNA分子之間的多個(gè)可供選擇的拼接位點(diǎn)而自然產(chǎn)生，并可以導(dǎo)致從相同的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生幾種mRNA。拼接變體可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語拼接變體在本文中也用于指基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA拼接變體編碼的蛋白質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解通過粗略的分析方法(例如凝膠電泳)測定的多聚物的分子量和長度是近似值。當(dāng)該值以"約"X或"大約"X表示時(shí)，X的所述值應(yīng)理解為精確到±10%。本文引用的所有參考文獻(xiàn)均完整地并入作為參考。本發(fā)明包括與干擾素具有功能和結(jié)構(gòu)相似性的一類多核苷酸和多肽分子。此新家族包括命名為zcyto20(SEQIDN0S:1和2)、zcyto21(SEQIDNOS:4和5)、zcyto22(SEQIDNOS:6和7)、zcyto24(SEQIDN0S:8和9)、zcyto25(SEQIDNOS:10和11)的分子，其中zcyto20、21和22是人的序列而zcyto24和25是小鼠的序列。表1顯示了核普酸和氨基酸水平上該家族內(nèi)的同源性，該同源性在核苷酸水平上為大約72%至98%,而在氨基酸水平上為大約51%至97%。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2顯示了zcyto20、zcyto21、zcyto22、IFNa、IFNp、IFNy和IL-10在氨基酸水平上的序列一致性。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>該家族的所有成員均被證實(shí)和相同的II類細(xì)胞因子受體結(jié)合，該受體被命名為zcytorl9受體。而且，已經(jīng)證實(shí)家族中的所有成員均表現(xiàn)出某些生物學(xué)活性。這些活性包括例如抗病毒活性和增加循環(huán)的髓樣細(xì)胞水平。盡管不想受到理論的束綽，但這些分子似乎均通過zcyt0rl9受體沿著相同的途徑傳導(dǎo)信號。zcyto加基因編碼Z05個(gè)氨基酸的多肽，顯示在SEQIDN0:2中?？梢灶A(yù)測出Zcyto20的信號序列包含SEQIDNO:2第1位氨基酸殘基(Met)至第21位氨基酸殘基(Ala)。Zcyto20的成熟肽起始于第22位氨基酸殘基(Val)。Zcyto21基因編碼200個(gè)氨基酸的多肽，顯示在SEQIDNO:5中?？梢灶A(yù)測出Zcyto21的信號序列包含SEQIDNO:5第1位氨基酸殘基(Met)至第19位氨基酸殘基(Ala)。Zcyto21的成熟肽起始于第20位氨基酸殘基(Gly)。Zcyto21描述在PCT申請WO02/02627。Zcyto22基因編碼205個(gè)氨基酸的多肽，顯示在SEQIDNO:7中?？梢灶A(yù)測出Zcyto22的信號序列包含SEQIDNO:7第1位氨基酸殘基(Met)至第21位氨基酸殘基(Ala)。Zcyto22的成熟肽起始于第22位氨基酸殘基(Val)。Zcyto24基因編碼202個(gè)氨基酸的多肽，顯示在SEQIDNO:9中。Zcyto24的分泌信號序列包含SEQIDNO:9第1位氨基酸殘基(Met)至第28位氨基酸殘基(Ala)?？梢栽诘?4位氨基酸殘基(Thr)位置找到該分泌信號序列的另一個(gè)可選擇的切割位點(diǎn)。成熟多肽包含第29位氨基酸殘基(Asp)至第202位氨基酸殘基(Val)。Zcyto25基因編碼202個(gè)氨基酸的多肽，顯示在SEQIDNO:11中。Zcyto25的分泌信號序列包含SEQIDNO:11的第1位氨基酸殘基(Met)至第28位氨基酸殘基(Ala)。可以在第24位氨基酸殘基(Thr)位置找到該分泌信號序列的另一個(gè)可選擇的切割位點(diǎn)。成熟多肽包含第29位氨基酸殘基(Asp)至第202位氨基酸殘基(Val)。Zcyto20、zcyto21和zcyto22基因已經(jīng)被作圖定位在人類染色體19ql3.13?；谶@些基因的發(fā)現(xiàn)，19號染色體的該區(qū)域被確定為包含一簇干擾素樣基因。這是一個(gè)新的基因家族的另一證據(jù)是在小鼠第7號染色體上鑒定到一簇同線基因，zcyto24(SEQIDNO:8)和zcyto25(SEQIDNO:10)。正如下述，本發(fā)明提供具有與SEQIDNO:2的第22位至第205位氨基酸殘基或SEQIDNO:2第1位至第205位氨基酸殘基至少70%、至少80%或至少90%、95%、96%、97%、98%或99%—致的氨基酸序列的分離的多肽，或其某些片斷。本發(fā)明還包括進(jìn)一步含有位于第一氨基酸序列的氨基端位置的信號分泌序列的多肽，其中該信號分泌序列包含SEQIDNO:2氨基酸序列第1至第21位氨基酸殘基。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有與SEQIDNO:7第22至205位氨基酸殘基或SEQIDNO:7第1至205位氨基酸殘基至少70%、至少80%或至少90%、95%、96%、97%、98%或99%—致的氨基酸序列的分離的多肽。本發(fā)明還包括進(jìn)一步含有位于此第一氨基酸序列的氨基端位置的信號分泌序列的多肽，其中該信號分泌序列包含SEQIDNO:7氨基酸序列的第1至21位氨基酸殘基。一般地，象紅細(xì)胞生成素(EP0)這樣的細(xì)胞因子被預(yù)測具有4個(gè)a螺旋結(jié)構(gòu)(其中螺旋A、C和D在配體和受體的相互作用中最為重要)，而且是該家族成員中更為高度保守的。然而，干擾素(IFN),尤其是干擾素a和干擾素t的特征在于6個(gè)螺旋束。EP0螺旋A相當(dāng)于zcyto20的螺旋A;EP0螺旋B相當(dāng)于zcyto20的螺旋C;EP0螺旋C相當(dāng)于zcyto20的螺旋D;EPO螺旋D相當(dāng)于zcyto20的螺旋F。這樣，EPO的AB環(huán)和CD環(huán)之間的環(huán)在zcyto20中被擴(kuò)展而含有zcyto20的短螺旋B和E。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的螺旋結(jié)構(gòu)與干擾素中發(fā)現(xiàn)的6螺旋結(jié)構(gòu)相似。蛋白質(zhì)中二級結(jié)構(gòu)的邊界一般從蛋白質(zhì)的3維模型根據(jù)蛋白質(zhì)主鏈的一系列PHI和PSI角來確定。可以從例如x射線晶體學(xué)或NMR數(shù)據(jù)、或基于已闡明的結(jié)構(gòu)的同源性模擬來構(gòu)建模型。根據(jù)所用技術(shù)，包括晶體形成和柔性NMR溶液結(jié)構(gòu)測定所用的條件，這些二級結(jié)構(gòu)的邊界可以稍有不同。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，根據(jù)環(huán)境的不同，螺旋邊界及一般而言二級結(jié)構(gòu)可以移動多達(dá)2、3、4或更多個(gè)殘基，但螺旋區(qū)域基本上如下面的描述。(見Brandon和Toosze,IntroductiontoProteinStructure,GarlandPublishingCo,inc.紐約，1991;Anderson等，Structure,10(2):175-84，2002。)預(yù)測的Zcyto20的螺旋如下螺旋A由第52(Ala)至66(Leu)位氨基酸殘基確定；螺旋B為第78(Arg)至87(Val)位氨基酸殘基；螺旋C為第91(Pro)至第108(Thr)位氨基酸殘基；螺旋D為第116(Val)至138(Ser)位氨基酸殘基；螺旋E為第151(Thr)至172(Lys)位氨基酸殘基；和螺旋F為第177(Gly)至197(Cys)位氨基酸殘基；參見SEQIDNO:2。4個(gè)半胱氨酸殘基在Zcyto20、Zcyto21和IFN-a中是保守的。此外，zcyto20還具有3個(gè)其它的半胱氨酸。氨基酸殘基第204位的半胱氨酸可以形成分子間二硫鍵，尤其是和其它zcyto20分子形成同二聚體?；诙嘀乇葘Φ膠cyto20進(jìn)一步分析預(yù)測，氨基酸殘基第37和136位；第69和197位；和第71和178位的半胱氨酸(顯示在SEQIDNO:2)將形成分子內(nèi)二硫鍵。編碼本文所述Zcyto20多肽區(qū)域、域、基序、殘基和序列的相應(yīng)多核苷酸顯示在SEQIDNO:1中。預(yù)測的zcyto21的螺旋如下螺旋A由第49(Ser)至63(Leu)位氨基酸殘基確定；螺旋B為第76(Asn)至84(Val)位氨基酸殘基；螺旋C為第89(Val)至第104(Ala)位氨基酸殘基；螺旋D為第111(Glu)至133(Gln)位氨基酸殘基；螺旋E為第137(Thr)至158(Lys)位氨基酸殘基；和螺旋F為第163(Gly)至189(Leu)位氨基酸殘基；如SEQIDN0:5所示。這些半胱氨酸殘基在zcyto21、zcyto21和IFN-a中是保守的，可以形成分子間二硫鍵，尤其是和其它zcyto21分子形成同二聚體?；诙嘀乇葘M(jìn)行的zcyto21的進(jìn)一步分析預(yù)測，氨基酸殘基第34和131位，及第68和164位的半胱氨酸將形成分子內(nèi)二硫鍵。第190位半胱氨酸是游離的，可以形成分子間二疏鍵。編碼本文所述zcyto21多肽區(qū)域、域、基序、殘基和序列的相應(yīng)多核苷酸顯示在SEQIDNO:4中。預(yù)測的zcyto22的螺旋如下螺旋A由第52(Ala)至66(Leu)位氨基酸殘基確定；螺旋B為第78(Arg)至87(Val)位氨基酸殘基；螺旋C為第91(Pro)至第108(Thr)位氨基酸殘基；螺旋D為第116(Val)至138(Ser)位氨基酸殘基；螺旋E為第151(Thr)至172(Lys)位氨基酸殘基；和螺旋F為第177(Gly)至197(Cys)位氨基酸殘基；如SEQIDNO:7所示。4個(gè)半胱氨酸殘基在zcyto22、zcyto21和IFN-a中是保守的。此外，zcyto22還具有3個(gè)其它的半胱氨酸。氨基酸殘基第204位的半胱氨酸可以形成分子間二疏鍵，尤其是和其它zcyto22分子形成同二聚體?；诙嘀乇葘M(jìn)行的zcyto22的進(jìn)一步分析預(yù)測，氨基酸殘基第37和136位；第69和197位；和第71和178位的半胱氨酸(顯示在SEQIDNO:7)將形成分子內(nèi)二硫鍵。編碼本文所述zcyto22多肽區(qū)域、域、基序、殘基和序列的相應(yīng)多核苷酸顯示在SEQIDNO:6中。Zcyto24的保守半胱氨酸被證實(shí)在SEQIDNO:9的殘基第44、78、141和175位?；诙嘀乇葘M(jìn)行的zcyto24的進(jìn)一步分析預(yù)測，氨基酸殘基第44位和第141位；第78位和第175位(顯示在SEQIDNO:9)之間將形成二硫鍵。編碼本文所述zcyto24多肽區(qū)域、域、基序、殘基和序列的相應(yīng)多核苷酸顯示在SEQIDNO:9中。預(yù)測的Zcyto24中的螺旋(如SEQIDNO:9所示)是殘基第59-73位(螺旋A);殘基第85-94位(螺旋B);殘基第98-115位(殘基C);殘基第121-143位(螺旋D);殘基第147-169位(螺旋E);殘基第174-194位(螺旋F)。Zcyto25的保守半胱氨酸被證實(shí)在SEQIDNO:11的殘基第44、78、141和175位。基于多重比對進(jìn)行的zcyto25的進(jìn)一步分析預(yù)測，氨基酸殘基第44位和第141位；第78位和第175位(顯示在SEQIDNO:ll)之間將形成二發(fā)f鍵。編碼本文所述zcyto25多肽區(qū)域、域、基序、殘基和序列的相應(yīng)多核苷酸顯示在SEQIDNO:11中。預(yù)測的Zcyto25中的螺旋(如SEQIDNO:11所示)是殘基第59-73位(螺旋A);殘基第85-94位(螺旋B);殘基第98-115位(殘基C);殘基第121-143位(螺旋D);殘基第147-169位(螺旋E);殘基第174-194位(螺旋F)。對鼠IL-2的詳細(xì)突變分析(Zurawski等，EMBOJ.12:5113-5119，1993)顯示螺旋A和C中的殘基對于與IL-2鄧的結(jié)合是重要的；關(guān)鍵性殘基是Asp34、Asn99和Asn啦。鼠IL-2的A/B環(huán)和螺旋B中的多個(gè)殘基對于IL-2Ra的結(jié)合是重要的，而螺旋D中僅一個(gè)殘基Gln出對于與IL-2Ra的結(jié)合是至關(guān)重要的。類似地，螺旋A和C是IL-4和IL-4Ra(結(jié)構(gòu)類似于IL-2Ra)之間相互作用的位點(diǎn)，而且螺旋D中的殘基對于與IL-2Ra的相互作用是至關(guān)重要的。(Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:1657-1662，1997;Kruse等，EMBOJ.11:3237-3244，1992)。尤其是，人IL-4中Tyr^突變?yōu)锳sp可產(chǎn)生拮抗劑，其與IL-4Ra結(jié)合但不與IL-2Ra結(jié)合，因此不能產(chǎn)生信號(Kruse等，同上，1992)。4螺旋束的細(xì)胞因子還通過其組成螺旋的長度分組。"長螺旋"形式的細(xì)胞因子一般由24-30個(gè)殘基的螺旋組成，包括IL-6、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)和人生長激素(hGH)。貨螺旋"形式的細(xì)胞因子一般由18-21個(gè)殘基的螺旋組成，包括IL-2、IL-4和GM-CSF。使用CNTF和IL-6進(jìn)行的研究證實(shí)，可以將CNTF螺旋替換為IL-6中的等同螺旋，從而使該嵌合體具有CTNF結(jié)合性質(zhì)。因此，似乎可以基于結(jié)構(gòu)同源性，而不管序列的同一性如何，確定4螺旋細(xì)胞因子的功能域，而且這些功能域能夠在嵌合體中保持功能的完整性(Kallen等，J.Biol.Chem.274:11859-11867，1999)。因此，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的螺旋域?qū)τ诤咸禺愋允怯杏玫?。尤其有意義的是將來自干擾素和細(xì)胞因子如IFN-a、IL-10、人生長激素的螺旋和環(huán)區(qū)域組合在一起的融合蛋白。已經(jīng)證實(shí)zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以和稱為zcytorl9的孤兒受體形成復(fù)合物。Zcytorl9描述在共同轉(zhuǎn)讓的專利申請PCT/US01/44808中。已經(jīng)證實(shí)Zcyto22、zcyto21和zcyto24也和zcytorl9結(jié)合或通過其傳導(dǎo)信號，這進(jìn)一步支持zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25是同一細(xì)胞因子家族的成員。Zcytorl9受體是II類細(xì)胞因子受體。II類細(xì)胞因子受體通常與4螺旋束細(xì)胞因子結(jié)合。例如，白細(xì)胞介素10和干擾素與該類型中的受體(例如千擾素y受體的a和p鏈、干擾素a/p受體的a和p鏈)結(jié)合。II類細(xì)胞因子受體的特征在于在其細(xì)胞外域中存在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞因子受體組件(CRM)。其它II類細(xì)胞因子受體包括zcytorll(共同擁有的美國專利5，965，704)、CRF2-4(Genbank登錄號Z17227)、IL-10R(Genbank登錄號畫672和NM—001558)、DIRS1、zcytor7(共同擁有的美國專利5，945，511)和組織因子。Zcytorl9與除了干擾素a/p受體a鏈外的所有已知II類受體一樣，在其細(xì)胞外域中僅具有單個(gè)II類CRM。對編碼zcytorl9的人cDNA克隆(SEQIDNO:26)的分析顯示編碼520個(gè)氨基酸(SEQIDNO:27)的開放閱讀框，其中包含分泌信號序列(SEQIDNO:27第1位殘基(Met)至第20位殘基(Gly))和成熟zcytorl9細(xì)胞因子受體多肽(SEQIDNO:27第21位殘基(Arg)至第520位殘基(Arg)),其中細(xì)胞外配體結(jié)合域大約206個(gè)氨基酸殘基(SEQIDNO:27第21位殘基(Arg)至第226位殘基(Asn))，跨膜域大約23個(gè)氨基酸殘基(SEQIDNO:27第227位殘基(Trp)至第249位殘基(Trp))，以及細(xì)胞內(nèi)域大約271個(gè)氨基酸殘基(SEQIDNO:27第250位殘基(Lys)至第520位殘基(Arg))。在細(xì)胞外配體結(jié)合域內(nèi)，有兩個(gè)III型纖連蛋白域和一個(gè)接頭區(qū)。第一個(gè)III型纖連蛋白域包含SEQIDNO:27的第21位(Arg)至119位(Tyr)殘基，接頭包含SEQIDNO:27的第120位(Leu)至124位(Glu)殘基，第二個(gè)III型纖連蛋白域包含SEQIDNO:27的第125位(Pro)至223位(Pro)殘基。因此，包含SEQIDNO:27第21位(Arg)至第223位(Pro)氨基酸的多肽被認(rèn)為是配體結(jié)合片斷。此外，如II類受體中一般是保守的一樣，有保守的色氨酸殘基(包括SEQIDNO:27所示第43位殘基(Trp)和第68位殘基(Trp))和位于SEQIDNO:27第74、82、195、217位的保守半胱氨酸殘基。此外，還鑒定到編碼其中缺失了30個(gè)氨基酸殘基的zcytorl9變體的人cDNA克隆。該zcytorl9變體(顯示在SEQIDNO:23)包含編碼491個(gè)氨基酸(SEQIDN0:24)的開放式閱讀框，其中包含分泌信號序列(SEQIDNO:24第l位殘基(Met)至第20位殘基(Gly))和成熟的zcytorl9細(xì)胞因子受體多肽(SEQIDNO:24第21位殘基(Arg)至第491位殘基(Arg))，其中細(xì)胞外配體結(jié)合域大約206個(gè)氨基酸殘基(SEQIDNO:24第21位殘基(Arg)至第226位殘基(Asn))，跨膜域大約23個(gè)氨基酸殘基(SEQIDNO:24第227位殘基(Trp)至第249位殘基(Trp))，而細(xì)胞內(nèi)域大約242個(gè)氨基酸殘基(SEQIDNO:24第250位殘基(Lys)至第491位殘基(Arg))。在細(xì)胞外配體結(jié)合域內(nèi)，有兩個(gè)III型纖連蛋白域和一個(gè)接頭區(qū)。第一個(gè)III型纖連蛋白域包含SEQIDNO:24的第21位(Arg)至119位(Tyr)殘基，接頭包含SEQIDNO:24的第120位(Leu)至124位(Glu)殘基，第二個(gè)III型纖連蛋白域較短，包含SEQIDNO:24的第125位(Pro)至223位(Pro)殘基。因此，包含SEQIDNO:24第21位(Arg)至第223位(Pro)氨基酸的多肽被認(rèn)為是配體結(jié)合片斷。此外，正如在II類受體中一般是保守的，有保守的色氨酸殘基(包括SEQIDNO:24所示第43位殘基(Trp)和第68位殘基(Trp))和位于SEQIDNO:24第74、82、195、217位的保守半胱氨酸殘基。似乎可天然表達(dá)產(chǎn)生Zcytorl9受體的一種截短可溶性形式的mRNA。對編碼該截短的可溶zcytorl9的人c腿克隆(SEQIDNO:28)的分析顯示編碼211個(gè)氨基酸(SEQIDNO:29)的開放式閱讀框，其包含分泌信號序列(SEQIDNO:29第l位殘基(Met)至第20位殘基(Gly))和成熟的截短可溶性zcytorl9受體多肽(SEQIDNO:29第21位殘基(Arg)至第211位殘基(Ser)),其中截短的細(xì)胞外配體結(jié)合域大約143個(gè)氨基酸殘基(SEQIDNO:29第21位殘基(Arg)至第163位殘基(Trp))，無跨膜域，但有一個(gè)大約48個(gè)氨基酸殘基的額外域(SEQIDNO:29第164位殘基(Lys)至第211位殘基(Ser))。在截短的細(xì)胞外配體結(jié)合域內(nèi)，有兩個(gè)III型纖連蛋白域和一個(gè)接頭區(qū)。第一個(gè)III型纖連蛋白域包含SEQIDNO:29的第21位(Arg)至119位(Tyr)殘基，接頭包含SEQIDNO:29的第120位(Leu)至124位(Glu)殘基，第二個(gè)III型纖連蛋白域包含SEQIDNO:29的第125位(Pro)至163位(Trp)殘基。因此，包含SEQIDNO:29第21位(Arg)至第163位(Trp)氨基酸的多肽被認(rèn)為是配體結(jié)合片斷。此外，正如在II類受體中一般是保守的，有保守的色氨酸殘基(包括SEQIDNO:29所示第43位殘基(Trp)和第68位殘基(Trp)),而且在該截短可溶性形式的zcytorl9受體中的保守半胱氨酸殘基位于SEQIDNO:29第74和82位。Zcytorl9受體是與II類細(xì)胞因子受體相同的受體亞家族的成員，該亞家族的受體可以結(jié)合形成轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的同二聚體。亞家族的幾個(gè)成員(例如結(jié)合干擾素、IL-10、IL-19和IL-TIF的受體)與第二亞基(稱作p-亞基)組合以結(jié)合配體和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。然而，在許多情況下，特定的p-亞基與許多特定的細(xì)胞因子受體亞基結(jié)合。例如，II類細(xì)胞因子受體，如zcytorll(美國專利5，965，704)和CRF2-4受體異二聚體化以結(jié)合細(xì)胞因子IL-TIF(見，WIPO公開文本W(wǎng)O00/24758;Dumontier等，J.Immunol.164:1814-1819,2000;Spencer，SD等，J.Exp.Med.187:57卜578，1998;Gibbs，VC和Pennica，Gene186:97-101，1997(CRF2-4c纖)；Xie，MH等，J.Biol.Chem.275:31335-31339，2000)。IL-10p受體被認(rèn)為與CRF2-4同義(Du畫tier，L等，Proc.Natl.Acad.Sci.97:10144-10149，2000;LiuY等，J.Immunol.152:1821-1829，1994(IL-10RcDNA)。因此，可以預(yù)期，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25將和單體、同二聚體、異二聚體和多聚體的zcytor19受體結(jié)合。試驗(yàn)證據(jù)已將CRF2-4(SEQIDNOS:40和41)確定為zcytorl9的推測的結(jié)合伙伴，這再次支持了zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25在免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)中有重要作用，影響諸如天然免疫系統(tǒng)和炎癥應(yīng)答系統(tǒng)等生理機(jī)能。定位受體/配體對中受體的表達(dá)可能對于筌定配體作用的把細(xì)胞或組織有重要意義。當(dāng)受體/配體復(fù)合物涉及異二聚體受體且受體的一個(gè)亞基廣泛表達(dá)而另一亞基以局限方式(空間或時(shí)間上有限)表達(dá)時(shí)，這尤其有用。使用原位雜交已經(jīng)在皮膚癌樣品中鑒定到zcytorl9的表達(dá)，其中癌性顆粒狀上皮為強(qiáng)陽性，而在正常皮膚中未觀察到陽性信號。鑒定到表達(dá)zcytor19的其它組織包括胎肝，其中在竇狀隙的單個(gè)核細(xì)胞的混合群體中觀察到信號；在肺中觀察到II型肺泡上皮內(nèi)有表達(dá)；并在間充質(zhì)組織的巨噬細(xì)胞樣單個(gè)核細(xì)胞中觀察到有表達(dá)。Zcytorl9的Northen分析鑒定到一個(gè)大約4.5kb轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，該轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量在心臟、骨骼肌、胰腺和前列腺組織中，以及在伯基特氏淋巴瘤(RAJI)細(xì)胞系和SW-480結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中最大。本發(fā)明提供編碼本文公開的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的多核苷酸分子，包括DNA和RNA分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易明了，鑒于遺傳密碼子的簡并性，這些多核苷酸分子中可能有相當(dāng)大量的序列變異。SEQIDN0:3是簡并DNA序列，其包含了編碼SEQIDNO:2的zcyto20多肽的所有DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，通過用U替代T,SEQIDNO:3的筒并序列還提供了編碼SEQIDNO:2的所有RNA序列。因此，包含SEQIDNO:3的第1或64位至第615位核苷酸的編碼zcyto20多肽的多核苷酸和其RNA等同物是本發(fā)明所考慮的。表3列出SEQIDN0:3中用以指示筒并核苷酸位置的單字母代碼。僻釋(resolutions)"是代碼字母所表示的核苷酸。"互補(bǔ)物"是指互補(bǔ)核苷酸的代碼。例如，代碼Y表示C或T，其互補(bǔ)物R表示A或G,其中A與T互補(bǔ)而G與C互補(bǔ)。SEQIDNO:46是簡并DNA序列，其包含了編碼SEQIDNO:7的zcyto22多肽的所有DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，通過用U替代T，SEQIDNO:46的簡并序列還提供了編碼SEQIDNO:7的所有RNA序列。因此，包含SEQIDNO:46的第1或64位至第615位核苷酸的編碼zcyto22多肽的多核苷酸和其RNA等同物是本發(fā)明所考慮的。表3列出SEQIDNO:46中用以指示筒并核苷酸位置的單字母代碼。僻釋"是代碼字母所表示的核苷酸。"互補(bǔ)物"是指互補(bǔ)核普酸的代碼。例如，代碼Y表示C或T，其互補(bǔ)物R表示A或G,其中A與T互補(bǔ)而G與C互補(bǔ)。表3核苷酸解釋互補(bǔ)物解釋AATTCCGGGGCCTTAARA|GYC|TYC|TRA|GMA|CKG|TKG|TMA|C.SC|GSC|GwA|TWA|THA|C|TDA|G|TBC|G|TVA|C|GVA|C|GBC|G|TDA|G|THA|C|TNA|C|G|TNA|C|G|T表4中給出了SEQIDNO:3中使用的簡并密碼子，包括了給定氨基酸的所有可能密碼子。22<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，在確定代表編碼每個(gè)氨基酸的所有可能密碼子的簡并密碼子時(shí)引入了某種不確定性。例如，絲氨酸的簡并密碼子(WSN)可以在某些情況下編碼精氨酸(AGR)，而精氨酸的筒并密碼子(MGN)可以在某些情況下編碼絲氨酸(AGY)。類似的關(guān)系也存在于編碼苯丙氨酸和亮氨酸的密碼子間。因此，簡并序列包括的某些多核苷酸可以編碼變體氨基酸序列，但本領(lǐng)域技術(shù)人員通過參考SEQIDNO:2和SEQIDN0:7的氨基酸序列可以容易地鑒定出這些變體序列。變體序列的功能性可以容易地按照本文所述來測試。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將理解，不同物種可以表現(xiàn)出貨先密碼子使用"。一般參見Grantham等，Nuc.AcidsRes.8:1893-912，1980;Haas等，Curr.BioL6:315-24，1996;Wain-Hobson等，Gene13:355-64，1981;Grosjean和Fiers，Gene18:199-209，1982;Holm,Nuc.AcidsRes.14:3075-87，1986;Ikemura，J.Mol.Biol.158:573-97，1982。本文中，術(shù)語"優(yōu)先密碼子使用"或"優(yōu)先密碼子"是本領(lǐng)域的一個(gè)術(shù)語，指某個(gè)物種的細(xì)胞中最為頻繁使用的蛋白質(zhì)翻譯密碼子，因此在編碼各種氨基酸的可能密碼子中會偏向一種或幾種代表性的密碼子(見表3)。例如，蘇氨酸(Thr)可以由ACA、ACC、ACG或ACT編碼，但在哺乳動物細(xì)胞中ACC是最常用的密碼子；在其它物種中，例如，昆蟲細(xì)胞、酵母、病毒或細(xì)菌中，不同的Thr密碼子可能是優(yōu)先的。通過本領(lǐng)域已知的多種方法，可以將一個(gè)特定物種的優(yōu)先密碼子引入本發(fā)明多核苷酸中。將優(yōu)先密碼子序列引入重組DNA中可以例如通過使蛋白質(zhì)在特定細(xì)胞類型或物種中的翻譯更為有效來增強(qiáng)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。因此，SEQIDNO:3和46公開的簡并密碼子序列可以作為模板以優(yōu)化多核苷酸在本領(lǐng)域常用的和本文公開的不同細(xì)胞類型和物種中的表達(dá)?？梢园幢疚牡墓_對含有優(yōu)先密碼子的序列在不同物種中的表達(dá)進(jìn)行測試和優(yōu)化，并測試這些序列的功能性。正如前面提及的，本發(fā)明的分離多核普酸包括DNA和RNA。制備DNA和RNA的方法是本領(lǐng)域熟知的。一般地，從產(chǎn)生大量zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25RNA的組織或細(xì)胞中分離腿。這些組織和細(xì)胞可以通過Northern印跡(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:5201，1980)或通過根據(jù)對耙細(xì)胞或組織的活性篩選來自不同細(xì)胞類型的條件培養(yǎng)液來鑒定。一旦鑒定到產(chǎn)生該活性或RNA的細(xì)胞或組織后，就可以使用異硫氰酸胍抽提，之后在CsCl梯度中離心分離，制備總賺(Chirgwin等，Biochemistry18:52-94，1979)。使用Aviv和Leder的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:1408-12，1972)從總RNA制備poly(A)+RNA?？梢允褂靡阎椒◤膒oly(A)+RM制備互補(bǔ)DNA。在另一可供選擇的方案中，可以分離基因組DNA。然后通過例如雜交或PCR筌定并分離編碼zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的多核苷酸?？梢酝ㄟ^常規(guī)克隆方法獲得編碼zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的全長克隆。優(yōu)選互補(bǔ)DNA(cDNA)克隆，但對于一些應(yīng)用(例如在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá))可能優(yōu)選使用基因組克隆，或?qū)DNA克隆進(jìn)行l(wèi)務(wù)飾以包括至少一個(gè)基因組內(nèi)含子。制備cDNA和基因組克隆的方法是熟知的并屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平，它們包括使用本文公開的序列或其部分來作為探針篩選文庫或作為引物來擴(kuò)增文庫。表達(dá)文庫可以使用zcytorl9受體的片斷或其它特異性結(jié)合伙伴來探查。本發(fā)明還提供來自其它物種的對應(yīng)多肽和多核普酸(定向進(jìn)化同源物)。這些物種包括但不限于哺乳動物、鳥類、兩棲動物、爬行動物、魚類、昆蟲和其它脊推動物和無脊推動物物種。尤其有意義的是來自其它哺乳動物物種的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽，包括鼠、豬、綿羊、牛、犬、貓、馬和其它靈長類動物多肽。可以使用本發(fā)明提供的信息和組合物以及常規(guī)克隆技術(shù)克隆人zcyto20、zcyto21和zcyto22的定向進(jìn)化同源物。例如，可以使用從表達(dá)本文7>開的zcyto20、zcyto21和zcyto22的組織或細(xì)胞類型獲得的mRNA克隆cDNA。mRNA的適宜來源可以通過用根據(jù)本文公開的序列設(shè)計(jì)的探針探查Northern印跡來鑒定。然后從陽性組織或細(xì)胞系的mRNA制備文庫。之后可以通過多種方法，例如用完整的或部分的人cDNA或用一組或多組基于公開的序列的簡并探針進(jìn)行探查，分離編碼zcyto20、zcyto21和zcyto22的cDNA。還可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或PCR(Mullis，美國專利4,683,202),使用根據(jù)本文公開的代表性人zcyto20序列設(shè)計(jì)的引物，克隆cDNA。在另一方法中，可以使用cDNA文庫轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，然后可以用zcyto20多肽的抗體、結(jié)合研究或活性測試方法檢測目的cDNA的表達(dá)。類似的技術(shù)也可以應(yīng)用于基因組克隆的分離。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，SEQIDNOS:1、4和6中7>開的序列分另'〗代表人zcyto20、zcyto21和zcyto22帶的一種等位基因，而且預(yù)期可以出現(xiàn)等位變異和可變拼接。該序列的等位變體可以通過利用標(biāo)準(zhǔn)方法探查來自不同個(gè)體的cDNA或基因組文庫進(jìn)行克隆。SEQIDNO:1、4和6所示DNA序列的等位變體，包括含有沉默突變的那些和其中的突變導(dǎo)致氨基酸序列改變的那些，均屬于本發(fā)明的范圍，作為SEQIDNO:2、5和7的等位變體的蛋白質(zhì)同樣也屬于本發(fā)明的范圍。由可變拼接產(chǎn)生的mRNA制備的、仍保留了zcyto20、zcyto21和zcyto22多肽性質(zhì)的cDNA包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，同樣這些cDNA和mRNA編碼的多肽也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些序列的等位變體和拼接變體可以通過使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法探查來自不同個(gè)體或組織的cDNA或基因組文庫進(jìn)行克隆。本發(fā)明還提供在診斷應(yīng)用中有用的試劑。例如，zcyto20、zcyto21和zcyto22基因、包含zcyto20、zcyto21和zcyto22DNA或■或其亞序列的探針可以用于確定zcyto20、zcyto21和zcyto22基因是否存在于人染色體上，如19號染色體上，或是否有基因突變發(fā)生。Zcyto20、zcyto21和zcyto21定位在19號染色體的q13.13區(qū)。zcyto20、zcyto21和zcyto22基因座位上可檢測的染色體畸變包括，但不限于，非整倍性、基因拷貝數(shù)改變、異質(zhì)性喪失(LOH)、易位、插入、缺失、限制性位點(diǎn)改變和重排。可以通過使用分子遺傳學(xué)技術(shù)，例如限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)分析、利用PCR技術(shù)進(jìn)行的短串聯(lián)重復(fù)(STR)分析，和本領(lǐng)域已知的其它遺傳學(xué)連鎖分析技術(shù)(Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；Marian,Chest108:255-65，1995)，使用本發(fā)明多核苷酸來檢測這些畸變?；蛭恢玫木_信息對于許多目的可能是有用的，包括1)確定序列是否是現(xiàn)有重疊群的一部分并以多種形式例如YAC、BAC或cDNA克隆獲得其它的周圍遺傳序列；2)為表現(xiàn)出與相同染色體區(qū)域連鎖的遺傳疾病提供可能的候選基因；和3)與模式生物(例如小鼠)相互參照，這可以幫助確定特定基因可能具有的功能。例如，Delague等(Am.J.Hum.Genet.67:236-243，2000)鑒定到Charcot-Marie-Tooth疾病定位在19ql3.1-13.3(Delague等，Am.J.Hum.Genet.67:236-243,2000)。診斷可以幫助醫(yī)師確定疾病類型和適當(dāng)?shù)南嚓P(guān)治療，或幫助遺傳咨詢。同樣地，^^吏用本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法，按本文所述，本發(fā)明的抗zcyto20抗體、多核苷酸和多肽可以用于檢測zcyto20多肽、mRNA或抗zcyto20抗體，由此充當(dāng)標(biāo)記，并可以直接用于檢測遺傳疾病或癌癥。而且，可以使用zcyto20、zcyto21和zcyto22多核苷酸探針檢測與如下情況相關(guān)的異?；蚧蛐腿旧w19ql3.13中的人類疾病相關(guān)性缺失及易位、或涉及胂瘤的惡性發(fā)展的其它易位、或預(yù)期涉及惡性腫瘤或其它癌癥中的染色體重排的其它19ql3.13突變。類似地，可以使用zcyto20多核苷酸探針檢測與如下情況有關(guān)的異?；蚧蛐团c人類疾病或自然流產(chǎn)相關(guān)的染色體19ql3.13三體性和染色體丟失。因此，zcyto20、zcyto21和zcyto22多核普酸探針可以用于檢測與這些缺陷有關(guān)的異?；蚧蛐?。一般地，用于遺傳連鎖分析以檢測患者的遺傳畸變或異常的診斷方法是本領(lǐng)域已知的。分析性探針一般長至少20nt，但有時(shí)可以使用更短的探針(例如14-17nt)。PCR引物長至少5nt,優(yōu)選15nt或更大，更優(yōu)選20-30nt。對于基因或染色體DNA的總體分析，zcyto20多核普酸探針可以包含完整的外顯子或更多。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過比較zcyto20、zcyto21、和zcyto22序列(分別是SEQIDN0S:1、4和6)與zcyto20、zcyto21、和zcyto22的基因組腿，可以容易地確定夕卜顯子。一般地，用于遺傳連鎖分析以檢測患者的遺傳畸變或異常的診斷方法是本領(lǐng)域已知的。大多數(shù)診斷方法包括步驟(a)從可能患病的患者、患病的患者或隱性疾病等位基因的可能非患病攜帶者獲得遺傳樣品；(b)通過在例如RFLP分析中將遺傳樣品與zcyto20多核苷酸探針一起孵育(其中所述多核苷酸與互補(bǔ)多核苷酸序列雜交)或通過將遺傳樣品和有義及反義引物在PCR反應(yīng)中在適當(dāng)?shù)腜CR反應(yīng)條件下一起孵育，產(chǎn)生第一反應(yīng)產(chǎn)物；(c)通過凝膠電泳和/或其它已知方法顯現(xiàn)第一反應(yīng)產(chǎn)物，例如使用zcyto20多核苷酸探針(其中所述多核苷酸將與第一反應(yīng)物中的互補(bǔ)多核苷酸序列雜交)顯現(xiàn)第一反應(yīng)產(chǎn)物；和(d)將顯現(xiàn)到的第一反應(yīng)產(chǎn)物和來自野生型患者的遺傳樣品的第二對照反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行比較。第一反應(yīng)產(chǎn)物和對照反應(yīng)產(chǎn)物之間的差異將指示該患病的或可能患病的患者中的遺傳異常，或非患病患者存在雜合隱性攜帶者表型、或病患者的肺瘤中存在遺傳缺陷、或胎兒或植入前胚胎中存在遺傳異常。例如，zcyto20遺傳座位在限制性片斷圖、PCR產(chǎn)物長度、重復(fù)序列長度方面的差異將指示與正常野生型對照相比存在遺傳異常、遺傳畸變或等位差異。對照可以來自未受影響的家族成員或無關(guān)個(gè)體，這取決于所作試驗(yàn)及樣品的可獲得性。用于本發(fā)明的遺傳樣品包括從患者的任何組織或其它生物學(xué)樣品(例如，但不限于，血液、唾液、精液、胚胎細(xì)胞、羊水等)分離的基因組DNA、mRNA和cDNA。多核普酸探針或引物可以是RNA或DNA，并將包含SEQIDNO:1的部分、SEQIDN0:1的互補(bǔ)分子、或其RNA等同物。進(jìn)行人類疾病表型的遺傳連鎖分析的這些方法是本領(lǐng)域熟知的。對于基于PCR的診斷方法，一般參見Mathew(編)，ProtocolsinHumanMolecularGenetics(HumanaPress,Inc.1991)、White(編)，PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications(HumanaPress,Inc.1993)、Cotter(編)，MolecularDiagnosisofCancer(HumanaPress,Inc.1996)、Hanausek和Walaszek(編)，TumorMarkerProtocols(HumanaPressInc.1998)、Lo(編)，ClinicalApplicationsofPCR(HumanaPress,Inc.1998)和Meltzer(編),PCRinBioanalysis(HumanaPress,Inc.1998))?？梢允褂帽景l(fā)明核酸分子通過用于直接突變分析的標(biāo)準(zhǔn)方法，如限制性片斷長度多態(tài)性分析、基于PCR技術(shù)的短串聯(lián)重復(fù)分析、擴(kuò)增不應(yīng)哭變系統(tǒng)分析(amplification-refractorymutationsystemanalysis)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測、RNase切割方法、變性梯度凝膠電泳、借助熒光的錯(cuò)配分析和其它本領(lǐng)域已知的遺傳分析技術(shù)(見，例如，Mathew(編)，ProtocolsinHumanMolecularGenetics(HumanaPress,Inc.1991)，Marian,Chest108:255(1995);Cole隨和Tsongalis，MolecularDiagnosis(HumanaPress,Inc.1996);Elles(編)MolecularDiagnosisofGeneticDiseases(HumanaPress,Inc.1996);Landegren(編)LaboratoryProtocolsforMutationDetection(OxfordUniversityPress1996);Birren等(編),GenomeAnalysis,第2巻檢測基因(ColdSpringHarborLaboratoryPress1998);Dracopoli等(編)，CurrentProtocolsinHumanGenetics(JohnWiley&Sons1998);和Richards和Ward,"分子診斷檢測，，，《PrinciplesofMolecularMedicine》第83-88頁(HumanaPress,Inc.1998)),檢測與zcyto20、zcyto21和zcyto22座位有關(guān)的突變。對Zcyto20基因的突變的直接分析可以使用受試對象的基因組DNA來進(jìn)行。擴(kuò)增從例如外周血淋巴細(xì)胞獲得的基因組DNA的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(見，例如，Dracopoli等(編)，CurrentProtocolsinHumanGenetics,第7丄6-7.1.7頁(JohnWiley&Sons1998))。在本發(fā)明實(shí)施方案中，分離的zcyto20編碼核酸分子可以在嚴(yán)緊條件下與具有SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸分子雜交，與具有SEQIDNO:1核苷酸第64-618位的核苷酸序列的核酸分子雜交，或與具有與SEQIDNO:1互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸分子雜交。一般地，選擇的嚴(yán)緊條件為對于特定的序列在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下比熱熔解溫度(Tm)低大約5t:。Tm是50。/。靶序列與完全匹配的探針發(fā)生雜交時(shí)的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下)。在本發(fā)明實(shí)施方案中，分離的zcyto22編碼核酸分子可以在嚴(yán)緊條件下與具有SEQIDNO:6的核苷酸序列的核酸分子雜交，與具有SEQIDNO:6核苷酸第64-618位的核苷酸序列的核酸分子雜交，或與具有與SEQIDNO:6互補(bǔ)的核苷酸序列的核酸分子雜交。如果一對核苷酸序列具有一定程度的互補(bǔ)性，則該核酸分子對，例如DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA可以雜交。雜交體可以在雙螺旋中耐受錯(cuò)配堿基對，但雜交體的穩(wěn)定性受到錯(cuò)配程度的影響。錯(cuò)配的雜交體的Tm每1-1.596堿基對錯(cuò)配降低rC。改變雜交條件的嚴(yán)緊性使得可以控制雜交體中存在的錯(cuò)配程度。當(dāng)雜交溫度增加而雜交緩沖液的離子強(qiáng)度減少時(shí)，嚴(yán)緊程度增加。使這些條件適用于具體的多核苦酸雜交體屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍。特定靶序列的Tm是50%該靶序列與完全匹配的探針序列發(fā)生雜交時(shí)的溫度(在規(guī)定的條件下)。影響Tm的那些條件包括多核苷酸探針的大小和堿基對量、雜交溶液的離子強(qiáng)度和雜交溶液中去穩(wěn)定劑的存在。用于計(jì)算Tm的許多等式是本領(lǐng)域已知的，它們對于DNA、RNA和DNA-RNA雜交體及不同長度的多核苷酸探針序列是特異的(見例如，Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版(ColdSpringHarborPress1989);A畫bel等(編)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWileyandSons,Inc.1987);Berger和Kimmel(編),GuidetoMolecularCloningTechniques,(AcademicPress,Inc.1987);和Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26:227(1990))。序歹'分析軟件如OLIGO6.0(LSR;LongLake,MN)和PrimerPremier4.0(PremierBiosoftInternational;PaloAlto,CA)以及英特網(wǎng)上的站點(diǎn)，是公眾可得到的工具，可基于用戶定義的標(biāo)準(zhǔn)用于分析給定序列和計(jì)算Tm。這些程序也可以在規(guī)定的條件下分析給定的序列并確定適宜的探針序列。典型地，較長多核苷酸序列(〉50個(gè)堿基對)的雜交在低于計(jì)算的Tm大約20-25"的溫度下進(jìn)行。對于較小的探針(〈50個(gè)堿基對)，雜交典型地在Tm或低于計(jì)算的Tm5-l(TC的溫度下進(jìn)行。這允許DNA-DNA和DNA-RNA雜交體以最大速率雜交。雜交后，可以在嚴(yán)緊條件或在高度嚴(yán)緊條件下洗滌核酸分子以除去未雜交的核酸分子。典型的嚴(yán)緊洗滌條件包括在O.5x-2xSSC加0.W十二烷基碌u酸鈉(SDS)的溶液中55-65t:洗滌。也就是說，編碼zcyto20、zcyto21和zcyto22多肽變體的核酸分子可以在嚴(yán)緊洗滌條件下分別與具有SEQIDN0S:1、4和6的核苷酸序列的核酸分子(或其互補(bǔ)分子)雜交，其中所述洗滌嚴(yán)緊性相當(dāng)于0.5x-2xSSC加0.1%SDS在55-65匸下，包括0.5xSSC加0.1%SDS在55"C下或2xSSC加0.1%SDS在65"C下。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過例如用SSPE代替洗滌溶液中的SSC，容易地設(shè)計(jì)出等同的條件。典型的高度嚴(yán)緊洗滌條件包括在0.lx-0.2xSSC加0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)的溶液中50-65X:洗滌。也就是說，編碼zcyto20多肽變體的核酸分子可以在高度嚴(yán)緊洗滌條件下與具有SEQIDNO:1的核普酸序列的核酸分子(或其互補(bǔ)分子)雜交，其中所述洗滌嚴(yán)緊性相當(dāng)于0.lx_0.2xSSC加0.1%SDS在50_65X:下，包括0.lxSSC加0.1%SDS在50"C下或0.2xSSC加0.1%SDS在65"C下。本發(fā)明還提供分別與SEQIDN0S:2、5、7、9、ll的多肽或它們的定向進(jìn)化同源物具有基本上相似的序列一致性的分離的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽。術(shù)語"基本上相似的序列一致性"在本文中用于指分別與SEQIDN0S:2、5、7、9、11所示序列或它們的定向進(jìn)化同源物有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大于95%的序列一致性的多肽。本發(fā)明還包括含有與SEQIDNO:2或SEQIDNO:7氨基酸殘基第1至205位或第21至205位的序列有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大于95%、96°/。、97%、98%、99%的序列一致性的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還包括編碼這些多肽的核酸分子。確定一致性百分?jǐn)?shù)的方法見如下描述。本發(fā)明還考慮可以使用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)確定的zcyto20、zcyto21和zcyto22核酸分子變體對所編碼多肽分別與SEQIDN0S:2、5、7、9、11的氨基酸序列的相似性的確定，和/或如上所述的雜交分析。這些zcyto20變體包括(1)分別與具有SEQIDNOS:1、4、6、8、10的核苷酸序列的核酸分子(或其互補(bǔ)分子)在嚴(yán)緊洗滌條件下雜交的核酸分子，其中該洗滌嚴(yán)緊性相當(dāng)于0.5x-2xSSC加0.1%SDS在55-65t:下；或(2)編碼與SEQIDNO:2的氨基酸序列有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大于95%的序列一致性的多肽的核酸分子。或者，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25變體可以表征為(1)分別與具有SEQIDNOS:1、4、6、8、10的核苷酸序列的核酸分子(或其互補(bǔ)分子)在高度嚴(yán)緊洗滌條件下雜交的核酸分子，其中該洗滌嚴(yán)緊性相當(dāng)于0.lx-0.2xSSC加0.1%SDS在50-65。C下；和(2)編碼分別與SEQIDNOS:2、5、7、9、11的氨基酸序列有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大于95%的序列一致性的多肽的核酸分子。序列一致性百分?jǐn)?shù)可通過常規(guī)方法確定。見例如Altschul等，Bull.Math.Bio.48:603(1986)，和Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1992)。簡而言之，l吏用10的缺口(gap)開放罰分、1的缺口延伸罰分和Henikoff和Henikoff(同上)的BL0SUM62"評分矩陣(見表4，氨基酸用標(biāo)準(zhǔn)單字母代碼表示)，將兩個(gè)氨基酸序列對齊以優(yōu)化比對分?jǐn)?shù)。一致匹配的總數(shù)n數(shù)目]<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，已有許多成熟的算法可以比對兩個(gè)氨基酸序列。Pearson和Lipman的"FASTA"相似性檢索算法是一個(gè)適宜的蛋白質(zhì)比對方法，可用于檢測本文公開的氨基酸序列和推測的zcyto20變體的氨基酸序列之間的一致性水平。FASTA算法描述在Pearson和LipmanProc.Natl.Acad.Sci.眼85:2444(1988)及Pearson,Meth.Enzymol.183:63(1990)。簡而言之，F(xiàn)ASTA首先通過確定查詢序列(例如SEQIDNO:2)和測試序列共有的區(qū)域，即在不考慮保守氨基酸替代、插入或缺失的情況下具有最大的一致性密度(如果kt叩變量為l)或具有成對的一致性(如果kt叩二2)的區(qū)域，以表征序列相似性。然后使用氨基酸替代矩陣比較所有配對的氨基酸的相似性，對具有最大的一致性密度的10個(gè)區(qū)域進(jìn)行重新評分，并，務(wù)剪"這些區(qū)域的末端以便僅包括對此最高分?jǐn)?shù)有貢獻(xiàn)的那些殘基。如果有分?jǐn)?shù)大于識斷值"(通過預(yù)先確定的公式基于序列長度和ktup值計(jì)算的)的幾個(gè)區(qū)域，則檢驗(yàn)這些經(jīng)修剪的最初區(qū)域以確定這些區(qū)域是否可以結(jié)合缺口以形成近似對齊。最后，使用修改的Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:444(1970);Sellers,SIAMJ.Appl.Math.26:787(1974))(該算法允許氨基酸插入和缺失)，對這兩個(gè)氨基酸序列的最大得分區(qū)域進(jìn)行比對。FASTA分析的優(yōu)選參數(shù)是kt叩二l、缺口開放罰分=10、缺口延伸罰分二l和替代矩陣二BL0SUM62。這些參數(shù)可以通過修飾評分矩陣文件("SMATRIX")引入FASTA程序中，對此的解釋參見Pearson,Meth.Enzymol.183;63(1990)的附錄2。使用上面公開的比例，F(xiàn)ASTA還可以用于確定核酸分子的序列一致性。對于核苷酸序列比較，kt叩值可以在1至6的范圍內(nèi)，優(yōu)選3至6，最優(yōu)選3，而其它參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。zcyto20、zcyto21和zcyto22多肽變體或具有實(shí)質(zhì)上相似的序列一致性的多肽的特征在于具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代、缺失或插入。這些改變優(yōu)選在性質(zhì)上較小，即保守氨基酸替代(見表5)和不顯著影響多肽的折疊或活性的其它替代；小的缺失，典型地一個(gè)至約30個(gè)氨基酸的缺失；氨基或羧基端延伸，例如氨基端甲硫氨酸殘基，不超過約20-25個(gè)殘基的小的接頭肽或親和標(biāo)簽。本發(fā)明因此提供包含與SEQIDNO:2的相應(yīng)區(qū)域有至少70%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的序列的具有約154-235個(gè)氨基酸殘基的多狀。包含親和標(biāo)簽的多肽還可以在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽與親和標(biāo)簽之間含有蛋白酶剪切位點(diǎn)。優(yōu)選的這些位點(diǎn)包括凝血酶切割位點(diǎn)和因子Xa切割位點(diǎn)。表6保守氨基酸替代<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>可以確定包含對于維持結(jié)構(gòu)完整性關(guān)鍵的區(qū)域或域的氨基酸殘基?？梢源_定在這些區(qū)域中或多或少耐受改變而保持分子的整個(gè)三級結(jié)構(gòu)的特定殘基。分析序列結(jié)構(gòu)的方法包括，但不限于具有高氨基酸或核苷酸一致性的多個(gè)序列的比對、二級結(jié)構(gòu)傾向(propensity),二元圖(binarypatterns)、互補(bǔ)堆積(complementarypacking)和隱蔽的極性相互作用(Barton,CurrentOpin.Struct.Biol.5:372-376，1995;和Cordes等，CurrentOpin.Struct.Biol.6:3-10,1996)。一般地，當(dāng)設(shè)計(jì)分子修飾或鑒定特定片斷時(shí)，將在確定結(jié)構(gòu)的同時(shí)評價(jià)修飾的分子的活性。可以在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽中進(jìn)行氨基酸序列改變以便最少破壞對于生物學(xué)活性必需的高級結(jié)構(gòu)。例如，當(dāng)zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽包含一個(gè)或多個(gè)螺旋時(shí)，將改變氨基酸殘基以便不破壞螺旋的幾何學(xué)和其中的構(gòu)象改變將使一些關(guān)鍵功能(例如分子與其結(jié)合伙伴的結(jié)合)減弱的其它分子成分。氨基酸序列改變的效果可以通過例如以上公開的計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行預(yù)測，或通過晶體結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行測定(見例如L鄰thorn等，Nat.Struct.Biol.2:266-268，1995)。本領(lǐng)域熟知的其它技術(shù)對變體蛋白和標(biāo)準(zhǔn)分子(例如天然蛋白)的折疊進(jìn)行比較。例如，可以比較變體和標(biāo)準(zhǔn)分子中的半胱氨酸分布情況。質(zhì)譜和使用還原和烷基化的化學(xué)修飾為測定與二疏鍵相關(guān)的或未形成這些鍵的半胱氨酸殘基提供了方法(Bean等，Anal.Biochem.201:216-266，1992;Gray,ProteinSci.2:1732-1748，1993;和Patterson等，Anal.Chem.66:3727-3732，1994)。一般認(rèn)為如果〗務(wù)飾的分子與標(biāo)準(zhǔn)分子具有不相同的半胱氨酸分布情況，則折疊受到影響。另一個(gè)用于測量折疊的被接受的熟知方法是園二色性(CD)。測量和比較修飾分子和標(biāo)準(zhǔn)分子產(chǎn)生的CD譜是常規(guī)的(Johnson,Proteins7;205-214，1990)。晶體學(xué)是另一個(gè)分析折疊和結(jié)構(gòu)的熟知方法。核磁共振(NMR)、消化肽作圖和表位作圖也是分析折疊及蛋白質(zhì)和多肽之間的結(jié)構(gòu)相似性的已知方法(Sch繊an等，Science257:96卜964，1992)?？梢灾苽銼EQIDNO:2所示Zcyto20蛋白質(zhì)序列的Hopp/Woods親水性分布圖(Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci.78:3824-3828,1981;Hopp，J.I咖un.Meth.88:1-18,1986和Triquier等,ProteinEngineering11:153-169，1998)。該分布圖以滑動的六殘基窗為基礎(chǔ)。忽略隱蔽的G、S和T殘基及暴露的H、Y和W殘基。例如，在zcyto20中，親水區(qū)域包括SEQIDNO:2的第169(Glu)至174(Glu)位氨基酸殘基、SEQIDNO:2的第54(Lys)至第59(Ala)位氨基酸殘基、SEQIDNO:2的第53(Phe)至第58(Asp)位氨基酸殘基、SEQIDNO:2的第168(Gln)至173(Lys)位氨基酸殘基、以及SEQIDNO:2的第154(Pro)至第159(Arg)位氨基酸殘基?？梢灾苽銼EQIDNO:7所示Zcyto22蛋白質(zhì)序列的Hopp/Woods親水性分布圖(Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci.78:3824-3828，1981;Hopp，J.Immun.Meth.88:1-18，1986和Triquier等，ProteinEngineering11:153-169,1998)。該分布圖以滑動的六殘基窗為基礎(chǔ)。忽略隱蔽的G、S和T殘基及暴露的H、Y和W殘基。例如，在zcyto22中，親水區(qū)域包括SEQIDNO:7的第169(Glu)至174(Glu)位氨基酸殘基、SEQIDNO:7的第54(Lys)至第59(Ala)位氨基酸殘基、SEQIDNO:7的第53(Phe)至第58(Asp)位氨基酸殘基、SEQIDNO:7的第168(Gln)至173(Lys)位氨基酸殘基、以及SEQIDNO:7的第154(Pro)至第159(Arg)位氨基酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，當(dāng)在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的氨基酸序列中設(shè)計(jì)修飾時(shí)應(yīng)考慮親水性或疏水性，以便不破壞整體的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)情況。對于替代尤其有意義的是選自Val、Leu和lie組成的組或選自Met、Gly、Ser、Ala、Tyr和Trp組成的組的疏水'l"生殘基。從IFN-a與zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25家族的成員之間的序列相似性分析(顯示在表1和2)，也可以推斷出哪些是必需氨基酸。使用如前述"FASTA"分析等方法，可以在蛋白質(zhì)家族中鑒定高相似性區(qū)域，這些區(qū)域可以用于分析保守區(qū)域的氨基酸序列?；诮Y(jié)構(gòu)鑒定變體多核苷酸的另一可選擇的方法是按上述確定編碼潛在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因變體的核酸分子是否可以和具有SEQIDNOS:1、4、6、8或10的核苷酸序列的核酸分子雜交?？审芏ū景l(fā)明多肽中的必需氨基酸的其它方法是本領(lǐng)域已知的方法，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，Science244:1081(1989)，Bass等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4498(1991),Coombs和Corey,"定點(diǎn)誘變和蛋白質(zhì)工程，，，《Proteins:AnalysisandDesign》，Angeletti(編),第259-311頁(AcademicPress,Inc.1998))。在后一技術(shù)中，在分子的每個(gè)殘基位置引入單丙氨酸突變，并按下面的公開方法測試所獲突變分子的生物學(xué)或生物化學(xué)活性以確定對于該分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。也參見Hilton等，J.Biol.Chem.271:4699(1996)。本發(fā)明還包括zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的功能性片斷和編碼這些功能性片斷的核酸分子。在本文中，^能性"zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25或其片斷的特征在于其增殖或分化活性、誘導(dǎo)或抑制特化細(xì)胞功能的能力或特異結(jié)合抗zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25抗體或zcytorl9受體(可溶的或固定的)的能力。如本文前述，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的特征在于6螺旋束。因此，本發(fā)明還提供如下融合蛋白，其包括(a)包含上述一個(gè)或多個(gè)螺旋的多肽分子；和(b)包含這些螺旋中的一個(gè)或多個(gè)螺旋的功能性片斷。融合蛋白的另一多肽部分可以由另一螺旋束細(xì)胞因子或干擾素(如IFN-a)提供或由促進(jìn)融合蛋白分泌的非天然的和/或無關(guān)的分泌信號肽提供。本發(fā)明zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽，包括全長多肽、生物學(xué)活性片斷和融合多肽，可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)使用其中導(dǎo)入了編碼該多肽的表達(dá)載體的細(xì)胞來制備。本文中，嚷中導(dǎo)入了表達(dá)載體的細(xì)胞"包括直接接受操作引入了外源DNA分子的細(xì)胞和其含有該引入的DNA的后代。適宜的宿主細(xì)胞是可以用外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染且可以培養(yǎng)生長的那些細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、真菌細(xì)胞和培養(yǎng)的高等真核細(xì)胞。操作克隆的DNA分子和將外源DNA引入多種宿主細(xì)胞的技術(shù)公開在Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989;和Ausubel等，編，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.NY，1987。一般地，編碼zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的DNA序列與對于其表達(dá)必需的其它遺傳元件，一般包括轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子，在表達(dá)載體中可操作地連接。載體通常還含有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記和一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了在某些系統(tǒng)中選擇標(biāo)記可以在分開的不同載體上提供，而且外源DNA的復(fù)制可以通過整合至宿主細(xì)胞基因組中來實(shí)現(xiàn)。啟動子、終止子、選擇標(biāo)記、載體和其它元件的選擇是屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員水平內(nèi)的常規(guī)設(shè)計(jì)。這些元件中的許多在文獻(xiàn)中已有描述，并可通過供應(yīng)商獲得。為了引導(dǎo)zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多欣進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在表達(dá)載體中提供分泌信號序列(又稱作前導(dǎo)序列，前原序列(pr印rosequence)或前序歹1(presequence))。該分泌信號序歹'j可以是zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的分泌信號序列，或可以來源于另一分泌蛋白(例如t-PA;見美國專利5，641，655)或從頭合成。將分泌信號序列與zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的DNA序列可操作地連接，即將兩個(gè)序列在正確的閱讀框中連接并放置在一定位置以指導(dǎo)新合成的多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑。分泌信號序列通常位于編碼目的多肽的DNA序列的5，，但某些信號序列可以位于目的DNA序列的其它地方(見例如Welch等，美國專利5,037,743;Holland等，美國專禾'J5，143，830)。本發(fā)明中可以使用培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞作為宿主。將外源DNA引入哺乳動物宿主細(xì)胞中的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，Cell14:725，1978;Corsaro和Pearson,SomaticCellGenetics7:603，1981;Graham和VanderEb，Virology52:456，1973)、電穿孔(Neumann等，EMBOJ.1:841-845，1982)、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Ausubel等，同上)和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Hawley-Nelson等，F(xiàn)ocus15:73，1993;Cicca雨e等，F(xiàn)ocus15:80，1993)。在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)重組多肽/>開在例如Levinson等，美國專利4,713,339;Hagen等，美國專利4，784，950;Palmiter等，美國專利4,579,821;和Ringold,美國專利4，656，134。適宜的培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞包括COS-1(ATCCNo.CRL1650)、COS-7(ATCCNo.CRL1651)、B服(ATCCNo.CRL1632)、BHK570(ATCCNo.CRL10314)、293(ATCCNo.CRL1573;Graham等，J.Gen.Virol.36:59-72，1977)和中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(例如CH0-Kl，ATCCNo.CCL61;或CHODG44，Chasin等，Som.CellMolec.Genet.12:555，1986)。其它適宜的細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的，并可以通過公共保藏單位(如美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas,VA)獲得。一般地，優(yōu)選強(qiáng)轉(zhuǎn)錄啟動子，如來自SV40或巨細(xì)胞病毒的啟動子。見例如美國專利4,956,288。其它適宜的啟動子包括來自金屬硫蛋白基因的啟動子(美國專利4,579,821和4，601，978)和腺病毒主要晚期啟動子。用于哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體包括pZP-1和pZP-9(它們保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,VA，USA)，保藏號分別是98669和98668)及其衍生物。一般使用藥物篩選以選擇其中插入了外源DNA的培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞。這些細(xì)胞通常被稱作,染子"。在選擇劑存在下培養(yǎng)并能夠?qū)⒛康幕騻鬟f給其后代的細(xì)胞被稱作^!定轉(zhuǎn)染子"。優(yōu)選的選擇標(biāo)記是編碼抗生素新霉素抗性的基因。選擇在存在新霉素類藥物，如G-418等時(shí)進(jìn)行。還可以使用選擇系統(tǒng)以增加目的基因的表達(dá)水平，該過程被稱作"擴(kuò)增"。擴(kuò)增的實(shí)施方式是在有低水平選擇劑時(shí)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染子然后增加選擇劑的量以選擇產(chǎn)生高水平的引入基因之產(chǎn)物的細(xì)胞。優(yōu)選的可擴(kuò)增選擇標(biāo)記是二氫葉酸還原酶，該酶賦予對氨甲蝶呤的抗性。也可以使用其它藥物抗性基因(例如潮霉素抗性、多重抗藥性、嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)。也可以將腺病毒系統(tǒng)用于體外蛋白質(zhì)生產(chǎn)。通過在細(xì)胞不會快速分裂的條件下培養(yǎng)腺病毒感染的非293細(xì)胞，該細(xì)胞可以長時(shí)期產(chǎn)生蛋白質(zhì)。例如，在細(xì)胞工廠中將BHK細(xì)胞培養(yǎng)至匯合，然后將其暴露于編碼目的分泌蛋白的腺病毒載體。然后在無血清條件下培養(yǎng)細(xì)胞，在該條件下允許感染的細(xì)胞存活幾周而不發(fā)生顯箸的細(xì)胞分裂。在另一可選擇的方法中，可以將腺病毒感染的293細(xì)胞以貼壁細(xì)胞的形式或以懸浮培養(yǎng)物的形式培養(yǎng)至相對高的細(xì)胞密度以產(chǎn)生顯著大量的蛋白質(zhì)(見Garnier等，Cytotechnol.15:145—55，1994)。使用任一種方案，可以根振表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的分布重復(fù)從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、裂解物或膜碎片中分離表達(dá)的分泌異源蛋白質(zhì)。在使用感染的293細(xì)胞的生產(chǎn)方案中，還可以有效地獲得非分泌的蛋白質(zhì)?？梢杂猛ǔ碓从谲俎ｃy紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)的重組桿狀病毒根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法感染昆蟲細(xì)胞。在優(yōu)選方法中，通過使用基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)(描述在Luckow等，J.Virol.67:4566-4579，1993)產(chǎn)生重組桿狀病毒。該系統(tǒng)利用轉(zhuǎn)移載體，并可以以試劑盒的形式購買得到(Bac-to-Bac試劑盒；LifeTechnologies,Rockville,MD)。所述轉(zhuǎn)移載體(例如pFastBacl;LifeTechnologies)含有Tn7轉(zhuǎn)座子以便可以將編碼目的蛋白質(zhì)的DNA移入在大腸桿菌中作為所謂"桿粒"的大質(zhì)粒維持的桿狀病毒基因組中。見，Hill-Perkins和Possee,J.Gen.Virol.71:971-976，1990;Borming等，J.Gen.Virol.75:1551-1556，1994;和ChazenbalkRapoport，了.Biol.Chem.270:1543-1549，1995。此外，轉(zhuǎn)移載體可以包括與編碼上文公開的多肽延伸段或親和標(biāo)簽的DNA的框內(nèi)融合物。使用本領(lǐng)域已知技術(shù)，可以將含有zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25編碼序列的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主細(xì)胞中，篩選帶有含中斷的lacZ基因(指示重組桿狀病毒)的桿粒的細(xì)胞。使用常規(guī)技術(shù)分離含有重組桿狀病毒基因組的桿粒DNA,并用其轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞，如Sf9細(xì)胞。隨后產(chǎn)生表達(dá)zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的重組病毒。通過本領(lǐng)域常用方法頁制備重組病毒原液。為了產(chǎn)生蛋白質(zhì)，可以使用該重組病毒感染宿主細(xì)胞，典型地來源于秋粘蟲，草地貪夜蛾(如Sf9或Sf21細(xì)胞)或粉紋夜蛾(Trichoplusiani)(如HighFive細(xì)胞；Invitrogen，Carlsbad,CA)的細(xì)胞系。見例如美國專利5,300,435。使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)和維持細(xì)胞。適宜的培養(yǎng)基配方是本領(lǐng)域已知的，可以從供應(yīng)商處獲得。從大約2-5xl05個(gè)細(xì)胞的接種密度將細(xì)胞培養(yǎng)至1-2xl()6個(gè)細(xì)胞的密度，此時(shí)加入感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1-10，更典型地近3的重組病毒原液。所用方法是本領(lǐng)域一般已知的。還可以使用其它高等真核細(xì)胞作為宿主，包括植物細(xì)胞和鳥類細(xì)胞。關(guān)于毛根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)作為載體用于植物細(xì)胞中表達(dá)基因的綜述見Sinkar等，J.Biosci.(Bangalore)11:47-58,1987。在本發(fā)明中還可以使用真菌細(xì)胞，包括酵母細(xì)胞。在此方面特別有意義的酵母種包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)和Pichiamethanolica。用夕卜源DNA轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞和從其中制備重組多肽的方法公開在例如Kawassaki，美國專利4，599，311;Kawasaki等，美國專利4，931，373;Brake,美國專利4，870，008;Welch等，美國專利5，037，743;和Murray等，美國專利4,845,075。通過選擇標(biāo)記所確定的表型，通常是藥物抗性或在缺少特定養(yǎng)分(例如亮氨酸)時(shí)的生長能力，選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用于釀酒酵母的優(yōu)選載體系統(tǒng)是Kawasaki等(美國專利4，931，373)公開的POTI載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)允許通過在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中的生長選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用于酵母的適宜啟動子和終止子包括來自糖酵解酶基因(見例如Kawasaki,美國專利4,599,311;Kingsman等，美國專利4,615,974;和Bitter,美國專利4，977，092)和醇脫氫酶的那些。也參見美國專利4,990,446;5，063;154;53139,936和4,661,454。用于其它酵母，包括多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)、Schizosaccharomycespombe、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克魯維氏酵母(Kluyvero邁ycesfragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago邁aydis)、巴斯德畢赤酵母、Pichiamethanolica、季也蒙氏畢赤酵母(Pichiaguillermondii)和麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也是本領(lǐng)域已知的。見例如Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132:3459—3465，1986;Cregg,美國專利4,882,279;和Raymond等，Yeast14，11-23，1998?？梢愿鶕?jù)McKnight等，美國專利4,935,349的方法使用曲霉屬細(xì)胞。轉(zhuǎn)化Acremoniumchrysogenum的方法公開在Sumino等，美國專利5,126,228。轉(zhuǎn)化鏈孢霉的方法公開在Lambowitz，美國專利4,486,533。在Pichiamethanolica中制備重組蛋白公開在美國專利5，716，808、5，736，383、5，854，039和5，888，768。原核宿主細(xì)胞，包括細(xì)菌大腸桿菌(Escherichiacoli)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和其它屬的菌抹，也是本發(fā)明中有用的宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化這些宿主和表達(dá)克隆在其中的外源DNA序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(見例如Sambrook等，同上)。當(dāng)在細(xì)菌如大腸桿菌中表達(dá)zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽時(shí)，可以將多肽保留在細(xì)胞質(zhì)中，典型地以不溶性顆粒的形式，或可以通過細(xì)菌分泌序列將其引導(dǎo)至周質(zhì)間隙。在前面的情況下，裂解細(xì)胞，回收該顆粒并使用例如異硫氰酸胍或尿素進(jìn)行變性。之后通過稀釋該變性劑，例如通過對尿素溶液和還原及氧化谷胱甘肽的組合進(jìn)行透析，隨后對緩沖鹽溶液進(jìn)行透析，使該變性的多肽重折疊并二聚化。在后一情況下，可以從周質(zhì)間隙中以可溶性功能形式回收該多肽，方式是破碎細(xì)胞(通過如超聲或滲壓震擾)釋放周質(zhì)間隙內(nèi)容物并回收該蛋白質(zhì)，這由此省去變性和重折疊的需要。成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。多種適宜的培養(yǎng)基，包括已知成分培養(yǎng)基和復(fù)雜培養(yǎng)基，是本領(lǐng)域已知的，一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)。如果需要，培養(yǎng)基還可以含有諸如生長因子或血清這樣的成分。生長培養(yǎng)基一般通過例如藥物篩選或缺少可由表達(dá)載體攜帶的或共轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中的選擇標(biāo)記補(bǔ)充的必需養(yǎng)分來選擇含有外源添加DNA的細(xì)胞。通過常規(guī)方式，如振搖小三角瓶或發(fā)酵罐噴氣給液體培養(yǎng)物提供充足的空氣。優(yōu)選純化本發(fā)明多肽和蛋白質(zhì)達(dá)到>80%純度，更優(yōu)選>90%純度，甚至更優(yōu)選>95%純度，尤其優(yōu)選藥物純狀態(tài)，即相對于污染的大分子，尤其是其它蛋白質(zhì)和核酸而言大于99.9%的純度，而且不含感染劑和致熱劑。優(yōu)選地，純化的多肽或蛋白質(zhì)基本上不含有其它多肽或蛋白質(zhì)，尤其是動物來源的那些?？梢酝ㄟ^常規(guī)蛋白質(zhì)純化方法，典型地通過層析技術(shù)的組合，純化表達(dá)的重組zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)(包括嵌合多肽和多體蛋白)。一般參見親和層析原則和方法(AffinityChromatography:Principles&Methods)，PharmaciaLKBBiotechnology,Uppsala,瑞典，1988;和Scopes,蛋白質(zhì)純化原貝'J和實(shí)踐(ProteinPurification:PrinciplesandPractice),Springer-Verlag，紐約，1994。包含多聚組氨酸親和標(biāo)簽(典型地約6個(gè)組氨酸殘基)的蛋白質(zhì)可以通過在鎳螯合樹脂上親和層析進(jìn)行純化。見例如Houchuli等，Bio/Technol.6:1321-1325，1988。包含glu-glu標(biāo)簽的蛋白質(zhì)可以根據(jù)常規(guī)方法通過免疫親和層析純化。見例如Grussenmeyer等，同上。麥芽糖結(jié)合蛋白融合物根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法在直鏈淀粉柱上純化。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽還可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法通過化學(xué)合成制備，包括完全固相合成、部分固相合成方法、片斷縮合或經(jīng)典的溶液合成。見例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85:2149，1963;Stewart等，SolidPhasePeptideSynthesis(第2版)，PierceChemicalCo.，Rockford，IL，1984;B，r和Rapp，Chem.Pept.Prot.3:3，1986;和Atherton等，SolidPhasePeptideSynthesis:APracticalApproach,IRLPress,Oxford,1989。體外合成對于制備較小的多肽是尤其有利的。使用本領(lǐng)域已知方法，可以制備單體或多體；糖基化或未糖基化；PEG化(pegylated)或未PEG化(議-pegylated)形式的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可以包括或可以不包括起始甲錄u氨酸殘基。用于zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性分析的耙細(xì)胞包括，但不限于，血管細(xì)胞(尤其是內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)、造血(髓樣和淋巴樣)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞(包括肝細(xì)胞、有窗內(nèi)皮細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞和Ito細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞(包括人皮膚成纖維細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞)、胎肺細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞、周細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和前列腺上皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞來源于共同的祖先細(xì)胞，即成血管細(xì)胞(h醒ngioblast)(Choi等，Development125:725-732，1998)。本發(fā)明的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)可以通過其活性，即調(diào)節(jié)應(yīng)答細(xì)胞類型的增殖、分化、遷移、粘著或代謝，進(jìn)行表征。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性可以使用設(shè)計(jì)以檢測細(xì)胞增殖、分化、遷移或粘外或體內(nèi)試驗(yàn)來測試。許多適宜的試驗(yàn)是本領(lǐng)域已知的，本文中公開了代表性試驗(yàn)。對于篩選，例如對于確定氨基酸替代、缺失或插入的效果，使用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行的試驗(yàn)是最方便的。然而，筌于發(fā)育過程(例如血管發(fā)生、傷口愈合)的復(fù)雜性，一般使用體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證和進(jìn)一步表征生物學(xué)活性。某些體外模型，例如P印per等的三維膠原凝膠基質(zhì)模型(Biochem.Biophys.Res.Comm.189:824—831，1992)足夠復(fù)雜以致可測試組織學(xué)效果?？梢允褂猛庠串a(chǎn)生的蛋白質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，或可以使用表達(dá)目的多肽的細(xì)胞在體外或體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。可以使用單獨(dú)的或與其它生長因子(例如VEGF家族成員)或造血細(xì)胞因子(如EPO、TPO、G-CSF、干細(xì)胞因子)結(jié)合的zcyto20蛋白質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。代表性的試驗(yàn)公開如下。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的活性可以使用培養(yǎng)細(xì)胞體外測量，或通過將本發(fā)明分子施用于適當(dāng)?shù)膭游锬?5型來體內(nèi)測量。測量細(xì)胞增殖或分化的試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的。例如，測量增殖的試驗(yàn)包括例如對中性紅染料的化學(xué)敏感性(Cavanaugh等，InvestigationalNewDrugs8:347-354，1990)、在增殖細(xì)胞的腿中摻入放射性標(biāo)記的核苷酸(公開在例如Rains和Ross,MethodsEnzymol.109:749-773，1985;Wahl等，Mol.CellBiol.8:5016-5025，1988;和Cook等，AnalyticalBiochem.179:1-7,1989)、在增殖細(xì)胞的腿中摻入5_溴-2，-脫氧尿苷(BrdU)(Porstmann等，J.Immunol.Methods82:169-179，1985)、和使用四氮唑鹽(Mosmann，J.Immunol.Methods65:55-63，1983;Alley等，CancerRes.48:589-601,1988;Marshall等，GrowthReg.5:69-84，1995;和Scudiero等，C塞erRes.48:4872-4833，1988)。分化可以使用能被誘導(dǎo)分化出更成熟表型的適宜前體細(xì)胞來測試。測量分化的試驗(yàn)包括例如測量與組織的階段特異性表達(dá)有關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)記、酶活性、功能活性或形態(tài)學(xué)改變(Watt，F(xiàn)ASEB，5:281-284，1991;Francis,Differentiation57:63-75，1994;Res，Adv.Anim.CellBiol.Technol.Bioprocesses，161-171，1989;所有文獻(xiàn)均并入本文作為參考)。還可以使用設(shè)計(jì)以檢效'Jzcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24驗(yàn)來檢測zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的活性。優(yōu)選的該類試驗(yàn)包括確定肝細(xì)胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a(TGFa)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、VEGF、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)、血管生成素和肝臟產(chǎn)生的其它大分子是否存在的那些試驗(yàn)。適宜的試驗(yàn)包括使用應(yīng)答目的大分子的靶細(xì)胞進(jìn)行的有絲分裂試驗(yàn)、受體結(jié)合試驗(yàn)、竟?fàn)幗Y(jié)合試驗(yàn)、免疫學(xué)試驗(yàn)(例如ELISA)和本領(lǐng)域已知的其它形式?？梢詮慕?jīng)處理的原代人皮膚成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞測量金屬蛋白酶分泌。響應(yīng)在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)存在下培養(yǎng)而產(chǎn)生的膠原酶、明膠酶和基質(zhì)溶解酶(stromalysin)的相對水平可以使用酶譜凝膠(Loita和Stetler-Ste薦son，CancerBiology1:96-106，1990)測量。皮膚成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞應(yīng)答測試蛋白質(zhì)而進(jìn)行的原膠原/膠原合成可以使用3H-脯氨酸在新生的分泌膠原中的摻入來測量。3H-標(biāo)記的膠原可以通過SDS-PAGE之后放射自顯影進(jìn)行觀察(Unemori和Amento，J.Biol.Chem.265:10681-10685，1990)。從皮膚成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分泌的糖胺聚糖(GAG)可以使用1,9-二甲基亞甲藍(lán)染料結(jié)合試驗(yàn)(Farndale等，Biochem.Biophys.Acta883:173-177，1986)測量。膠原和GAG試驗(yàn)還可以在存在IL-la或TGF-a時(shí)進(jìn)行以檢測zcyto20蛋白質(zhì)修飾針對這些細(xì)胞因子建立的應(yīng)答的能力。包含zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的蛋白質(zhì)家族的某些成員已被證實(shí)可以增加體內(nèi)循環(huán)的單核細(xì)胞數(shù)量?；罨瘑魏思?xì)胞對于天然免疫和獲得性免疫均是重要的。例如，已證實(shí)單核細(xì)胞的活化可以通過幾種機(jī)制刺激抗原呈遞。抗原呈遞則促進(jìn)T細(xì)胞(細(xì)胞毒性和輔助T細(xì)胞)的活化和增殖。樹突細(xì)胞的成熟和活化也促進(jìn)T細(xì)胞的激活和天然及獲得性免疫。而且已證實(shí)活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增加可以增加細(xì)胞裂解活性。因此，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以用作抗感染劑，以增強(qiáng)天然的、細(xì)胞介導(dǎo)的和體液免疫應(yīng)答。在CD14+單核細(xì)胞中觀察到ICAM染色增強(qiáng)，提示zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25在單核細(xì)胞的活化中有重要作用。盡管數(shù)據(jù)顯示該家族成員可以促進(jìn)對病毒的抗病毒應(yīng)答，但也可以影響細(xì)菌和寄生蟲?？蛇M(jìn)行單核細(xì)胞活化試驗(yàn)以(1)探測zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)進(jìn)一步刺激單核細(xì)胞激活的能力，和(2)檢測zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)由附著誘導(dǎo)的或由外毒素誘導(dǎo)的單核細(xì)胞活化的能力(Fuhlbrigge等，J.Immunol.138:3799-3802，1987)。響應(yīng)活化產(chǎn)生的IL-la和TNFa的水平可以通過ELISA(Biosource，Inc.Camarillo，CA)測量。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞借助CD14(LPS受體)對外毒素極為靈敏，具有適當(dāng)水平的外毒素樣活性的蛋白質(zhì)可以活化這些細(xì)胞。單核細(xì)胞水平的增加提示，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以對骨髓中的髓樣祖先細(xì)胞直接產(chǎn)生作用。髓樣祖先細(xì)胞向單核細(xì)胞分化的增加是例如化療后恢復(fù)免疫能力所必需的。因此，給接受化療的患者施用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以促進(jìn)患者的恢復(fù)和提高他們抵抗通常與化療相關(guān)的感染的能力。因此，本發(fā)明提供通過如下方式擴(kuò)增單核細(xì)胞或單核細(xì)胞祖先細(xì)胞的數(shù)量的方法用本發(fā)明分子培養(yǎng)骨髓或外周血細(xì)胞以便體外或離體地實(shí)現(xiàn)單核細(xì)胞或單核細(xì)胞祖先細(xì)胞數(shù)量的增加。本發(fā)明還提供了給需要增加單核細(xì)胞或單核細(xì)胞祖先細(xì)胞的哺乳動物體內(nèi)施用本發(fā)明分子的方法。單核細(xì)胞和單核細(xì)胞祖先細(xì)胞的增加可以使用臨床醫(yī)師、醫(yī)師和本領(lǐng)域其它技術(shù)人員熟知的方法測量。單核細(xì)胞屬于髓樣造血細(xì)胞譜系，因此對該譜系中的其它細(xì)胞的影響并不是不尋常的。例如，當(dāng)一種因子利于髓樣或淋巴樣譜系中的一類細(xì)胞的分化或增殖時(shí)，這也可以影響具有共同的祖先細(xì)胞或干細(xì)胞的其它細(xì)胞的產(chǎn)生。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)的造血活性可以在培養(yǎng)的多種造血細(xì)胞上進(jìn)行測試。優(yōu)選的測試方法包括原代骨髓集落分析和晚期譜系限制性集落分析，它們是本領(lǐng)域已知的(例如Holly等，WIPO公開文本W(wǎng)095/21920)。將接種在適宜半固體培養(yǎng)基(例如含有15%胎牛血清、10%牛血清白蛋白和0.6%PSN抗生素混合物的50%甲基纖維素)上的髓細(xì)胞在存在測試多肽的情況下培養(yǎng)，然后顯微鏡檢測集落形成。已知的造血因子用作對照。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽對造血細(xì)胞系的促有絲分裂活性可以按以上公開測量。細(xì)胞遷移基本上按Kahler等(Arteriosclerosis,Thrombosis,andVascularBiology17:932-939,1997)/>開的方法測定。如果一個(gè)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞從低蛋白濃度的區(qū)域向高蛋白濃度的區(qū)域遷移，則該蛋白被認(rèn)為具有趨化性。典型的試驗(yàn)使用修飾的Boyden室(用聚笨乙烯膜分開兩室)(Transwell;CorningCostarCorp.)進(jìn)行。將稀釋在含有1%BSA的培養(yǎng)基中的測試樣品加入含Transwell的24孔板的下部室中。然后，將細(xì)胞放在預(yù)先用0.2%明膠處理的Transwell插入物上。37i:孵育4小時(shí)后測量細(xì)胞遷移。除去Transwell膜頂部的非遷移細(xì)胞，并固定附著在膜下表面上的細(xì)胞，用O.1%結(jié)晶紫染色。然后用10%乙酸提取染色的細(xì)胞，并于600nm測量吸光度。然后從標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定曲線計(jì)算遷移。還可以使用Grant等("血管發(fā)生是上皮-間充質(zhì)相互作用的一個(gè)成分"，Goldberg和Rosen,Epithelial—MesenchymalInteractioninCancer,BirkhauserVerlag，1995，235-248;Baatout，AnticancerResearch17:451-4561997)的matrigel方法測量細(xì)胞遷移。細(xì)胞祐著活性基本上按照LaFleur等(J.Biol.Chem.272:32798-32803，1997)公開的方法測定。筒而言之，用測試蛋白質(zhì)包被微量滴定板，用BSA封閉非特異位點(diǎn)，并以大約104-105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種細(xì)胞(如平滑肌細(xì)胞、白細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞)。在37。C孵育這些孔(典型地大約60分鐘)，然后通過溫和洗滌除去未貼壁的細(xì)胞。通過常規(guī)方法(例如用結(jié)晶紫染色、裂解細(xì)胞并測定裂解物的光密度)定量貼壁細(xì)胞的數(shù)量。對照孔用已知的粘著蛋白，如纖連蛋白或玻連蛋白包被。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)的活性可以用珪基生物傳感顯微生理計(jì)(microphysiometer)(其測量與受體結(jié)合及隨后的細(xì)胞生理反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞外酸化速率或質(zhì)子排出)測量。此類裝置的一個(gè)例子是MolecularDevices(Sunnyvale,CA)制造的Cytosensor顯微生理計(jì)。多種細(xì)胞應(yīng)答，如細(xì)胞增殖、離子運(yùn)輸、能量產(chǎn)生、炎癥應(yīng)答、調(diào)節(jié)和受體激活等均可以通過此方法測量。見，例如，McCo騰ll等，Science257:1906-1912，1992;Pitchford等，Meth.Enzymol.228:84-108，1997;Arimilli等，J.Immunol.Meth.212:49-59，1998;和VanLiefde等，Eur.J\Pharmacol.346:87-95，1998。顯微生理計(jì)可以用于分析粘著或非粘著真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。通過測量細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞外酸化隨時(shí)間推移的改變，顯微生49理i十可以直接測量出細(xì)胞對多種刺激(包括Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白、它們的激動劑和拮抗劑)的應(yīng)答。優(yōu)選使用顯微生理計(jì)測量相對于不應(yīng)答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的對照真核細(xì)胞，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25應(yīng)答性真核細(xì)胞的反應(yīng)。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25應(yīng)答性真核細(xì)胞包括通過轉(zhuǎn)染Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的受體而產(chǎn)生的應(yīng)答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的細(xì)胞、以及天然應(yīng)答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的細(xì)胞。通過細(xì)胞外酸化的改變(如增加或減少)測量到的暴露于Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的細(xì)胞與對照(未暴露于Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25)在反應(yīng)方面的差異，是對Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25調(diào)節(jié)的細(xì)胞應(yīng)答的直接測量。而且，由Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25調(diào)節(jié)的此類應(yīng)答還可以在多種刺激物下進(jìn)行測定。因此，本發(fā)明提供養(yǎng)定Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的激動劑和拮抗劑的方法，包括提供應(yīng)答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的細(xì)胞，將這些細(xì)胞的第一部分在無測試化合物時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，將這些細(xì)胞的第二部分在有測試化合物時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，和檢測第二部分細(xì)胞相對于第一部分細(xì)胞在細(xì)胞應(yīng)答方面的改變，如增加或減少。細(xì)胞應(yīng)答的改變表現(xiàn)為可測量的細(xì)胞外酸化速率的改變。將上述細(xì)胞的第三部分在有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白但無測試化合物的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，這為Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25應(yīng)答性細(xì)胞提供了陽性對照,并為比較測試化合物的激動劑活性與Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的活性提供了對照。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的拮抗劑可以通過使細(xì)胞在有和無觀〗試化合物的情況下暴露于Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白進(jìn)行鑒定，籍此Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25刺激活性的降低指示測試化合物具有拮抗劑活性。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多核普酸在動物中的表達(dá)為進(jìn)一步研究體內(nèi)過量產(chǎn)生或抑制蛋白質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)提供了模型?？梢允褂貌《据d體或棵DNA將Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的編碼多核苷酸和反義多核苷酸引入測試動物，如小鼠中，或可以制備轉(zhuǎn)基因動物。測試本發(fā)明蛋白質(zhì)的一個(gè)體內(nèi)方法利用了病毒遞送系統(tǒng)。用于此目的的實(shí)例病毒包括腺病毒、皰瘆病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒和腺相關(guān)病毒(AAV)。腺病毒，一種雙鏈DNA病毒，是目前研究得最好的遞送異源核酸的基因轉(zhuǎn)移載體。綜述見Becker等，Meth.CellBiol.43:161-89，1994;和Douglas和Curiel，Science&Medicine4:44-531997。腺病毒系統(tǒng)有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。腺病毒可以(i)容納相當(dāng)大的插入DNA;(ii)生長至高滴度；(iii)感染廣譜的哺乳動物細(xì)胞類型；和(iv)與許多不同的啟動子，包括遍在的、組織特異性的和可調(diào)節(jié)的啟動子一起使用。由于腺病毒在血流中是穩(wěn)定的，故它們可以通過靜脈注射給藥。通過缺失部分腺病毒基因組，可以容納更大的異源DNA插入片斷(多達(dá)7kb)。可以通過直接連接或通過和共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒同源重組，將這些插入片斷整合在病毒DNA中。在一個(gè)示例性系統(tǒng)中，從病毒載體中缺失必需的El基因，這樣除非宿主細(xì)胞(如人293細(xì)胞系)提供El基因，否則該病毒將不能復(fù)制。當(dāng)通過靜脈內(nèi)方式施用給完整動物時(shí)，腺病毒主要把向肝。如果腺病毒遞送系統(tǒng)具有E1基因缺失，則該病毒不能在宿主細(xì)胞中復(fù)制。然而，宿主組織(例如肝)將表達(dá)和加工(并且，如果存在信號序列，分泌)該異源蛋白質(zhì)。分泌的蛋白質(zhì)將在高度血管化的肝中進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，并可以測定它對感染動物的作用?；蜻f送的另一備選方法包括采取機(jī)體的細(xì)胞并以棵DNA質(zhì)粒的形式將載體引入該細(xì)胞中。然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞重新植入機(jī)體。將棵DNA載體引入宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的，包括轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、使用基因槍或使用DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)者。見，Wu等，J.Biol.Chem.263:14621-14624，1988Wu等，J.Biol.Chem.267:963-967，1992;和Johnston和Tang,Meth.CellBiol.43:353_365,1994。還可以制備(Lowell等，Nature366:740--742，1993)經(jīng)工程化表達(dá)Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因的轉(zhuǎn)基因小鼠、和表現(xiàn)出完全缺失Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因功能的小鼠，后者被稱作效除小鼠(knockoutmice)"(Snouwaert等，Science257:1083，1992)?？梢岳眠@些小鼠在體內(nèi)系統(tǒng)中研究Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因和由此編碼的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)基因小鼠對于研究Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白在早期發(fā)育中的作用尤其有用，因斷。也參見Maiso叩ierre等，Science277:55-60，1997和Hanahan，Science277:48-50，1997。轉(zhuǎn)基因表達(dá)的優(yōu)選啟動子包括來自金屬硫蛋白和白蛋白基因的啟動子。對肌肉收縮的正常抑制性控制的喪失與選擇的分泌Y氨基丁酸的神經(jīng)元的損傷或紊亂有關(guān)。例如，僵人綜合征表現(xiàn)出顯著的肌肉系統(tǒng)僵硬，這被i^為是通過干擾產(chǎn)生y氨基丁酸(gaba)的神經(jīng)元的功能來介導(dǎo)的。其它相關(guān)的神經(jīng)肌肉疾病包括肌強(qiáng)直、代謝性肌病、艾薩克綜合征、肌張力障礙和強(qiáng)直性痙攣(Valldeoriola，J.Neurol.246:423-431，1999)。類似地，可以在經(jīng)歷腫瘤進(jìn)展的組織或細(xì)胞中對Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽、或它們在組織中的表達(dá)喪失進(jìn)行直接測量。與正常組織相比，癌前或癌性情況下細(xì)胞侵入性和運(yùn)動性的增加、或Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25表達(dá)的獲得或喪失可以用于診斷腫瘤進(jìn)程中的轉(zhuǎn)化、侵入和轉(zhuǎn)移。就這一點(diǎn)而論，有關(guān)肺瘤進(jìn)展或轉(zhuǎn)移階段的信息將幫助醫(yī)師針對給定的獨(dú)特癌癥患者選擇最適當(dāng)?shù)闹委熁蛑委熐忠u性。用于測量(mRNA或蛋白質(zhì)的)表達(dá)獲得和喪失的方法是本領(lǐng)域熟知的并描述在本文中，可以將它們應(yīng)用于Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的表達(dá)。例如，可以使用調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動性的多肽的出現(xiàn)或消失來幫助診斷前歹'J腺癌和進(jìn)4亍預(yù)后(Banyard，J.和Zetter,B.R.，CancerandMetast.Rev.17:449-458，1999)。作為細(xì)胞運(yùn)動性的效應(yīng)子或作為肝特異性標(biāo)志，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的表達(dá)獲得或喪失可以用于診斷腦癌和其它癌癥。而且，類似于前列腺特異性抗原(PSA)，相對于正常對照，患者中Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多欣的水平增加或抗zcyto20、抗zcyto21、抗zcyto22、抗zcyto24和抗zcyto25抗體可以指示腦癌和其它癌癥(見例如Mulders,TMT等，Eur.J.SurgicalOncol.16:37-41，1990)。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25在正常發(fā)現(xiàn)不表達(dá)這些多核苷酸的組織中的強(qiáng)表達(dá)可以用于診斷細(xì)胞或組織類型中的異常、癌性肝組織向非肝組織的侵入或轉(zhuǎn)移，并可以幫助醫(yī)師指導(dǎo)進(jìn)一步的測試或研究或幫助醫(yī)師指導(dǎo)治療。此夕卜，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多核*酸探針、抗Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25抗體、及對組織中Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25存在的檢測也可以用于評價(jià)是否存在正常表達(dá)Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的腦或其它組織，例如，在涉及切除患病的或癌性肝或神經(jīng)組織的手術(shù)后進(jìn)行評價(jià)。在這點(diǎn)上，本發(fā)明的多核普酸、多肽和抗體可以用于幫助確定手術(shù)后(例如，腦和其它癌的手術(shù)后)是否所有的組織都被切除。在這些情況中，尤其重要的是除去所有潛在的患病組織以便在癌癥后實(shí)現(xiàn)最大的恢復(fù)和最小的復(fù)發(fā)。優(yōu)選的實(shí)施方案包括可以組織學(xué)或原位使用的熒光的、放射性標(biāo)記的或量熱方式標(biāo)記的抗zcyto20抗體和Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多狀結(jié)合伙伴。而且，可以體內(nèi)測量Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的活性和對腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的影響。幾個(gè)同基因小鼠模型已被開發(fā)用于研究多肽、化合物或其它治療對腫瘤進(jìn)展的影響。在這些胞植入與腫瘤供體相同品系的小鼠中。細(xì)胞將在受體小鼠中發(fā)育成具有相似特征的腫瘤，而且在某些模型中會發(fā)生轉(zhuǎn)移。對于我們的研究，適當(dāng)?shù)哪[瘤模型包括尤其是Lewis肺癌(ATCCNo.CRL-1642)和B16黑素瘤(ATCCNo.CRL-6323)。這兩個(gè)均是常用的腫瘤系，與C57BL6小鼠同基因，易于在體外培養(yǎng)和操作。由植入其中任一個(gè)細(xì)胞系引起的腫瘤能夠在C57BL6小鼠中向肺轉(zhuǎn)移。Lewis肺癌模型近來被用于小鼠中鑒定血管生成抑制劑(O'ReillyMS等，Cell79:315-328，1994)。通過每日注射重組蛋白、激動劑或拮抗劑或一次性注射重組腺病毒用試驗(yàn)劑處理C57BL6/J小鼠。此處理后3天，將105至106個(gè)細(xì)胞移植在背部皮膚之下?；蛘撸梢栽谝浦睬坝弥亟M腺病毒(例如表達(dá)Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的重組腺病毒)感染細(xì)胞本身，以便在腫瘤位置或在細(xì)胞內(nèi)而不是在全身合成該蛋白質(zhì)。該小鼠正常在5日內(nèi)長出可見的腫瘤。允許該肺瘤生長多達(dá)3個(gè)星期，在此期間它們在對照處理組中可以達(dá)到1500-1800mi^大小。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中仔細(xì)監(jiān)測胂瘤的尺寸和體重。處死時(shí)，與肺和肝一起取出胂瘤并稱重。肺重顯示出與轉(zhuǎn)移的胂瘤負(fù)荷十分相關(guān)。作為另一種測量方法，計(jì)數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移瘤。使用本領(lǐng)域已知的和本文中描述的方法處理切下的肺瘤、肺和肝以便進(jìn)行組織病理學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)分析和原位雜交。由此可以評價(jià)表達(dá)的目的多肽，例如Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25對腫瘤募集血管系統(tǒng)和進(jìn)行轉(zhuǎn)移的能力的影響。此外，除了使用腺病毒夕卜，還可以用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25瞬時(shí)轉(zhuǎn)染植入的細(xì)胞。應(yīng)用穩(wěn)定的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25轉(zhuǎn)染子以及應(yīng)用誘導(dǎo)型啟動子體內(nèi)激活Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25表達(dá)是本領(lǐng)域已知的，而且可以將它們用于該系統(tǒng)中以評價(jià)zcyto20對轉(zhuǎn)移的誘導(dǎo)。而且，可以直接將純化的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25或Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的條件培養(yǎng)基注射至該小鼠模型中，并由此用于該系統(tǒng)。一般地參見，O'ReillyMS等，Cell79:315-328，1994;和RuscianoD等，肝轉(zhuǎn)移的鼠模型，InvasionMetastasis14:349—361，1995?？梢允褂梅戳x方法學(xué)抑制zcyto20基因轉(zhuǎn)錄以檢測該抑制的體內(nèi)效應(yīng)。設(shè)計(jì)與Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的編碼多核苷酸(例如SEQIDN0:1中所示多核苷酸)的區(qū)段互補(bǔ)的多核苷酸，以便其與Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的編碼mRNA結(jié)合并抑制該mRNA翻譯。這些反義寡核苷酸還可以用于細(xì)胞培養(yǎng)物中抑制Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的編碼基因的表達(dá)。大多數(shù)細(xì)胞因子以及活化淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的其它蛋白質(zhì)對于整個(gè)身體的細(xì)胞分化、激活、募集和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有重要的生物學(xué)作用。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25及其活性的抑制劑預(yù)期具有多種治療用途。這些治療用途包括治療需要免疫調(diào)節(jié)的疾病，包括自身免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼癡和糖尿病。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25對于炎癥調(diào)節(jié)可能是重要的，因此可以用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘和敗血癥。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可能在介導(dǎo)胂瘤發(fā)生中有作用，由此Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25拮抗劑可以用于治療癌癥。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，由此，可以使用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25及Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的拮抗劑降低移植排斥、預(yù)防移植物抗宿主疾病、增強(qiáng)對感染性疾病的免疫、治療無免疫應(yīng)答的患者(例如HIW患者)或改善疫苗。本發(fā)明蛋白質(zhì)家族的成員已證實(shí)具有與干擾素a相似的抗病毒作用。在美國，干擾素已被批準(zhǔn)用于治療自身免疫病、尖銳濕疣、慢性丙型肝炎、膀胱癌、宮頸癌、喉乳頭狀瘤病、蕈樣肉芽肺病、慢性乙型肝炎、感染人免疫缺陷病毒的患者中的卡波西肉瘤、惡性黑素瘤、毛細(xì)胞白血病和多發(fā)性硬化。此外，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以通過抑制細(xì)胞增殖用于治療各種形式的動脈硬化，如動脈粥樣硬化。因此，本發(fā)明考慮具有zcyto20活性的蛋白質(zhì)、多肽和肽在治療這些疾病以及治療視網(wǎng)膜病中的用途。本發(fā)明還考慮具有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的蛋白質(zhì)、多肽和肽在治療淋巴增生性疾病(包括B細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、非何杰金氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、急性髓細(xì)胞性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病)中的用途。千擾素還被證實(shí)可以誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)抗原(見例如，Auth等，H印atology18:546(1993)，Guadagni等，Int.J.Biol.Markers9:53(1994)，Girolomoni等，Eur.J.Immunol.25:2163(1995)，和Maciejewski等，Blood85:3183(1995))。此活性增強(qiáng)了體外筌定新胂瘤相關(guān)抗原的能力。而且，干擾素提高人腫瘤抗原的表達(dá)水平的能力說明干擾素能夠作為佐劑用于免疫治療中或增強(qiáng)使用抗腫瘤抗原抗體進(jìn)行的免疫閃爍照相術(shù)(immunoscintigmphy)(Guadagni等，CancerImmunol.Immunother.26:222(1988);Guadagni等，Int.J.Biol.Markers9:53(1994))。因此，本發(fā)明包括具有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的蛋白質(zhì)、多肽和肽作為佐劑用于免疫治療或用于改善使用抗腫瘤抗原抗體進(jìn)行的免疫閃爍照相術(shù)的用途。檢測和診斷病毒感染的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。用于測量響應(yīng)本發(fā)明分子的施用引起的病毒下降的確切方法將取決于患者、病毒感染類型等。例如，方法包括，但不限于，測量CD4細(xì)胞數(shù)量的改變、血清學(xué)試驗(yàn)、通過常規(guī)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(yàn)測量病毒DNA和病毒RNA、病毒誘導(dǎo)的抗體水平、免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、致細(xì)胞病毒效應(yīng)和組織學(xué)。而且，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以結(jié)合CD4或另外的白細(xì)胞受體，并表現(xiàn)出抗病毒作用，例如抗人免疫缺陷病毒(HIV)或人T細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒(HumanT-celllymphotropicvirus,HTLV)。或者，zcyto20多肽可以和病毒竟?fàn)幉《臼荏w或共同受體56以阻斷病毒感染。Zcyto20可以胃腸外給藥以預(yù)防病毒感染或降低正在進(jìn)行的病毒復(fù)制和再感染(Gayowski，T.等，Transplantation64:422-4261997)。因此，zcyto20可以用作抗病毒治療劑，例如治療病毒性白血病(HTLV)、AIDS(HIV)，或由如輪狀病毒、杯狀病毒(例如，NorwalkAgent)和某些致病性腺病毒抹引起的胃腸道病毒感染、乙型肝炎和丙型肝炎。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25還可以用于治療心肌炎，一種當(dāng)心臟涉及炎癥過程時(shí)引起的疾病。淋巴細(xì)胞浸潤和肌細(xì)胞裂解被認(rèn)為是病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲感染后的結(jié)果(見例如，Brodison等，J.Infection37:99(1998))。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以通過靜脈內(nèi)或皮下途徑注射以治療與心肌炎有關(guān)的感染。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25還可以通過靜脈內(nèi)途徑作為免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子給藥以治療自身免疫性心肌炎。干擾素的劑量可以使用A/J小鼠心肌炎自身免疫模型來推斷(Do畫eyer等，J.Exp.Med.182:1291(1995))。給綿羊外源性施用干擾素t可以增加妊娠率(Aggarwal，HumanCytokinesIII，(BlackwellScience1997))。正如本文所述，zcyto20mRNA在胎盤中表達(dá)。因此，本發(fā)明包括Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25，如本文公開的人Zcyto20、zcyto21和zcyto22，在促進(jìn)和保護(hù)胎兒生長方面的用途。作為舉例說明，可以使用Zcyto20、zcyto21和zcyto22保護(hù)發(fā)育的胎兒免受病毒(例如人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒等)感染。此夕卜，Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以用于促進(jìn)體夕卜受精。近來的報(bào)道提示，I型干擾素可以在病毒感染早期通過在胰腺p細(xì)胞中誘導(dǎo)強(qiáng)抗病毒狀態(tài)起到預(yù)防病毒誘導(dǎo)的糖尿病的作用(Flodstroem等，NatureImmunology3,373-382(2002))。這可以防止由于病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡以及伴隨發(fā)生的自身免疫引起的p細(xì)胞喪失。Zcyto20、21和22還可以在,表達(dá)它們的受體zcytorl9的細(xì)胞中誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)。Zcytorl9在胰腺組織中高表達(dá)，因此，zcyto20-22可以起到預(yù)防因P細(xì)胞死亡引起的病毒誘導(dǎo)性糖尿病的作用。此外，還可以將I型干擾素在預(yù)防病毒誘導(dǎo)性糖尿病中的作用擴(kuò)展至其它病毒誘導(dǎo)的自身免疫疾病，因此，zcyto20-22也可能起到預(yù)防其它疾病(如肌硬化(muscularsclerosis)、狼掩和在表達(dá)zcyto20-22受體zcytorl9的組織中病毒誘導(dǎo)的自身免疫病)的作用。I型干擾素的慢性系統(tǒng)性表達(dá)還與I型糖尿病的病理有關(guān)。由于I型干擾素和zcyto20-22在生物學(xué)活性和基因誘導(dǎo)方面的相似性，zyto20、21或22的慢性系統(tǒng)性表達(dá)也可能在I型糖尿病的病理中有作用。因此，zcyto20-22活性的抑制劑在胰腺中可能對于預(yù)防I型糖尿病是有益的。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽可以單獨(dú)或聯(lián)合其它脈管生成劑或血管生成劑(包括VEGF)—起給藥。當(dāng)與其它藥劑聯(lián)合使用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25時(shí)，對于所治療的具體疾病，可以適當(dāng)?shù)赝瑫r(shí)或相繼施用這兩種化合物。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25對于治療肺瘤發(fā)生是有用的，因此可以用于治療癌癥。zcyto20可以抑制抗IgM剌激的正常B細(xì)胞，在B細(xì)胞腫瘤系中觀察到類似效果，這提示使用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25治療患者以資導(dǎo)B細(xì)胞肺瘤細(xì)胞進(jìn)入增殖較不活躍的狀態(tài)可以具有治療益處?？梢詫⒃撆潴w和其它已應(yīng)用的藥劑(包括常規(guī)化療藥劑以及免疫調(diào)節(jié)劑如干擾物疾病模型，而且對于B細(xì)胞胂瘤來源的細(xì)胞系，干擾素a和zcyto20的生長抑制作用可以相加。本發(fā)明提供降低贅生性B或T細(xì)胞增殖的方法，包括給具有B或T細(xì)胞贅生物的哺乳動物施用給藥量足以降低贅生性B或T細(xì)胞增殖的zcyto20組合物。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以剌激來自骨髓祖先細(xì)胞的裂解性NK細(xì)胞并在抗原受體活化后刺激T細(xì)胞增殖，這將增強(qiáng)對接受同種異型骨髓移植的患者的治療，因此，在輸注或不輸注供體淋巴細(xì)胞的情況下，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25均可以增強(qiáng)抗肺瘤應(yīng)答的產(chǎn)生。另一方面，本發(fā)明提供降低贅生性B或T細(xì)胞增殖的方法，包括給具有B或T細(xì)胞贅生物的哺乳動物施用給藥量足以降低贅生性B或T細(xì)胞增殖的zcyto20拮抗劑組合物。而且，該zcyto20拮抗劑可以是配體/毒素融合蛋白?？梢允褂脄cyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25與皂草素的融合毒素對抗一組類似的白血病和淋巴瘤，從而擴(kuò)大了可以用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25治療的白血病范圍。融合毒素介導(dǎo)的zcyto20受體激活為抑制靶細(xì)胞生長提供了兩個(gè)獨(dú)立方式，第一個(gè)方式與單獨(dú)使用配體時(shí)觀察到的效應(yīng)一樣，而第二個(gè)方式是由于通過受體內(nèi)化遞送毒素。對于藥物應(yīng)用，可以根據(jù)常規(guī)方法對zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)進(jìn)行配制以便局部或胃腸外，尤其是靜脈內(nèi)或皮下給藥。一般，藥物制劑包括zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽和可藥用載體，如鹽水、緩沖鹽水、5%葡聚糖水溶液等。制劑還可以包括一種或多種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩沖劑、防止蛋白質(zhì)丟失在瓶表面上的白蛋白等。配制方法是本領(lǐng)域熟知的,公開在例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Gennaro編，MackPublishingCo.，Eastern,PA，第19版，1995。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25優(yōu)選以大約10至lOOjig/ml總體積的濃度使用，但也可以使用lng/ml至lOOOpg/ml的濃度。對于局部使用，例如為了促進(jìn)傷口愈合，可以按0.l-10jig/cm2傷口面積使用該蛋白質(zhì)，確切的劑量由臨床醫(yī)師根據(jù)接受的標(biāo)準(zhǔn)，考慮待治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性、患者的特性等來確定。劑量的確定屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平?？梢栽谥委熎陂g每日或間歇地給藥?？梢栽谝恢翈讉€(gè)小時(shí)的典型時(shí)間期限內(nèi)通過快速注射或灌注進(jìn)行靜脈給藥。還可以使用緩釋制劑。一般，zcyto20的治療有效量是指足以造成所治療疾病出現(xiàn)臨床上顯著改變(例如造血或免疫功能方面的臨床顯著改變、發(fā)病率的顯著降低或組織學(xué)評分的顯著增加)的量。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)、激動劑和拮抗劑可以用于調(diào)節(jié)應(yīng)答性細(xì)胞類型的擴(kuò)增、增殖、激活、分化、遷移或代謝，這些細(xì)胞類型包括原代細(xì)胞和培養(yǎng)的細(xì)胞系。在這方面尤其有意義的是造血細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞(包括干細(xì)胞和成熟髓樣細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。將zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽加入這些細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)基中，濃度為約10pg/ml至約100ng/ml。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，可以在培養(yǎng)基中有利地聯(lián)合使用zcyto20蛋白質(zhì)和其它生長因子。在實(shí)驗(yàn)室研究領(lǐng)域，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白還可以用作分子量標(biāo)準(zhǔn)或在測定該蛋白質(zhì)的循環(huán)水平的分析中用作試劑，如用于診斷以過量或低量產(chǎn)生zcyto20蛋白質(zhì)為特征的疾病或分析細(xì)胞表型。還可以用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)筌定它們活性的抑制劑。將測試化合物加入上述試驗(yàn)中以鑒定抑制zcyto20蛋白質(zhì)活性的化合物。除了上述試驗(yàn)外，還可以在多種設(shè)計(jì)用來測量受體結(jié)合或zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25依賴性細(xì)胞應(yīng)答的刺激/抑制的試驗(yàn)中測試樣品對zcyto20活性的抑制。例如，可以用響應(yīng)zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25所刺激的細(xì)JJ包途徑的才艮道基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25應(yīng)答性細(xì)胞系。該類報(bào)道基因結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域已知的，一般包括可操作地與編碼可檢測蛋白質(zhì)(如螢光素酶)的基因連接的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25激活的血清效應(yīng)元件(SRE)。在靶細(xì)胞上測試候選化合物、溶液、混合物或提取物抑制zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的能力，這可以通過zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25刺激的報(bào)道基因表達(dá)的減少來證實(shí)。此類試驗(yàn)可以檢測直接阻斷zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25與細(xì)胞表面受體結(jié)合的化合物以及阻斷發(fā)生在受體-配體結(jié)合后的細(xì)胞途徑中的過程的化合物。在備選方法中，可以使用連接有可檢測標(biāo)記(例如"51、生物素、辣根過氧化物酶、FITC等)的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25,測試直接阻斷zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25與受體結(jié)合的化合物或其它樣品。在此類試驗(yàn)中，測試樣品抑制標(biāo)記的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25與受體結(jié)合的能力指示了抑制活性，這可以通過別的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。用于結(jié)合試驗(yàn)中的受體可以是細(xì)胞受體或分離的固定化受體。本文中，術(shù)語"抗體"包括多克隆抗體、單克隆抗體、其抗原結(jié)合片斷如F(ab，)2和Fab片斷、單鏈抗體等，其中包括遺傳工程化抗體。非人抗體可以通過在人構(gòu)架和恒定區(qū)上嫁接非人CDR、或通過整合完整的非人可變區(qū)(任選地通過替換暴露的殘基用人樣表面踅蔽"它們，其結(jié)果是嘴飾"抗體)實(shí)現(xiàn)人源化。在一些情況中，人源化抗體可以在人可變區(qū)構(gòu)架域中保留非人殘基以增加正確的結(jié)合特征。通過使抗體人源化可以增加生物學(xué)半衰期，并減少在施用于人后出現(xiàn)不良免疫Ig亞型)制備人源化抗體以促進(jìn)或抑制與特定抗體恒定區(qū)有關(guān)的不同免疫功能。如果抗體與Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力比抗體與對照(非Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25)多欣或蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力高至少10倍，則該抗體被定義為發(fā)生特異結(jié)合。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地測定單克隆抗體的親和力(見，例如Scatchard，Ann.NYAcad.Sci.51:660-627,1949)。制備單克隆和多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的(見例如HurrellJ.G.R.編,MonoclonalHybridomaAntibodies:TechniquesandApplications,CRCPress,Inc.，BocaRaton，F(xiàn)L，1982，并入本文作為參考)。尤其有意義的是制備針對親水性抗原性位點(diǎn)的抗體，所述抗原性位點(diǎn)包括例如SEQIDN0:2第169(Glu)至174(Glu)位氨基酸殘基，SEQIDNO:2第54(Lys)至59(Ala)位氨基酸殘基，SEQIDNO:2第53(Phe)至58(Asp)位氨基酸殘基，SEQIDN0:2第168(Gln)至173(Lys)位氨基酸殘基，及SEQIDN0:2第154(Pro)至159(Arg)位氨基酸殘基。例如，zcyto22中，親水區(qū)域包括SEQIDNO:7第169(Glu)至174(Glu)位氨基酸殘基，SEQIDNO:7第54(Lys)至59(Ala)位氨基酸殘基、SEQIDNO:7第53(Phe)至58(Asp)位氨基酸殘基，SEQIDNO:7第168(Gin)至173(Lys)位氨基酸殘基，及SEQIDNO:7第154(Pro)至159(Arg)位氨基酸殘基，它們將是有用的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明了，多克隆抗體可以從多種溫血動物如馬、牛、山羊、綿羊、狗、雞、兔、小鼠和大鼠制備。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的免疫原性可以通過使用佐劑如明礬(氫氧化鋁)或弗氏完全或不完全佐劑來加強(qiáng)。用于免疫的多肽還包括融合多肽，如Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肷或其部分與免疫球蛋白多肽或與麥芽糖結(jié)合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全長分子或其部分。如果多肽部分是"半抗原樣的"，則該部分可以有利地與大分子載體(如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破傷風(fēng)類毒素)結(jié)合或連接用于免疫。制備或篩選抗體的備選技術(shù)包括體外使淋巴細(xì)胞暴露于Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽、和在嗜菌體或類似載體中篩選抗體展示文庫(例如通過使用固定化的或標(biāo)記的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽)。人抗體可以在已經(jīng)通過工程化而含有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因非人動物中制備，見WIPO公開文本W(wǎng)098/24893中的公開。優(yōu)選通過例如同源重組的方式失活或清除這些動物中的內(nèi)源性免疫球蛋白基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種試驗(yàn)均可以用于檢測特異結(jié)合Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的抗體。示例性試驗(yàn)詳細(xì)描述在Antibodies:ALaboratoryManual,Harlow和Lane(編)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988。此類試驗(yàn)的代表性例子包括并行免疫電泳(concurrentimmunoelectrophoresis)、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、斑點(diǎn)印跡分析、Western印跡分析、抑制或竟?fàn)幵囼?yàn)和三明治試驗(yàn)。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的抗體可以用于親和純化這些蛋白質(zhì)，在診斷試驗(yàn)中用于確定這些蛋白質(zhì)的循環(huán)水平；用于檢測或定量作為潛在病理學(xué)或疾病的標(biāo)志的可溶性Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽.，用于在整體動物或組織切片中免疫定位，包括免疫診斷應(yīng)用；用于免疫組織化學(xué)；和用作拮抗劑以體內(nèi)和體外阻斷蛋白質(zhì)活性。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的抗體還可以用于標(biāo)記表達(dá)Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的細(xì)胞；用于親和純化Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽和蛋白質(zhì)；用于使用FACS的分析方法中；用于篩選表達(dá)文庫;和用于制備抗獨(dú)特型抗體。可以使用已知方法使抗體和其它化合物，包括治療性和診斷性藥劑連接，以使這些化合物可以耙向表達(dá)Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的受體的細(xì)胞。對于某些應(yīng)用，包括體外和體內(nèi)診斷應(yīng)用，有利的是使用標(biāo)記的抗體。適宜的直接標(biāo)簽或標(biāo)記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、磁性顆粒等；間接標(biāo)簽或標(biāo)記可以類似使用生物素-親和素或其它互補(bǔ)物/反互補(bǔ)物對作為中間體。本發(fā)明抗體還可以直接或間接地與藥物、毒素、放射性核素等偶連，而且這些偶連物可以用于體內(nèi)診斷或治療應(yīng)用(例如抑制細(xì)胞增殖)。一般見R畫krish腿等，CancerRes.56:1324-13301996。本發(fā)明多肽和蛋白質(zhì)可以用于鑒定和分離受體。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的受體可能參與肝臟中的生長調(diào)節(jié)、血管形成和其它發(fā)育過程。例如，可以將Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)和多肽固定在柱子上，然后^f吏膜制品過柱(一般見ImmbolizedAffinityLigandTechniques,Hermanson等編，AcademicPress,SanDiego,CA，1992，第195-202頁)。還可以對蛋白質(zhì)和多肽進(jìn)行放射性標(biāo)記(MethodsEnzymol.第182巻，,白質(zhì)純化指南"，M.Deutscher編，AcademicPress,SanDiego,1990，721-737)或光親和標(biāo)記(B進(jìn)證等，Ann.Rev.Biochem.62:483-514，1993和Fedan等，BiochemPh翻謡l-33:1167-1180，1984)，并可以將其用于標(biāo)記特異的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。類似地，可以在結(jié)合試驗(yàn)中使用cDNA表達(dá)文庫轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，利用放射性標(biāo)記的zcyto20蛋白質(zhì)和多肽克隆同源受體。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多欣還可以用于教導(dǎo)分析技術(shù)，例如質(zhì)譜、園二色性以確定尤其是四a螺旋的構(gòu)象，x射線晶體學(xué)以在原子細(xì)節(jié)上確定三維結(jié)構(gòu)，核磁共振光譜分析以揭示蛋白質(zhì)在溶液中的結(jié)構(gòu)。例如，可以給學(xué)生含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的試劑盒用于分析。由于氨基酸序列是教導(dǎo)者已知的，因此可以給予學(xué)生該蛋白質(zhì)作為確定或發(fā)展學(xué)生技能的試驗(yàn)，然后教導(dǎo)者將知道學(xué)生是否正確地分析了該多肽。由于每個(gè)多肽都是獨(dú)特的，因此教學(xué)利用zcyto20本身將具有獨(dú)特性。與Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25特異結(jié)合的抗體可以用作教學(xué)輔助工具以教導(dǎo)學(xué)生如何制備親和層析柱以純化Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25，以及克隆和測序編碼該抗體的多核苷酸并由此作為實(shí)踐課用于教導(dǎo)學(xué)生如何設(shè)計(jì)人源化抗體。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因、多肽或抗體可以由試劑公司包裝并出售給教學(xué)機(jī)構(gòu)以便學(xué)生掌握分子生物學(xué)領(lǐng)域的技能。由于每個(gè)基因和蛋白質(zhì)都是獨(dú)特的，因此在實(shí)驗(yàn)課中每個(gè)基因和蛋白質(zhì)對于學(xué)生來說都構(gòu)成了獨(dú)特的挑戰(zhàn)和學(xué)習(xí)經(jīng)驗(yàn)。這些含有ZCYT020基因、多肽或抗體的教學(xué)試劑盒被認(rèn)為屬于本發(fā)明范圍。總之，本發(fā)明提供與選自下組的多肽具有至少80%或95%或100%—致性的分離的多肽(a)包含SEQIDN0:2第22位氨基酸殘基至第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDN0:7第22位氨基酸殘基至第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位氨基酸殘基至第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDN0:11第29位氨基酸殘基至第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽。另一實(shí)施方案中，該分離的多肽結(jié)合SEQIDNOS:24、27或29所示的單體或同二聚體受體形式的受體或SEQIDNOS:24、27或29與SEQIDNO:41組合的異二聚體受體。在另一方面，本發(fā)明包括含有SEQIDN0:2第22位氨基酸殘基至第205位氨基酸殘基所示或SEQIDNO:2第1位氨基酸殘基至第205位氨基酸殘基所示的氨基酸序列的分離多肽。另一方面，本發(fā)明包括含有SEQIDN0:7第22位氨基酸殘基至第205位氨基酸殘基所示或SEQIDNO:7第1位氨基酸殘基至第205位氨基酸殘基所示的氨基酸序列的分離多肽。另一方面，本發(fā)明包括含有SEQIDN0:9第29位氨基酸殘基至第202位氨基酸殘基所示或SEQIDN0:9第1位氨基酸殘基至第202位氨基酸殘基所示的氨基酸序列的分離多肽。另一方面，本發(fā)明包括含有SEQIDNO:11第29位氨基酸殘基至第202位氨基酸殘基所示或SEQIDNO:11第1位氨基酸殘基至第202位氨基酸殘基所示的氨基酸序列的分離多肽。另一方面，本發(fā)明包括具有SEQIDNO:2第22位氨基酸殘基至第205位氨基酸殘基中或SEQIDNO:2第1位氨基酸殘基至第205位氨基酸殘基中的至少14個(gè)連續(xù)氨基酸的分離多肽，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應(yīng)答(antigenicresponse)。另一方面，本發(fā)明包括具有SEQIDNO:7第22位氨基酸殘基至第205位氨基酸殘基中或SEQIDNO:7第1位氨基酸殘基至第205位氨基酸殘基中的至少14個(gè)連續(xù)氨基酸的分離多肽，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應(yīng)答。另一方面，本發(fā)明包括具有SEQIDNO:9第29位氨基酸殘基至第202位氨基酸殘基中或SEQIDNO:9第1位氨基酸殘基至第202位氨基酸殘基中的至少14個(gè)連續(xù)氨基酸的分離多肽，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應(yīng)答。另一方面，本發(fā)明包括具有SEQIDNO:11第29位氨基酸殘基至第202位氨基酸殘基中或SEQIDNO:11第1位氨基酸殘基至第202位氨基酸殘基中所示至少14個(gè)連續(xù)氨基酸的分離多肽，其中所述多肽剌激哺乳動物的抗原性應(yīng)答。本發(fā)明包括在可藥用載體中含有本文所迷多肽的藥物組合物。本發(fā)明還包括含有本文所述多肽的融合蛋白。在其它方面，本發(fā)明包括編碼多肽的分離的多核苷酸，其中該核酸分子選自(a)含有SEQIDNO:3的核苷酸序列的多核苷酸；(b)在嚴(yán)緊洗滌條件后仍與由SEQIDNO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQIDNO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列組成的多核苷酸雜交的多核苷酸。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括編碼多肽的分離多核苷酸，其中該核酸分子選自(a)含有SEQIDNO:36的核苷酸序列的多核苷酸；(b)在嚴(yán)緊洗滌條件后仍與由SEQIDNO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQIDNO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列組成的多核香酸雜交的多核香酸。另一方面，本發(fā)明包括包含SEQIDNO:1第64位核香酸至第618位核普酸所示或SEQIDNO:1第1位核苷酸至第618位核苷酸所示核普酸序列的分離多核苷酸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含SEQIDNO:6第64位核苷酸至第618位核苷酸所示或SEQIDNO:6第1位核苷酸至第618位核普酸所示的核普酸序列的分離多核苷酸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含SEQIDNO:8第67位核苷酸至第606位核苷酸所示或SEQIDNO:1第1位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列的分離多核苷酸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含SEQIDNO:10第67位核苷酸至第606位核苷酸所示或SEQIDNO:10第1位核香酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列的分離多核苷酸。本發(fā)明提供包含本文所述分離的核酸分子和轉(zhuǎn)錄啟動子及轉(zhuǎn)錄終止子的表達(dá)栽體，其中該啟動子與該核酸分子可操作地連接，且該核酸分子與該轉(zhuǎn)錄終止子可操作地連接。本發(fā)明提供包含本文所述表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞和植物細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供制備多肽的方法，包括步驟培養(yǎng)包含本文所述表達(dá)載體并產(chǎn)生該多肽的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供特異性地與本文所述多肽結(jié)合的抗體或抗體片斷。另一方面，本發(fā)明提供擴(kuò)增單核細(xì)胞或單核細(xì)胞祖先細(xì)胞的方法，包括用包含本文所述多肽的組合物培養(yǎng)骨髓或外周血細(xì)胞，其中本文所述多肽的量足以造成骨髓或外周血細(xì)胞中單核細(xì)胞或單核細(xì)胞祖先細(xì)胞數(shù)量相對于在未施用多肽時(shí)培養(yǎng)的骨髓或外周血細(xì)胞而言發(fā)生增加。本發(fā)明還提供刺激暴露于抗原或病原體的哺乳動物的免疫應(yīng)答的方法，包括(l)測定抗原或病原體特異性抗體的水平；(2)施用在可藥用載體中包含有本文所述多肽的組合物；(3)測定施用后抗原或病原體特異性抗體的水平；(4)比較步驟(1)中的抗體水平和步驟(3)中的抗體水平，其中抗體水平增加指示剌激了免疫應(yīng)答。其它方面，本發(fā)明提供在哺乳動物中產(chǎn)生抗病毒應(yīng)答的方法，包括給感染病毒的哺乳動物施用用量足以引起病毒減少的本文所述多肽的組合物。由此對本發(fā)明作了一般性的描述，而參考如下實(shí)施例可以更容易理解本發(fā)明，這些實(shí)施例以舉例說明的方式提供并不旨在限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒含有編碼Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的多核苷酸的表達(dá)質(zhì)粒可以通過同源重組構(gòu)建。使用5，和3，末端側(cè)翼區(qū)相應(yīng)于包圍zcyto20插入位點(diǎn)的載體序列的SEQIDN0:1多核苷酸序列，67通過PCR分離cDNA片斷，如zcyto20cDNA。引物ZC40923和ZC40927分別顯示在SEQIDNO:12和13中。在1%瓊脂糖凝膠上電泳PCR反應(yīng)混合物，并使用QIAquickTM凝膠提取試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)凝膠提取相應(yīng)于插入片斷大小的條帶。質(zhì)粒pZMP21是哺乳動物表達(dá)載體，其包含具有MPSV啟動子、用于插入編碼序列的多個(gè)限制性位點(diǎn)、終止密碼子、大腸桿菌(E.coli)復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)盒；包含SV40啟動子、增強(qiáng)子和復(fù)制起點(diǎn)、DHFR基因及SV40終止子的哺乳動物選擇標(biāo)記表達(dá)單位；和在釀酒酵母(S.cerevisiae)中進(jìn)行選擇和復(fù)制所必需的URA3和CEN-ARS序列。該質(zhì)粒是使用取自pRS316(保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801Universityboulevard,M醒ssas，VA20110-2209，保藏號77145)的酵母遺傳元件、來自脊髓灰質(zhì)炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件、和在跨膜域C末端發(fā)生截短的CD8細(xì)胞外域從pZP9(保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801Universityboulevard,Manassas,VA20110-2209，保藏號98668)構(gòu)建的。用BglII消化質(zhì)粒pZMP21,將其用于和PCR插入片斷重組。將100^1酵母(釀酒酵母)感受態(tài)細(xì)胞分別與10^1以上的各種DNA混合物混合，并轉(zhuǎn)移至0.2cm電穿孔杯中。使用電源(BioRadLaboratories,Hercules,CA)設(shè)定O.75kV(5kV/cm)、00歐姆、25^iF，電沖擊酵母/DNA混合物。每個(gè)杯中加入600^11.2M山梨糖醇，將酵母以兩個(gè)300nl等分試樣接種在兩個(gè)URA-D平板上，并在30"C孵育。約48小時(shí)后，將來自單個(gè)平板的Ura+酵母轉(zhuǎn)化體重懸在lmlH20中，短暫旋轉(zhuǎn)以沉淀酵母細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重懸在lml裂解緩沖液(2%TritonX-100、1%SDS、100mMNaCl、10mMTris，pH8.0、1mMEDTA)中。將500jil裂解混合物加入含有300nl酸洗滌的玻璃珠和200^1酚-氯仿的Eppendorf管中，渦旋1分鐘，2或3次，然后以最大速率在Eppendorf離心機(jī)中離心5分鐘。將300^1水相轉(zhuǎn)移至新管中，用600nl乙醇(Et0H)沉淀DNA,之后4C離心10分鐘。將DNA沉淀重懸在lO^ilH20中。使用0.5-2ml酵母DNA制備物和40pl細(xì)胞轉(zhuǎn)化電感受態(tài)的大腸桿菌宿主細(xì)胞(ElectromaxDH10B細(xì)胞；獲自LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg,MD)。以1.7kV、25^F和400歐姆對細(xì)胞進(jìn)行電脈沖。電穿孔后，將lmlSOC(2%BatoTM胰蛋白胨(Difco，Detroit,MI)、0.5%酵母提取物(Difco)、lOmMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgS04、20mM葡萄糖)加入250^il等分試樣中，然后接種在4個(gè)LBAMP平板(LB'液體培養(yǎng)基(Lennox)、1.8%BactoJ京月旨(Difco)、100mg/L氨芐青霉素)上。通過限制性消化鑒定包含正確的zcyto20表達(dá)結(jié)構(gòu)的各個(gè)克隆，以便驗(yàn)證zcyto20插入片斷的存在和證實(shí)各個(gè)DNA序列均已正確地彼此連接。對陽性克隆的插入片斷進(jìn)行序列分析。使用商業(yè)試劑盒(QIAGENPlasmidMaxi試劑盒，Qiagen，Valencia,CA)根據(jù)廠商說明書更大規(guī)模地分離質(zhì)粒DNA。正確的構(gòu)建體命名為zcyto20_CEE/pZMP21。含有zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的質(zhì)粒使用核菩酸特異性引物以相似方式制備。實(shí)施例2在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)—將CH0DG44細(xì)胞(Chasin等，Som.CellMolec.Genet.12:555-666，1986)接種在10cm組織培養(yǎng)皿中，使之在及5%C02下于Ham氏F12/FBS培養(yǎng)基(Ham氏F12培養(yǎng)基(LifeTechnology)、5W胎牛血清(Hyclone，Logan,UT)、1%L-谷氨酖胺(JRHBioscience,Lenexa，KS)、1%丙酮酸鈉(LifeTechnologies))中過夜生長至大約50%至70%匯合。然后通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，用3:1(w/w)聚陽離子脂2,3-二油基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙亞胺錯(cuò)三氟乙酸鹽和中性脂二油?；字Ｒ掖及吩谀み^濾水中的脂質(zhì)體制劑(LipofectamineReagent,LifeTechnologies),在無血清(SF)培養(yǎng)基制劑(Ham氏F12、10mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、5mg/ml胰島素、-谷氨跣胺和1%丙酮酸鈉)中，用含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的質(zhì)粒，如zcyto20/pZMP6，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用SF培養(yǎng)基將zcyto20/pZMP6稀釋在15ml管中至640pl的總最終體積。使35fi1LipofectamineT"和605^1SF培養(yǎng)基混合。將所獲混合物加入DNA混合物中，使之在室溫孵育約30分鐘。向DNA:Lipofectamine化混合物中加入5mlSF培養(yǎng)基。用5mlSF培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，將之吸出，之后加入DNA:Lipofectamine混合物。37"C孵育細(xì)胞5小時(shí)，然后向每個(gè)平板加入6.4mlHam氏F12/10。/。FBS、1%PSN培養(yǎng)基。平板在37"C孵育過夜，第二天用新鮮的5%FBS/Ham氏F12更換DNA:LipofectamineTM混合物。在轉(zhuǎn)染后第三天，將細(xì)胞分開，放入T-175搖瓶的生長培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)染后第7天，用FITC-抗CD8單克隆抗體(PharmingenBiotec,Auburn,CA)，之后用抗FITC偶連的磁珠(MiltenyiBiotec，Auburn,CA)染色細(xì)胞。使用商品柱(mini-MACS柱;MiltenyiBiotec)根據(jù)廠商指導(dǎo)分離CD8陽性細(xì)胞，將其放入無核苷但有50nM氨甲蝶呤的DMEM/Ham氏F12/5%FBS(選擇培養(yǎng)基)中。以每孔0.5、1和5個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種在96孔平皿的選擇培養(yǎng)基中以便進(jìn)行亞克隆，使細(xì)胞生長大約2周。檢查孔中培養(yǎng)基的蒸發(fā)，在該過程中如果必要可以使每孔恢復(fù)到200nl。當(dāng)平板上大多數(shù)集落接近匯合時(shí)，從每個(gè)孔收集lOOjil培養(yǎng)基用于點(diǎn)印跡分析，并給細(xì)胞添加新鮮選擇培養(yǎng)基。在點(diǎn)印跡裝置中將上清液加載在硝酸纖維素濾膜上，然后真空爐中ioox:處理該濾膜以變性蛋白質(zhì)。濾膜在625mMTris-甘氨酸(pH9.1)、5mMp-巰基乙醇中65i:孵育10分鐘，然后在2.5%脫脂干奶粉的WesternA緩沖液(O.25%明膠、50mMTris-HClpH7.4、150mMNaCl、5mMEDTA、0.05%Ig印alCA-630)中于旋轉(zhuǎn)搖床上4"孵育過夜。室溫下于旋轉(zhuǎn)搖床上在2.5%脫脂干奶粉的WesternA緩沖液中用抗體-服P綴合物孵育濾膜l小時(shí)。然后室溫下在添加有0.01%Tween20的PBS中洗滌濾膜三次，每次15分鐘。用化學(xué)發(fā)光試劑ECL,AmershamCorp.)曝光約5分鐘。用胰蛋白酶處理96孔皿中的陽性克隆，將之轉(zhuǎn)移至6孔m的選擇培養(yǎng)基中以便放大和用于Western印跡分析。實(shí)施例3在幼倉鼠腎細(xì)胞中表達(dá)在BHK細(xì)胞中產(chǎn)生全長zcyto24和zcyto25蛋白質(zhì)。例如，用zcyto24-CEE/pZMP21或zcyto25-CEE/pZMP21(實(shí)施例l)轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞。將BHK570細(xì)胞(ATCCCRL-10314)接種在T75組織培養(yǎng)瓶中，使之在37。C和5%C02下于生長培養(yǎng)基(SL7V4，5%胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)，1%青霉素/鏈霉素)中過夜生長至大約50%至70%匯合。然后通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(使用Lipofectamine;LifeTechnologies)在無血清(SF)培養(yǎng)基中用zcyto24—CEE/pZMP21或zcyto25-CEE/pZMP21轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用SF培養(yǎng)基將質(zhì)粒稀釋在1.5ml管中至640nl的總最終體積。將35^1脂混合物和605piSF培養(yǎng)基混合，室溫孵育所獲混合物大約30分鐘。然后將6mlSF培養(yǎng)基加入DNA/脂混合物中。用5mlSF培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，將之吸出，然后加入DNA/脂混合物。細(xì)胞在37。C孵育5小時(shí)，然后向每個(gè)平板加入15ml生長培養(yǎng)基。37i:孵育平板過夜，第二天用選擇培養(yǎng)基(SL7V4，5%胎牛血清(Hyclone，Logan,UT)、1%青霉素/鏈霉素、ljiMMTX)更換DNA/脂混合物。轉(zhuǎn)染后大約7-10天，胰蛋白酶處理抗氨甲蝶呤的集落，將細(xì)胞重新接種在T-162搖瓶中然后轉(zhuǎn)移至大規(guī)模培養(yǎng)。實(shí)施例4腺病毒載體的構(gòu)建為了構(gòu)建腺病毒載體，使用分別在5，和3'末端添加了Pmel和Ascl限制性位點(diǎn)的引物通過PCR擴(kuò)增Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的蛋白質(zhì)編碼區(qū)。使用全長cDNA模板按如下在PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增95"C5分鐘進(jìn)行一個(gè)循環(huán)；之后95^1分鐘、61t:l分鐘、721C1.5分鐘進(jìn)行15個(gè)循環(huán)；之后72^7分鐘；之后4C保溫。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物加載至TAE緩沖液(O.04MTris乙酸，0.001MEDTA)中的1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上。從凝膠上切下PCR產(chǎn)物，并用包含硅膠膜離心柱的商業(yè)試劑盒(QIAquick⑧PCR純化試劑盒和凝膠提純試劑盒；Qiagen，Inc.)按照試劑盒說明進(jìn)行純化。然后用Pmel和Ascl消化、酚/氯仿抽提、EtOH沉淀PCR產(chǎn)物，之后重新在20mMTE(Tris/EDTApH8.0)中水合。然后將zcyto20片斷連接至轉(zhuǎn)基因載體pTG12-8的Pmel-Ascl位點(diǎn)中，并通過電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Btm感受態(tài)細(xì)胞。載體pTG12-8通過在NruI位點(diǎn)插入大鼠胰烏素II內(nèi)含子(大約200bp)和多接頭(FseI/PmeI/AscI)來源于p2999B4(Palmiter等，Mol.CellBiol.13:5266-5275，1993)。該載體包含被10kbMT-l5，側(cè)翼序列和7kbMT-13'側(cè)翼序列包圍的小鼠金屬硫蛋白(MT-1)啟動子(大約750bp)和人生長激素(hGH)非翻譯區(qū)及聚腺苷酸化信號(大約650bp)。將cDNA插在胰島素II和hGH序列之間。含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25cDNA的克隆通過質(zhì)粒DNA小量制備，之后用Pmel和Ascl消化進(jìn)行鑒定。測序陽性克隆以確保構(gòu)建體中無缺失或其它異常。使用商業(yè)試劑盒(Maxi試劑盒，Qiagen，Inc.)制備DNA,并使用Pmel和Ascl酶從pTG12-8載體中釋放cDNA。在1%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上分離該cDNA并從凝膠上將之切下。切下的膠條在70t:溶化，用等體積Tris緩沖的酚抽提DNA兩次，用Et0H沉淀，然后將之重懸在腳lH20中。將該cDNA克隆至修飾的pAdTrack-CMV(He,T-C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:2509-2514，1998)的EcoRV-Ascl位點(diǎn)中。該構(gòu)建體含有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記基因。將驅(qū)動GFP表達(dá)的CMV啟動子替換成SV40啟動子，并用人生長激素聚腺苷酸化信號替代SV40的聚,腺苷酸化信號。此夕卜，用FseL.EcoRV和Ascl位點(diǎn)替換原來的多接頭。該修飾形式的pAdTrack-CMV被命名為pZyTrack。使用商業(yè)DNA連接和篩選試劑盒(Fast—Link試劑盒；EpicentreTechnologies,Madison,WI)進(jìn)行連接。通過用Fsel和Ascl消化小量制備的DNA，鑒定含有zcyto20的克隆。為了線性化該質(zhì)粒，用Pmel消化約5pg的所獲pZyTrackzcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25質(zhì)粒。大約ljig線性化質(zhì)粒和200ng超螺旋pAdEasy(He等，同上)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183細(xì)胞(He等，同上)。使用Bio-Rad基因脈沖儀在2.5kV、200歐姆和25pFa時(shí)進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。將所有的共轉(zhuǎn)化混合物鋪在4個(gè)含有25pg/ml卡那霉素的LB平板上。挑取最小的菌落并在LB/卡那霉素中擴(kuò)增，通過標(biāo)準(zhǔn)DNA小量制備方法鑒定重組腺病毒DNA。用小量制備的重組腺病毒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B化感受態(tài)細(xì)胞中，并使用Maxi試劑盒(Qiagen，Inc.)根據(jù)試劑盒說明制備DNA。用Pacl酶(NewEnglandBiolabs)37C消化約5pg重組腺病毒DNA3小時(shí)，其中反應(yīng)體積為100nl，含有20-30UPacl。消化的DNA用等體積酚/氯仿抽提兩次，并用乙醇沉淀。將DNA沉淀重懸在lOjil蒸餾水中。用Pacl消化的DNA對前一天接種并生長至60%-70%匯合的T25搖瓶中的QBI-293A細(xì)胞(QuantumBiotechnologies,Inc.,Montreal,Qc.加拿大)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用無菌HBS(150mMNaCl，20mM服PES)將Pacl消化的DNA稀釋至50nl總體積。在單獨(dú)的管中，用HBS將20^1lmg/mlN-[卜(2，3-二油?；趸?丙基]-N，N，N-三甲基銨鹽(D0TAP)(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)稀釋至lOO^il總體積。在D0TAP中加入DNA，通過上下抽吸溫和地混勻，然后置室溫下15分鐘。從293A細(xì)胞中除去培養(yǎng)基，并用5ml含有ImM丙酮酸鈉、0.ImMMEM非必需氨基酸和25mMHEPES緩沖液(從LifeTechnologies,Gaithersburg，MD獲得的試劑)的無血清極限必需培養(yǎng)基(MEM)a洗滌。在293A細(xì)胞中加入5ml無血清MEM,并置于37t:。向T25搖瓶中的293A細(xì)胞滴加DNA/脂混合物，溫和混合，并37"C孵育4小時(shí)。4小時(shí)后，吸出含有DNA/脂混合物的培養(yǎng)基，并更換為含有5/。胎牛血清的5ml完全MEM。監(jiān)測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的GFP表達(dá)和轉(zhuǎn)化灶(病毒斑)的形成。用重組腺病毒DNA轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后7天，細(xì)胞表達(dá)GFP蛋白并開73始形成病灶(病毒貨")。使用細(xì)胞刮棒收集粗病毒裂解物以便收集所有的293A細(xì)胞。將裂解物轉(zhuǎn)移至50ml錐形管中。為了將大多數(shù)病毒顆粒從細(xì)胞中釋放出來，在干水/乙醇浴和37t:水浴中進(jìn)行3個(gè)凍/融循環(huán)。擴(kuò)增(初次(1。)擴(kuò)增)粗裂解物以獲得zcyto20rAdV裂解物的工作"原液"。預(yù)先培養(yǎng)20小時(shí)以得到其中293A細(xì)胞接近匯合(80%-90%)的10個(gè)10cm平板，向每個(gè)10cm平板加入200ml粗rAdV裂解物，然后在白光顯微鏡下監(jiān)測細(xì)胞的CPE(致細(xì)胞病變效應(yīng))48至72小時(shí)，并在熒光顯微鏡下監(jiān)測GFP的表達(dá)。當(dāng)所有的293A細(xì)胞表現(xiàn)出CPE時(shí)，收集此原液裂解物并按上述進(jìn)行凍融循環(huán)。然后二次(2。)擴(kuò)增zcyto20rAdV。預(yù)備20個(gè)15cm組織培養(yǎng)皿的293A細(xì)胞以便細(xì)胞達(dá)到80-90%匯合。僅留下20ml5%MEM培養(yǎng)基，并用300-500ml初次擴(kuò)增的rAdV裂解物接種每個(gè)平板。48小時(shí)后，由于病毒生產(chǎn)，293A細(xì)胞裂解，將裂解物收集在250ml聚丙烯離心瓶中，純化rAdV。向粗裂解物的瓶中加入NP-40去污劑，達(dá)到O.5%的終濃度，以便裂解所有細(xì)胞。將瓶子放置在旋轉(zhuǎn)平臺上IO分鐘，在不翻轉(zhuǎn)瓶子的情況下盡可能快地進(jìn)行搖動。20，000xG離心15分鐘以沉淀碎片。將上清液轉(zhuǎn)移至250ml聚碳酸酯離心瓶中，然后加入0.5體積的20%PEG8000/2.5MNaCl溶液。在冰上振搖瓶子過夜。20,OOOxG離心瓶子15分鐘，然后將上清液丟棄至漂白溶液中。使用無菌細(xì)胞刮棒，將2個(gè)瓶子的白色病毒/PEG沉淀重懸在2.5mlPBS中。將所獲病毒溶液置于2ml微量離心管中，在微量離心機(jī)中14，OOOxG離心10分鐘以除去所有的其它細(xì)胞碎片。將來自2ml微量離心管的上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)15ml聚丙烯具有保護(hù)帽蓋的管中并用CsCl調(diào)節(jié)至1.34g/ml密度。將該溶液轉(zhuǎn)移至3.2ml聚碳酸酯薄壁離心管，在25t:以348，OOOxG離心3-4小時(shí)。病毒形成白色條帶。使用寬孔吸頭收集病毒帶。使用商業(yè)離子交換柱(例如預(yù)先填充了SephadexG-25M的PD-10柱；PharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)對病毒制品進(jìn)行脫鹽處理。該柱用20mlPBS平衡。加載病毒然后使之過柱。將5mlPBS加入柱中，然后按8-10滴收集餾分。在分光光度計(jì)上測定每個(gè)餾分的1:50稀釋物在260nm的光密度。匯集峰值餾分，測定1:25稀釋物的光密度(OD)。使用公式(260nm的OD)(25)(1.lx1012)二毒粒/ml,將OD轉(zhuǎn)化成病毒濃度。為了儲存病毒，向純化的病毒中加入甘油達(dá)到15%終濃度，溫和但有效地混合，并等分后儲存在-80pC。按照QuantumBiotechnologies,Inc.(Montreal,加拿大)發(fā)展的實(shí)驗(yàn)方案測量重組病毒感染性。簡而言之，對于每個(gè)待測重組病毒，按每孔lxl04個(gè)293A細(xì)胞將細(xì)胞接種在兩個(gè)96孔組織培養(yǎng)板的MEM(含有2。/。胎牛血清)中。24小時(shí)后在含有2%胎牛血清的MEM中制得每個(gè)病毒的10倍稀釋物(從lxl(T至1x1014)。在20個(gè)孔的每個(gè)孔中各加入一種稀釋物(100nl)。37"C孵育5天后，觀察孔的CPE是陽性或陰性，并計(jì)算噬斑形成單位/ml"(PFU)的值。實(shí)施例5zcyto20、zcyto22、zcyto24和zcyto25的克隆A:zcyto20和zcyto22在預(yù)測的編碼序列中設(shè)計(jì)zcyto20和zcyto22共有的PCR引物。它們被命名為ZC39339(SEQIDNO:47)和ZC39393(SEQIDNO:48)。在一組來自不同組織的人cDNA文庫上進(jìn)行PCR。在腦、胰島(胰腺)、前列腺、胎盤、睪丸、HPVS(前列腺上皮)和CD3+文庫中觀察到產(chǎn)物。然后根據(jù)zcyto20的起始甲硫氨酸5，基因組序列和終止密碼子3，基因組序列(與zcyto22高度相似)設(shè)計(jì)PCR引物。將它們命名為ZC39340(SEQIDNO:49)和ZC39341(SEQIDNO:50)。在以上文庫上進(jìn)行PCR。4個(gè)文庫含有全長克隆。對來自這些克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果3個(gè)文庫含有zcyto22(前列腺、睪丸和CD3+),—個(gè)文庫含有zcyto20(HPVS(前列腺上皮))。還使用特異針對zcyto22的預(yù)測編碼序列的引物進(jìn)行PCR。這些引物稱為ZC39295(SEQIDN0:51)和ZC39298(SEQIDNO:52)。該P(yáng)CR的陽性文庫是腦、前列腺、CD3+和睪丸。測序證實(shí)了Bzcyto20序列。B:zcyto24和zcyto25在預(yù)測的編碼序列中設(shè)計(jì)zcyto24和zcyto25共有的PCR引物。這些命名為ZC39687(SEQIDNO:53)和ZC39741(SEQIDNO:54)。在一組來自不同組織的小鼠cDNA文庫上進(jìn)行PCR。在如下文庫中觀察到產(chǎn)物心臟、肺、胎盤、Torres前列腺、皮膚、小腸、睪丸和胸腺。然后設(shè)計(jì)起始甲硫氨酸5'和終止密碼子位置的PCR引物。5'引物命名為ZC39732(SEQIDN0:55),其與zcyto24和zcyto25序列均匹配。Zcyto243，引物命名為ZC39701(SEQIDNO:56)。Zcyto253，引物命名為ZC39688(SEQIDN0:57)。在上述陽性文庫上進(jìn)行PCR。對于zcyto24,除了心臟和Torres前列腺外所有的文庫均是陽性。測序證實(shí)了來自胎盤、睪丸和小腸文庫的zcyto24序列。對于zcyto25,除了心臟和Torres前列腺外所有的文庫均是陽性。測序證實(shí)了來自肺文庫的zcyto25序列。實(shí)施例6在桿狀病毒中表達(dá)A:用于表達(dá)zcyto20的構(gòu)建體制備表達(dá)載體pzBV37L:zCyto20以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)zcyto20多肽。使用引物ZC41932(SEQIDNO:14)及ZC41933(SEQIDNO:15)和ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(BoerhingerMannheim)按照廠商說明書從質(zhì)粒zcyto20PCR擴(kuò)增含有zcyto20的序列并在5，和3'末端分別編碼BspEl和Xbal限制性位點(diǎn)的536bp片斷。PCR條件如下94°C4分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；94"C30秒、50"C30秒和72"C1分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；74X:4分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；之后4"C保溫。通過凝膠電泳(1%NuSieve瓊脂糖)觀察小量PCR產(chǎn)物，證實(shí)片斷長度大約550bp。剩余反應(yīng)混合物通過QiagenPCR純化試劑盒按照廠商說明純化，并將之稀釋在30fil水中。在36^1體積中使用Bspel和Xbal(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)在適當(dāng)?shù)木彌_液條件下37"C消化該cDNA。通過1%瓊脂糖TAE凝膠電泳分離消化的PCR產(chǎn)物帶，將之切下并用QIAquickTM凝膠提取試劑盒(Qiagen，Cat.No.28704)提取，然后稀釋在30^ilEB緩沖液中。將消化的zcyto20PCR產(chǎn)物連接在載體pZBV37L多克隆位點(diǎn)的Bspel和Xbal位點(diǎn)處。pZBV37L載體是〗務(wù)飾的pFastBacl(LifeTechnologies)表達(dá)載體，其中已經(jīng)除去多角體啟動子并在MCS上游替換為晚期活化堿性蛋白啟動子和EGT前導(dǎo)信號序列。將5^1限制性酶消化的zcyto20PCR片斷和4^1相應(yīng)的pZBV37L載體在20pl體積中適當(dāng)?shù)木彌_液條件下15€連接72小時(shí)。通過在400歐姆、2.00kV和25pF下2mm間隔電穿孑L杯(BTX，ModelNo.620)中進(jìn)行電穿孔，用5^1連接混合物轉(zhuǎn)化33^1ElectoMAXDH12sTM細(xì)胞(LifeTechnologies,Cat.No.18312-017)。將轉(zhuǎn)4匕的細(xì)J包稀釋在500nlLB培養(yǎng)基，在37。C生長1小時(shí)，將lOpl和20jil稀釋物鋪在含有100ng/ml氨芐青霉素的LB平板上。PCR分析克隆，并選擇陽性克隆，接種并進(jìn)行測序。然后驗(yàn)證序列。B.帶標(biāo)簽的zcyto20的構(gòu)建和表達(dá)制備表達(dá)載體pZBV32L:zCyto20cee以在昆蟲細(xì)胞表達(dá)zcyto20cee多肽。設(shè)計(jì)pZBV32L:zCyto20cee以表達(dá)帶有C端GLU-GLU標(biāo)簽(SEQIDN0:16)的zcyto20多肽?？梢允褂迷摌?gòu)建體以確定切除信號肽后zcyto20的N端氨基酸序列。1.pZBV32L:zCyto20cee的構(gòu)建使用引物zc40240和zc40241(分別為SEQIDNOS:17和18)從含有zcyto20cDNA的質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)生5，和3'末端分別含有BainHI和Xbal限制性位點(diǎn)的625bpzcyto20片斷。PCR條件如下在含有5%DMSO的lOOfil體積反應(yīng)物中利用ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(BoehringerMannheim),94"C4分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；94"C30秒、50€30秒和72"C60秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；4分鐘進(jìn)行1循環(huán)；之后4"C保溫。凝膠電泳(196NuSieve瓊脂糖)觀察5plPCR片斷。剩余的反應(yīng)混合物通過QiagenPCR純化試劑盒按照廠商說明書純化，并稀釋在7730nl水中。使用BamHI和Xbal(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)在適當(dāng)緩沖液條件下35^il體積中37"C消化該cDNA2小時(shí)。通過1%瓊脂糖TAE凝膠電泳分離消化的PCR產(chǎn)物帶，將之切下并使用QIAquickTM凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取，然后稀釋在30nl水中。將純化的消化zCyto20ceePCR產(chǎn)物連接在預(yù)先制備并限制性酶消化(BamHI和Xbal)的栽體pZBV32L的多克隆位點(diǎn)中。載體pZBV32L是修飾的pFastBacl(LifeTechnologies)表達(dá)載體，其中已經(jīng)除去多角體啟動子并替換為晚期活化堿性蛋白啟動子，并將Glu-Glu標(biāo)簽(SEQIDNO:IO)及終止信號的編碼序列插在多克隆區(qū)域的3'末端。在20pl體積中16。C過夜連接5ji1限制性消化的zCyto20插入片斷和40ng相應(yīng)的pZBV32L載體。以400歐姆、2.OOkV和25pF在2mm間隔電穿孔杯中通過電穿孔，用5ji1連接混合物轉(zhuǎn)化50filElectoMAXDH12sTM細(xì)胞(LifeTechnologies).將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞稀釋在500^1SOC培養(yǎng)基(296Bacto胰蛋白胨、0.5%Bacto酵母提取物、10ml1MNaCl、1.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgS04和20mM葡萄糖)中，將50^1稀釋物鋪在含有100ng/ml氨千青霉素的LB平板上。通過PCR和限制性消化分析克隆。選擇陽性克隆并接種用于測序。一旦證實(shí)了正確的序列，通過在42。C加熱塊中熱休克45秒用25ng陽性克隆DNA轉(zhuǎn)化66^1DHlOBacMAXEfficiency⑧感受態(tài)細(xì)胞(GIBCO-BRL)。將轉(zhuǎn)化的DB10BacTM細(xì)胞稀釋在600nlSOC培養(yǎng)基(296Bacto胰蛋白胨、0.5%Bacto酵母提取物、10ml1MNaCl、1.5mMKC1、lOmMMgCl2、10mMMgS04和20mM葡萄糖)中并37。C生長1小時(shí)，然后將100^1鋪在含有50pg/ml卡那霉素、7pg/ml慶大霉素、l(Wml四環(huán)素、40fig/mlIPTG和200pg/inlBluoGal的Luria瓊脂平板上。37X:孵育平板48小時(shí)。使用顏色選擇以鑒定具有轉(zhuǎn)座的病毒DNA(稱作軒粒")的那些細(xì)胞。挑取白色菌落進(jìn)行分析。PCR分析菌落并選擇陽性菌落(含有期望的桿粒)進(jìn)行培養(yǎng)，隨后純化桿粒DNA。使用針對桿粒中轉(zhuǎn)座元件的引物ZC447(SEQIDN0:19)和ZC976(SEQIDNO:20),通過PCR擴(kuò)增DNA篩選具有正確分子量插入片斷的克隆。PCR反應(yīng)條件如下94X:4分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；94"C30秒、30秒和72"2.5分鐘進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72X34分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；之后4X:保溫。在1。/。瓊脂糖凝膠上電泳PCR產(chǎn)物以驗(yàn)證插入片斷的大小。具有正確大小的插入片斷的那些用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(SpodopteraFrugiperda)(Sf9)細(xì)胞。2.轉(zhuǎn)染以每孔1xi()6個(gè)細(xì)胞將Sf9細(xì)胞接種在6孔板中，并使之在27"C貼壁1小時(shí)。用Sf-900IISFM(LifeTechnologies)將大約5pg桿粒腿稀釋至100nl。用Sf-900IISFM將20plLipofectamine"試劑(LifeTechnologies)稀釋至lOOjil。溫和地混合桿粒DNA和脂溶液，然后室溫孵育45分鐘。將800^1Sf-900IISFM加入脂-DNA混合物中。吸出孔中培養(yǎng)基并在細(xì)胞中加入lmlDNA-脂混合物。27。C孵育細(xì)胞過夜。吸出每個(gè)孔中的DNA-脂混合物，并替換為2mlSf-900II培養(yǎng)基。271C、90%濕度下孵育平板大約7天，之后收獲病毒。3.擴(kuò)增按每孔1xi(f個(gè)細(xì)胞將Sf9細(xì)胞接種在6孔板上。將來自轉(zhuǎn)染平板的500nl病毒加入孔中，然后27X:、90%濕度下孵育平板96小時(shí)，之后收獲病毒(初次擴(kuò)增)。將100nl來自上述初次擴(kuò)增平板的病毒轉(zhuǎn)移至含有^106個(gè)細(xì)胞/孔的孔中，從而進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。收獲前孵育平板96小時(shí)。進(jìn)行再一輪擴(kuò)增(第三次擴(kuò)增)。在250ml搖瓶的50mlSf-900IISFM中使Sf9細(xì)胞生長至大約lxl06個(gè)細(xì)胞/ml的密度。然后用來自上述平板的lml病毒原液感染之，然后27"C孵育6天，此后收獲病毒。通過生長抑制曲線滴定病毒原液，允許指示1的感染復(fù)數(shù)(MOI)的滴定培養(yǎng)進(jìn)行總共48小時(shí)。使用特異針對Glu-Glu標(biāo)簽的單克隆一抗，隨后使用HRP-偶聯(lián)的山羊抗鼠二抗，通過還原Western分析上清液。結(jié)果顯示大約20kDa的一條帶。上清液還被用于活性分析。然后通過如下方法制備大量病毒原液在2800ml搖瓶的1LSf-900IISFM中將Sf9細(xì)胞培養(yǎng)至大約lxl(f個(gè)細(xì)胞/ml的密度。然后用來自上述搖瓶的5ffil病毒原液感染之，27X:孵育4天，此后收獲病毒。完成更大規(guī)模的感染以為下游純化提供材料。類似地，在桿狀病毒中表達(dá)了zcyto21和zcyto22。實(shí)施例7蛋白質(zhì)純化對于本文所述的任何一種蛋白質(zhì)而言，均可以制備重組蛋白質(zhì)。A.zcyto20的純化從重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞、穩(wěn)定或瞬時(shí)的B服細(xì)胞系制備羧基端帶有Glu-Glu標(biāo)簽的重組zcyto20。收獲培養(yǎng)物，并使用0.2nm濾器無菌過濾培養(yǎng)基。通過聯(lián)合使用抗Glu-Glu(抗-EE)肽抗體親和層析和Superdex75凝膠排阻層析，從條件培養(yǎng)液純化蛋白質(zhì)。將來自BV的培養(yǎng)基(pH6.0，導(dǎo)電率7mS)調(diào)節(jié)至pH6.7。然后向BV和BHK培養(yǎng)基中均加入NaCl至300mM，之后以2-5ml/分鐘的流速將其加載在10><70mm(5-ml柱體積)Poros蛋白A抗-EE抗體親和柱上。然后用5倍柱體積(CV)的5xPBS(pH7.2)洗滌柱子。用0.5M乙酸、0.5MNaCl(pH3，0)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。按2ml收集餾分，加入2MTris以中和洗脫物。從抗-EE抗體親和柱得到的樣品通過SDS-PAGE用銀染和western印跡分析zcyto20蛋白質(zhì)的存在。將含有zcyto20蛋白質(zhì)的餾分匯合，并使用Biotnax-5濃縮器(Millipore)濃縮至大約2ml，然后加載至16x600mmS卯erdexx75凝股過濾柱(AmershamPharmaciaBiotech)上。將含有純化的zcyto20蛋白質(zhì)的餾分匯合，通過O.2jim濾器過濾，等分成100^1小份，然后冰凍在-80"C。通過BCA試驗(yàn)(Pierce，Rockford，IL)和HPLC-氨基酸分析測定最終純化的蛋白質(zhì)的濃度。B.SDS-PAGE和Western印跡分析zcyto20蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE(N叩age4-12%Bis-Tris，Invitrogen，Calsbad,CA)以銀染方法(FastSilver,G簡Technology,Inc.,St.Louis，M0)及用抗EE抗體進(jìn)行的Western印跡分析重組zcyto20蛋白質(zhì)。使用XcellIIMINI-CELL(Invitrogen，Calsbad,CA)電泳條件培養(yǎng)液或純化的蛋白質(zhì)，室溫下在攪拌同時(shí)使用Xcell11化印跡組件(Invitrogen)按照儀器手冊提供的指導(dǎo)將之轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(O.2一m;Bio-RadLaboratories,Hercules，CA)上。轉(zhuǎn)移在含有25mMTris堿、200mM甘氨酸和20%甲醇的緩沖液中500mA進(jìn)行45分鐘。然后用10%脫脂干奶粉的PBS溶液室溫封閉濾膜10分鐘?？焖傧礈煸撓跛崂w維素膜，然后加入在含有2.5%脫脂干奶粉的PBS中的一抗。溫和搖動下，該印跡在室溫孵育2小時(shí)或4t:孵育過夜。孵育后，PBS中洗滌印跡三次，每次10分鐘。加入1:2000稀釋在含有2.5%脫脂干奶粉的PBS中的二抗(偶聯(lián)辣根過氧化物酶的兔抗小鼠IgG;獲自PierceChemicalCo.,Rockford，IL),然后，溫和搖動下，室溫孵育印跡兩小時(shí)。之后在PBS中洗條印跡三次，每次10分鐘，然后在&0中快速洗滌。使用商業(yè)化學(xué)發(fā)光底物試劑(S叩erSigna1⑧ULTRA試劑1和2的1:1混合物；試劑獲自PierceChemicalCo.)顯色印跡，使用Lumi-Imager，sLumiAnalyst3.0軟件(BoehringerMannheimGmbH,德國)經(jīng)10秒至5分鐘或按需要的時(shí)間捕獲信號。C.對蛋白質(zhì)純化和分析的總結(jié)來自BV培養(yǎng)基的純化的zcyto20-CEE蛋白質(zhì)在4-12%Bis-Tris凝膠上遷移為一21kDa的單體，然而還觀察到微弱的36kDa二體帶。二體蛋白質(zhì)在使用還原劑還原時(shí)變成單體，提示zcyto20-CEE通過二疏鍵二聚體化，而且這與半胱氨酸殘基的奇數(shù)數(shù)目(總共7個(gè))是一致的，從而導(dǎo)致鏈間二硫鍵。以相似方式純化了zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽。實(shí)施例8zcyto20的干擾素樣轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)對已表征的IFN-a、IFN-p、IFN，啟動子及許多其它細(xì)胞因子的,總動子與zcyto20、zcyto21牙口zcyto24的上游區(qū)域進(jìn)4亍局部序歹'M:對，以鑒定這些基因是否是共調(diào)節(jié)的。假說是基因調(diào)節(jié)的共同性質(zhì)應(yīng)反映在基因上游區(qū)域的序列相似性上。由于TF的低結(jié)合特異性，各結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測具有高比例的假陽性。因此，為了筌定在體內(nèi)具有功能作用的結(jié)合位點(diǎn)，孤立的位點(diǎn)預(yù)測是沒有用的。然而，可能具有序列特異性功能的預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)可以通過基于保守性的過濾進(jìn)行選擇物種之間調(diào)節(jié)區(qū)通常比其它非編碼區(qū)要保守許多，可以對這一生物學(xué)觀察結(jié)果進(jìn)行量化以揭示稱作系統(tǒng)發(fā)生足跡(phylogeneticfootprints)的保守模式(Fickett等，Curr.Opin.Biotechnol.11:19-24，2000)。尤其是，人-嚙齒類動物的比較證實(shí)對于鑒定功能性調(diào)節(jié)元件是一個(gè)有價(jià)值的資源(Wasserman等，Nat.Genet.26:225-228，2000)。比對主要在不同的IFN-a基因的啟動子之間揭示出顯著的匹配，而基于該分析幾乎沒有zcyto20-22和其它細(xì)胞因子的啟動子之間具有相似性的證據(jù)。用DBA(Jareborg等，Ge讓eRes.9:815-824，1999)進(jìn)行成對序列比對。用標(biāo)準(zhǔn)位置權(quán)重矩陣(Fickett，Mol.CellBiol.16;437-441，1996)(來自TRANSFAC數(shù)據(jù)庫(3.0版，Wingender等，NucleicAcidsRes.28:316-319，2000))對各轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行檢索，并用S歸匪(3.ltl2版，Pearson,Genomics11:635-固，1991)計(jì)算區(qū)域1-4的比對情況?；诠_的關(guān)于其它TF組的研究，可以預(yù)期小鼠和人之間充分保守的大多數(shù)天然結(jié)合位點(diǎn)可以在所用的評分范圍內(nèi)檢測到(Fickett，Mol.CellBiol.16;437-441，1996;Wasserman等，J.Mol.Biol.278:167-181，1998)。計(jì)算的結(jié)果提示，通過序列相似性反映出的zcyto20家族和其它細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)上所共有的特征將預(yù)期出現(xiàn)在單個(gè)的結(jié)合位點(diǎn)水平上，而非大范圍的匹配?；谝唤M(32個(gè))TF的結(jié)合位點(diǎn)的檢索，鑒定公知參與干擾素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的有限數(shù)量的因子的推測位點(diǎn)。比較的結(jié)果證實(shí)在IFN-卩[NF-kB5ISRE(結(jié)合IRF的元件)]和IFN-y(AP-1，CREB，GATA，NF-kB，NF-AT)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中有重要作用的TF的推測結(jié)合位點(diǎn)也存在于保守的非編碼區(qū)中。例如，區(qū)域l中一對相鄰的AP-1/NF-AT位點(diǎn)是出現(xiàn)在許多細(xì)胞因子啟動子中的一個(gè)得到很好闡明的協(xié)同結(jié)合的例子(Holloway等，Mol.Immunol.38;567-580，2000)。TF的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)被確定對于細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)是關(guān)鍵的，提示zcyto20啟動子區(qū)域中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)簇是候選的功能區(qū)域。區(qū)域2與該組已知細(xì)胞因子的比對的結(jié)果是在AK155啟動子中，在相對于AK155的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Knapper等給出，J.Virol.74:3881-3887，2000)的-415位有匹配。Zcyto20啟動子在該位置上有推測的NF-kb結(jié)合位點(diǎn)的這一事實(shí)說明AK155啟動子中可能存在NF-kB位點(diǎn)。實(shí)施例9轉(zhuǎn)基因動物使用成年能育雄性(種鼠)(B6C3fl，2-8月齡(TaconicFarms,Germantown，NY))、切除輸精管的雄性(去勢鼠)(CD1，2-8月齡(TaconicFarms))、性成熟前的能育雌性(供體)(B6C3fl，4-5周齡(TaconicFarms))和成年能育雌性(受體)(CD1，2-4月齡(TaconicFarms))，制備表達(dá)zcyto21基因的轉(zhuǎn)基因動物。使供體適應(yīng)環(huán)境1周，然后每只小鼠腹膜內(nèi)(I.P.)注射大約8IU妊娠母馬的血清促性腺激素(Sigma，St.Louis，M0),46-47小時(shí)后每只小鼠腹膜內(nèi)(I.P.)注射大約8IU人絨毛膜促性腺激素(hCG(Sigma))以誘導(dǎo)超排卵。使供體和種鼠交配，隨后注射激素。排卵一般發(fā)生在注射hCG后13小時(shí)內(nèi)。通過交配后早上陰道栓的存在證實(shí)交配發(fā)生。在手術(shù)顯微鏡(LeicaMZ12StereoMicrospcope，Leica，Wetzlar，DE)下收集受精卵。收集輸卵管并將卵釋放至含有透明質(zhì)酸鰷(Sig邁a)的尿分析(urinanalysis)玻片上。卵在透明質(zhì)酸酶中洗滌一次，在Whitten氏W640培養(yǎng)基(表7)(已經(jīng)在5%0)2、5%02和9(T/。N2中37"C孵育過)洗滌兩次。然后在顯微注射前將卵儲存在37IV5。/。C02孵箱中。將10-20pg含有zcyto21基因的cDNA的質(zhì)粒DNA線性化，凝膠純化并重懸在10mMTrispH7.4、0.25mMEDTApH8.0中，終濃度83為每微升5-10ng用于顯微注射。將質(zhì)粒DNA顯微注射至包含于一滴W640培養(yǎng)基中的收獲的卵中，之上覆蓋COz平衡的溫暖石蠟油。將DNA吸入注射針(從O.75mmID,lmmOD硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管牽拉)，然后注射入各卵中。對于所有的卯，注射針均穿刺入一個(gè)或兩個(gè)單倍體原核中。將皮升DNA注射至原核中，撤出注射針并且不接觸核仁。重復(fù)該過程直到所有卵都已完成注射。將成功顯微注射的卵轉(zhuǎn)移至含有預(yù)先放氣(pregassed)的W640培養(yǎng)基的器官組織培養(yǎng)皿中，在37匸/5%C02孵箱中保存過夜。第二天，將來自前一天注射的12-17個(gè)健康2細(xì)胞胚胎植入受體。定位壺腹，固定住壺腹和粘液嚢(bursa)之間的輸卵管，用28G針頭在靠近粘液嚢的位置在輸卵管上造成一個(gè)切口，同時(shí)確保不戳破壺腹或粘液嚢。通過此切口植入胚胎，然后通過固定在腹膜壁上，引導(dǎo)生殖器官回到腹腔內(nèi)。將受體成對放回籠中，允許其妊娠19-21天。注射了zcyto21cDNA的動物在出生前死亡。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>所有試劑均可獲自Sigma。實(shí)施例10抗體制備A:zcytorl9多克隆抗體用純化的重組蛋白質(zhì)huzcytorl9/MBP-6H免疫2只雌性新西蘭白兔，以制備多克隆抗體。每只兔最初腹膜內(nèi)(ip)注射200pg完全弗氏佐劑中的純化蛋白質(zhì)，隨后每3周腹膜內(nèi)加強(qiáng)注射lOOpg不完全弗氏佐劑中的肽。第二次加強(qiáng)注射后7-10天(總共注射3次)，采取動物血液并收集血清。然后每3周加強(qiáng)動物并采血一次。使用CNBr-SEP證0SE4B蛋白柱(Pha鹿ciaLKB，Pe鄰ack，N.J.)使huzcytor19/MBP-6H特異性兔血清預(yù)先與抗MBP抗體吸附，所述蛋白柱是按每克CNBr-SEPHAROSE使用10mg純化的重組MBP制備的。使用CNBr-SEPHAR0SE4B蛋白柱(使用10mg純化的重組蛋白質(zhì)特異性抗原h(huán)uzcytorl9/MBP-6H，隨后在PBS中20x透析過夜制備的)從兔血清中親和純化huzcytorl9-特異性多克隆抗體。使用500ng/ml純化的重組蛋白質(zhì)huzcytorl9/MBP-6H或huzcytor19-Fc4作為抗體把標(biāo)在ELISA中表征huzcytor19特異性抗體。測定兔抗huzcytorl9/MBP-6H親和純化的抗體對其特異性純化的重組抗原h(huán)uzcytorl9/MBP-6H及對純化的重組huzcytor19-Fc4的檢測下限(LLD)。B:Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多克隆抗體用純化的重組蛋白質(zhì)zcyto20/MBP-6H、zcyto21/MBP-6H和zcyto22/MBP-6H以及小鼠zcyto24/MBP-6H或zcyto25/MBP-6H，通過免疫雌性新西蘭白兔制備多克隆抗體。每只兔最初腹膜內(nèi)(ip)注射200jig完全弗氏佐劑中的純化蛋白質(zhì)，隨后每3周腹膜內(nèi)加強(qiáng)注射100pg不完全弗氏佐劑中的肽。第二次加強(qiáng)注射后7-10天(總共注射3次)，采取動物血液并收集血清。然后每3周加強(qiáng)動物并采血一次?？梢允褂肅NBr-SEPHAR0SE4B蛋白柱(PharmaciaLKB,Peapack，N.J.)使zcyto20/MBP-6H、zcyto21/MBP-6H、zcyto22/MBP-6H、zcyto24/MBP-6H或zcyto25/MBP-6H特異性兔血清預(yù)先與抗MBP抗體吸附，所述蛋白柱是按每克CNBr-SEPHAROSE使用10mg純化的重組MBP制備的。使用CNBr-SEPHAROSE4B蛋白柱(使用10mg純化的重組蛋白質(zhì)特異性抗原，隨后在PBS中20x透析過夜制備的)從兔血清中親和純化Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的特異性多克隆抗體。使用500ng/ml純化的重組蛋白質(zhì)作為抗體靶標(biāo)在ELISA中表征抗體。測定純化的抗體對其純化的特異性重組抗原的檢測下限(LLD)。使用類似的方法通過用CEE標(biāo)簽的zcyto21蛋白質(zhì)免疫兔制備zcyto21的多克隆抗體，并純化該抗體。實(shí)施例11聚肌苷酸-聚胞苷酸誘導(dǎo)的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因表達(dá)A:各種細(xì)胞類型在存在聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C;100fig/ml)(SIGMA;St.Louis胞、正常人皮膚成纖維細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人平滑肌細(xì)胞-,C固ETICS公司；Walkersville，MD)和人絨毛膜癌細(xì)胞系(Jar，BeWo，和3A-SubE細(xì)胞；ATCC，Manassas,VA)的培養(yǎng)物。在一些情況下，還檢測了10ng/mlhTNFa或10ng/mlhILlb。孵育4小時(shí)后，分離細(xì)胞的總RNA，用無RNase的DNase處理。使用AdvantageRT-for-PCR試劑盒按廠商建議(Clontech，PaloAlto，CA)，使用lpg總RNA合成第一鏈cDNA。使用如下引物對zcyto20，ZC40134(SEQIDNO:30)和ZC40214(SEQIDNO:31);zcyto21，ZC40209(SEQIDNO:32)和ZC40213(SEQIDNO:33);zcyto22,ZC39295(SEQIDNO:34)和ZC39298(SEQIDNO:35),按廠商建議(Clontech)使用5%cDNA反應(yīng)物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。針對G3PDH的引物用作對照。在所有測試細(xì)胞類型中均檢測到低水平的zcyto20mRNA。在用聚I:C刺激的,E、麗EC、JAR、3-ASubE和BeWo細(xì)胞中觀察到zcyto20mRNA水平增加。在所有測試細(xì)胞類型中均檢測到低水平的zcyto22mRNA。在用聚I:C刺激的NHBE、JAR、3-ASubE和BeWo細(xì)胞中觀察到zcyto22mRNA水平增加。這些結(jié)果說明，已知千擾素誘導(dǎo)劑聚I:C可以刺激zcyto20和zcyto22固A合成。在所有測試細(xì)胞類型中均檢測到低水平的zcyto21mRNA。在用聚I:C刺激的NHBE、HUVEC、NHDF、SMC、HMVEC、JAR、3—ASubE和BeWo細(xì)胞中觀察到zcyto21mRNA水平增加。在ILlb處理的3-ASubE胎盤細(xì)胞中也觀察到zcyto21mRNA水平增加。這些結(jié)果說明，已知干擾素誘導(dǎo)劑聚I:C可以刺激zcyto21mRNA合成，并且在某些細(xì)胞類型中細(xì)胞因子ILlb也可以刺激其合成。B:外周血單個(gè)核細(xì)胞使用FicollHypaque從人血液中分離全外周血單個(gè)核細(xì)胞。從外周血單個(gè)核細(xì)胞利用VarioMacs陽性篩選柱按照廠商說明書(MiltenyiBiotecInc.，Auburn,CA)純化T細(xì)胞。對來自各群體的樣品進(jìn)行染色，并通過熒光抗體細(xì)胞分揀(FACS)(BectinDickinson,Sanjose，CA)分析法分析以確定富集百分?jǐn)?shù)。CD3+丁細(xì)胞為大約95%純度。在聚I:C(100pg/ml)或在單純的培養(yǎng)基中培養(yǎng)全外周血白細(xì)胞或CD3+T細(xì)胞。孵育4小時(shí)后，分離細(xì)胞的總RNA，用無RNase的DNase處理。使用Superscript—步RT-PCR和Plati誦Taq試劑盒(Invitrogen，F(xiàn)rederick,MD)以100ng總RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR以合成cDNA。所用引物對如下zcyto20:ZC40134(SEQIDNO:30)和ZC40214(SEQIDNO:31);zcyto21:ZC40209(SEQIDNO:32)和ZC40213(SEQIDNO:33);zcyto22:ZC39295(SEQIDNO:34)和ZC39298(SEQIDNO:35)。對每一種RNA的等分試樣，還以特異于I類MHC的引物對(Clontech)作為對照進(jìn)行了檢測。在聚I:C剌激的全外周血單個(gè)核細(xì)胞中檢測到zcyto20mRNA。此結(jié)果表明已知的干擾素刺激劑聚I:C可以刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞合成zcyto20mRNA。在聚I:C刺激的全外周血單個(gè)核細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞中檢測到zcyto21mRNA。此結(jié)果表明已知干擾素刺激劑聚I:C可以刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞(包括CD3+T細(xì)胞)合成zcyto21m謹(jǐn)。在聚I:C刺激的全外周血單個(gè)核細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞中檢測到zcyto22mRNA。此結(jié)果表明已知干擾素剌激劑聚I:C可以刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞(包括CD3+T細(xì)胞)合成zcyto22m腿。這些結(jié)果表明聚I:C對zcyto24和zcyto25以及其它家族成員都將有作用。實(shí)施例12使用RT-PCR對人原代免疫細(xì)胞和免疫細(xì)胞系進(jìn)行的表達(dá)分析使用RT-PCR篩選一組原代人免疫細(xì)胞群和人免疫細(xì)胞系的RNA，以篩查zcyto21、zcyto21和zcyto22的表達(dá)。該組腿是自制的，包含來自下述16種不同的靜息和活化細(xì)胞的RNA。所有的原代免疫細(xì)胞群是從幾個(gè)匿名供體的血液中分離得到的。然后使用標(biāo)記的Microbeads和磁性細(xì)胞分離系統(tǒng)(MiltenyiBiotec)分離各種免疫細(xì)胞亞型(CD3+、CD14+、CD19+和CD56+)。使用RNeaseyMidiprep試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)按廠商說明書制備RNA。CD56+NK細(xì)胞RNA分離自靜息態(tài)的這些細(xì)胞。聯(lián)合使用500ng/ml離子霉素和5.0ng/mlPMA(12-豆蔻酸13-乙酸佛波酯)活化一個(gè)CD3+群體。另一個(gè)CD3+群體使用來自ConconavalinA剌激的大鼠脾細(xì)胞的上清液(已知富含細(xì)胞因子和生長因子的介質(zhì))進(jìn)行刺激。在0、4和16小時(shí)的活化時(shí)間收集CD3+細(xì)胞用于RNA分離。從人扁挑體分離CD19+樣品并用0.5pg/ml離子霉素和10ng/mlPMA活化。然后在0、4和24小時(shí)收集細(xì)胞并分離RNA。用0.1ng/ml脂多糖(LPS)或1.0ng/inlLPS活化人CD14+單核細(xì)胞20小時(shí)。然后收集靜息和活化的細(xì)胞，并分離RNA。此外，從靜息和活化的人單核細(xì)胞系HL-60、THP-1和U93788分離RNA。HL-60細(xì)胞用10ng/mlPMA活化過夜。THP-1細(xì)胞用1.Ong/mlLPS+10ng/mlIFNy活化過夜。最后U937細(xì)胞用10ng/mlPMA活化過夜。用Superscript—步RT-PCR和Plati誦Taq試劑盒(Invitrogen),并使用1OOng總RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR以合成cDNA。所用PCR引物對如下zcyto20:ZC40632(SEQIDNO:36)和ZC40633(SEQIDNO:37);zcyto21:ZC40209(SEQIDNO:32)和ZC40213(SEQIDNO:33);zcyto22:ZC40638(SEQIDNO:38)和ZC40639(SEQIDNO:39)。對每一種RNA的等分試樣，還以特異于I類MHC的引物對(Clontech)作為對照進(jìn)行了檢測。在LPS和干擾素y處理的THP-1細(xì)胞中檢測到zcyto20mRNA。在PMA處理4'J、時(shí)的CD3+細(xì)胞中也檢淡'J至!]zcyto20mRNA。在靜,lU937細(xì)胞和靜息THP-1細(xì)胞中檢測到^氐水平的zcyto21mRNA。用LPS和干擾素y處理THP-1細(xì)胞時(shí)zcyto21mRNA水平增加。在PMA處理4小時(shí)的CD3+細(xì)胞中也檢測到zcyto21mRNA。用LPS和干擾素y處理的THP—1細(xì)胞中檢測至'Jzcyto22mRNA。在PMA處理4小時(shí)和16小時(shí)的CD3+細(xì)胞中以及在用ConconavalinA處理4小時(shí)和16小時(shí)的CD3+細(xì)胞中也檢測到zcyto22mRNA。這些結(jié)果表明，活化單核細(xì)胞系和原代CD3+免疫細(xì)胞可以刺激zcyto20、zcyto21和zcyto22mRNA的合成。這些結(jié)果說明，聚I:C將會對zcyto24和zcyto25以及其它家族成員產(chǎn)生影響。實(shí)施例13抗病毒活性:在Hela和L929細(xì)胞中的致細(xì)胞病變效應(yīng)對抗病毒活性的最初功能性試驗(yàn)是使用來自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人胚胎腎(服K)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基進(jìn)行的。該條件培養(yǎng)基的制備如下。使用標(biāo)準(zhǔn)方法將zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的全長cDNA克隆至pzp7Z載體中。用此Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25構(gòu)建體轉(zhuǎn)染293HEK細(xì)胞。簡而言之，對于每個(gè)構(gòu)建體，在轉(zhuǎn)染前約18小時(shí)將700,000個(gè)細(xì)胞/孔(6孔板)接種在2mlDMEM+1096胎牛血清中。對每個(gè)孔，向總共lOOfilDMEM中的6^1Fugene6試劑(RocheBiochemicals)中添加1.5pgZcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25DNA和0.5pgpIRES2-EGFP腿(Clontech)。單獨(dú)的2jigpIRES2-EGFPDNA用作陰性對照。30分鐘后將這些轉(zhuǎn)染混合物加入預(yù)先接種的293細(xì)胞中。24小時(shí)后，除去細(xì)胞培養(yǎng)基并加入DMEM+0.1%牛血清白蛋白。48小時(shí)后收集條件培養(yǎng)基，通過O.45微米濾器過濾，然后用于抗病毒和報(bào)道試驗(yàn)。使用人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)和小鼠成纖維細(xì)胞(L929)實(shí)施抗病毒試驗(yàn)。在第一天，稀釋含有zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的條件培養(yǎng)基(見實(shí)施例10)并與50,000個(gè)細(xì)胞一起接種在96孔平底微量滴定板中。37。C孵育24小時(shí)后，除去培養(yǎng)基并更換為含有感染復(fù)數(shù)O.1的腦心肌炎病毒的培養(yǎng)基。再次于37'C孵育細(xì)胞24小時(shí)。然后在4分等級上通過觀察對培養(yǎng)細(xì)胞中致細(xì)胞病變效應(yīng)的存在評分，然后將之轉(zhuǎn)化成y。CPE，見表8所示。將來自僅轉(zhuǎn)染了GFP和純化的人干擾素a-2a或鼠干擾素a的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包括在內(nèi)作為對照。表8:致細(xì)胞病變效應(yīng)的測定<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>表9顯示，含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的條件培養(yǎng)基以劑量依賴性方式抑制了病毒對HeLa細(xì)胞的感染(%CPE),而對照GFP條件培養(yǎng)基沒有顯著阻斷致細(xì)胞病變效應(yīng)的出現(xiàn)。如表10所示，含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的條件培養(yǎng)基并不抑制病毒對L929細(xì)胞的感染。純化的干擾素在兩個(gè)試驗(yàn)中都顯示出陽性抗病毒活性。襲9:使用條件培養(yǎng)基(CM)時(shí)HeLa細(xì)胞中Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的致細(xì)胞病變效應(yīng)百分?jǐn)?shù)相對CM濃度對照zcyto20zcyto21zcyto22zcyto24zcyto25hIFN-hlFN-a-2aGFP(CM)(CM)(CM)(CM)(CM)a墨2a濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>作為進(jìn)一步研究，將來自感染了表達(dá)Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的桿狀病毒的Sf9細(xì)胞的條件培養(yǎng)基用于抗病毒試驗(yàn)。使用來自野生型桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為對照。使用來自桿狀病毒的條件培養(yǎng)基進(jìn)行的抗病毒試驗(yàn)的結(jié)果與使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293的條件培養(yǎng)基時(shí)的結(jié)果類似。表11顯示，桿狀病毒來源的含有zcyto21的條件培養(yǎng)基以劑量依賴方式抑制病毒對HeLa細(xì)胞的感染，而對照桿狀病毒條件培養(yǎng)基不能阻斷致細(xì)胞病變效應(yīng)的出現(xiàn)。表11:使用來源于桿狀病毒的ZCyto21條件培養(yǎng)基(CM)時(shí)HeLa細(xì)胞中的致細(xì)胞病變效應(yīng)百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>桿狀病毒構(gòu)建體和條件培養(yǎng)基的制備如上述。實(shí)施例14抗人干擾素a受體2B鏈抗體不能阻斷抗病毒活性使用人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)進(jìn)行了另一些抗病毒試驗(yàn)。在第一天，將抗人IFN受體,(ResearchDiagnosticsInc.)和同種型匹配的陰性對照MAb稀釋在96孔平底微量滴定板中。加入來自表達(dá)ZCyto20、zcyto21或zcyto22的桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，得到0.0MSxCM的終濃度，然后每孔接種50,000HeLa細(xì)胞。37t!孵育24小時(shí)后，除去培養(yǎng)基并更換為含有感染復(fù)數(shù)0.1的腦心肌炎病毒的培養(yǎng)基。再次wx:孵育細(xì)胞24小時(shí)。然后按表8所示，通過觀察對培養(yǎng)細(xì)胞中致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的存在進(jìn)行評分。濃度0.01ng/ml的純化人干擾素-a-2a被包括在內(nèi)作為陽性對照。表12顯示，含有zcyto20、zcyto21和zcyto22的條件培養(yǎng)基在有或無抗人干擾素a受體2P鏈的中和抗體存在時(shí)在HeLa細(xì)胞中都具有抗病毒活性(由0%CPE所證實(shí))。相反，在抗人干擾素a受體2p鏈的中和抗體存在時(shí)，干擾素-a-2a的抗病毒活性以劑量依賴性方式特異地受到抑制。這些數(shù)據(jù)表明，zcyto20、zcyto21和zcyto22與不同于人干擾素a受體的受體相互作用，或者它與人干擾素a受體以不同于人千擾素-a-2a與人干擾素a受體相互作用的機(jī)制相互作用。表12:使用zcyto20、zcyto21或zcyto22條件培養(yǎng)基(CM)及抗人干擾素a受體2p鏈的中和抗體時(shí)HeLa細(xì)胞中的致細(xì)胞病變效應(yīng)百分?jǐn)?shù)Anti-zcyto20zcyto20zcyto21zcyto21zcyto22zcyto22hIFN-a-hIFN-a-hIFNRCM+CM+CM+CM+CM'+CM+2a+2a+MAbAnti-對照Anti-對照Anti-對照Anti-對照濃度ihIFNRMAbhEFNRMAbhEFNRMAbhIFNRMAbMAbMAbMAbMabOug/ml0000007.5100.0010000007.510ug/ml0.010000001010ug/ml0.100000027.510ug/ml1ug/ml0000004010100000008710ug/ml實(shí)施例15使用BAF3細(xì)胞系進(jìn)行抗增殖試驗(yàn)使用BaF3以確定zcyto20是否具有抗增殖性質(zhì)。用在ZCyto20cDNA或稱作Za30的無關(guān)cDNA上游含有CMV啟動子及內(nèi)含子A的表達(dá)載體，通過BRLlipofectamine穩(wěn)定轉(zhuǎn)染幼倉鼠腎(B服)細(xì)胞。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種在細(xì)胞工廠的無血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天后收獲條件培養(yǎng)基，然后在5K濾器中將其濃縮10倍。將濃縮的條件培養(yǎng)基樣品儲存在4x:。使用如下試驗(yàn)在BaF3上測試抗增殖活性。在96孔板上，用單純的生長培養(yǎng)基(RPMI1640，10%胎牛血清，lmM丙酮酸鈉，2邁ML-谷氨酰胺)或鼠IL-3(生長培養(yǎng)基中起始50pg/ml)配制成終體積100jU的8個(gè)1:2系列稀釋物。將如下50微升物質(zhì)加入單純的生長培養(yǎng)基或mlL-3稀釋的道中人干擾素a(100ng/ml,10ng/ml或lng/邁l，稀釋在生長培養(yǎng)基中)、人干擾素p(100ng/ml，10ng/ml或lng/ml，稀釋在生長培養(yǎng)基中)、鼠干擾素a(100ng/ml，10ng/ml或lng/ml,稀釋在生長培養(yǎng)基中)、鼠干擾素p(100ng/邁l，10ng/ml或lng/ml,稀釋在生長培養(yǎng)基中)、zcyto20(2.5x，0.5x或0.lx)和鼠Za20(2.5x，0.5x或0.lx)。在生長培養(yǎng)基中洗滌BaF3細(xì)胞系三次，沉淀重懸在生長培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)細(xì)胞并將之稀釋在生長培養(yǎng)基中至5，000個(gè)細(xì)胞/50nl。然后向每個(gè)樣品稀釋物中加入50nl稀釋的細(xì)胞。試驗(yàn)板在37X:孵箱中孵育3至4天。然后每孔加入20^1Alomar藍(lán)，平板37t:孵育過夜。在熒光平板讀數(shù)器上以544激發(fā)波長和590發(fā)射波長對平板進(jìn)行讀數(shù)。實(shí)施例16通過千擾素應(yīng)答途徑的信號傳導(dǎo)1型干擾素和其特異性受體相互作用將對許多負(fù)責(zé)抗病毒/抗增殖活性的基因產(chǎn)生誘導(dǎo)。這些基因包括2'-5，寡腺苷酸合成酶(2-5A合成酶)、雙鏈RNA依賴性Pkr激酶(Pkr)、磷脂scra邁blase和細(xì)胞間粘著分子-1(ICAM-1)。還誘導(dǎo)目前仍未知功能的基因，如干擾素剌激的56kDa基因產(chǎn)物(ISG-56k)。為了確定zcyto20處理細(xì)胞時(shí)是否會誘導(dǎo)其中一些或所有的基因，用來自表達(dá)zcyto20的桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理人DaudiB淋巴樣細(xì)胞72小時(shí)。使用來自野生型桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為陰性對照。處理后，收集細(xì)胞并裂解以分離總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶將ljig總RNA轉(zhuǎn)化成cDNA，并將其作為模板并使用特異針對上述人干擾素刺激的基因的寡核苷酸引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。針對人甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的寡核苷酸引物被用作非干擾素刺激的基因?qū)φ?。結(jié)果顯示，用zcyto20處理細(xì)胞后明顯誘導(dǎo)了ISG-56k、Pkr、2-5A合成酶和磷脂scramblase。沒有觀察到對ICAM-1或非千擾素刺激的基因?qū)φ誈3PDH的誘導(dǎo)。實(shí)施例17:作為zcyto21受體的zcytorl9的鑒定A:COS細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分泌誘捕測試生物素化的zcyto21與已知的或^^兒細(xì)胞因子受體的結(jié)合。用含有細(xì)胞因子受體(包括人IFNaRl,IFN(5R2，IFNaRl，IFNpR2，IL-10R，CRF2-4，zcytoR7，DIRS1，zcytorl9和組織因子)的cDM的pZP7表達(dá)栽體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，并使用下述分泌誘捕試驗(yàn)測試生物素化的zcyto20與轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的結(jié)合。在該試驗(yàn)中陽性結(jié)合顯示了受體-配體對。COS細(xì)胞轉(zhuǎn)染按如下轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞將COS細(xì)胞接種(lxl()5個(gè)細(xì)胞/孔)在纖連蛋白包被的12孑L組織培養(yǎng)板(BectonDickinson,Bedford,MA)上，并37"孵育過夜。將細(xì)胞因子受體DNA(O.75pg)與50jil無血清DMEM培養(yǎng)基(500mlDMEM中55mg丙酮酸鈉，146mgL-谷氨酰胺，5mg轉(zhuǎn)鐵蛋白，2.5mg胰烏素，lfig硒和5mg胎球蛋白)混合，然后與45jil無血清廳M培養(yǎng)基中的5jilLipofectamine(Invitrogen,Carlsbad,CA)混合，并室溫孵育30分鐘。再加入400ji1無血清DMEM培養(yǎng)基。用無血清DMEM洗滌細(xì)胞，并加入500jilDNA混合物。37匸孵育細(xì)胞5小時(shí)，在此期間再加入500fi120%FBSDMEM培養(yǎng)基(500mlDMEM中100mlFBS，55mg丙酮酸鈉和146mgL-谷氨酰胺)，然后孵育細(xì)胞過夜。分泌誘捕試驗(yàn)95按如下進(jìn)行分泌捕獲吸出培養(yǎng)基，用PBS中的1。/。BSA洗滌細(xì)胞。用水中的TNB(O.1MTris-HCl,0.15MNaCl和0.596封閉劑(NENRenaissanceTSA-Direct試劑盒,NENLifeScienceProducts,Boston,MA))封閉細(xì)胞1小時(shí)。細(xì)胞與TNB中的3jig/ml生物素化的zcyto21蛋白質(zhì)(實(shí)施例27)—起孵育1小時(shí)。然后用PBS中的1%BSA洗滌細(xì)胞3次，然后與TNB中的1:300稀釋的鏈霉親和素-HRP(NEN試劑盒)一起再孵育l小時(shí)。再次用PBS中的196BSA洗滌細(xì)胞3次，然后用PBS中的1.8%甲醛固定15分鐘。然后用TNT(水中0.1MTris-HCl，0.15MNaCl和0.05%Tween-20)洗滌細(xì)胞3次。用1:50稀釋在稀釋緩沖液(NEN試劑盒)中的熒光素tyramide試劑檢測陽性結(jié)合，孵育4.5分鐘后用TNT洗滌。用1:5稀釋在TNT中的VectashieldMounting介質(zhì)(VectorLabsBurlingame，CA)保存細(xì)胞。使用FITC濾光片在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染了人zcytorl9cDNA并與生物素化的zcyto21—起孵育過的細(xì)胞上檢測到陽性結(jié)合。其它轉(zhuǎn)染的受體沒有一個(gè)與zcyto21結(jié)合，而且zcytorl9不與對照生物素化的蛋白質(zhì)結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明zcytorl9是zcyto21的受體。其它實(shí)驗(yàn)表明人和鼠zcytorl9與生物素化的zcyto21均有陽性結(jié)合。在轉(zhuǎn)染了人zcytorl9c畫并與生物素化的zcyto20和zcyto24一起孵育的細(xì)胞上也檢測到陽性結(jié)合。實(shí)施例18信號轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)道試驗(yàn)可以使用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)道試驗(yàn)確定zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25與zcytorl9的功能性相互作用。在有或無含有II類細(xì)胞因子受體(包括人DIRS1、IFNaRl、IFNaR2和zcytorl9(SEQIDN0S:2S和加))的cDNA的pZP7表達(dá)載體存在時(shí)，用含有干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)的報(bào)道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎(HEK)細(xì)胞，所述ISRE驅(qū)動安光素酶報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄。在用II類配體(包括zcyto20(SEQIDN0:1)、zcyto21(SEQIDN0:4)、zcyto22(SEQIDN0:6)、zcyto10、人IL10和人IFNa-2a)刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的螢光素酶活性反映了配體與細(xì)胞表面上轉(zhuǎn)染的和天然的細(xì)胞因子受體的相互作用。結(jié)果和方法如下。細(xì)胞轉(zhuǎn)染如下轉(zhuǎn)染293HEK細(xì)胞轉(zhuǎn)染前約18小時(shí)將700,00個(gè)293細(xì)胞/孔(6孔板)接種在2邁1DMEM+1096胎牛血清中。對于每個(gè)孔，向總共lOOjtl,M中的％1Fugene6試劑(RocheBiochemicals)中加入ljigpISRE-螢光素酶DM(Stratagene)、lfig細(xì)胞因子受體DM和ljigpIRES2-EGFPDNA(Clontech)。當(dāng)不包括細(xì)胞因子受體DNA在內(nèi)時(shí)，使用2pgpIRES2-EGFPDNA。30分鐘后將該轉(zhuǎn)染混合物加入預(yù)先接種的293細(xì)胞中。24小時(shí)后，使用胰蛋白酶-EDTA從平板上剝離轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后按約25，000個(gè)細(xì)胞/孔將之重新接種在96孔微量滴定板中。配體刺激前大約18小時(shí)，將培養(yǎng)基改變?yōu)镈MEM+0.5%FBS。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)道試驗(yàn)按如下進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)道試驗(yàn)在DMEM+0.5%FBS中37C孵育18小時(shí)后，用如下II類配體的稀釋物(在DMEM+0.5%FBS中)刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto10、人IL10(huIU0)和人IFN-a-2a(huIFNa-2a)。37C孵育4小時(shí)后，裂解細(xì)胞，并在加入螢光素酶底物后在光度計(jì)上測量相對光單位(RLU)。所獲結(jié)果顯示為實(shí)驗(yàn)樣品的RLU相對于單純培養(yǎng)基對照的RLU的誘導(dǎo)倍數(shù)(實(shí)驗(yàn)樣品的RLU/單純培養(yǎng)基的RLl^誘導(dǎo)倍數(shù))。表14顯示，在ISRE-螢光素酶轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中zcyto20、zcyto21和zcyto22誘導(dǎo)了ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與單純培養(yǎng)基相比產(chǎn)生15-17倍的螢光素酶活性誘導(dǎo)。向轉(zhuǎn)染混合物中加入zcytorl9腿導(dǎo)致zcyto20、zcyto21和zcyto22豫導(dǎo)的ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)再提高6-8倍，從而總共產(chǎn)生104至125倍誘導(dǎo)。所有的其它轉(zhuǎn)染的II類細(xì)胞西子受體DNA均未導(dǎo)致ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加。這些結(jié)果說明，zcyto20、zcyto21和zcyto22與zcytorl9細(xì)胞因子受體發(fā)生功能性相互作用。表13還顯示，人IFNa-2a可以在ISRE-螢光素酶轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中誘導(dǎo)ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與單純培養(yǎng)基相比產(chǎn)生205倍螢光素酶活性誘導(dǎo)。然而，向轉(zhuǎn)染物中加入zcytorl9DNA導(dǎo)致ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)降低11倍(與單純的ISRE-螢光素酶DNA相比)，提示zcytorl9的過量表達(dá)會負(fù)面影響千擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，相反，zcytorl9的過量表達(dá)會對zcyto20、zcyto21和zcyto22信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生正面影響。表13:n類細(xì)胞因子刺激后轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(誘導(dǎo)倍數(shù))配體ISRE-螢光素酶ISRE-螢光素錄/Zcytor19Zcyto20(125ns/ml)15125Zcyto21(125ng/m)17108Zcyto22(125ng/ml)17104HuIFNa-2a(100ng/ml)20518ZcytolO(125ng/ml)1.31HuILlOClOOng/ml)10.5實(shí)施例19:鑒定作為zcytorl9的受體亞基的IL10Rb(CRF2-4)A:IL10Rb中和抗體抑制ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)道實(shí)驗(yàn)測定zcyto20、zcyto21和zcyto22與zcytorl9及IL10Rb(CRF2-4)的功能性相互作用。用含有干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)的報(bào)道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎(HEK)細(xì)胞或穩(wěn)定過量表達(dá)人zcytorl9的人胚胎腎(HEK)細(xì)胞，該ISRE將驅(qū)動螢光素酶報(bào)道分子轉(zhuǎn)錄。用II類配體(包括zcyto20、zcyto21、zcyto22和人IFNa-2a)在有或無IL10Rb(CRF2-4)的中和抗體時(shí)刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的螢光素酶活性反映了配體與細(xì)胞表面上細(xì)胞因子受體的相互作用。結(jié)果和方法如下。細(xì)胞轉(zhuǎn)染為了制備穩(wěn)定過量表達(dá)人zcytorl9的293HEK細(xì)胞，按如下轉(zhuǎn)染293細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前約6小時(shí)將300,000個(gè)293細(xì)胞/孔(6孔板)接種在2mlDMEM+10%胎牛血清。對于每個(gè)孔，向總共lOOjilDMEM中的6^1Fugene6試劑(RocheBiochemicals)中加入2pg含有人zcytorl998的cDNA(SEQIDN0:23)的pZP7表達(dá)載體。30分鐘后將該轉(zhuǎn)染混合物加入預(yù)先接種的293細(xì)胞中。48小時(shí)后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞置于2jxg/ml嘌呤霉素選擇之下。嘌呤霉素抗性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞群。按如下轉(zhuǎn)染293HEK細(xì)胞(野生型或過量表達(dá)人zcytorl9):在轉(zhuǎn)染前約18小時(shí)將700,000個(gè)293細(xì)胞/孔(6孔板)接種在2mlDMEM+10%胎牛血清中。對于每個(gè)孔，在總共100filDMEM內(nèi)的6nlFugene6試劑(RocheBiochemicals)中加入ljigpISRE-螢光素酶DNA(Stratagene)和ljigpIRES2-EGFP腿(Clontech)。30分鐘后將該轉(zhuǎn)染混合物加入預(yù)先接種的293細(xì)胞中。24小時(shí)后使用胰蛋白酶-EDTA將轉(zhuǎn)染細(xì)胞從平板上剝離下來，然后按約25,000個(gè)細(xì)胞/孔將之重新接種在96孔微量滴定板中。配體刺激前大約18小時(shí)，將培養(yǎng)基改變?yōu)镈MEM+0.5%FBS。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)道試驗(yàn)按如下進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)道試驗(yàn)在DMEM+0.5%FBS中37'C孵育18小時(shí)后，用IL10Rb的中和多克隆山羊抗體(對于zcytor21，2.5jig/ml;對于zcyto20和zcyto22,8jig/ml，R&DSystems)或PBS37匸預(yù)先處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞1小時(shí)。對于涉及zcyto20和zcyto22的實(shí)驗(yàn)，還用IFNAR1的非中和多克隆山羊抗體(8ng/ml，R&DSystems)作為抗體對照預(yù)先處理穩(wěn)定過量表達(dá)人zcytoR19的人胚胎腎(HEK)細(xì)胞。用如下II類配體的稀釋物(在DMEM+0.596FBS中)剌激預(yù)先處理的細(xì)胞zcyto20、zcyto21或zcyto22。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用人IFNa-2a作為對照。371C孵育4小時(shí)后，裂解細(xì)胞，并在加入螢光素酶底物后在光度計(jì)上測量相對光單位(RLU)。所獲結(jié)果顯示為與單純培養(yǎng)基對照相比實(shí)驗(yàn)樣品的RLU的誘導(dǎo)倍數(shù)(實(shí)驗(yàn)樣品的RLU/單純培養(yǎng)基的RLU=誘導(dǎo)倍數(shù))。表14和15顯示，用IL10Rb的中和抗體預(yù)先處理野生型293細(xì)胞或過量表達(dá)人zcytoR19的293細(xì)胞可以抑制zcyto20對ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的誘導(dǎo)。幾乎或完全觀察不到對人IFNa-2a誘導(dǎo)的ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。這些結(jié)果說明，對于ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最大誘導(dǎo)，zcyto20需要與IL10Rb(CRF2-4)相互作用，而且zcyto20的受體是zcytoR19和<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>表16:II類細(xì)胞因子刺激后轉(zhuǎn)染的野生型293細(xì)胞的ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的IL10Rb抑制(誘導(dǎo)倍數(shù))細(xì)胞因子濃度!Zeyto21Zcyto21+HuEFNa-2aHuIFNa-2a+IL10RbIL10Rb(ng/ml)中和抗體中和抗體1004.11.83130103.21.4323i11.51.316.3150.11.11.31.420.011.21.3i.l1.20.0011.21.30.92.101111表17:II類細(xì)胞因子剌激后過量表達(dá)zcytoR19的轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的IL10Rb抑制(誘導(dǎo)倍數(shù))細(xì)胞因子濃度Zcyto21Zcyto21+Hu顧a-2aHuIFNa-2a+IL10RbBL10Rb(ng/ml)中和抗體中和抗體100453197.710482898.51355.84.34.30.13.511.41.30.011.51.10.91.20.0011.111.2i01111表l8和19顯示，用IL10Rb的中和抗體預(yù)先處理野生型293細(xì)胞或過量表達(dá)人zcytoR19的293細(xì)胞可以抑制zcyto22引起的ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。對于人IFNa-^誘導(dǎo)的ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，沒有或幾乎沒有觀察到抑制。這些結(jié)果說明，為了最大誘導(dǎo)ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，zcyto22需要與IL10Rb(CRF2-4)相互作用，而且zcyto21的受體是zcytoR19和101IL10Rb(CRF2-4)的異二聚體組合。表18:II類細(xì)胞因子刺激后轉(zhuǎn)染的野生型293細(xì)胞的ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的IL10Rb抑制(誘導(dǎo)倍數(shù))<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>B:抗IL10Rb抗體阻斷抗病毒活性進(jìn)行抗病毒試驗(yàn)以確定抗IL10Rb抗體阻斷zcyto20的抗病毒活性的能力。該試驗(yàn)使用293HEK細(xì)胞(野生型或過量表達(dá)人zcyto!U9)進(jìn)行。第一天，按5jig/ml將抗體(抗人IL10Rp、抗人L印tin受體，R&DSystems)稀釋在細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后與50，000個(gè)細(xì)胞/孔一起接種在96孔板中。37X:孵育1小時(shí)后，將zcyto20-CEE(來自實(shí)施例3)(200ng/ml用于野生型293細(xì)胞、0.5ng/ml用于過量表達(dá)人zcytoR19的293細(xì)胞)或人干擾素a-2a(lng/ml用于野生型293細(xì)胞、100ng/ml用于過量表達(dá)人zcytorl9的293細(xì)胞)加入孔中，并37t:孵育過夜。第二天，除去培養(yǎng)基并更換為含有感染復(fù)數(shù)O.1的腦心肌炎病毒(EMCV)的培養(yǎng)基。然后371C將細(xì)胞孵育過夜。隨后，每孔中加入25jil5mg/ml甲基噻唑四唑鏘(MTT)(Sigma),37t:孵育2小時(shí)，然后用lOOjil抽提緩沖液(12.5%SDS，4596DMF)抽提各孔。37C孵育過夜后，在Spect薦ax平板讀數(shù)器(MolecularDevices,CA)上測量570nM的光密度。光密度(570nm)降低表明細(xì)胞存活減少(抗病毒活性喪失)。對于不同的試驗(yàn)條件，光密度(570nm)顯示在下表20中。結(jié)果顯示，封閉人IL10受體P特異地抑制了zcyto20的抗病毒活性，但不影響干擾素-a-2a的活性。這說明，人IL10受體(i是參與zcyto20抗病毒活性的受體復(fù)合物(包括人zcytorl9)的一部分。表20:ECMV感染的經(jīng)細(xì)胞因子處理的細(xì)胞的光密度(570mn)<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>C:zcytoR19和IL10Rb的共表達(dá)可增加zcyto20、zcyto21和zcyto22的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)道試驗(yàn)測定zcyto20、zcyto21和zcyto22與zcytorl9及IL10Rb(CRF2-4)的功能性相互作用。在有或無含有II類細(xì)胞因子受體zcytorl9和IL10Rb(CRF2-4)的cDNA的pZP7表達(dá)載體時(shí)，用含有用干擾素剌激應(yīng)答元件(ISRE)的報(bào)道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染倉鼠腎(BHK)細(xì)胞，該ISRE將驅(qū)動螢光素酶報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄。用II類配體(包括zcyto20、zcyto21和zcyto22)刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的螢光素酶活性反映了配體與細(xì)胞表面上轉(zhuǎn)染的和天然的細(xì)胞因子受體的相互作用。結(jié)果和方法如下。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按如下轉(zhuǎn)染BHK-570細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前約5小時(shí)將200,000個(gè)B服細(xì)胞/孔(6孔板)接種在2mlDMEM+5%胎牛血清中。對于每個(gè)孔，在總共lOOjil匿M內(nèi)的9jilFugene6試劑(RocheBiochemicals)中加入lpgpISRE-螢光素酶DNA(Stratagene)、ljig細(xì)胞因子受體DNA和lfigpIRES2-EGFPDNA(Clontech)。當(dāng)不包含細(xì)胞因子受體DNA時(shí)使用2pgpIRES2-EGFPDNA。30分鐘后將該轉(zhuǎn)染混合物加入預(yù)先接種的BHK細(xì)胞中。24小時(shí)后使用胰蛋白酶-EDTA將轉(zhuǎn)染細(xì)胞從平板上剝離下來，然后按約25,000個(gè)細(xì)胞/孔將之重新接種在96孔微量滴定板中。配體刺激前大約18小時(shí)，將培養(yǎng)基改變?yōu)镈MEM+0.5%FBS。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)道試驗(yàn)按如下進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)報(bào)道試驗(yàn)在DMEM+0.5%FBS中37"C孵育18小時(shí)后，用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25配體的稀釋物(在DMEM+0.5%FBS中)刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞。37t:孵育4小時(shí)后，裂解細(xì)胞，并在加入螢光素酶底物后在光度計(jì)上測量相對光單位(RLU)。所獲結(jié)果顯示為與單純培養(yǎng)基對照相比實(shí)驗(yàn)樣品的RLU的誘導(dǎo)倍數(shù)(實(shí)驗(yàn)樣品的^11/單純培養(yǎng)基的既11=誘導(dǎo)倍數(shù))。表21顯示，zcyto20、zcyto21和zcyto22在ISRE-螢光素酶和zcytorl9轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞中以劑量依賴性方式誘導(dǎo)ISRE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。向轉(zhuǎn)染混合物中加入IL10Rb(CRF2-4)DNA導(dǎo)致以低10-100倍的細(xì)胞因子劑量得到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最大誘導(dǎo)量的一半。單純使用ISRE轉(zhuǎn)染時(shí)未觀察到反應(yīng)。這些結(jié)果說明，zcyto20、zcyto21和zcyto22通過干擾素刺激應(yīng)答元件傳導(dǎo)信號的能力可以被zcytoR19和IL10Rb(CRF2-4)的共表達(dá)加強(qiáng)，表明zcyto20、zcyto21和zcyto22的受體是zcytoR19和IL10Rb(CRF2-4)的異二聚體組合。104表21:II類細(xì)胞因子刺激后轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞的干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(誘導(dǎo)倍數(shù))<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>實(shí)施例20構(gòu)建表達(dá)zcytorl9可溶性受體zcytorl9CEE、zcytorl9CFLG、zcytorl9CHIS和zcytorl9-Fc4的哺乳動物表達(dá)載體為了表達(dá)zcytor19多肽的可溶性細(xì)胞外域，制備表達(dá)載體pC4zcytorl9CEE，其中對該構(gòu)建體進(jìn)行設(shè)計(jì)以便表達(dá)包含預(yù)測的起始甲硫氨酸且在預(yù)測的跨膜域處附近截短的帶有C端Glu-Glu標(biāo)簽(SEQIDN0:16)的zcytorl9多肽。使用PCR構(gòu)建包含本文所述zcytorl9細(xì)胞外域或zcytorl9的細(xì)胞因子結(jié)合域的zcytorl9DNA片斷，并用標(biāo)準(zhǔn)方法純化。將切下的DNA亞克隆至質(zhì)粒表達(dá)載體中，該載體具有信號肽(如天然zcytorl9信號肽)并將Glu-Glu標(biāo)簽(SEQIDNO:16)加至zcytorl9多肽C端的編碼核苷酸序列上。該哺乳動物表達(dá)載體含有帶哺乳動物啟動子、用于插入編碼序列的多克隆位點(diǎn)、終止密碼子和哺乳動物終止子的表達(dá)盒。該質(zhì)粒還可以具有大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)、哺乳動物選擇標(biāo)記表達(dá)單位(具有SV40啟動子、增強(qiáng)子和復(fù)制起點(diǎn)、D服F基因和SV40終止子)。限制性消化的zcytorl9插入片斷與預(yù)先消化的載體使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行連接，然后按照廠商說明書電穿孔至感受態(tài)細(xì)胞如DH10B感受態(tài)細(xì)胞(GIBCOBRL，Gaithersburg,MD)中，之后接種在含有50mg/ml氨芐青霉素的LB平板上并孵育過夜。通過限制性分析從各個(gè)菌落制備出的DNA,篩選菌落。陽性克隆的插入序列通過序列分析驗(yàn)證。使用QIAGEf大量制備試劑盒(Qiagen)根據(jù)廠商說明大規(guī)模制備質(zhì)粒。使用相同方法制備帶有C端his標(biāo)簽(由一排6個(gè)His殘基組成)的zcytorl9可溶性受體；和帶有C端FLAG⑧標(biāo)簽(SEQIDN0:42)的zcytorl9CFLAG。為了構(gòu)建這些構(gòu)建體，將前述載體中的glu-glu標(biāo)簽(SEQIDN0:16)替換為C-HIS或FLAG⑧標(biāo)簽。制備表達(dá)載體zcytorl9/Fc4/pzmp20以在BHK細(xì)胞中表達(dá)C端帶有Fc4標(biāo)簽的可溶性zcytorl9版本(人zcytorl9-Fc4)。將包括zcyotrl9受體細(xì)胞外域的多核苷酸序列的zcytorl9cDNA片斷與Fc4多核苷酸序列(SEQIDN0:43)在閱讀框中融合以產(chǎn)生zcytorl9-Fc4融合物。pzmp20載體是哺乳動物表達(dá)栽體，含有Fc4多核苷酸序列和允許使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)快速構(gòu)建C端Fc4融合物的克隆位點(diǎn)。通過PCR產(chǎn)生含有人zctorl9細(xì)胞外域以及在5，和3，末端分別編碼有BamHI和Bgl2位點(diǎn)的一段630堿基對片斷。該P(yáng)CR片斷使用引物ZC37967(SEQIDN0:44)和ZC37972(SEQIDN0:45)通過擴(kuò)增人腦cDNA文庫來制備。該P(yáng)CR反應(yīng)條件如下94X:20秒和2分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；68X:4分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；之后IOX]保溫。用BamHI和Bgl2限制性內(nèi)切酶消化該片斷，隨后通過1%凝膠電泳純化，并使106用QiaQuick凝膠提取試劑盒(Qiagen)進(jìn)行條帶純化。所獲純化DM室溫下與預(yù)先用Bgl2消化的pz見p20載體(其在Bgl2位點(diǎn)3，含有Fc4)連接5小時(shí)。在37jilDH10B電感受態(tài)大腸桿菌(Gibco)中根據(jù)廠商指導(dǎo)用連接混合物進(jìn)行電穿孔。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞稀釋在400jilLB培養(yǎng)基中，并鋪在含有l(wèi)OOpg/ml氨,青霉素的LB平板上。通過限制性消化分析克隆，陽性克隆進(jìn)行DNA測序以驗(yàn)證融合構(gòu)建體的序列。實(shí)施例21哺享L動物表達(dá)人zcytorl9可溶性受體zcytorl9/Fc4將BHK570細(xì)胞(ATCCNO:CRL-10314)接種在T-75組織培養(yǎng)瓶中，使之37X:和5%(:02下在DMEM/FBS培養(yǎng)基(DMEM,Giboco/BRL高葡萄糖(GibcoBRL,Gaithersburg，MD)，5%胎牛血清，lmML-谷氨酰胺(JRHBiosciences,Lenea,KS)，lmM丙酮酸鈉(GibcoBRL))中生長至大約50%至70%匯合。然后用質(zhì)粒zcytorl9/Fc4/pzmp20(實(shí)施例4B)和Lipofectamine(GibcoBRL),在無血清(SF)培養(yǎng)基制品(DMEM,10mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5mg/ml胰島素，2mg/ml胎》求蛋白，1%L-谷氨酰胺和1%丙酮酸鈉)中轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用SF培養(yǎng)基將10pg質(zhì)粒DNAzcytorl9/Fc4/pmzp20(實(shí)施例4B)稀釋在15ml管中至500jU終體積。使50jilLipofectamine與450filSF培養(yǎng)基混合。向DNA混合物中加入該Lipofectamine混合物，然后在室溫下孵育約30分鐘。將4mlSF培養(yǎng)基加入該DNA:Lipofectamine混合物中。用5mlSF培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，吸出然后加入該DNA:Lipofectamine混合物。37"C粹育細(xì)胞5小時(shí)，然后加入5mlDMEM/10%FBS培養(yǎng)基。搖瓶在37"孵育過夜，之后將細(xì)胞分開按1:2、1:10和1:50加入150mm平板的選擇培養(yǎng)基(上述DMEM/FBS培養(yǎng)基加上ljiM氨甲蝶呤(SigmaChemicalCo.St.Louis,M0.))中。轉(zhuǎn)染后大約10天，將1個(gè)150mm平板中的ljiM氨甲蝶呤抗性集落用胰蛋白酶處理，匯合細(xì)胞，然后將其中一半細(xì)胞重新接種在10jiM氨甲蝶呤中；以便進(jìn)一步擴(kuò)大zcytorl9/Fc4蛋白質(zhì)的表達(dá)。使用SDS-PAGE和Western分析測試從該匯合的擴(kuò)增細(xì)胞得到的條件培養(yǎng)基樣品，以確定表達(dá)水平。還可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離、篩選表達(dá)該可溶性受體的單個(gè)克隆，并將之培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后進(jìn)行純化。此外，對于這些目的，CHO細(xì)胞也是適宜的細(xì)胞。實(shí)施例22使用ORIGEN試驗(yàn)評價(jià)zcytorl9受體異二聚化根據(jù)廠商搡作方案通過與5倍摩爾過量的Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce,Inc.,Rockford，lU反應(yīng)對可溶性zcytorl9受體進(jìn)行生物素化?？扇苄詚cytorl9受體和另一可溶性受體亞基(例如可溶性II類細(xì)胞因子受體，如CRF2-4(SEQIDN0:40))根據(jù)廠商操作方案用5倍摩爾過量的Ru-BPY-NHS(Igen，Inc.,Gaithersburg，MD)標(biāo)記。該生物素化的和Ru-BPY-NHS標(biāo)記形式的可溶性zcytorl9受體可以分別命名為Bio-zcytorl9受體和Ru-zcytorl9;另一可溶性受體亞基的該生物素化形式和Ru-BPY-NHS標(biāo)記形式可以類似地命名。^吏用條件培養(yǎng)基或使用純化的配體進(jìn)行試驗(yàn)。對于最初對可溶性受體結(jié)合的表征，測試上述細(xì)胞因子或條件培養(yǎng)基以確定它們是否可以介導(dǎo)zcytorl9受體的同二聚體化以及它們是否能介導(dǎo)zcytorl9與上述可溶性受體亞基的異二聚體化。為了達(dá)到此目的，將50jil條件培養(yǎng)基或含有純化細(xì)胞因子的TBS-B與含有如400ng/mlRu-zcytorl9受體和Bio-zcytor19、或400ng/mlRu-zcytor19和如Bio-CRF2-4、或400ng/ml如Ru-CRF-4和Bio-zcytor19的50jilTBS-B(20mMTris,150邁MNaCl,lmg/mlBSA，pH7.2)混合。室溫孵育l小時(shí)后，加入30ng鏈霉親和素包被的2.8mm磁珠(Dynal,Inc.,Oslo,Norway),并室溫再將育該反應(yīng)物1小時(shí)。然后加入200ji1ORIGEN試驗(yàn)緩沖液(Igen，Inc.Gaithersburg,MD)，并使用M8ORIGEN分析儀(Igen，Inc.)測量受體結(jié)合的程度。實(shí)施例23用于制備zcytorl9受體異二聚體的構(gòu)建體表達(dá)分泌的人zcytorl9異二聚體的載體是通過將zcytorl9的細(xì)胞外細(xì)胞因子結(jié)合域與IgGyl重鏈融合，并將異聚(heteromeric)細(xì)胞因子受體亞基(例如II類細(xì)胞因子受體，如CRF2-4)的細(xì)胞外部分與人k輕鏈融合來構(gòu)建的。a.構(gòu)建IgGyl和人k輕鏈融合載體將IgGyl重鏈克隆在Zem229R哺乳動物表達(dá)載體(ATCC保藏號69447)中以便可以在其中克隆具有5，EcoRI和3，Nhel位點(diǎn)的任何期望的細(xì)胞因子受體細(xì)胞外域，導(dǎo)致形成N端細(xì)胞外域-C端IgGyl融合物。用于該構(gòu)建體中的IgGyl片斷是通過PCR從作為模板的Clontech人胎肝cDNA文庫中分離出IgGyl序列而制備的。使用本文所述方法純化PCR產(chǎn)物，并用MluI和EcoRI(Boehringer-Mannheim)消化，乙醇沉接頭的寡聚物一起連接至預(yù)先用EcoRI消化的Zem229R中。將人k輕鏈克隆在Zera228R哺乳動物表達(dá)栽體(ATCC保藏號69446)中以^更可以在其中克隆具有5，EcoRI和3，Kpnl位點(diǎn)的任何期望的細(xì)胞因子受體細(xì)胞外域，導(dǎo)致形成N端細(xì)胞因子細(xì)胞外域-C端人k輕鏈融合物。由于有一個(gè)KpnI位點(diǎn)位于人k輕鏈序列中，故設(shè)計(jì)特異引物以將期望的細(xì)胞因子受體細(xì)胞外域的3，端克隆至該Kpnl位點(diǎn)中對該引物進(jìn)行設(shè)計(jì)以便所獲PCR產(chǎn)物含有期望的細(xì)胞因子細(xì)胞外域和到該Kpnl位點(diǎn)之前的一段人k輕鏈。該引物優(yōu)選包含與人k輕鏈5，端在閱讀框中融合的期望細(xì)胞因子細(xì)胞外域3，末端的至少10個(gè)核苷酸的部分。用于該構(gòu)建體中的人k輕鏈片斷是通過PCR從用于上面的同樣Clontech人胎肝cDNA文庫中分離出人k輕鏈序列而制備的。使用本文所述方法純化PCR產(chǎn)物，并用MluI和EcoRI(Boehringer-Mannheim)消化，乙醇沉淀，并使用本文公開的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將其與MluI/EcoRI接頭一起連接至預(yù)先用EcoRI消化的Zem228R中。b.將zcytorl9受體或異二聚化的亞基細(xì)胞外域插入融合載體構(gòu)建體中使用上述構(gòu)建栽體，制備zcytorl9與IgGyl融合的構(gòu)建體。通過標(biāo)準(zhǔn)方法使用提供EcoRI和NheI限制性位點(diǎn)的寡聚物經(jīng)PCR從前列腺cDNA文庫(Clontech)或活化的淋巴細(xì)胞cDNA文庫擴(kuò)增本文所述zcytorl9受體的細(xì)胞外域或細(xì)胞因子結(jié)合域，從而實(shí)現(xiàn)此構(gòu)建。按本文所述，所獲PCR產(chǎn)物用EcoRI和NheI消化，凝膠純化，并連接至預(yù)先用EcoRI和Nhel消化并經(jīng)帶純化的上述Zem229R/IgGYl中。對所獲載體測序以驗(yàn)證該zcytorl9/IgGyl融合物(zcytorl9/ChlIgG)是正確的。按上述還構(gòu)建了另一獨(dú)立結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有與k輕鏈融合的異二聚體化的細(xì)胞因子受體亞基(即CRF2-4)的細(xì)胞外域。按上述通過PCR用標(biāo)準(zhǔn)方法和提供EcoRI和Kpnl限制性位點(diǎn)的寡聚物從例如淋巴細(xì)胞cDNA文庫(Clontech)擴(kuò)增，進(jìn)行細(xì)胞因子受體/人k輕鏈的構(gòu)建。用EcoRI和Kpnl消化所獲PCR產(chǎn)物，然后將該產(chǎn)物連接至預(yù)先EcoRI和Kpnl消化并經(jīng)帶純化的上述Zem228R/人k輕鏈載體中。測序所獲載體以證實(shí)細(xì)胞因子受體亞基/人K輕鏈融合物是正確的。c.zcytorl9和異二聚體化細(xì)胞因子受體亞基細(xì)胞外域的共表達(dá)利用LipofectaminePlusTM試劑(Gibco/BRL)，按制造商的i兌明，用上述每個(gè)載體大約15fig共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，如BHK-570細(xì)胞(ATCCNo.CRL-10314)。在含有l(wèi)jiM氨甲蝶呤(MTX)(Sigma,St.Louis,MO)和0.5mg/mlG418(Gibco/BRL)的DMEM+596FBS(Gibco/BRL)中選才奪轉(zhuǎn)染細(xì)胞10天。所獲轉(zhuǎn)染子庫在10jiMMTX和0.5mg/mlG418中再次選纟奪10天。使用所獲二次選擇的細(xì)胞庫制備蛋白質(zhì)。利用該庫的3個(gè)工廠(Nunc.丹麥)制備10L無血清條件培養(yǎng)基。使該條件培養(yǎng)基通過lml蛋白A柱，然后洗脫在約10,750nl餾分中。將具有最高蛋白質(zhì)濃度的餾分匯合，并對PBS透析(10kDMW截?cái)嘀?。最后，使用常規(guī)方法對該透析物進(jìn)行氨基酸分析(AAA)。d.體夕卜重建zcytorl9受體110為了鑒定參與zcytorl9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的成分，按如下進(jìn)行受體的重建研究。例如，使用本文所述標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)染了螢光素酶報(bào)道哺乳動物表達(dá)載體質(zhì)粒的BHK570細(xì)胞(ATCCNo.CRL-10314)可以用作生物分析細(xì)胞系以測量在zcytorl9配體存在時(shí)從轉(zhuǎn)染的zcytorl9受體復(fù)合物到螢光素酶報(bào)道分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)答。因?yàn)锽HK細(xì)胞不內(nèi)源性表達(dá)zcytorl9受體，故可以使用BHK細(xì)胞。也可以使用其它細(xì)胞系。一個(gè)示例性螢光素酶報(bào)道哺乳動物表達(dá)載體是KZ134質(zhì)粒，該質(zhì)粒是使用含有來自4個(gè)基因的STAT轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的互補(bǔ)寡核苷酸構(gòu)建的。修飾的c-fosSis誘導(dǎo)型元件(m67SIE或hSIE)(Sadowski，H等，Science261:1739-1744，1993)、來自p21WAF1基因的p21SIEl(ChinY.等，Science261:1739-1744,1996)、p-酪蛋白基因的乳腺應(yīng)答元件(Schmitt-Ney，M.等，Mol.CellBiol.11:3745-3755，1991)和FcgRI基因的STAT誘導(dǎo)型元件(Seidel，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.92:3041-3045,1995)。這些寡核苷酸含有Asp718-Xhol相容性末端，使用標(biāo)準(zhǔn)方法將其連接入用相同酶消化過的、具有c-Fos啟動子并含有新霉素選擇標(biāo)記的受體螢火蟲螢光素酶報(bào)道載體(Poulsen:L.K.等，J.Biol.Chem.273:6229—6232，1998)。通過標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染和選擇方法，使用KZ134質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BHK或BaF3細(xì)胞，以分別制備BHK/KZ134或BaF3/KZ134細(xì)胞系。用單獨(dú)的zcytorl9受體轉(zhuǎn)染該生物分析細(xì)胞系，或用zcytorl9和多種其它已知受體亞基中的一種一起共轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系。受體復(fù)合物包括但不限于單純的zcytorl9受體、zcytorl9與II類細(xì)胞因子受體(如干擾素Y、a和P鏈和干擾素ot/p受體a和p鏈、zcytorll(共同擁有的美國專利5,965,704)、CRF2-4、DIRS1、zcytor7(共同擁有的美國專利5，945，511)受體)的各種組合。然后在存在細(xì)胞因子條件培養(yǎng)基或純化的細(xì)胞因子時(shí)分析每種獨(dú)立的受體復(fù)合物細(xì)胞系，并使用常規(guī)方法測量螢光素酶活性。未轉(zhuǎn)染的生物分析細(xì)胞系作為對照以得到背景螢光素酶活性，由此用作基線以便于比較不同的受體復(fù)合物組合的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在正確受體復(fù)合物存在時(shí)與zcytorl9受體結(jié)合的條件m培養(yǎng)基或細(xì)胞因子預(yù)期將給出相對于背景大約5倍或更多的螢光素酶讀數(shù)。作為備選方案，可以進(jìn)行類似試驗(yàn)，其中按本文所述共轉(zhuǎn)染Baf3/'/cytor19細(xì)胞系并使用諸如標(biāo)準(zhǔn)AlamarBlue增殖試驗(yàn)等已知試驗(yàn)測量增殖。實(shí)施例24配體與可溶性受體的結(jié)合可以使用塽珠標(biāo)記方法測試配體(Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25)與可溶性受體的結(jié)合。例如，1251標(biāo)記的zcyto21-CEE是標(biāo)記的(1.2xl07CPM/ml;1.5ng/fU;和8.6xl06CPM/ng)。將50ng1251標(biāo)記的zcyto21-CEE(見實(shí)施例3)(399,600CPM)與1000ng冷zcytorl9/Fc4同二聚體受體、1000ng冷zcytorl9/CRF2-4異二聚體受體或1000ng對照II類細(xì)胞因子受體/Fc4受體以及作為竟?fàn)幷叩募s10，000ng冷zcyto21混合。將樣品在4t!孵育2小時(shí)，之后向每個(gè)樣品中加入30plG蛋白(ZymedSanFrancisco.CA)。4'C孵育樣品1小時(shí)，然后用PBS洗滌3次。使用y計(jì)數(shù)器(PackardInstruments,DownersGrove,lU測量洗滌后G蛋白的放射活性。實(shí)施例25用zcyto20和zcyto21-生物素流式細(xì)胞術(shù)染色人單核細(xì)胞用FicollHypaque(Amersham，瑞典)分離方法從肝素化人血中分離外周血白細(xì)胞(PBL)。37t!在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中以1xioe6個(gè)細(xì)胞/ml的密度在6孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)PBL。過夜孵育后，收獲PBL并用濃度lOpg/ml的生物素化zcyto20-cee和zcyto2卜cee(見實(shí)施例18)染色。用按1:1000稀釋制備的藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素(Pharmingen，CA，USA)檢測染色。染色后將PBL在2%多聚甲搭中固定，在Facscaliber(BectonDickinson,SanDiego，CA)上讀數(shù)。使用Cellquest軟件(BectonDickinson)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，生物素化的zcyto20-cee和zcyto21-cee均染色處于外周血白細(xì)胞的骨髓門(myeloidgate)中的細(xì)胞淋巴門(lymphoidgate)中的細(xì)胞不與zcyto20-cee和zcyto21-cee結(jié)合。實(shí)施例26zcyto21-CEE對PBL上活化標(biāo)記的表達(dá)的影響通過FicollHypaque分離方法從肝素化人血液中分離外周血白細(xì)胞(PBL)。然后用來自如下的純化蛋白或培養(yǎng)基對照剌激PBL:1)zcyto21-CEE(2jig/ml);2)zcyto21-cee(ljig/ml);3)單純培養(yǎng)基；4)A141F陰性對照蛋白(2ng/ml);或5)IFNa-A(lng/ml)(PBLBiomedicalNJ,USA)。經(jīng)過剌激的PBL在37°C及5%C02下按1xi0e6個(gè)細(xì)胞/ml細(xì)胞密度培養(yǎng)。24小時(shí)和48小時(shí)收獲培養(yǎng)物，并對活化標(biāo)記進(jìn)行染色。用PBS洗滌PBL,然后用Facs緩沖液(HBSS+296正常山羊血清、2%BSA、0.2%NaN3)中的正常小鼠IgG封閉，之后用針對如下標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色CD19、CD14、CD3、HLA-DR、CD54、HLA-ABC(Pharmingen,CA，USA和Immunotech，法國)。洗滌細(xì)胞，然后在2%多聚甲醛中固定，然后在Facscaliber(BectonDickinson,CA，USA)上分析。所獲數(shù)據(jù)4吏用Cellquest軟件(BectonDickinson,CA，USA)分析。結(jié)果說明，與單純培養(yǎng)基對照相比，用zcyto21-cee刺激的單核細(xì)胞上表面CD54(ICAM)表達(dá)在24和48小時(shí)增加。用zcyto21-cee刺激也導(dǎo)致在第24小時(shí)B細(xì)胞上主要組織相容性復(fù)合體I的表達(dá)增加和在第48小時(shí)B細(xì)胞和單核細(xì)胞上MHCI的表達(dá)增加。實(shí)施例27配體的生物素化按如下PierceChemical公司提出的^務(wù)飾方案用Sulfo-NHS-LC-生物素對zcyto21CEE進(jìn)行生物素化。將250pgzcyto21CEE(在0.5mlPBS中)加入8.4^ilS-NHS-生物素原液(84pg)中，搖動下室溫孵育2小時(shí)。孵育步驟后，加入20jil2MTrisHCl(pH8),搖動下室溫孵育混合物20分鐘。然后將此生物素化的配體混合物儲存在4x:。按基本上相同的方法制備zcyto20CEE、zcyto22CEE和zcyto24CEE。實(shí)施例28Northern分析zcytorl9的表達(dá)探測Northern印跡以確定zcytorl9的組織分布。使用PCR和基因特異性引物，即5，ZC40285(顯示在SEQIDNO:21)和3，ZC40286(顯示在SEQIDNO:22)，獲得人zcytorl9cDNA片斷。模板是克隆的人zcytorl9cDNA(SEQIDNO:23)。凝膠純化PCR片斷，用P32a-dCTP和Prime—ItRmT隨機(jī)引物才示i己試劑盒(Stratagene,Lajolla，CA)標(biāo)記大約25ng。探溯'j如下Northern印跡(Clontech,PalAlto，CA)以檢測zcytorl9mRNA的表達(dá)(1)人癌細(xì)胞系印跡C，其含有來自如下各癌細(xì)胞系的RNA樣品早幼粒細(xì)胞白血病HL-60、HELAS3、慢性骨髓性白血病k-562、淋巴母細(xì)胞白血病M0LT-4、伯基特氏淋巴瘤RAJI、結(jié)腸直腸腺癌SW480、肺癌A549和黑素瘤G-361;(2)人MINH印跡，其含有來自如下組織的mRNA:心臟、全腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟和胰腺；(3)人MTNH3，其含有來自如下組織的mRNA:胃、甲狀腺、脊髓、淋巴結(jié)、氣管、腎上腺和骨髓；和(4)人MTNH4，其含有來自如下組織的mRNA:脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、子宮、小腸、結(jié)腸和外周血白細(xì)胞。除了將額外的0.2mg/ml鮭精DNA加入雜交和預(yù)雜交緩沖液中以減低非特異性雜交外，雜交均在ULTRAhybTM超靈敏雜交緩沖液(Ambion，Austin,TX)中根據(jù)廠家推薦進(jìn)行。雜交后，通過用0.lxSSC/0.5%SDS在50X:處理，除去非特異性放射信號。使用BioMaxMR膠片和增感屏(EastmanKodak,Rochester,NY)按廠家推薦曝光印跡3天。一個(gè)~4.5kb轉(zhuǎn)錄本在心臟、骨骼肌、胰腺和前列腺組織，以及伯基特淋巴瘤(RAJI)細(xì)胞系中表達(dá)量最大。在多種其它組織中觀察到較低水平。此外，還有一個(gè)2kb轉(zhuǎn)錄本，其一般比上述該較大轉(zhuǎn)錄114本豐度小，但也存在于許多組織和細(xì)胞系中。除了具有該2和4.5kb轉(zhuǎn)錄本外，睪丸組織中還可能具有約4kb和1.4kb轉(zhuǎn)錄本。腎上腺表現(xiàn)出該4.5kb和2kb轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平相等。實(shí)施例29原位分析zcytorl9的表達(dá)分離特定人組織并原位雜交篩查zcytorl9的表達(dá)。制備多種人組織，切片并進(jìn)行原位雜交，這些組織包括正常和癌性結(jié)腸、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、正常和癌性卵巢、正常和贅生性皮膚、胎肝、肺、心臟和MFH(肌肉肉瘤)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在10%緩沖的甲醛中固定組織，并石蠟包埋。將組織切成4至8微米切片。使用標(biāo)準(zhǔn)方案制備組織。筒而言之,用Histo—Clear(NationalDiagnostics,Atlanta,GA)給組織切片脫石蠟，然后用乙醇脫水。接著，用蛋白酶K(50ng/ml)(BoehringerDiagnostics,Indi謹(jǐn)polis，IN)37"C消化切片2至7分鐘。該步驟后對組織進(jìn)行乙?；椭噩F(xiàn)水化。使用標(biāo)準(zhǔn)方法針對人zcytorl9(變體><i)序列(INC7128744,見SEQIDNO:25)(含有zcytorl9的3，UTR)設(shè)計(jì)了一個(gè)原位探針。使用T7聚合酶產(chǎn)生反義探針。使用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Rib叩robe⑧體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，Promega，Madison,WI),除了使用地高配基辛探針代替放射標(biāo)記的rCTP以及調(diào)節(jié)水以適應(yīng)rNTP的減少體積外，按照廠家說明標(biāo)記探針。使用地高辛配基標(biāo)記的zcytorl9探針(上述)進(jìn)行原位雜交。以1至5pmol/ml將探針加至載玻片上，12至16小時(shí)。隨后在2xSSC和0.lxSSC中55X:洗滌載玻片。使用TSA(TyramideSignalAmplification;PerkinElmerLifeSciencesInc.,Boston,MA)擴(kuò)大信號，并用VECTOR紅底物試劑盒(VectorLaboratories,Burlingame,CA)按廠家指導(dǎo)進(jìn)行顯色。然后用蘇木精復(fù)染載玻片。在幾種測試的組織中觀察到信號結(jié)腸癌組織中，在癌細(xì)胞和幾個(gè)免疫浸潤區(qū)觀察到弱信號。然而，在正常結(jié)腸和小腸中，包括固有層、上皮、免疫節(jié)中的細(xì)胞和外周神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞，沒有觀察到陽性信號。在宮頸癌組織中，在癌細(xì)胞及免疫節(jié)的一些細(xì)胞中有弱信號。在子宮內(nèi)膜癌組織中，在癌細(xì)胞中有弱信號。在正常子宮組織中，沒有觀察到陽性信號。在卵巢癌樣品中，一些癌細(xì)胞為弱陽性。在正常卵巢樣品中，一些毛細(xì)血管內(nèi)皮和大濾泡的上皮可能是弱陽性的。在皮膚癌樣品中，癌性顆粒上皮(granularepithelium)為強(qiáng)陽性，而正常皮膚中沒有觀察到陽性信號。在胎肝中，在竇狀隙內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞混合群體中觀察到信號。在肺中，zcytorl9在II型肺泡上皮中似乎為陽性。偶爾支氣管上皮也可以是弱陽性。間質(zhì)組織中的巨噬細(xì)胞樣單個(gè)核細(xì)胞也是陽性。心臟中，肌細(xì)胞是陰性，而一些循環(huán)單個(gè)核細(xì)胞是zcytor19陽性。在其中一個(gè)樣品中，血管內(nèi)皮可能是弱陽性。測試的其它組織，包括MFH(肌肉肉瘤)樣品和卡波西肉瘤皮膚樣品。這些組織中沒有明確的陽性信號。實(shí)施例30基于RT-PCR分析剌激的細(xì)胞相對未刺激的細(xì)胞中人zcytorl9的表達(dá)使用RT-PCR分析如下細(xì)胞類型以檢測zcytorl9的基因表達(dá)Hela、293、Daudi、CD14+、U937和HL-60。使用用于RT-PCR的商業(yè)第一鏈合成系統(tǒng)(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)從總RNA合成第一鏈cDNA。使用分別產(chǎn)生806bp和892bp產(chǎn)物的zcytorl9x1(SEQIDNO:23)和zcytorl9x2(SEQIDNO:28)及特異寡聚引物ZC40288(SEQIDNO:58)和ZC40291(SEQIDN0:59)、QiagenHotStarTaqDNA聚合酶和緩沖液(Qiagen，Inc.，Valencia,CA)、GeneAmpdNTP(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)、RediLoadTM染料(ResearchGenetics,Inc.,Huntville，AL)和2pl來自各細(xì)胞類型的第一鏈cDNA(10%第一鏈反應(yīng)物)，設(shè)置隨后的PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)條件如下初始l個(gè)循環(huán)95X:變性15分鐘；35個(gè)循環(huán)94X:變性45秒、63"C退火1分鐘和72C延伸15秒；隨后最后1個(gè)循環(huán)72t:延伸7分鐘。在2%瓊脂糖凝膠(EMScience,Gibbstown，NJ)上電泳分離反應(yīng)物，并通過溴化乙錠染色進(jìn)行顯色。在Hela±IFN—p(僅892bp帶)、293+親代Adv、Daudi±IFN-P、Daudi±IFN-a、活化的CD14+、活化的HL-60中觀察到正確大小的條帶。在靜息CD14+、靜息和活化的U937和靜息HL-60中沒有觀察到條帶。這些結(jié)果顯示，當(dāng)單核細(xì)胞或單核細(xì)胞系活化或分化時(shí)誘導(dǎo)zcytorl9表達(dá)。實(shí)施例31RAW細(xì)胞中NFKB才艮道分子的刺激使用小鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞報(bào)道細(xì)胞系測試Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25通過NFkP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳遞信號的能力。該細(xì)胞系是通過用含有驅(qū)動螢光素酶報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄的NFkP應(yīng)答元件的KZ170逆轉(zhuǎn)錄病毒報(bào)道分子轉(zhuǎn)導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞制備的。起初溯'J試Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的報(bào)道試驗(yàn)是使用描述用于抗病毒分析的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293的條件培養(yǎng)基進(jìn)行的。收獲RAW264.7/KZ170細(xì)胞，并按50，000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔平板中。37。C下在RPMI+10%FBS中孵育細(xì)胞過夜。第二天，從貼壁細(xì)胞中除去培養(yǎng)基，然后向細(xì)胞中加入未稀釋的zcyto20-25條件培養(yǎng)基或zcyto20-25條件培養(yǎng)基的稀釋物(稀釋在RPMI+0.1%BSA中)。37。C孵育5小時(shí)后，裂解細(xì)胞，加入螢光素酶底物后在光度計(jì)上進(jìn)行讀數(shù)。通過將zcyto20-25條件培養(yǎng)基的相對光單位(RLU)與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的相對光單位進(jìn)行比較，分析結(jié)果。與未稀釋的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基相比，未稀釋的zcyto20-25條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的螢光素酶表達(dá)高4-9倍。這些結(jié)果表明，在小鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞系中zcyto20-25能夠通過NFicp信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳遞信號。作為進(jìn)一步研究，在該報(bào)道試驗(yàn)中使用來自感染了表達(dá)zcyto20、zcyto21或zcyto22的桿狀病毒的Sf9細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。野生型桿狀病毒用作陰性對照。桿狀病毒構(gòu)建體和條件培養(yǎng)基的制備如上述。117使用桿狀病毒來源的條件培養(yǎng)基進(jìn)行的RAW264.7NFkb-受體試驗(yàn)的結(jié)果與使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293條件培養(yǎng)基時(shí)得到的結(jié)果相似。含有zcyto20-22的桿狀病毒來源的條件培養(yǎng)基以劑量依賴方式誘導(dǎo)螢光素酶表達(dá)，而相應(yīng)對照條件培養(yǎng)基無此現(xiàn)象。實(shí)施例32體內(nèi)結(jié)果將zcyto24的毒性和生物學(xué)活性與另一II類細(xì)胞因子、親代腺病毒載體以及未注射的小鼠比較。按如下注射4組(每組8只)C57B16小鼠(雌性，9周齡)組1:每只小鼠注射lx1011個(gè)Adzcyto24顆粒；組2:按lxl()H個(gè)顆粒注射II類細(xì)胞因子(Adzcyto);組3:按lxl()U個(gè)顆粒注射親代腺病毒載體(Adzpar);和組4:未處理的。在-l天將溫度發(fā)送器放置在小鼠身上，在第0天注射病毒?；\子方便食物攝取，每5天檢測一次體重，第10天采血(最大0.25ml)用于試驗(yàn)，包括CBC和Abbot血液分析。在第20天處死所有小鼠。在第10天采取Adzcyto24(組1)處理的小鼠的血液，測試血清以檢測是否存在zcyto24生物活性。病毒試驗(yàn)證實(shí)對于Adzcyto24組的每只小鼠在1:500最大稀釋下有顯著抗病毒活性。這相應(yīng)于大約160ng/ml純化的zcyto24CEE。用于檢測小鼠千擾素的抗病毒試驗(yàn)在Adzcyto24組中未檢測到活性。使用具有IRSE的報(bào)道分子進(jìn)行的生物分析也在Adzcyto24注射的小鼠的血清中檢測到顯著的zcyto24活性，而在其它組中則沒有檢測到。溫度探頭顯示，組2的平均體溫到第10天降低了5"C以上，而Adzcyto24(組l)組的平均體溫減低了2X:以上。對照組的體溫在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)出不到it:的改變。Adzcyto24(組1)小鼠在20天的實(shí)驗(yàn)中體重表現(xiàn)出輕微增加，與對照組(組3和4)相同。組2小鼠體重下降到第10天組2的平均體重降低約8%。對第10天和第20天采取的血液進(jìn)行的Abbot血液分析儀分析揭示，組1和2中白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著改變。圖1顯示了Adzcyto24處理的小鼠相對于其它組而言單核細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加。Adzcyto24注射的小鼠與親代載體(Adzpar)注射的小鼠相比，單核細(xì)胞計(jì)數(shù)高2,77倍。到第20天,單核細(xì)胞計(jì)數(shù)稍微下降，但仍顯著高于親代載體注射的小鼠的單核細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖2顯示，用編碼II類細(xì)胞因子的腺病毒(Adzcyto)而非用編碼zcyto24的腺病毒注射時(shí)，導(dǎo)致在第10天嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加。為了驗(yàn)證Abbot血液分析儀檢測到的細(xì)胞類型的性質(zhì),使用譜系特異性Mab(單克隆抗體)對實(shí)驗(yàn)第20天采取的血液實(shí)施流式細(xì)胞術(shù)分析。圖3顯示了每只小鼠外周血中CDllb陽性細(xì)胞，即單核細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。將每組的平均值作圖，圖4顯示，用帶zcyto24的腺病毒注射的組與親代載體感染的組相比，單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著增加(p=0.05)。這與之前使用Abbot血液分析儀觀察到的改變是相符的。用針對粒細(xì)胞(GR-1)的特異性MAb對同樣血液樣品進(jìn)行的分析顯示，Adzcyto24注射的小鼠中粒細(xì)胞(即，主要是嗜中性粒細(xì)胞)百分?jǐn)?shù)沒有顯著增加。PBL還用B細(xì)胞(B220)特異的Mabs進(jìn)行了染色，相對于其它組，Adzcyto24注射小鼠沒有觀察顯著不同。值得注意的是，使用Adzcyto24時(shí)，與Adzcyto注射相關(guān)的寒戰(zhàn)和重量減輕并不明顯。在第10天和20天通過Abbot血液分析儀檢測到的單核細(xì)胞明顯增加，得到用譜系特異的MAbs對第20天的血液進(jìn)行的流式細(xì)胞分析的證實(shí)。注射了Adzcyto24的小鼠的PBL中單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的明顯增加好象是腺病毒感染情況下zcyto24直接或間接介導(dǎo)的獨(dú)特活性。注射了Adzcyto24的小鼠中顯著水平表達(dá)的zcyto24可能通過從周圍組織募集和動員單核細(xì)胞或通過刺激從骨髓或肝來源的祖先細(xì)胞產(chǎn)生單核細(xì)胞而促進(jìn)抗病毒反應(yīng)。該證據(jù)提示，單核細(xì)胞/巨嚆細(xì)胞被zcyto24和zcyto21激活。根據(jù)以上的描述應(yīng)當(dāng)理解，盡管為了舉例說明的目的這里描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，仍可以進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明只受所附權(quán)利要求書的限制。本申請還公開了如下內(nèi)容1.分離的多肽，其與選自如下組的多肽有至少80%的一致性(a)包含SEQIDNO:2第22位氨基酸殘基到笫205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDNO:7第22位氨基酸殘基到笫205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位氨基酸殘基到笫202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO:11第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽。2.項(xiàng)目1的分離的多肽，其中所述多肽特異地結(jié)合如下受體SEQIDNOS:24、27或29的單體或同二聚體受體，或SEQIDNOS:24、27或29聯(lián)合SEQIDNO:41的異二聚體受體。3.分離的多肽，其與選自如下組的多肽有至少95%的一致性(a)包含SEQIDNO:2第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDNO:7第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO:11第29位氛基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽。4，項(xiàng)目3的分離的多肽，其中所述多肽特異地結(jié)合如下受體SEQIDNOS:24、27或29的單體或同二聚體受體，或SEQIDNOS:24、27或29聯(lián)合SEQIDNO:41的異二聚體受體。5.分離的多肽，包含SEQIDNO:2第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:2第1位氨基酸殘基到笫205位氨基酸殘基所示氨基酸序列。6.分離的多肽，包含SEQIDNO:7列第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序或SEQIDNO:7第1位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列。7.分離的多肽，包含SEQIDNO:9第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:9列第1位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序。8.分離的多肽，包含SEQIDNO:11第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:11第1位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列。9.分離的多肽，其是SEQIDNO:2第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:2第1位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列中的至少14個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應(yīng)答。10.分離的多肽，其是SEQIDNO:7第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:7第1位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列中的至少14個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應(yīng)答。11.分離的多肽，其是SEQIDNO:9第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:9第1位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列中的至少14個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應(yīng)答。12.分離的多肽，其是SEQIDNO:11第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:11第1位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列中的至少14個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應(yīng)答。13.藥物組合物，其在可藥用栽體中包含SEQIDNO:2第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:2第1位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列。14.藥物組合物，其在可藥用載體中包含SEQIDNO:7第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:7第l位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列。15.包含至少兩個(gè)多肽的融合蛋白，其中至少一個(gè)多肽包含選自如下組的多肽(a)包含SEQIDNO:2第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDNO:7第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO:11第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽。16.編碼多肽的分離的多核苷酸，其中該核酸分子選自(a)包含SEQIDNO:3的核苷酸序列的多核苷酸；(b)在嚴(yán)緊洗滌條件后仍與由SEQIDNO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQIDNO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)分子組成的多核苷酸雜交的多核苷酸。17.編碼多肽的分離的多核苷酸，其中該核酸分子選自(a)包含SEQIDNO:36的核苷酸序列的多核苷酸；(b)在嚴(yán)緊洗滌條件后仍與由SEQIDNO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQIDNO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)分子組成的多核苷酸雜交的多核苷酸。18.編碼選自如下組的多肽的分離的多核苷酸(a)包含SEQIDNO:2第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDNO:7第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO:11第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽。19.項(xiàng)目18的分離的多核苷酸，其中所述核酸分子編碼的氨基酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列之間的任何差異均是由于保守氨基酸替代引起的。20.分離的多核苷酸，其包含SEQIDNO:1第64位核苷酸至第618位核普酸所示的核苷酸序列或SEQIDNO:1第1位核苷酸至第618位核苷酸所示的核苷酸序列。21.分離的多核苷酸，其包含SEQIDNO:6第64位核苷酸至笫618位核苷酸所示的核苷酸序列或SEQIDNO:6第1位核苷酸至笫618位核苷酸所示的核苷酸序列。22.分離的多核苷酸，其包含SEQIDNO:8第67位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列或SEQIDNO:1第1位核苷酸至笫606位核苷酸所示的核苷酸序列。23.分離的多核苷酸，其包含SEQIDNO:10第67位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列或SEQIDNO:10第1位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苦酸序列。24.表達(dá)載體，其包含項(xiàng)目20、項(xiàng)目21、項(xiàng)目22或項(xiàng)目23的分離的核酸分子、轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子，其中所述啟動子與所述核酸分子可操作地連接，并且所述核酸分子與所述轉(zhuǎn)錄終止子可操作地連接。25.重組宿主細(xì)胞，其包含項(xiàng)目24的表達(dá)載體，其中所述宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞和植物細(xì)胞。26.制備多肽的方法，該方法包括步驟培養(yǎng)包含項(xiàng)目24的表達(dá)栽體并產(chǎn)生所述多肽的重組宿主細(xì)胞，和從所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中分離該多肽。12327.與項(xiàng)目9、項(xiàng)目10、項(xiàng)目ll或項(xiàng)目12的多肽特異結(jié)合的抗體或抗體片斷。28.檢測生物樣品中基因表達(dá)是否存在的方法，包括步驟(a)在雜交條件下使核酸探針和(l)分離自該生物樣品的測試RNA或(2)從該分離的RNA分子合成的核酸分子接觸，其中該探針由包含SEQIDNO:l核苷酸序列、SEQIDNO:1核苷酸序列的互補(bǔ)分子的一部分；SEQIDNO:6核苷酸序列、SEQIDNO:6核普酸序列的互補(bǔ)分子的一部分的核苷酸序列組成，和(b)檢測核酸探針和測試RNA分子或合成的核酸分子形成的雜交體，其中該雜交體的存在指示了生物樣品中存在該RNA,或(a，)使該生物樣品與項(xiàng)目27的抗體或抗體片斷接觸，其中所述接觸在允許該抗體或抗體片斷與該生物樣品結(jié)合的條件下進(jìn)行，和(b)檢測所有結(jié)合的抗體或結(jié)合的抗體片斷。29.擴(kuò)增單核細(xì)胞或單核細(xì)胞的祖先細(xì)胞的方法，包括用包含項(xiàng)目9、項(xiàng)目10、項(xiàng)目ll和項(xiàng)目12的多肽的組合物培養(yǎng)骨髓或外周血細(xì)胞，其中所述多肽在組合物中的量足以造成所述骨髓或外周血細(xì)胞與在未給予多肽的情況下培養(yǎng)的骨髓或外周血細(xì)胞相比其中的單核細(xì)胞或單核細(xì)胞的祖先細(xì)胞數(shù)量增加。30.在暴露于抗原或病原體的哺乳動物中刺激免疫應(yīng)答的方法，包括(1)確定抗原或病原體特異的抗體的水平；(2)給予在可藥用栽體中含有項(xiàng)目9、項(xiàng)目10、項(xiàng)目11或項(xiàng)目12的多肽的組合物；(3)確定給藥后抗原或病原體特異的抗體的水平；(4)將步驟(1)中的抗體水平和步驟(3)中的抗體水平進(jìn)行比較，其中抗體水平增加表明刺激了免疫應(yīng)答。序列表<110>ZymoGenet"ics,Inc.<120>細(xì)胞因子蛋白質(zhì)ZCYT020<130>01-17PC<150>US60/285,408<151>2001魯20<150>US60/286.482<151>2001-04-25<150>US60/341,050<151>2001-10-22<150>US60/341,105<151>2001-10-22<150>US09/895.834<151>.2001-06-29<150>US60/285.424<151>2001-04-20<160>59<170>FastSEQforWindowsVers化n4.0<210>1<211>618<212>DMA<213〉人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(1)...(618)<400>1atgactMetThr1gggGlygacAsptgcCys5acgTh廣CCdProgtgValctgLeugtgctgValLeu10atgMetgccAlagcaAlagtgVal15ctg48accgtgThrValactThrgga20gcaAlagttValcctProgtcValgccAla25aggetcArgLeuC3CHisgggGlygetAla30etcLeuccgPro96gatgcaAspAlaaggArg35ggcGlytgcCysC3CHisataliegccAla40cagGinttcaagPheLystecSe廣ctgLeu45tctSe廣CC3Proc的Gin144gagctgGluLeu50c的GingccAlatttPheaag柳Arg55gccAla333LysgatgccAspAlatta匕eu60gaaGlug的GlutegSercttLeu192ctgctgl_eul_eu65aaggacAsptgcCysaggArg70tgcQysC3CHistecSercgcetcArgLeu75ttcPhecccProaggArg3CCThrtggTrp80240gacctgaggcagctgcaggtgagggagcgccccatggetttggagget288AspLeuArgGinLeuGinValArgGluArgProMetAlaLeuGluAla85卯95gagctgGluLeugccAlactgLeu100acgThrctgLeuaaggttValctgLeu105gaggccGluAla3CCThrgetAlagacAsp110actThrgacAsp336ccagccProAlactgLeu115gtgValgacAspgtcValttgLeugacAsp120cagGinccccttProl_euC3CHis3CCThr125ctgLeuC3CHiscatHis384ateetcteccagttcegggcctgtgtgagtcgtcagggcctgggcseclieLeuSerGinPheArgAlaCysValSerArgGinGlyLeuGlyThr130135140432cagateGinlie145cagGincctProcagGincccPro150acgThrgcaAlagggcccaggProArg1553CCThreggArgggcGlycgcArgetct_eu160480caccattggctgtaceggetccaggaggccccaaaaaaggagteccct528HisHisTrpLeuTyrArgLeuGinGluAlaProL_ysUysGluSerPro165170175doctgcetcgaggcctctgtcaccttcaacetcttccgcetcetcacg576CysLeuGluAlaSerValThrPheAsnLeuPheArgLeuLeuThr180185l卯cgagacctgaattgtgttgccagtggggacctgtgtgtctga618ArgAspLeuAsnCysValAlaSerGlyAspLeuCysVal*195200205<210>2<211>205<212>PRT<213〉人<400〉2MetTh「GlyAspCysThrProValLeuValLeuMetAlaAlaValLeu15.1015ThrValThrGlyAlaValProValAlaArgLeuHisGlyAlaLeuPro202530.AspAlaArgG，yCysHislieAlaGinPheLysSerLeuSerProGin354045..GluLeuGinAlaPheU/sArgAlaLysAspAlaLeuGluGluSerLeu'505560LeuLeuLysAspCysArgQysHisSerArgLeuPheProArgThrTrp65707580AspLeuA「gGinLeuGinValArgGluArgProMetAlaLeuGluAla85卯95GluLeuAlaLeuThrLeuLysValLeuGluAlaThrAlaAspThrAsp100105110ProAlaLeuValAspValLeuAspGinProLeuHisThrLeuHisHis115120125lieLeuSe「GinPheA「gAlaCysValSerArgGinGlyLeuGlyThr130135140GinlieGinProGinProThrAlaGlyProArgTh「ArgGlyA「gLeu145150155160HisHisTrpLeuTyrArgLeuGinGluAlaProLysLysGluSerPro165170175GlyCysLeuGluAlaSerValTh廣PheAsnLeuPheArgLeuLeuThr180185190ArgAspLeuAsnQysValAlaSerGlyAspLeuQysVal195200205<210>3<211>615<212>DNA<213>人工序列<220><223〉簡并序列<221〉misc—feature<222〉(1)...(615)<223〉n=A,T,C或G<柳>3atgacnggngaytgyacnccngtnytngtngcngtnccngtngcrrnignytncayggngcncarttyaarwsnytnwsnccncargarytngargarwsnytnytnytnaargaytgymgngayytnmgncarytncargtnmgnganngnacnytnaargtnytngargcnacngcngaycarccnytncayacnytncaycayathytnggnytnggnacncarathcarccncarccncaycaytggytntaymgnytnca廠gargcngcnwsngtnacnttyaayytntt，gnytnggngayytntgygtn<210>4<211>603<212>DNA<213〉人<220><221>CDS<222〉(1)...(603)<400>4ytnatggcngcngtnytnacngtnacnggn60ytnccngaygcnmgnggntgycayathgcn120cargcnttyaarmgngcnaargaygcnytn180tgycaywsnmgnytnttyccnmgnacntgg240ccnatggcnytngargcngarytngcnytn300acngayccngcnytngtngaygtnytngay360wsncarttymgngcritgygtnwsnmgnca廣420acngcnggncc闊nac網(wǎng)ngg,nytn480ccnaaraargarwsnccnggntgyytngar540ytnacnmgngayytnaaytgygtngcnwsn600615atggetgcagettggaccgtggtgctggtgactttggtgetaggcUg48MetAlaAlaAlaTrpThrValValLeuValThrLeuValLeuGlyLeu151015gccgtggcaggccctgtccccacttecaagcccaccacaactgggaag%AlaValAlaGlyProValProThrSerLysProThrTh「ThrGlyLys202530ggctgccacattggcaggUcaaatctctgteaccacaggagetagcg144GlyCysH.lslieGlyArgPheLysSerLeuSerProGinGluLeuAla354045agettcaagaaggccagggacgccUggaagagteaetcaagctgaaa192Se「PheLysUysAlaArgAspAlaLeuGluGluSerLeuLysLeuLys505560aactggagttgcagetctcctgtcttccccgggaattgggacctgagg240AsnTrpSerCysSerSe「ProValPheProGlyAsnTrpAspLeuArg65707580cUetccaggtgagggagcgccctgtggccttggaggetgagctggcc288LeuLeuGinValArgGluArgProValAlaLeuGluAlaGluLeuAla8590%ctgacgctgaaggtcctggaggccgetgetggcccagccctggaggac336LeuThrLeuL_ysValLeuGluAlaAlaAlaGlyProAla.LeuGluAsp100105110gtcetagacc的ccccttcacaccctgcaccacateetcteccagetc384ValLeuAspGinProLeuHisThrLeuHisHislieLeuSerGinLeu115120125caggcctgtatecagcctcagcccacagcagggcccaggccceggggc432GinAlaCyslieGinPmGinP「oThrAlaGlyProA「gProArgGly130135140cgcetccaccactggctgcaceggetccaggaggcccccaaaaaggag480ArgLeuHisHisTrpLeuHisA「gLeuGinGluAlaProLysLysGlu145150155160tecgetggctgcctggaggcatctgtcaccttcaacetcttccgcetcSerAlaGlyQysLeuGluAlaSerValThrPheAsnLeuPheArgLeu165170175528etcacgcgagacetcaaatatgtggccgatggggacctgtgtctgagaLeuThrArgAspLeuLysXy「ValAlaAspGlyAspLeuCysLeuArg180185190576acgteaThrSe「3CCThr195C3CHiscctProgagGlutecSe廣3CCThr200tga603<210>5<211>200<212>PRT<213>人<400>5MetAlaAlaAlaTrpThrValValLeuValThrLeuValLeuGlyLeu151015AlaValAlaGly20ProValProThrSer25LysProThrThrThr30GlyLysGlyHis35lieGlyA「gPheLys40SerLeuSe「ProGinGlu45LeuAlaSe廣Phe50LysLysAlaA「gAsp55Ala匕euG，uGluSerLeuLys60l_euLysAsnTrpSerCysSerSerProValPheProGlyAsnTrpAspl_euA「g65707580LeuLeuGinValArg85GluArgProValAla90LeuGluAlaGluLeu95AlaLeuThrLeuLys100ValLeuGluAlaAla105AlaGlyProAlaLeu110GluAspValLeuAsp115GinProLeuHisTh「120LeuHisHislieLeuSer125GinLeuGinAla130QyslieGinProGin135ProThrAlaGlyProArgPro140A「gGlyArgLeuHisHisTrpLeuHisArg匕euGinGluAlaP「oLysLysGlu145150155160SerAlaGlyCysLeu165G，uAlaSerValThr170PheAsnLeuPheArg175LeuLeuThrArgAspLeuLysTyrValAlaAspGlyAspLeuQysLeuArg180185190ThrSerThrHisProGluSerThr195200<210>6<211>615<212>DMA<213〉人<220><221>CDS<222>(1)..,(615)<400>6atgaccggggactgcatgccagtgctggtgctgatggcc'gcagtgctg48MetThrGlyAspCysMetProValLeuValLeuMetAlaAlaValLeu151015accgtgactggagcagUcctgtcgccaggetccgcggggetetcccg%ThrValThrGlyAlaValProValAlaArgLeuArgGl_yAlaLeuPro202530gatgcaaggggctgccacatagcccagttcaagtecctgtctccacag144AspAlaArgGlyCysHislieAlaGinPheLysSerLeuSe「ProGin354045gagctgcaggcctUaagagggccaaagatgccttagaagagtegctt192GluLeuGinAlaPheLysArgAlaLysAspAlaLeuGluGluSerLeu505560ctgctgaaggactgcaagtgccgcteccgcetcttccccaggacctgg240LeuLeuLysAspCysLysCysArgSerArgLeuPheProArgThrTrp65707580gacctgaggcagctgcaggtgagggagcgccccgtggetttggagget288AspLeuA「gGinLeuGinValArgGluArgProValAlaLeuGluAla85卯95gagctggccctgacgctgaaggttctggaggccaccgetgacactgacGluLeuAlaLeuThrLeuL_ysValLeuGluAlaThrAlaAspThrAsp100105110336ccagccctgggggatgtcttggaccagccccttcacaccctgcaccat;YcjAlaLeuGlyAspValLeuAspGin-ProLeuHisThrLeuHisHis115120125384ateetcteccagetcegggcctgtgtgagtcgtcagggcccgggcacclieLeuSerGinLeuArgAlaCysValSerArgGinGl_yProGlyThr130135140432cagatecagcctcagcccacggcagggcccaggacceggggccgcetcGinHeGinProGinProThrAlaGlyProArgThrArgGlyArgLeu145150155160■C3CC3tHisHistggctgcacTrpLeuHis165eggetccaggagArgLeuGinGlugccAla170CC3333ProLysaaggagGlutecSe廣175cctPro528ggctgcetcgaggcctctgtcaccttcaacetcttccgcetcetcacgGlyCysLeuGluAlaSerValThrPheAsnLeuPheA廠gLeuLeuThr1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Gl_yAspSerCysSerLeuGlyThrProProGly305310315320GinGlyProGinSer325<210>42<211>8<212>P叮<213>人工序列<220〉〈223〉FLAG肽標(biāo)簽<40O42Asp7>rLysAspAspAspAspLys15<210>43<211>699<212>DNA〈213>人<■>43gagcccagatcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgag60ggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc3tgatctcccgg120acccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc180aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcag240tacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaat300ggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccatcctccatcgagaaaacc360atctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgg420gatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagc480gacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcct540cccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggaca柳gc600aggtggcagcaggggaacgtc'ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccac660tacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaataa699<210>44<211>28<212>■〈213〉人工序列〈220〉.〈223〉寡核苷酸引物ZC37967<44gcggatccaggccccgtctggcccctcc28<210>45<2U>30<212>DMA<213〉人工序列<220><223>寡核苷酸引物ZC37972<400>45gcagatctccagttggcttctgggacctcc<210>46<211>615<212>眼30161〈213〉人工序列<220〉<223>簡并序列<221〉misc—feature<222>(1)...(615)<223〉n=A,丁，C或G<400>46atgacnggnggcngtnccngcarttyaarwgargarwsnygayytnmgncacnytnaargca「ccnytncggnccnggnacaycaytggygcnwsngtnaggngayytntaytgyatgcctngc,nytsnytnwsncctnaaarytncargttnytngargcayacnytncacnca廣3thcatnca則nytcnttyaayytgygtnngtnytngtn闊nggngcnncarga「ytnrgaytgyaar,ngamignnacngcngayycayathytnrccnc3rccnncargargcnnttytngnytnytnatggcngytnccngaygcargcnttyatgymgnwsnmccngtngcnyacngayccngwsncar7tnmacngcnggnccc門33ra3rgytnacnmgngcngtnytnacc同nggntgarmgngcnaagnytnttycctngargcngacnytnggngagngcntgygtcn,acnmgarwsnccnggayytnaaytgngtnacnggn60ycayathgcn120rgaygcnytn180nmgnacntgg240rytngcnytn300ygtnytngay360nws,ncar420nggnmgr\ytn480ntgyytngar540ygtngcnwsn600615<210-4723DMA〈2i3>人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸引物ZC39339<400>47cagacatgactggggactgcacg23<210>48<211>22<212>隱<213〉人工序列<220><223〉寡核苷酸引物ZC39393<400>48tcagacacac卿tccccactg22162<210>49<211>22<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉寡核苷酸引物ZC39340<400>49tgggtgacagcctcagagtgtt22<210>50<211>22<212>■<213〉人工序列.<220>〈223〉寡核苷酸引物ZC39341<400>50atagcgactgggtggcaataaa22<210>51<211>23<212>DNA<213〉人工序列<220><223>寡核脊酸引物ZC39295<棚>51cagacatgaccggggactgcatg23<210>52<211>22<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉寡核普酸引物ZC39298<52<image>imageseeoriginaldocumentpage164</image><400>56aggtcagacacactggtctccat<210>57<211>22<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉寡核苷酸引物ZC39688<400>57ggtcagacacactggtctccac<210>58<211>4<212>DNA<213〉人工序列〈220〉<223>寡核苷酸引物ZC40288<400>58gaaggagggggccggaaacaagac<210>59<211>24<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>寡核苷酸引物ZC40291<咖>59cagattcggctccggtggtaaggt2322242權(quán)利要求1.分離的多肽，其與選自如下組的多肽有至少80％的一致性(a)包含SEQIDNO2第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDNO7第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO9第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO11第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽。2.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述多肽特異地結(jié)合如下受體SEQIDNOS:24、27或29的單體或同二聚體受體，或SEQIDNOS:24、27或29聯(lián)合SEQIDNO:41的異二聚體受體。3.分離的多肽，其與選自如下組的多肽有至少95%的一致性(a)包含SEQIDNO:2第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(b)包含SEQIDNO:7第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；(c)包含SEQIDNO:9第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽；和(d)包含SEQIDNO:11第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列的多肽。4.權(quán)利要求3的分離的多肽，其中所述多肽特異地結(jié)合如下受體SEQIDNOS:24、27或29的單體或同二聚體受體，或SEQIDNOS:24、27或29聯(lián)合SEQIDNO:41的異二聚體受體。5.分離的多肽，包含SEQIDNO:2第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:2第1位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列。6.分離的多肽，包含SEQIDNO:7列第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序或SEQIDNO:7第1位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列。7.分離的多肽，包含SEQIDNO:9第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:9列笫1位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序。8.分離的多肽，包含SEQIDNO:11第29位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:11第1位氨基酸殘基到第202位氨基酸殘基所示氨基酸序列。9.分離的多肽，其是SEQIDNO:2第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:2第1位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列中的至少14個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應(yīng)答。10.分離的多肽，其是SEQIDNO:7第22位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列或SEQIDNO:7第1位氨基酸殘基到第205位氨基酸殘基所示氨基酸序列中的至少14個(gè)連續(xù)氨基酸，其中所述多肽刺激哺乳動物的抗原性應(yīng)答。全文摘要本發(fā)明涉及與干擾素α在氨基酸序列水平上極為緊密相關(guān)的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的多核苷酸和多肽分子。該蛋白質(zhì)家族的受體是II類細(xì)胞因子受體。本發(fā)明包括降低病毒感染和增強(qiáng)單核細(xì)胞數(shù)量的方法。本發(fā)明還包括zcyto20多肽的抗體，和制備這些多核苷酸和多肽的方法。文檔編號C07K14/52GK101531715SQ200910126508公開日2009年9月16日申請日期2002年4月19日優(yōu)先權(quán)日2001年4月20日發(fā)明者B·A·弗克斯,D·W·塔伏特,K·M·克魯施爾,P·O·舍帕德,W·R·金德斯沃格申請人:津莫吉尼蒂克斯公司