抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒；所述試劑盒包括試劑R1、試劑R2、標準品和標準品稀釋液；所述試劑R2是將CCP抗原膠乳顆粒用含第一穩(wěn)定劑20～500mmol/L和防腐劑1～10‰的50mM?Tirs緩沖液洗滌分散制備而得；所述CCP抗原膠乳顆粒是由CCP抗原與聚苯乙烯膠乳微球發(fā)生化學交聯(lián)并封閉后形成。本發(fā)明的試劑盒采用乳膠增強免疫比濁法檢測抗CCP抗體含量，靈敏度高，穩(wěn)定性好，檢測快速，從測定開始到得出結(jié)果僅需5～10分鐘；能夠在常規(guī)生化儀上進行大批量樣本測定，大大提高了檢測工作效率。
【專利說明】抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及乳膠增強免疫比濁法技術，具體涉及一種抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒。

【背景技術】
[0002]抗環(huán)瓜氨酸肽抗體是風濕自身抗體系統(tǒng)的一種，類風濕關節(jié)炎(RA)具有高特異性的瓜氨酸相關自身抗體系統(tǒng)包括AKA、APF、AFA、抗CCP抗體，這些抗體對早期RA診斷具有較好的特異性，類風濕關節(jié)炎(RA)是一種常見的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以關節(jié)滑膜炎癥以及對稱性、破壞性的關節(jié)病變?yōu)橹饕R床特征，其病程長，易反復，給患者造成很大痛苦。該病在我國的發(fā)病率約為0.4%，全球為0.5?1.0%，患者發(fā)病年齡多在20?50歲，女性多于男性，男女之比為1: 3。
[0003]抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(CCP)是環(huán)狀聚絲蛋白的多肽片段，是以IgG型為主的抗體，對類風濕性關節(jié)炎(RA)具有很好的敏感性和特異性，且抗CCP抗體陽性的RA病人骨破壞較抗CCP抗體陰性者嚴重。類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種常見的慢性自身免疫性疾病。在全世界大約有I %的人罹患此病。RA能引起關節(jié)的疼痛、僵直及腫脹。在發(fā)病2年內(nèi)即可能出現(xiàn)不可逆的骨關節(jié)損傷，并可引起多種并發(fā)癥，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心包炎、淋巴腺炎等。因此，及早診斷RA及給予緩解病情的藥物治療，對控制病情非常重要。1998年，國外，首次報道的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(ant1-cyclic cirullinated peptideantibodies,抗CCP抗體)的檢測，對RA具有較高的敏感性和特異性，是RA新的血清標志物。
[0004]研究表明，在RA患者的血清中可以檢測到抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗體(AKA)，其抗原位點是環(huán)瓜氨酸多肽(CCP)。該肽段是在肽基精氨酸脫亞胺酶的催化下，由蛋白中的精氨酸轉(zhuǎn)化而成。由于CCP可以通過人工合成，對RA的診斷具有較高的敏感性和特異性，而且抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體的檢測較APF和AKA檢測具有一定的優(yōu)越性，因此抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體的檢測對與RA的診斷具有重要意義。
[0005]一、間接免疫熒光法
[0006]該法的基本原理是用特異性的抗體與載玻片中的抗原結(jié)合后形成抗原抗體復合物，繼用熒光抗體與抗原抗體復合物結(jié)合，形成抗原抗體熒光復合物。在熒光顯微鏡下，根據(jù)復合物的發(fā)光情況來確定所檢測的抗體。該方法評價:由于結(jié)合在抗原抗體復合物上的熒光抗體增多，發(fā)出的熒光亮度強，因而其敏感性強。但是其不足也是明顯的:
[0007](I)在分析結(jié)果時無法根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別；
[0008](2)操作相對復雜，需要價格較昂貴的熒光顯微鏡，在很多基層醫(yī)院難以推廣，也不太適用于標本量較多的實驗室；
[0009](3)熒光測定中的本底較高，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難；
[0010](4)結(jié)果判定需要有經(jīng)驗的專業(yè)人員，分析結(jié)果的客觀性不足；
[0011](5)只能進行定性檢測，不能進行定量測定。
[0012]二、放射免疫分析法
[0013]放射免疫分析法是利用同位素標記的與未標記的抗原，同抗體發(fā)生競爭性抑制反應，是一種在無須采用生物測定方法的情況下用于檢測抗原的實驗室測定方法。該法極其敏感而又極其特異，但其卻需要具備尖端復雜的設備，且成本也不低。同時，還需要特殊的預防措施，因為其要用到放射性物質(zhì)。因此，如今放射免疫分析法在很大程度上已經(jīng)被ELISA所取代。
[0014]三、免疫印跡法
[0015]免疫印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。其不足之處在于:
[0016](I)只能進行定性和半定量分析，無法得出被檢物質(zhì)具體的量。
[0017](2)操作步驟繁瑣，試驗用時較長。
[0018](3)檢測的靈敏度還有待提聞。
[0019]四、酶聯(lián)免疫吸附法
[0020]酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)被廣泛應用于檢測抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體，但該方法也存在著下述的不足之處:
[0021]酶聯(lián)免疫法自動化程度不高，且受人為因素影響較大；放射免疫法存在著環(huán)境污染問題；而化學發(fā)光法靈敏度雖高，但測定線性范圍較小且檢測成本較高，需要特定化學發(fā)光檢測儀，這些原因?qū)е缕鋺梅秶^小。
[0022]乳膠增強免疫比濁法也是測定血清中CCP濃度的常用方法，與其他幾種方法相比較，存在操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬、無污染、應用范圍廣等顯著的特點。因此，膠乳免疫比濁法有著極大的研究價值，但是目前市場上的乳膠增強免疫比濁法檢測試劑盒抗干擾能力差、特異性低、試劑穩(wěn)定性不好、試劑本底太高或檢測線性范圍窄等問題，有待改進。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒。本發(fā)明通過抗CCP抗原與膠乳微球偶聯(lián)，采用膠乳增強比濁法來測定人體血清CCP抗體的含量，運用該方法的試劑應具有操作簡單，準確度高，重復性好，靈敏度高，且能夠在全自動生化分析儀或者特種蛋白儀以及分光光度計上使用。
[0024]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0025]本發(fā)明涉及一種抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，所述試劑盒包括試劑R1、試劑R2、標準品和標準品稀釋液；所述試劑R2是將CCP抗原膠乳顆粒用含第一穩(wěn)定劑20?500mmol/L和防腐劑I?10%。的50mmol/LTirs緩沖液洗滌分散制備而得；所述CCP抗原膠乳顆粒是由CCP抗原與聚苯乙烯膠乳微球發(fā)生化學交聯(lián)并封閉后形成。
[0026]優(yōu)選的，所述CCP抗原膠乳顆粒是通過包含如下步驟的方法制備而得:
[0027]A、將抗CCP抗原在pH值為4.0?6.0的20mmol/L MES溶液中進行活化；
[0028]B、將步驟A所得溶液用PBS (磷酸鹽)緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至6.1，加入粒徑為50?500nm的羧化改性聚苯乙烯膠乳微球溶液，在37°C孵育2?4小時；
[0029]C、將步驟B所得溶液用pH值為7.0?8.5的封閉液在37°C封閉5個小時以上；
[0030]D、將步驟C所得溶液經(jīng)離心或過濾后，取沉淀，即得所述CCP抗原膠乳顆粒。
[0031]優(yōu)選的，所述CCP抗原選自天然抗原、基因重組抗原、化學合成抗原或多肽中的一種或幾種。
[0032]優(yōu)選的，所述羧化改性聚苯乙烯膠乳微球為核殼結(jié)構，所述殼層為苯乙烯、丙烯酸正丁酯、甲基苯烯酸形成的共聚物，所述核層為苯乙烯聚合物。
[0033]優(yōu)選的，所述試劑R2中的第一穩(wěn)定劑選自無關蛋白、無機鹽、表面活性劑、助懸劑和抗氧化劑中的一種或多種。
[0034]更優(yōu)選的，所述試劑R2中的無關蛋白選自牛血清白蛋白或明膠。
[0035]更優(yōu)選的，所述試劑R2中的無機鹽選自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、醋酸鈉和醋酸鉀中的一種或多種。
[0036]更優(yōu)選的，所述試劑R2中的表面活性劑選自陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或非離子表面活性劑。該表面活性劑能夠吸附在膠乳顆粒的表面，降低膠乳顆粒表面張力，使膠乳顆粒不易聚集，有效提高膠乳顆粒在溶液中的穩(wěn)定性。
[0037]更優(yōu)選的，所述試劑R2中的助懸劑選自乙二醇、丙三醇或麥芽糖。
[0038]更優(yōu)選的，所述試劑R2中的抗氧化劑選自2，6_ 二叔丁基對甲酚、叔丁基對羥基茴香醚、掊酸丙酯中的一種或幾種。
[0039]優(yōu)選的，所述試劑R2中的防腐劑選自山梨酸鈉、苯甲酸鈉、疊氮化鈉、亞硝酸鈉、硫柳汞、苯酚、PC300中的一種或幾種。
[0040]優(yōu)選的，
[0041]所述試劑Rl含pH = 7.0?7.6的緩沖液20?500mmol/L、表面活性劑50?300mmol/L、螯合劑5?100mmol/L、助懸劑5?200ml/L、加速劑5?500mmol/L和防腐劑I ?10%0 ；
[0042]所述標準品是將含98?105U/ml抗環(huán)瓜氨酸肽抗體、I?30mg/ml緩沖液、15?120mol/L第二穩(wěn)定劑、2?30mg/ml賦形劑和I?5%。防腐劑的混合溶液經(jīng)分裝凍干而成；
[0043]所述標準品稀釋液含磷酸氫二鈉2.6g/L、磷酸二氫鈉4.8g/L、氯化鈉5?25mmol/L ;螯合劑10?60mmol/L，BSA(牛血清白蛋白)0.5?2%、蔗糖0.5?2.5%和防腐劑I?
10%o。
[0044]優(yōu)選的，所述試劑Rl中的緩沖液選自Tirs (三羥甲基氨基甲烷)、MES (2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)、磷酸鹽、MOPSO (3- (N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸)、DIPS0 (3_[N_N_雙(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸)中的一種或幾種。
[0045]優(yōu)選的，所述試劑Rl中的表面活性劑選自陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或非離子表面活性劑。
[0046]優(yōu)選的，所述試劑Rl中的螯合劑選自乙二胺四乙酸二鈉、二乙基三胺五乙酸或乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸。
[0047]優(yōu)選的，所述試劑Rl中的助懸劑選自乙二醇、丙三醇或麥芽糖。采用乙二醇、丙三醇、麥芽糖等作為一種助懸劑，可以提高溶液的密度和粘度，使標準品中的膠乳顆粒能夠長期懸浮在溶液中不會沉降而起到很好的穩(wěn)定作用。
[0048]優(yōu)選的，所述試劑Rl中的加速劑選自PEG (乙二醇)200-10000或葡聚糖4000-12000中的一種或幾種。更優(yōu)選加速劑濃度為250?500mmol/L。
[0049]優(yōu)選的，所述試劑Rl中的防腐劑選自山梨酸鈉、苯甲酸鈉、疊氮化鈉、亞硝酸鈉、硫柳汞、苯酚、PC300中的一種或幾種。
[0050]優(yōu)選的，所述標準品中的緩沖液選自Tirs (三羥甲基氨基甲烷)、MES (2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)、磷酸鹽、MOPSO (3- (N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸)、DIPSO (3- [N-N-雙(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸)中的一種或幾種。
[0051 ] 優(yōu)選的，所述標準品中的第二穩(wěn)定劑選自無關蛋白和無機鹽。
[0052]更優(yōu)選的，所述標準品中的無關蛋白選自牛血清白蛋白或明膠。
[0053]更優(yōu)選的，所述標準品中的無機鹽選自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、醋酸鈉和醋酸鉀中的一種或多種。
[0054]優(yōu)選的，所述標準品中的賦形劑選自蔗糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷、乳糖、麥芽糖中的一種或幾種。
[0055]優(yōu)選的，所述標準品中的防腐劑選自山梨酸鈉、苯甲酸鈉、疊氮化鈉、亞硝酸鈉、硫柳汞、苯酚、PC300中的一種或幾種。
[0056]優(yōu)選的，所述標準品稀釋液中的螯合劑選自乙二胺四乙酸二鈉、二乙基三胺五乙酸或乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸。
[0057]優(yōu)選的，所述標準品稀釋液中的防腐劑選自山梨酸鈉、苯甲酸鈉、疊氮化鈉、亞硝酸鈉、硫柳汞、苯酚、PC300中的一種或幾種。
[0058]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0059]所述試劑R2組成中的羧化改性聚苯乙烯膠乳微球，是一種核殼形式的膠乳，膠乳核是苯乙烯聚合物，乳殼是苯乙烯，丙烯酸正丁酯，甲基苯烯酸形成的共聚物；本試劑盒采用苯乙烯聚合物形成的微球，具有高的折光系數(shù)和化學惰性，在其表面吸附或交聯(lián)抗體或抗原，用免疫比濁法的原理檢測樣本中抗體或抗原的濃度，可以增加散射光和透射光的變化強度，從而提高檢測靈敏度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯:
[0061]圖1為2種不同含量的CCP參考標準的標準曲線，每個點代表不同含量CCP的參考標準，其中X軸表示CCP的含量，Y軸表示吸光度；
[0062]圖2為對本試劑盒的線性范圍驗證示意圖；其中X軸表示的是本發(fā)明試劑實際測試結(jié)果，Y軸表示的是稀釋理論濃度，相關系數(shù)為R2 = 0.9981，回歸方程為y =1.0327x+0.5524 ；
[0063]圖3分別采用本發(fā)明試劑和武漢康珠公司的CCP乳膠增強免疫比濁法試劑，采用日立全自動生化分析儀對50份人血清(包含正常和異常標本)按各自參數(shù)同時進行測定，對測定值進行相關分析的示意圖；其中X軸表示的是本發(fā)明試劑測定的病人血清結(jié)果，Y軸表示的是某知名公司試劑測定的病人血清結(jié)果，相關系數(shù)R2 = 0.9951，回歸方程為y =
0.9911X+0.9066。

【具體實施方式】
[0064]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。以下實施例中的原料均為現(xiàn)有常用原料，可以直接通過商家購買獲得。本發(fā)明以下實施例中沒有特別說明的操作，均可以采用現(xiàn)有常規(guī)技術手段。
[0065]實施例1
[0066]本實施例的CCP檢測試劑盒包括試劑Rl、試劑R2、標準品和標準品稀釋液；其制備具體如下:
[0067]試劑Rl:
[0068]
pH7.4MES 緩沖液100mmol./L
葡聚糖 4000250mmol/L
乙二胺四乙酸二納100mmol/L
氯化鈉200mmol/L
甘油5ml/L
NaN31%
[0069]各種成分可以室溫下依次添加，密封保存，備用。
[0070]試劑R2:
[0071]所述CCP抗原的膠乳試劑的制備包括以下步驟。
[0072]步驟1:將抗CCP抗原在pH值為5.0?5.5的20mM MES溶液中進行活化；
[0073]步驟2:將步驟I所得溶液用PBS溶液調(diào)節(jié)pH至6.1，加入粒徑為100?300nm的羧化改性聚苯乙烯膠乳微球溶液，在37°C孵育2?3小時；
[0074]步驟3:將步驟2所得溶液用pH值為7.0?7.5的50mM Tris在37°C封閉5個小時以上；
[0075]步驟4:將步驟3所得溶液經(jīng)離心或過濾后，取沉淀，即CCP抗原膠乳顆粒；
[0076]步驟5:將CCP抗原膠乳顆粒用含第一穩(wěn)定劑(BSA) 200?250mmol/L和防腐劑(NaN3) 3?4%。的50mM Tirs緩沖液洗滌分散即得試劑R2。
[0077]CCP標準品的制備:
[0078]將CCP用標準品稀釋液稀釋濃度至98?105U/ml的重組蛋白溶于30mg/mlBSA、30mg/ml甘露醇、mol/L氯化鈉、1%。疊氮化鈉,混合均勻。以0.5ml/瓶分裝進行凍干，即得CCP標準品的凍干粉。取10瓶用0.5ml的純化水復溶，作為樣本用武漢康珠公司的CCP乳膠增強免疫比濁法試劑，每瓶重復測試3次，計算總均值即為標識值，濃度為100.26U/ml。
[0079]CCP標準品的凍干粉用0.5ml的純化水復溶，即可得到濃度為100U/ml的，并用純化水稀釋為不同濃度的標準品(5U/ml、100U/ml)。
[0080]上述標準品稀釋液含磷酸氫二鈉2.6g/L、磷酸二氫鈉4.8g/L、氯化鈉5?1mmol/L ;乙二胺四乙酸二鈉10?20mmol/L，BSA(牛血清白蛋白)0.5?1%、蔗糖0.5?1.0 %和疊氮化鈉I?3%。。
[0081]實施例2
[0082]將實施例1描述的CCP檢測試劑盒，適用于各種類型的全自動生化儀，以日立7170全自動生化儀為例，其操作如表1。分析方法:兩點終點法，即試劑Rl ；R2的用量分別為150ul 和 50ul，樣本量 5ul。
[0083]采用本試劑及上述測定方法，采用日立7170生化分析儀測得的2種不同含量的CCP標準品(自制)的曲線(如圖1所示)，每個點代表一個含量的參考標準品，其中X軸表示CCP含量(U/ml) ；Y軸表示吸光度。
[0084]表1
[0085]

【權利要求】
1.一種抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括試劑R1、試劑R2、標準品和標準品稀釋液；所述試劑R2是將CCP抗原膠乳顆粒用含第一穩(wěn)定劑20?500mmol/L和防腐劑I?10%。的50mmol/L Tirs緩沖液洗滌分散制備而得；所述CCP抗原膠乳顆粒是由CCP抗原與聚苯乙烯膠乳微球發(fā)生化學交聯(lián)并封閉后形成。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述CCP抗原膠乳顆粒是通過包含如下步驟的方法制備而得: A、將抗CCP抗原在pH值為4.0?6.0的20mmol/L MES溶液中進行活化； B、將步驟A所得溶液用PBS溶液調(diào)節(jié)pH至6.1，加入粒徑為50?500nm的羧化改性聚苯乙烯膠乳微球溶液，在37°C孵育2?4小時； C、將步驟B所得溶液用pH值為7.0?8.5的封閉液在37°C封閉5個小時以上； D、將步驟C所得溶液經(jīng)離心或過濾后，取沉淀，即得所述CCP抗原膠乳顆粒。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述CCP抗原選自天然抗原、基因重組抗原、化學合成抗原或多肽中的一種或幾種。
4.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述羧化改性聚苯乙烯膠乳微球為核殼結(jié)構，所述殼層為苯乙烯、丙烯酸正丁酯、甲基苯烯酸形成的共聚物，所述核層為苯乙烯聚合物。
5.根據(jù)權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑R2中的第一穩(wěn)定劑選自無關蛋白、無機鹽、表面活性劑、助懸劑和抗氧化劑中的一種或多種。
6.根據(jù)權利要求1?5中任一項所述的檢測試劑盒，其特征在于， 所述試劑Rl含pH = 7.0?7.6的緩沖液20?500mmol/L、表面活性劑50?300mmol/L、螯合劑5?100mmol/L、助懸劑5?200ml/L、加速劑5?500mmol/L和防腐劑I?10%0; 所述標準品是將含98?105U/ml抗環(huán)瓜氨酸肽抗體、I?30mg/ml緩沖液、15?120mol/L第二穩(wěn)定劑、2?30mg/ml賦形劑和I?5%。防腐劑的混合溶液經(jīng)分裝凍干而成； 所述標準品稀釋液含磷酸氫二鈉2.6g/L、磷酸二氫鈉4.8g/L、氯化鈉5?25mmol/L ；螯合劑10?60mmol/L, BSA0.5?2%、蔗糖0.5?2.5%和防腐劑I?10%0。
7.根據(jù)權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑R1、標準品中的緩沖液分別選自打1^、1^5、磷酸鹽、1?^50、01?50中的一種或幾種；螯合劑分別選自乙二胺四乙酸二鈉、二乙基三胺五乙酸或乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸。
8.根據(jù)權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl中的表面活性劑選自陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或非離子表面活性劑；助懸劑選自乙二醇、丙三醇或麥芽糖；加速劑選自PEG200-10000、葡聚糖4000-12000中的一種或幾種。
9.根據(jù)權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑R1、試劑R2、標準品、標準品稀釋液中的防腐劑分別選自山梨酸鈉、苯甲酸鈉、疊氮化鈉、亞硝酸鈉、硫柳汞、苯酚、PC300中的一種或幾種。
10.根據(jù)權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述標準品中的第二穩(wěn)定劑選自無關蛋白和無機鹽，賦形劑選自蔗糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷、乳糖、麥芽糖中的一種或幾種。
【文檔編號】G01N33/544GK104198725SQ201410401284
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月14日 優(yōu)先權日:2014年8月14日
【發(fā)明者】李偉奇, 趙小鳳, 房君江, 張秀文, 林清玉 申請人:上海?？瞪锟萍加邢薰?br>