專利名稱：叉聚肽,其藥物組合物與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類以賴氨酸為支架的具有混雙叉鏈結(jié)構(gòu)的肽類化合
物；本發(fā)明還公開了這類肽的制備方法，包括液相片段合成、固相逐 步合成、液一固片段組裝合成；含有這類化合物的藥物組合物，體夕卜、
體內(nèi)抗癌細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移的活性試驗(yàn)表明這類肽類化合物可抑制癌細(xì) 胞轉(zhuǎn)移。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中許多活性內(nèi)源肽對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有一定的抑制活性。
例如纖維粘連蛋白中的RGD片段具有粘附識(shí)別活性；該蛋白中CS-1 片段(1978-1982) EILDV可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞之間緊密粘合，不宜脫落擴(kuò) 散；層粘連蛋白中的YIGSR片段可阻斷腫瘤細(xì)胞與基底膜的附著。然 而它們一旦脫離了原有的結(jié)合狀態(tài)，就很容易被體內(nèi)的蛋白酶降解。 因此它們作為外源性的藥物，因過快降解很難發(fā)揮抑制腫瘤擴(kuò)散及轉(zhuǎn) 移的作用。
為了克服這種弊端，藥物化學(xué)家們已經(jīng)進(jìn)行了很多相關(guān)的研究。 1986年Saiki等人合成并驗(yàn)證了均聚型(RGD)。及(YIGSR)。，發(fā)現(xiàn)它們 的抗癌轉(zhuǎn)移作用強(qiáng)于各自單體肽Brit. J. Cancer, 1989,59:194。Nomizu 等人設(shè)計(jì)、合成了 16叉鏈(Ac-YIGSR),6-K,6-K8-K4-K2-K肽?；钚栽囼?yàn) 證明，抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散的作用比單體肽高7.4倍Brit. J. Cancer, 1996， 73:589。美中不足的是，這種肽化合物的分子量多在10000Da以上， 合成難度及成本均高，而且由于分子量過高，易出現(xiàn)異蛋白樣副作用。 考慮到腫瘤的擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移是由多個(gè)環(huán)節(jié)組成的串接過程，單一使用上 述活性肽的一種化合物很難有效的阻斷擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移中的全部鏈條。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一類降解速度適 中；生產(chǎn)難度低，成本低；分子量適中，無異蛋白樣副作用；能作用 于腫瘤擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移的多個(gè)環(huán)節(jié)的叉聚肽化合物；
本發(fā)明還提供了含有這類叉聚肽化合物的藥物組合物以及制備抗 癌轉(zhuǎn)移藥物組合中的應(yīng)用。
為解決本發(fā)明的技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 本發(fā)明從兩方面對(duì)活性肽進(jìn)行新設(shè)計(jì)與合成
① 位點(diǎn)改造，使相關(guān)的天然氨基酸殘基Glu(E)、 Asp(D)、 Ile(I) 及Arg(R)分別換為酚基苯甲酸、Ida(亞氨基二乙酸)及胱氨 酸。旨在迷惑蛋白酶的識(shí)別，提高抗水解能力。
② 把不同的活性肽段或其位點(diǎn)改造肽結(jié)合在同一個(gè)Lys支架上， 構(gòu)成混合叉聚型肽化合物。其結(jié)果是一方面加強(qiáng)了肽的分子量 效應(yīng)，另一方面該種化合物具有多靶點(diǎn)的"雞尾酒分子"性能， 具有效發(fā)揮抗擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移作用。
本發(fā)明設(shè)計(jì)了具有以下結(jié)構(gòu)通式的肽化合物，其特征在于，它們具
有下列結(jié)構(gòu)通式
Z1、 Z、 C"—Z\
〕Lys-X-R 〉ys-X-R | /Lys-X-R
Z2 或 Z 或 Cys-Z
Z1、 Z2，相同或不同，Z、 Z1、 z2分別獨(dú)立的選自 Arg-Gly-X' (X'=Asp, Ida)
X2-X3- Gly-Ser-Arg (X2=Tyr， 3，5 二羥基苯甲酰Gly; X3=Ile, Cys) X4-X5- Leu -X6- Val (X4= Ida, Glu; X5= Ile， Cys; X6= Asp， Ida) 其中Glu可以替換為3，5-二羥基苯甲酰Gly、 Asp可以替換為Ida、 Arg 可以替換為Arg(N02)
及上述結(jié)構(gòu)的反序肽段，正序及反序的類似肽段 例如Arg-Gly-Asp (RGD) 、 Tyr隱Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR)、 Gly-Asp-Ala-Lys ( GDAK )、 Glu-Ile-Leu-Asp-Val ( EILDV ),及其反序 結(jié)構(gòu)為DGR、 RSGIY、 VDLIE。
X選自Ala、 -Ala或des(缺失)
R選自O(shè)H、 OCH3、 NH2、 NHR，(R^C, io烷基)、NH-CH2-CHrOH。
優(yōu)選的R選自NHMe、 NHEt、 NHCHMe2、 NHBu。
優(yōu)選的Z、 Z1、 ZZ分別獨(dú)立的選自 Arg-Gly-Asp Arg-Gly-Ida Ida-Gly-Arg
Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg Arg-Ser-Gly-Ile-Tyr
Ida-IIe-Leu-Asp-Val
Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Glu-Ile-Leu醒Ida-Val
3,5-二羥基苯甲酰-Gly-Ile-Leu- Ida—VaL
更優(yōu)選的化合物選自
Arg-Gly-Asp \
,Lys-OMe
Arg-Gly-Asp
Arg-Gly-Asp—Lys—OMe Tyr-He-Gly-Ser-Arg
Tyr-lle-Gly-Ser-Arg\
,Lys-OMe
Tyr-lle-Gly-Ser-Arg
Glu-lle~Leu-lda-Val\
>s-NHEt
Glu-"e-Leu-lda-Val
Gly-He-Leu-lda-Val—Lys—NHBu
6' 9、
Gly-lle-Leu-lda層Val
OH
Arg-Ser-Gly-lle-Tyr\
》ys-Glyol
Arg-Ser-Gly-lle-Tyr
Cys-Tyr-lle-Gly-Ser-Arg \
i 》ys-NHBu Cys-Tyr-lle-Gly-Ser-Arg
Arg-Ser-G ly-l le-Ty r\
》ys-NHEt
Arg-Ser-Gly-lle-Tyr
lda-lle-Leu-Asp-Val \
,Lys—NHMe
lda-lle-Leu-Asp-Val
Glu-lle-Leu-Asp-Val—Lys—p-Ala-NHMe Tyr-lle-Gly-Ser-Ar丄Glu-lle-Leu墨Asp-Val—Lys—p-Ala-NHMe Arg-Gly-lda
Cys-Glu-lle-Leu-Asp-Val \
i -Lys-NHMe
Cys-Glu-lle-Leu-Asp-Val
Arg-Gly-Asp—Lys—p-Ala-NHMe
j
Tyr-"e-Gly-Ser-Arg
TyMle-Gly-Ser-Arg—Lys—P"Ala隱NHMe lda-Gly-Arg
Ida:亞氨基二乙酸單酰
A = Ala D = Asp E = Glu G = Gly I = Ile K-Lys L = Leu O-Ida R-Arg， S = Ser V-Val Y - Tyr
本發(fā)明還提供了這類化合物的制備方法。
由于本發(fā)明涉及的化合物具有不同序列肽段的并列叉聚結(jié)構(gòu)，因此 不便采用傳統(tǒng)的逐步串接方式接肽。本發(fā)明綜合了液相片段分別預(yù)制、 賴氨酰兩個(gè)氨基正交式分別與不同的片段縮合及固相組裝等策略，實(shí) 施了目標(biāo)化合物的合成。
其中涉及的各氨基酸的保護(hù)形式為Boc-Arg(HCl)-OH， Fmoc-Arg(Mtr)-OH， Boc-Gly-OH， Boc-Ala畫OH， Boc- -Ala-OH， Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH， Fmoc-Glu(tBu)-OH， Boc-Ida誦OH (Boc-亞氨基二乙酸)，F(xiàn)moc-Ile-OH， Boc-Ile-OH， Fmoc-Leu-OH, Boc-Tyr-OH, Boc隱Ser-OH， Boc-Cys(Acm)-OH， Fmoc-Cys(Trt)-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH及Boc-Lys(Boc)-OH?？s合劑配方分別為DCC (二環(huán)己基碳二亞胺)與HOBt (N-羥基苯 丙三唑)等摩爾混合物，HBTU (O-苯丙三唑-N，N,N，,N，-四甲基脲錄六 氟磷酸鹽)與HOBt及NMM等摩爾混合物，TBTU (O-苯丙三唑 -N，N,N，，N，-四曱基脲鐵四氟硼酸鹽)與HOBt及NMM等摩爾混合物。
其他試劑與溶劑的縮寫形式為H2NMe (曱胺)、H2NEt (乙胺)、 H2NBu(正丁胺)、TEA(三乙胺)、TFA(三氟乙酸)、TESi(三乙基 硅)、DMF ( 二甲基加酰胺)、Py.(吡。定)、DCM ( 二氯甲烷)、THF (四 氬p夫喃)、HOAc (乙@吏)、EtOAc (乙酸乙酯)、Et20 (乙醚)。
脫除Boc試劑3N HCl/HOAc或飽和HCl/EtOAc。脫除Fmoc試劑 20。/。哌啶/DMF。脫除Pac (苯羰亞甲基)酯試劑Zn/HOAc。切除樹 脂試劑H2NR/H2OTHF。
全部產(chǎn)物均經(jīng)溶劑重沉淀或C-18濾層純化，并由FAB-MS或 ESI-MS分析證明結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明因此還涉及以本發(fā)明化合物作為活性成份的藥物組合物。該 藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備?？赏ㄟ^將本發(fā)明化合物與 一種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成適 于人或動(dòng)物使用的任何劑型。本發(fā)明化合物在其藥物組合物中的含量 通常為0.1-95重量％。
本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥 途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、月幾肉注射、皮下注射、 鼻腔、口腔粘膜、目艮、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以 是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w型、w/o型和復(fù) 乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻 劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含 片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠嚢劑(包括硬膠嚢、 軟膠嚢、腸溶膠嚢)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、 氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑 等。
本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也制成是緩釋制劑、控釋制劑、 靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將本發(fā)明化合物制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種 賦形劑，包括稀釋劑、勦合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。 稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、 木糖醇、微晶纖維素、硫酸4丐、磷酸氬4丐、碳酸釣等；濕潤劑可以是 水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡
萄糖溶波、孩史晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧曱基纖維素鈉、甲 基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、
聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、 低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、 羧曱基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十 二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸 鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。
還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、 腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發(fā)明化合物與稀 釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠嚢或軟膠囊中。也可將有 效成分本發(fā)明化合物先與稀釋劑、翁合劑、崩解劑制成顆粒或微丸， 再置于硬膠嚢或軟膠嚢中。用于制備本發(fā)明化合物片劑的各稀釋劑、 祐合劑、潤濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發(fā)明化合物的 膠嚢劑。
為將本發(fā)明化合物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二 醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領(lǐng)域常用的增溶劑、助溶劑、 pH調(diào)劑劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、 羥丙基-P-環(huán)糊精等；pH調(diào)劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化 鈉等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸 鹽等。如制備凍千粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。 此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、
矯P木劑或其它添力D劑。
為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可 用任何公知的給藥方法給藥。
本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量依照所要預(yù)防或治療疾病的 性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的個(gè)體情況，給藥途徑和劑型等可以有 大范圍的變化。 一般來講，本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍為
0.001-150mg/Kg體重，優(yōu)選為0.1-100mg/Kg體重，更優(yōu)選為l-60mg/Kg 體重，最優(yōu)選為2-30mg/Kg體重。上述劑量可以一個(gè)劑量單位或分成 幾個(gè)劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療 手段的給藥方案。
本發(fā)明的化合物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY 藥物合并使用。當(dāng)本發(fā)明的化合物與其它治療藥物存在協(xié)同作用時(shí)， 應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整它的劑量。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
降解速度適中 生產(chǎn)難度低，成本低。 分子量適中，無異蛋白樣副作用。 能作用于腫瘤擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移的多個(gè)環(huán)節(jié)。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不受限于這 些實(shí)施例。
制備例
片段肽的液相合成試驗(yàn)
制備例1 Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-OH(I)的制備
(1) Boc-Ser-OPac的制備
稱取3.078g Boc-Ser-OH ( 15mmo1)和3.284g淡代苯乙酮 U6.5mmo1)共同溶于30ml乙酸乙酯中，水水外浴下邊攪拌邊 滴加2.31ml三乙胺，攪拌反應(yīng)過夜。次日向反應(yīng)液中加入70ml 乙酸乙酯，依次以飽和NaHC03溶液x3、 1NHC1溶液x3、飽和 食鹽水x3、蒸餾水x2洗滌(每次100ml),有機(jī)層以無水疏酸鈉 干燥后過濾，濾液濃縮為油狀物后低溫固化為針狀結(jié)晶，以石油 醚:乙醚=1:2混合溶劑研磨后抽濾得到白色固體粉末，產(chǎn)率92%。 Mp: 91.5~92.5°C ESI-MS:324.4 [M+H]+
(2 ) HOH2N-Ser-OPac的制備
以飽和HC1的EtOAc溶解Boc-Ser-OPac,水水外浴下攪拌 反應(yīng)4小時(shí)后減壓蒸出溶劑和酸氣，殘余物以Et20研磨后抽濾 得到白色光澤4分末，產(chǎn)率99%。
Mp: 155~157°C
(3) HOH2N-Gly-Ser-OPac的制備
稱取3.854g Boc-Gly-OH( 22mmol)與2.97g HOBt( 22mmol) 共同溶于80ml四氫呋喃(THF )中，水水外浴下加入2 mmol/ml DCC的四氳呋喃溶液llml，置于4'C下活化4小時(shí)后過濾除去 DCU，濾液在0。C下加入到以10ml DMF+10ml THF溶解的 5.197g HOH2N-Ser-OPac ( 20mmol)溶液中，攪拌10分鐘后在 水水外浴下邊攪拌邊滴入2.32ml NMM,反應(yīng)過夜。次日減壓蒸 出THF,向所得溶液中加入80ml飽和食鹽水以100ml EtOAc分 兩次萃取，合并有機(jī)層依次以飽和NaHCCV溶液x3、 1NHC1溶 液x3、飽和食鹽水x3、蒸餾水x2洗滌(每次100ml),有機(jī)層以 無水硫酸鈉千燥后過濾，減壓濃縮后以無水乙醚重結(jié)晶的到白色 固體粉末，產(chǎn)率82%。 Mp: 52 54°C ESI畫MS:381.2 [M+H〗+。 Boc 保護(hù)基的脫除按(2)節(jié)中的方法進(jìn)行，以無水乙醚研磨得到白
色粉末，產(chǎn)率96°/。
Mp: 157-160°C (4 ) HCl*H2N-Ile-Giy-Ser-OPac的制備
Boc-Ile-OH的活化按照(2)節(jié)中DCC活化方法操作，將 活化后的羧基組分與本實(shí)施例(3)節(jié)的產(chǎn)物的THF:DMF=1:1 混合溶劑的溶液在0。C下混合，反應(yīng)液濃度1 mmol/ml,混合10 分鐘后加入NMM，攪拌反應(yīng)過夜。后處理同(3)節(jié)的后處理 方法，最后以無水乙醚研磨后抽濾得到白色粉末，產(chǎn)率94%。 Mp: 154 156°C ESI-MS:516.2 [M+Na]+。 Boc保護(hù)基的脫除按 (2)節(jié)中的方法進(jìn)行，以無水乙醚研磨得到白色粉末，產(chǎn)率 96%。 Mp: 106~110°C
(5 ) Boc-Tyr-Ile誦Gly-Ser-OPac的制備
以10ml無水THF和10ml DMF的混合溶液溶解1.406g Boc-Tyr-OH ( 5mmo1)和l，954g ( 4 )節(jié)所得產(chǎn)物(4.54mmol), -16匸下邊攪拌邊加入1.05ml NMM ( 9.53mmol )， 5分鐘后緩慢 滴加0.664ml氯曱酸異丁酯(IBCF, 5mmo1) 3小時(shí)后轉(zhuǎn)為室溫 并反應(yīng)過夜。次日蒸出THF后向反應(yīng)液中加入70ml飽和食鹽 水，以100ml EtOAc萃取，有機(jī)層依次以飽和NaHC03溶液x3、 IN HC1溶液x3、飽和食鹽水x3、蒸餾水x2洗滌(每次100ml), 直接抽濾得到白色固體并以EtOAc重結(jié)晶后得到產(chǎn)物，產(chǎn)率 55%。 Mp:212 214。C， ESI-MS: 657.3 [M+H]+
(6 ) Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-OH的制備
以50ml HOAc溶解1.614g (5)節(jié)所得產(chǎn)物(2.456mmol )，油 浴40。C下邊攪拌邊加入30倍量鋅粉攪拌反應(yīng)1小時(shí)后再加入 20倍量鋅粉，繼續(xù)反應(yīng)5小時(shí)后過濾除去鋅粉，濾液濃縮后以 80mlEtOAc稀釋，以IN HC1溶液x2飽和食鹽水溶液x3洗，有 機(jī)層以無水石克酸鈉千燥后過濾，濾液濃縮至干，以無水乙醚研 磨過夜后抽濾得到白色固體產(chǎn)物，產(chǎn)率83%。 Mp: 145-147°C ESI-MS: 539,3 [M+H]+
制備例2Boc-Arg(Mtr)-Gly-Ida-OH (II)的制備
(1 ) HOH2N-Ida-OPac的制備
按照實(shí)施例1中(1 ) 、 ( 2 )節(jié)的方法得到中間體 HOH2N-Ida-OPac。投料比Boc-Ida-OH:溴代苯乙酮4:2.2，反應(yīng) 液濃度0.5mmol/ml。兩步總產(chǎn)率92%。 Mp: 131-132°C
(2) HOH2N-Gly-Ida-OPac的制備
稱取 0.741g Boc-Gly-OH ( 4.231mmol ) 和 1.561g HCl*H2N-Ida-OPac (3.874mmol)共同溶于20ml DMF中，0于攪 拌下滴加0.74ml ( 4.231mmol) DIPEA,攪拌5分鐘后加入0.811g
EDOHC1 (4.231mmol)。攪拌反應(yīng)過夜，次日向反應(yīng)液中加入 120ml飽和食鹽水，以乙酸乙酯萃取，有機(jī)層依次以飽和NaHC03 溶液x3、 1NHC1溶液x3、飽和食鹽水x3、蒸餾水x2洗滌(每次 100ml),以無水石充酸鈉干燥后過濾。將濾液蒸千，加入無水乙醚 研磨過夜，過濾后得乳白色固體粉末。產(chǎn)率58%, Mp: 126 130°C, ESI-MS: 549.3 [M+Na]+。 Boc保護(hù)基的脫除按實(shí)施例1中(2) 節(jié)的方法進(jìn)行，以無水乙醚研磨得到白色粉末，產(chǎn)率96%。 (3 ) Boc-Arg(Mtr)-Gly-Ida-OH的制備
Boc-Arg(Mtr)-OH的活化按照實(shí)施例1中(2)節(jié)的DCC活化方 法操作，將活化后的羧基組分與本實(shí)施例中(2)節(jié)所得產(chǎn)物的 THF:DMF (l:l)溶液在0。C下混合，反應(yīng)物液濃度0.5 mmol/ml， IO分鐘后加入NMM,攪拌反應(yīng)過夜，后處理同產(chǎn)率51%。 Mp: 99 102°C, ESI-MS: 917.5 [M+Na]+。羧基端Pac酯保護(hù)的脫除按 照實(shí)施例1中(6)節(jié)的方法進(jìn)行，鋅粉投料比為1:100，按60/40 的比例分兩次加入。產(chǎn)物為白色固體，產(chǎn)率80%, ESI-MS: 659.4 [M+H]+
制備例3Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Leu-OH (III)的制備
(1 )HC1'H2N-Leu-OPac的制備
按照實(shí)施例1中(1 ) 、 ( 2 )節(jié)的方法得到中間體 HCl*H2N-Leu-OPac。投料比Boc-Leu-OH:溴代苯乙酮=1:1.05, 反應(yīng)液濃度0.5mmol/ml。兩步總產(chǎn)率80%。 Mp: 163 165°C (2) HCl*H2N-Ile-Leu-OPac的制備
按照實(shí)施例1中(5)節(jié)的方法采用IBCF混合酸酐法活化接肽 制備Boc-Ile-Leu-OPac，投料比例為羧基組分:氨基組分=1 :U無 水乙醚重結(jié)晶得到白色粉末，產(chǎn)率53%。 Mp:143 144。C。 Boc 保護(hù)基的脫除按實(shí)施例1中(2)節(jié)的方法進(jìn)行，以無水乙醚研 磨得到白色粉末，產(chǎn)率98%。 Mp: 181~183°C (3 ) Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Leu-OH的制備
按照實(shí)施例1中(5 )節(jié)的方法采用IBCF混合酸酐法活化接肽 制備Fmoc畫Glu(OtBu)-Ile-Leu-OPac,投料比例為羧基組分:氨 基組分=1:1.05無水乙醚重結(jié)晶得到白色粉末，產(chǎn)率53%。 Mp:210 212。C。 ESI-MS: 792.5 [M+Na]+。羧基端Pac酯保護(hù)的 脫除按照實(shí)施例1中(6)節(jié)的方法進(jìn)行，鋅粉投料比為1:50, 按30/20的比例分兩次加入。終產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇中結(jié)晶純化得 到白色固體粉末，產(chǎn)率86%， Mp: 254~256°C， ESI-MS: 652.5 [M+H]+
制備例4固相肽合成試-瞼
(1) Boc-氨基酸與氯曱基樹脂的鍵合
稱取10g (5 mmol)氯曱基樹脂(取代當(dāng)量0.5 mmol/g,粒度 100 200目，交聯(lián)度1%)、兩倍(10 mmol)摩爾數(shù)的Boc-氨基 酸[Boc-Lys(Boc)-OH或Boc- -Ala-OH]、兩倍(10 mmol)摩爾 數(shù)的K2C03及十分之一摩爾數(shù)(0.5 mmol )的KI共同與DMF( 100 mL)混合在圓底燒瓶中。經(jīng)70。C空氣裕旋轉(zhuǎn)加熱反應(yīng)24h。將 反應(yīng)混懸物移入帶抽濾砂板的反應(yīng)管中，依次用60 70。C的 DMFx3, 95%EtOHx3、 DMFx3、 50%EtOHx3、 EtOHx3及常溫 的無水Et202混搖洗滌各lmin，抽干備用。
(2) 脫除Boc
Boc-AA-樹月旨(約5 mmol)與100 mL含3N HC1的無水HOAc 混合，室溫?fù)u動(dòng)5min。抽除酸液后再加100 mL 3N HCl/HOAc， 再搖動(dòng)反應(yīng)40 min。抽除酸液后，樹脂依次用下列溶劑洗濾 DCMx5、 Et202、 DMFx2、 95%EtOHx2、 70。C的DMFx2、 70°C 的EtOHx3、無水Et20x2,抽干備用。
(3) 脫除Fmoc
Fmoc-AA-樹脂與適量20Q/o哌咬/DMF混搖兩次(5+20min )，依次 用EtOAcx3、 DMFx3、 EtOHx3、 DMFx2、 EtOHx3、 Et2Ox2, 抽干備用。
(4) 羧基組分Boc-AA-OH或Fmoc-AA-OH的活化 稱取三倍于樹脂上氨基組分的Boc(或Fmoc)-AA-OH、 HBTU及 HOBt共溶于適量的千燥DMF中。然后加入四倍摩爾量(當(dāng)氨 基組分為.HC1鹽時(shí))或三倍摩爾量(當(dāng)氨基組分為游離胺時(shí))的 N-曱基嗎啉(NMM)。溶液澄清全溶后備用。
(5) 縮合接肽
將上述預(yù)制的羧基組分活化溶液與適量的氨基組分樹脂混合。室 溫?fù)u動(dòng)反應(yīng)，終點(diǎn)由茚三酮試驗(yàn)結(jié)果決定。本發(fā)明中多數(shù)接肽反 應(yīng)為兩次縮合，每次5 6h。反應(yīng)后樹脂依次用下列溶劑淋洗 DMFx3、 EtOHx2、 DMFx3、 EtOHx3、無水Et202。抽千，待 下一循環(huán)脫Boc或脫Fmoc用。
(6) 脫除側(cè)鏈保護(hù)基
合成中使用 Fmoc-Ser(tBu)-OH ， Fmoc-Arg(Mtr)-OH , Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH及Fmoc-Cys(Trt)-OH 時(shí)，在肽鏈組裝完成后脫除側(cè)鏈保護(hù)基tBu、 Mtr、 Trt的條件為 硫代苯甲醚:H20:TFA-5:5:90 (v:v:v),脫除Trt時(shí)加用5%EDT， 共兩次(10min+50min)。抽干酸液后樹脂依次用DCMx5 、 EtOAcx2、 EtOHx2、 60。C的DMFx3、 EtOAcx2、 10%TEA/DMFx2、 60。C的DMFx3、 50%EtOHx2、 60。C的DMFx2、 60。C的EtOHx5 進(jìn)行洗濾，每次lmin。抽干溶劑后待做胺解用。
(7)氨解反應(yīng)切除樹脂
取脫除全部保護(hù)基的肽樹脂，按每克樹脂10mL胺溶液的比例加 入一種相應(yīng)的H2NR/EtOH (或H20):THF (l:l)溶液。室溫反應(yīng) 24h，然后收集上清液。殘余樹脂再用60°C 95。/。EtOH洗濾三次， 合并醇洗液與氨解液。在50 6(TC下減壓濃縮，蒸干溶劑。殘留 物在與適量曱苯混合，再蒸千。殘留物經(jīng)無水Et20研磨成粉狀， 過濾收集沉淀，得產(chǎn)物。
實(shí)施例
實(shí)施例i目標(biāo)化=::=pLys-QMe合物的制備i
按照制備例4中(1) (5)節(jié)的方法得到中間體(Arg-Gly-Asp)2Lys-樹脂。此樹脂3g與5%TEA/MeOH ( 30mL ) i 55。C加熱時(shí)旋轉(zhuǎn) 反應(yīng)24h,收集濾液后，殘余樹脂再與30mL 5% TEA/MeOH混 合，55°C 24h重復(fù)反映一次。合并兩次濾液，于50。C下減壓濃縮 至干。殘留物經(jīng)無水Et20研磨，出現(xiàn)粉狀沉淀，過濾收集沉淀 的目標(biāo)化合物。
FAB-MS分析817.3 [M+H]+ 實(shí)施例2.目標(biāo)化,lle;:y=》S-oMe合物的制備2
按照制備例4中(l) (5)節(jié)的方法先制備中間體Fmoc-Lys(Arg)-樹 月旨。然后以Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-OH為羧基組分(制法見制備例 1 )，按照制備例4中(4 )及(5 )節(jié)的方法予以活化并與中間體 側(cè)鏈 Arg 的氨基縮合，得到中間體 Fmoc-Lys(Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)-樹脂。隨之脫除Fmoc基[見制 備例4中第(3)節(jié)]，再依次有逐步法接上Boc-Arg-Gly-Asp,得到 中間體Boc-Arg-Gly-Asp(OtBu)-Lys(Boc-Tyr-Ile畫Gly-Ser-Arg)-樹 月旨。此中間體的Boc及tBu保護(hù)基用TFAAt代苯甲醚/H20脫除[詳 見制備例4中第(6)節(jié)]。最后用酯交換法(詳見實(shí)施例1 .)切除
樹脂得到終產(chǎn)物。 FAB-MS: 1065.5 [M+H〗+
實(shí)施例3.目標(biāo)化=Ss=:^ 0l合物的制備3
按照前述方法，逐步縮合得到中間體(Arg-Ser-Gly-Ile-Tyr)2-Lys-
樹脂，最后用乙醇胺為氨解試劑切除樹脂30倍摩爾量的 H2N-CH2CH2OH/H20/THF(2:l:3，體積比)溶液與1摩爾量的肽樹 脂混合搖動(dòng)24h,收集上清液。于50。C下減壓蒸除THF。殘留液 用50倍體積的蒸餾水稀釋。此溶液經(jīng)C-18濾層過濾。全部濾完 后，用大量蒸餾水、洗濾C-18濾層，直至滴出液呈茚三酮為陰性 反應(yīng)，表明乙醇胺已被洗凈。盡量抽除C-18濾層中的水分，再 用無水Et20洗濾C-18濾層。最后用混合纟容劑HOAc-EtOH( 1:2)洗 脫濾層中的產(chǎn)物，收集洗出液。直至流出液成茚三酮為陰性反應(yīng)。 洗脫液在5(TC下減壓濃縮至千。殘留物經(jīng)EtOAc研磨，使粘稠 物粉末化。過濾收集沉淀，得目標(biāo)化合物。 FAB-MS分析1374.6 [M+H]+
實(shí)施例4.目標(biāo)化^^;t;》ys-隨合物的制備8
由實(shí)施例3 .得到的肽樹脂(Arg-Ser-Gly-Ile-Tyr)2-Lys-樹脂中間體 用乙胺為試劑切除樹脂(詳見制備例4中第7節(jié))。得目標(biāo)化合物。
FAB-MS分析1358 [M+H]+ 實(shí)施例5.目標(biāo)化===-》3-國6合物的制備9
用固相逐步縮合法[見制備例4中第(1) (5)節(jié)]完成雙叉鏈的組裝。 其中，Ida、 Leu、 Asp(tBu)三個(gè)殘基是用Fmoc保護(hù)形式引入， 以防止Asp上的tBu側(cè)鏈保護(hù)基提前被脫除。其余均用Boc保護(hù) 方式。最后以曱胺解方法與制備例4中第(7)節(jié)相同。得目標(biāo)化合 物。
FAB-MS分析1270.6 [M+H]+
實(shí)施例6.目標(biāo)化Hfe:te^》Lys—,-NHMe合物的制備^
依照制備例4中第(1).(2).(4)及(5)節(jié)的方法，首先制得 Fmoc-Lys(Boc-Arg-)- -Ala-樹脂中間體。然后將側(cè)鏈上的Boc脫 除，再與預(yù)制的片段肽Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-OH (制備方法見實(shí)施 例1.)經(jīng)HBTU/NMM法縮合，得到肽樹脂中間體 Fmoc-Lys(Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-), -Ala-樹脂。后者依照制備 例4中第(3)~(7)節(jié)的方法制得目標(biāo)化合物。 ESI-MS分析1376.9 [M+H]+
實(shí)施例7.目標(biāo)化GIU-|le-L=gA^:=-LyS-PAia-NHMe合物的制備ll
依照制備例4中第(1).(2).(勺及(5)節(jié)的方法，首先制備
Fmoc-Lys(HONH2-)- -Ala-樹脂中間體。然后將制備例2種制備 的三肽片段Boc-Arg(Mtr)-Gly-Ida-OH用HBTU/NMM活化，在 與 Lys 側(cè)鏈氨基縮合，得到中間體 Fmoc-Lys[Boc-Arg(Mtr)-Gly-Idal- -Ala-樹脂。后者經(jīng)逐步法先后 與Fmoc-Val-OH及Fmoc-Asp(OtBu)-OH縮合，再與預(yù)制好的片 段肽Fmoc-Glu-Ile-Leu-OH (制備方法制備例3.)進(jìn)行縮合，得 到 雙 叉 肽 中 間 體
Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Val-Lys[Boc隱Arg(Mtr)-Gly-Id a]— -Ala-樹脂，最后依次脫除。tBu、 Mtr及Fmoc基，再經(jīng)曱胺 解切除樹脂，得到目標(biāo)產(chǎn)物。 ESI-MS分析1128.8 [M]+
實(shí)施例8.目標(biāo)化合物的制備12
按照制備例4 中第(1)~(5)節(jié)的方法先制備出 [Fmoc-Asp(OtBu)-Val]2-Lys-樹脂中間體。脫除Fmoc后，再與片 段肽Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Leu-OH (由制備例3制備)縮合，得到 雙叉肽中間體[Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Val]2-Lys-樹 月旨。后者經(jīng)脫除Fmoc后再與Fmoc-Cys(Trt)-OH縮合，得到雙叉 肽中間體[Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)陽Ile-Leu扁Asp(OtBu)-Val]2-Lys-樹脂。對(duì)其脫除Fmoc后，用制備例4中第(6)節(jié)的條件脫除Trt 及tBu基。將肽樹脂與DMSO-DMF(l:l)溶液在室溫中混搖50h， 使形成二硫鍵。最后經(jīng)甲胺解切除樹脂[詳見制備例4中第(7) 節(jié)],得到目標(biāo)化合物。 ESI-MS分析1502.7 [M+H]+
實(shí)施例9.目標(biāo)化t ,, 二。:y "Lys-pAla-NHMe合物的制備14
Tyr-lle-Gly-Ser-Arg
按上迷方法，現(xiàn)制備中間體Fmoc-Lys(Arg)- -Ala-樹脂。其側(cè)鏈 Arg的-氨基再與肽片段Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-OH (由實(shí)施例3 制備)縮合。隨后將Lys的Fmoc基脫除，再經(jīng)逐步法一次與 Fmoc-Arg(Mtr)-OH、 Fmoc-Gly-OH及Boc-Ida-OH縮合，得到 Bco-Ida-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg誦)--Ala- 樹 月旨。后者經(jīng)TFA-EDT-H2O(90:5:5)處理，脫除Boc及Mtr基。最 后經(jīng)10%TEA/EtOAc中和及曱胺解切除樹脂得到目標(biāo)化合物。 ESI-MS分析1135.6 [M+H〗+
1 藥理實(shí)驗(yàn)
本發(fā)明涉及的各化合物經(jīng)過下述的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其生物活性
1、 體外對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲重組基底膜影響實(shí)驗(yàn)
在Transwell小室中，將各合成肽分別與高轉(zhuǎn)移性肺巨細(xì)胞癌PG細(xì) 胞在37°C、 5%(302條件中共育48小時(shí)后，再浸入含趨化因子的溶液 中作用10h。濾膜經(jīng)染色、淋洗，于顯微鏡下計(jì)數(shù)各視野的侵襲細(xì)胞數(shù)。 取平均值，按下公式計(jì)算侵襲抑制率(結(jié)果見表l)-侵襲抑制率(％) = 1『旭藥組侵-表堪胞數(shù)
2、 體內(nèi)黑素瘤肺轉(zhuǎn)移試驗(yàn)
對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)
x ■%
用B,6-F,。高轉(zhuǎn)移黑素腫瘤細(xì)胞接種的C57/BL6近交系小鼠為模型，
10只為一組，先在爪趾接種瘤細(xì)胞，隨后腹腔注射各組的肽化合物， 劑量為lmg/只/天。共25天后解剖動(dòng)物，檢査統(tǒng)計(jì)肺部轉(zhuǎn)移灶。抑制 率由下公式計(jì)算(結(jié)果見表l):
侵襲抑制率(％) = i-^SIfSSS: x ■%
接種對(duì)照組肺瘤灶數(shù) 表i.部分叉聚肽對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的抑制作用
RGD
Y1GSR
RGD RGD
RGD YIGSR
YIGSR YIGSR'
EILOV-曰LOV RSGIY-RSGIY
EILDV-YIGSR
* O-lda
肽結(jié)構(gòu)體外抑制率(％)體內(nèi)抑制率
29.2111
38.7319
:Lys-OMe7.70一
'-Lys-OMe70.3161
^Lys-OMe59.8253
，Lys-NHEt*39.1047
,，Lys-Glyol61.9760
')Lys-pAla-NHMe72.6881
上述結(jié)果表明，①不同活性肽段構(gòu)成的"雞尾酒式"叉聚肽的抗癌侵
潤及抗轉(zhuǎn)移的作用強(qiáng)于均叉肽，更強(qiáng)于非叉的線性肽；②活性差別在 體內(nèi)更明顯。
權(quán)利要求
1、一類化合物，其特征在于，它們具有下列結(jié)構(gòu)通式id="icf0001" file="A2006101144480002C1.gif" wi="133" he="14" top= "39" left = "41" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中，Z1、Z2，相同或不同，Z、Z1、Z2分別獨(dú)立的選自Arg-Gly-X1(X1＝Asp，Ida)X2-X3-Gly-Ser-Arg(X2＝Tyr，3，5二羥基苯甲酰Gly；X3＝Ile，Cys)X4-X5-Leu-X6-Val(X4＝Ida，Glu；X5＝Ile，Cys；X6＝Asp，Ida)其中Glu可以替換為3，5-二羥基苯甲酰Gly、Asp可以替換為Ida、Arg可以替換為Arg(NO2)及上述結(jié)構(gòu)的反序肽段，正序及反序的類似肽段X選自Ala、-Ala或des(缺失)R選自O(shè)H、OCH3、NH2、NHR’(R’＝C1～10烷基)、NH-CH2-CH2-OH。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其特征在于，R選自NHMe、 NHEt、 NHCHMe2、 NHBu。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其特征在于，Z、 Z1、 ZZ分別獨(dú)立的選i)Arg-Gly-AspArg-Gly-IdaIda-Gly-ArgTyr-Ile-Gly- Ser-ArgArg-Ser-Gly-Ile-TyrIda-IIe-Leu-Asp-ValGlu-Ile-Leu-Asp-Val-Glu-Ile-Leu-Ida畫Val3，5-二羥基苯曱酰-Gly-Ile-Leu- Ida-Val。
4、 根據(jù)權(quán)力要求1-3中所述的化合物，其特征在于，所述的化合物選 白<formula>formula see original document page 2</formula><formula>formula see original document page 3</formula>Arg-Gly-Asp—Lys—(3-Ala-NHMe Tyr-lle-Gly-Ser-ArgTyr-lte-Gly-Ser-Arg—Lys—p-Ala-NHMe lda-Gly-Arg 。
5、 一種藥物組合物，其特征在于，含有藥物有效劑量的如權(quán)利要求1-4 所述的任一化合物及藥用栽體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物可 以是片劑、膠囊、丸劑、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給 藥系統(tǒng)。
7 、權(quán)力要求1 - 4中所述的所述的任一化合物在制備抗癌轉(zhuǎn)移藥物組 合中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類以賴氨酸為支架的具有混雙叉鏈結(jié)構(gòu)的叉聚肽化合物；本發(fā)明還公開了這類叉聚肽的制備方法，包括液相片段合成、固相逐步合成、液-固片段組裝合成；含有這類叉聚肽的藥物組合物，體外、體內(nèi)抗癌細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移的活性試驗(yàn)表明這類叉聚肽化合物可抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
文檔編號(hào)C07K2/00GK101177449SQ200610114448
公開日2008年5月14日 申請日期2006年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日
發(fā)明者付招娣, 劉紅巖, 波 施, 楊瀟驍, 王德心, 邱傳亮, 銳 韓, 香 韓, 喜 龔 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所