專利名稱：肽的環(huán)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進(jìn)的二硫鍵推動(dòng)的肽環(huán)化的方法。
背景技術(shù)：
伐普肽(Vapreotide)是包含一個(gè)胱氨酸部分的環(huán)八肽。它是生長(zhǎng)激素釋放的抑制因子的合成類似物，其激素能抑制如胰島素和胰高血糖素(glucagon)的激素分泌，是肥胖和糖類代謝和生長(zhǎng)激素的重要調(diào)節(jié)劑。生長(zhǎng)激素釋放的抑制因子的生理半衰期為3分鐘，而伐普肽由于該類似物的C-末端酰胺化，能維持更長(zhǎng)時(shí)間的循環(huán)。二硫鍵是伐普肽和生長(zhǎng)激素釋放的抑制因子活性的重要參數(shù)。
生長(zhǎng)激素釋放的抑制因子具有以下結(jié)構(gòu) 伐普肽具有下結(jié)構(gòu) Volkmer-Engert等(在肽中形成分子內(nèi)二硫鍵的表面輔助催化(Surface-assisted catalysis of intramolecular disulfide bond formation in peptides)，J.Peptide Res.51，1998，365-369)描述了使用溶解于溶劑，即水中，的氧，在水中由炭催化的氧化形成分子內(nèi)二硫鍵。小心的控制表明氧在水性介質(zhì)中的物理溶解匯合能必要和充分地?fù)?dān)負(fù)炭與氧進(jìn)行氧化。與傳統(tǒng)的沒有催化劑存在下的氣流噴射相比，使用炭顯著并有選擇地加速了分子內(nèi)形成胱氨酸的反應(yīng)速率。
使用炭作為多相催化劑不可避免地需要在溶液而不是樹脂上進(jìn)行這種反應(yīng)。在可應(yīng)用的領(lǐng)域已成為可以廣泛應(yīng)用的方法；但是這種方法對(duì)溶劑系統(tǒng)的某些限制并不適用于每一種肽。
US6476186提出了在痕量炭存在下，在乙腈/水(1∶1)中線型脫保護(hù)的八肽D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(OH)的分子內(nèi)二硫鍵。這種肽是在2-氯三苯甲基樹脂上進(jìn)行合成，并且除了疏水殘基和半胱氨酸外還包含賴氨酸和蘇氨酸。半胱氨酸用酸不穩(wěn)定的三苯甲基保護(hù)。炭催化的環(huán)化是在裂解和脫保護(hù)之后，在水性溶劑混合物，用氫氧化鈉小心調(diào)節(jié)pH至8.0，濃度為50mg/mL中進(jìn)行5小時(shí)。純產(chǎn)物的產(chǎn)率約為80％。
存在的缺陷是，在尋求將同樣方法應(yīng)用于低水溶性的肽酰胺(peptidamide)的非環(huán)化的伐普肽時(shí)，只有在延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)44小時(shí)和在約1mg/mL稀溶液下才能達(dá)到80％分析產(chǎn)率。濃度僅升高到5-10mg/mL，出現(xiàn)離析物沉淀減慢，因此降低產(chǎn)物產(chǎn)率。通過改變pH至6，可以達(dá)到持續(xù)約10mg/mL的高濃度，但也會(huì)形成副產(chǎn)物，因此產(chǎn)率下降至30％。為了達(dá)到有效的工業(yè)規(guī)模工藝，需要更短反應(yīng)時(shí)間和更高的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供使成熟伐普肽的線型肽前體環(huán)化的另一種方法或者改進(jìn)的方法，這種方法避免了現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。本發(fā)明目的通過以下方法達(dá)到，即通過形成分子內(nèi)胱氨酸使線型肽(H)-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp(NH2)環(huán)化，該方法包括所述肽以至少20mg/mL的濃度在極性非質(zhì)子溶劑中，在炭存在下，還有作為堿試劑的伯胺、仲胺或叔胺和氧化劑存在下使所述肽環(huán)化的步驟。
所述肽可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備，可以采用生物技術(shù)，或者通過液相或固相化學(xué)合成制備。固相合成方法例如在Bodansky，M.，肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis)，第2版.柏林Springer Verlag/海德爾堡，1993中描述。C-末端酰胺化可以通過本領(lǐng)域已知的酶的方法或者化學(xué)方法來進(jìn)行，如通過在眾所周知的Sieber或Rink酰胺樹脂上的C-終端連接進(jìn)行樹脂上的固相合成，從樹脂裂解時(shí)產(chǎn)生羧酰胺(carboxamid)。化學(xué)合成通常需要使用對(duì)各氨基酸的保護(hù)基，如本領(lǐng)域常規(guī)了解的?？梢允褂酶鞣N保護(hù)基，如三苯甲基、乙酰氨基甲基-(acm-)、叔丁基、三甲基乙酰氨基甲基、2，4，6-三甲氧基芐基、甲氧基三苯甲基、叔丁基亞磺?；?sulphenyl)來保護(hù)半胱氨酸的殘基。除去這種保護(hù)基需要特定的試劑或者反應(yīng)條件，這取決于所用保護(hù)基的類型。
在合成肽時(shí)最常使用三苯甲基提供簡(jiǎn)單的保護(hù)，然后通過簡(jiǎn)單的酸解如在30-60％TFA中除去該保護(hù)基，同時(shí)除去其它保護(hù)基和樹脂連接物。對(duì)本發(fā)明來說，只需要使用于本發(fā)明方法的將要進(jìn)行環(huán)化的半胱氨酰肽(cysteinylpeptide)具有游離的未保護(hù)的半胱氨酸即可。Atherton等(1985，J.Chem.Perkin Trans.I.，2065)作為枝節(jié)問題所報(bào)道的內(nèi)容可能是有幫助的酸解時(shí)，使用既是清除劑也是酸解促進(jìn)劑的雙功能的公知的清除劑苯硫基甲烷也能導(dǎo)致acm、叔丁基和S-叔丁基亞磺?；Ｗo(hù)的半胱氨酸部分地脫保護(hù)。這樣能夠運(yùn)作本發(fā)明。通過用諸如β-巰基-乙醇或二硫代-蘇糖醇(threitol)的硫醇試劑處理，或者用如三苯基膦或者三乙基膦處理，可以在溫和條件下容易和選擇性地除去S-叔丁基-亞磺?；鶊F(tuán)。
相反，在本領(lǐng)域中，acm-保護(hù)的基團(tuán)通常是通過碘氧化同時(shí)環(huán)化來除去；因此，負(fù)載于碘氧化的acm基團(tuán)脫保護(hù)與本發(fā)明不兼容。
極性非質(zhì)子溶劑優(yōu)選是與水和丙酮混溶的溶劑。按照本發(fā)明，這種類型溶劑的適當(dāng)例子有，如二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基-吡咯烷酮(NMP)、乙酰胺或四氫呋喃(THF)。不用說，本文中合適的溶劑必須能夠使肽濃度達(dá)到至少20mg/mL。因此，乙腈并不是適合本發(fā)明的溶劑，如實(shí)驗(yàn)部分的比較例所示。
溶劑優(yōu)先選自以下組乙酰胺、二甲基甲酰胺和N-甲基-吡咯烷酮。更優(yōu)選，溶劑選自二甲基甲酰胺和N-甲基-吡咯烷酮。最優(yōu)選的溶劑是二甲基甲酰胺。
堿優(yōu)選是弱堿，其共軛pKa為7.5-10，是仲胺，更優(yōu)選是空間位阻叔胺。更優(yōu)選的例子是Hunig-堿(N，N-二異丙基乙胺)、N，N′-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶或N-烷基-嗎啉，所述烷基是直鏈或支鏈的C1-C4烷基，更優(yōu)選是N-甲基嗎啉或三甲基吡啶(2，4，6-三甲基吡啶)，最優(yōu)選是三甲基吡啶。
氧化劑優(yōu)選空氣和/或氧。從現(xiàn)有技術(shù)的水性溶劑體系改變到本發(fā)明的非水性溶劑體系時(shí)，優(yōu)選能夠至少在一定時(shí)間內(nèi)，通過主動(dòng)供給或者通過從浸沒在溶劑中的氣體噴頭導(dǎo)出穩(wěn)定的或隨時(shí)間變化的空氣流，通風(fēng)供給溶劑液體與空氣和/或氧氣，來確保催化劑被氧飽和。任選地，可以采用攪拌產(chǎn)生的強(qiáng)渦流與相對(duì)于該渦流優(yōu)選的液相長(zhǎng)寬比，以避免只有局部混合，具有可能適當(dāng)?shù)男螤钊鐦~形或珠粒形的攪拌器或攪拌裝置。
炭或活性炭可以是和現(xiàn)有技術(shù)使用的系統(tǒng)相同的類型；優(yōu)選使用至少催化劑量。不用說，反應(yīng)速率同時(shí)受到存在的催化劑量和離析物濃度的影響，后者提高了多相催化劑的固體表面從溶液中吸收或負(fù)載半胱氨酰-肽的速率或者量。然而，根據(jù)本發(fā)明，溶劑的選擇對(duì)有效催化有很大影響。此外，觀察到(不希望受到這些觀察結(jié)果或任何相關(guān)理論的嚴(yán)重影響)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)不僅取決于溶劑體系，而且與離析物的量有關(guān)當(dāng)離析物量增加到1-100mg/mL范圍時(shí)，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)發(fā)生形狀上完全令人驚奇的變化，并且線型程度更高，而非為S形曲線。某些仍未報(bào)道的在固-液相界的過渡現(xiàn)象可說明這種情況。結(jié)果，100％轉(zhuǎn)化率一定程度等于通過提高離析物濃度在明顯縮短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)所能達(dá)到的提高了的產(chǎn)物產(chǎn)率。過去，在使用炭催化的氧化反應(yīng)時(shí)一直未能說明。因此，根據(jù)本發(fā)明，反應(yīng)中可加入至少20mg/mL，優(yōu)選50mg/mL，更優(yōu)選100mg/mL的半胱氨酰肽-前體(H)-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp(NH2)。該上限當(dāng)然是由最大溶解度確定。
環(huán)化反應(yīng)可以在約0-80℃的溫度范圍，優(yōu)選5-60℃，更優(yōu)選15-40℃的溫度回流條件下進(jìn)行，并且優(yōu)選結(jié)合使用空氣/氧作為氧化劑。
實(shí)驗(yàn)1.合成(H)-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-VaI-Cys-Trp(NH2)采用Fmoc標(biāo)準(zhǔn)方法，在Sieber樹脂上合成線型肽。側(cè)鏈保護(hù)基D-oderL-Trp(Boc)、Cys(Trt)、Lys(Boc)、Tyr(tBu)。保護(hù)的肽在5％TFA的二氯甲烷中分解，然后，室溫，通過在300eq.(eq.＝體積份)濃TFA、12eq.二硫蘇糖醇、12.eq.二氯甲烷、50eq.水(acqua dest.)的分解混合物中酸解1小時(shí)，完全脫保護(hù)。產(chǎn)物通過添加甲基-叔丁基醚進(jìn)行沉淀，以完全除去產(chǎn)物(H)-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp(NH2)中的Boc基，純度由HPLC證實(shí)。
所有環(huán)化反應(yīng)都在25℃進(jìn)行。下式I的伐普肽產(chǎn)物可以通過將反應(yīng)混合物直接加入到反相HPLC中進(jìn)行純化。
2.比較例(H)-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp(NH2)環(huán)化實(shí)驗(yàn)1的產(chǎn)物基本按照US6476186所述進(jìn)行炭法，使用乙腈∶水(1∶1)，除了線型半胱氨酰肽濃度為1mg/mL，用氨調(diào)節(jié)pH至約8，攪拌條件下，向該液體再噴射低壓空氣。44小時(shí)后，達(dá)到100％轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)物從反應(yīng)混合物中經(jīng)快速HPLC純化后，分析產(chǎn)率為84％(w/w)。過去發(fā)現(xiàn)最高10mg/mL的較高濃度會(huì)不穩(wěn)定，離析物在短時(shí)間后沉淀。通過提高乙腈∶水的比例至3-2∶1，肽溶解度仍未明顯提高，而在1mg/mL條件下的反應(yīng)時(shí)間增加了50-100％，同時(shí)降低了純度(產(chǎn)率74％(w/w))。
3.比較例(H)-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp(NH2)環(huán)化重復(fù)實(shí)施例2的反應(yīng)，唯一的差別是使用氨/NH4Cl來調(diào)節(jié)pH至6，并溶解半胱氨酰肽為10mg/mL。70小時(shí)后，轉(zhuǎn)化率達(dá)到80％，但產(chǎn)物純度較低。產(chǎn)物I的產(chǎn)率為31％。
4.(H)-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp(NH2)環(huán)化使用痕量活化的粉末炭，對(duì)實(shí)驗(yàn)1的產(chǎn)物進(jìn)行所述炭法，線型半胱氨酰肽濃度為50mg/mL(1eq.)，在二甲基甲酰胺中，1eq.二異丙基乙胺存在下，攪拌條件下再噴射低壓空氣。
15-20小時(shí)后，達(dá)到100％轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)物I的分析產(chǎn)率為79％。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次，具有相同的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.通過形成分子內(nèi)胱氨酸使線型肽(H)-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp(NH2)環(huán)化的方法，該方法包括步驟使所述肽以至少20mg/mL的濃度在極性非質(zhì)子溶劑中，在炭存在下，還有作為堿試劑的伯胺、仲胺或叔胺以及氧化劑存在下，進(jìn)行環(huán)化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述炭至少以催化量存在。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化劑是空氣和/或氧。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在反應(yīng)期間向反應(yīng)提供空氣和/或氧。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，反應(yīng)器具有將空氣和/或氧直接導(dǎo)入液體的裝置，優(yōu)選包括在反應(yīng)器底部和/或壁上的多個(gè)孔，或包括至少一個(gè)浸沒的氣體噴頭，通過所述的裝置或噴頭，將空氣直接鼓泡入溶劑中。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述極性非質(zhì)子溶劑是選自以下組溶劑與水和丙酮都可混溶的溶劑，優(yōu)選自二甲基甲酰胺或N-甲基-吡咯烷酮。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述溶劑是二甲基甲酰胺。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽的濃度至少為50mg/mL，優(yōu)選所述溶劑是二甲基甲酰胺，所述肽的濃度至少為100mg/mL。
全文摘要
公開一種通過形成胱氨酸使肽(H)－D－Phe－Cys－Tyr－D－Trp－Lys－Val－Cys－Trp(NH2)環(huán)化的改進(jìn)方法。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101068834SQ200580038049
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月1日
發(fā)明者F·夸屈尼, S·瓦瑞, O·韋爾比茨基, T·賽特 申請(qǐng)人:隆薩股份公司