專利名稱：高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單體生物堿的制備方法，尤其涉及一種高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法。
背景技術(shù)：
浙貝母為百合科貝母屬的一種多年生草本植物，其鱗莖具有清熱化痰，止咳，開郁，散結(jié)之功效，用于熱痰咳嗽，肺癰，乳癰，痰核等多種疫病，為中藥臨床方劑常用飲片。其飲片品種有大貝，珠貝，浙貝片三種。浙貝母中的有效成分為甾體類生物堿類及其苷。主要有浙貝堿(貝母素甲，verticine，peimine)、去氫浙貝堿(貝母素乙，verticinone，peiminine)以及微量的貝母新堿(peimisine)、貝母芬堿(peimiphine)、貝母定堿(peimidine)、貝母替定堿(peimitidine)。此外，尚含有甾苷類生物堿貝母堿苷(peimirnoside)，一種甾醇類中性物質(zhì)原貝母素(propeimin)。浙貝母中的生物堿為止咳，化痰和平喘等作用的有效成分，而貝母素甲的鹽酸鹽在一定濃度下，對耐藥金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)作用，主要通過抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上的主動外排泵來發(fā)揮作用。且近年來研究表明，貝母素乙具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥活性。
結(jié)構(gòu)式如下
R＝α-OH，β-H R’＝H浙貝堿(貝母素甲，verticine，peimine)R＝O R’＝H去氫浙貝堿(貝母素乙，verticinone，peiminine)R＝α-OH，β-H R’＝-D-葡萄糖 貝母堿苷(peiminoside)從貝母素甲和貝母素乙的結(jié)構(gòu)式可以看出兩者均屬于甾體生物堿，具有異膽甾烷(C27)的骨架，含有六個環(huán)，其中A，B，D，E，F(xiàn)為六元環(huán)，C為五元環(huán)。氮原子位于E、F環(huán)連接處，兩者均為季胺堿。
貝母素甲的分子式C27H45NO3，物化特性熔點(diǎn)222-224℃，溶于氯仿，甲醇，乙醇，乙酸乙酯。
貝母素乙的分子式C27H43NO3，物化特性熔點(diǎn)212-214℃，溶于氯仿，甲醇，乙醇，乙酸乙酯。
由于浙貝母中貝母素甲和貝母素乙的結(jié)構(gòu)十分相似，加上二者在浙貝母中的含量很低(＜0.08％)，給分離帶來了較大的困難。傳統(tǒng)的單體生物堿的分離多是采用如下方法先用有機(jī)溶劑，如乙醇提取獲得粗提物，此粗提物中含有大量其他雜質(zhì)，貝母素甲和貝母素乙含量均較低，粗提物還需用酸水溶解、過濾，后用有機(jī)溶劑，如石油醚，乙酸乙酯萃取，經(jīng)過硅膠柱層析得到單體的生物堿。這種方法操作復(fù)雜，步驟冗長，樣品吸附損耗大。張建興等通過柱層析的方法分離制備得到貝母素甲和貝母素乙，回收率低于1％。
高速逆流色譜技術(shù)(High Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新型液-液色譜分離方法。其原理是利用螺旋柱在行星運(yùn)動時產(chǎn)生的離心力，使互不相溶的兩相不斷混合，同時保留其中的一相(固體相)，利用恒流泵連續(xù)輸入另一相(流動相)，隨流動相進(jìn)入螺旋柱的溶質(zhì)在兩相之間反復(fù)分配，按分配系數(shù)的次序，被依次洗脫。在流動相中分配比例大的先被洗脫，反之，在固體相中分配比例大的后被洗脫。不同于傳統(tǒng)液相色譜法，HSCCC分析方法不使用固相載體，因而避免了有效成分被固相載體的不可逆吸附和峰形拖尾等缺點(diǎn)；樣品粗提物可直接進(jìn)樣分離，可以高效、快速和大制備量分離，分離純化與制備可同步完成，有機(jī)溶劑消耗少，無損失、無污染?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，HSCCC色譜儀無論是作為分析型儀器還是制備型儀器，在天然產(chǎn)物上具有廣闊的開發(fā)前景和實(shí)際的應(yīng)用意義，它可以從復(fù)雜的天然粗制品中提取不同特性的有效成分，為天然藥物的發(fā)展提供了有利條件。目前，國內(nèi)外學(xué)者利用HSCCC已經(jīng)成功地分離提取天然藥物中黃酮、生物堿、蒽醌類衍生物、皂甙等有效成分。
目前，還沒有利用HSCCC分離浙貝母飲片中的有效成分-貝母素甲和貝母素乙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其克服了固態(tài)支持物或載體不可逆吸附、損耗和變性，使分離回收率提高，且節(jié)約溶劑、操作簡便。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明一種高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其采用高速逆流色譜技術(shù)，包括以下步驟制備浙貝母粗提物作為進(jìn)樣物；配置構(gòu)成固定相和流動相的溶劑系統(tǒng)；固定相和流動相同時泵入柱內(nèi)；主機(jī)轉(zhuǎn)動，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，檢測洗脫溶劑，接收目標(biāo)組分，收集得到產(chǎn)品。所述的溶劑系統(tǒng)為三組分溶劑系統(tǒng)，A組分可選氯仿、四氯甲烷等氯代烷烴；B組分可選甲醇、乙醇、丙酮等脂肪醇或脂肪酮；C組分為稀鹽酸、稀磷酸等稀酸性溶液。優(yōu)選氯仿-乙醇-稀鹽酸溶劑體系。
所述的溶劑系統(tǒng)各組分氯代烷烴，脂肪醇或脂肪酮，稀酸性溶液的體積比為(2-6)∶(1-4)∶2，例如3∶2∶2，4∶3∶2，4∶1.5∶2等，優(yōu)選3∶2∶2。
所述稀酸性溶液的濃度在0.05-0.5mol/l之間，例如0.1mol/l，0.2mol/l等。優(yōu)選0.2mol/l。
所述固定相和流動相同時泵入柱內(nèi)時，控制固定相保留值為0.4-0.8。
主機(jī)轉(zhuǎn)速和流動相流速需要控制在一定的范圍內(nèi)，按體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻靜置分層。待平衡一定時間后，將上相(固定相)和下相(流動相)分開，采用TBE-300A高速逆流色譜儀，該機(jī)型柱體積為119ml，進(jìn)樣圈為10ml，配有AKTA purifier P-900泵，ELSD(蒸發(fā)光散射檢測儀)。采用AKTA purifier P-900雙泵同時泵入固定相和流動相，使其充滿整個柱子，然后轉(zhuǎn)動主機(jī)，控制主機(jī)轉(zhuǎn)速在500-999r/min，單獨(dú)泵入流動相，控制流動相流速在0.5-3mL/min。優(yōu)選主機(jī)轉(zhuǎn)速為800r/min，流動相流速為1.2mL/min。
本發(fā)明適合溫度15-30℃，在上述溫度范圍內(nèi)，溫度較低時，ELSD(蒸發(fā)光散射檢測儀)檢測的出峰時間略有提前，分離效率變化不大，對峰形無多大影響。
本發(fā)明制備步驟包括有一個體系。經(jīng)過體系的一次分離后收集到的貝母素甲和貝母素乙的餾分蒸干、氯仿溶解后，經(jīng)水洗三次，可得到貝母素甲和貝母素乙的白色固體。經(jīng)高效液相色譜(HPLC)檢測，純度均在95％以上。
本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明采用的高速逆流色譜分離技術(shù)，是一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液-液分配色譜分離技術(shù)，它克服了固態(tài)支持物或載體不可逆吸附、損耗和變性，使被分離物回收率高，理論達(dá)100％，本發(fā)明實(shí)際達(dá)到99％以上。又因?yàn)椴捎脙?yōu)選的溶劑體系，控制溫度、調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速和流動相流速等工藝條件，可以高效率的分離，獲得高純度的單體生物堿(貝母素甲、貝母素乙分別達(dá)到98％，95％)。并且適合從各種工藝途徑制備的浙貝母粗提物。保證較高峰形分辨度，分離量大、回收率高、分離環(huán)境緩和、節(jié)約溶劑、操作簡便。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的HSCCC-ELSD檢測圖譜；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的HSCCC-ELSD檢測圖譜；圖3是本發(fā)明實(shí)施例3的HSCCC-ELSD檢測圖譜；圖4是本發(fā)明實(shí)施例4的HSCCC-ELSD檢測圖譜；圖5是本發(fā)明實(shí)施例5的HSCCC-ELSD檢測圖譜。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述實(shí)施例1取浙貝母粉(過60目篩)20g，加入20ml氨水浸潤1h后，加入氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液100ml，置于80℃水浴加熱2h，過濾，將濾液蒸干，殘?jiān)鼈溆谩?br> 從體系中選取氯仿-乙醇-0.2M鹽酸溶液在半制備型高速逆流色譜儀上來分離制備貝母素甲和貝母素乙。按4∶3∶2的體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻靜置分層。待平衡一定時間后，將上相(固定相)和下相(流動相)分開。設(shè)定實(shí)驗(yàn)溫度為25℃。采用TBE-300A型高速逆流色譜儀，柱容積119ml，進(jìn)樣圈為10ml，AKTA purifier P-900泵，ELSD檢測器，HX-1050恒溫循環(huán)器。
稱取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。進(jìn)樣前，先用AKTA purifier P-900泵把固定相和流動相充滿整個柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速800r/min，轉(zhuǎn)動主機(jī)，流動相以1.2mL/min的流速泵入柱內(nèi)，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣。然后根據(jù)ELSD(蒸發(fā)光散射檢測儀)檢測圖譜，接收目標(biāo)成分。HSCCC-ELSD圖譜如圖1所示，其中，peak3為貝母素乙，peak5為貝母素甲。目標(biāo)成分收集后經(jīng)蒸干、氯仿溶解后，水洗三次，可得貝母素甲和貝母素乙的白色固體，兩者經(jīng)HPLC-ELSD檢測純度分別為98％和95％。并經(jīng)過核磁共振氫譜(1HNRM)、質(zhì)譜(MS)測試鑒定了結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2取浙貝母粉(過60目篩)20g，加入20ml氨水浸潤1h后，加入氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液100ml，置于80℃水浴加熱2h，過濾，將濾液蒸干，殘?jiān)鼈溆谩?br> 從體系中選取氯仿-乙醇-0.1mol/l鹽酸溶液在半制備型高速逆流色譜儀上來分離制備貝母素甲和貝母素乙。按2∶1∶2的體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻靜置分層。待平衡一定時間后，將上相(固定相)和下相(流動相)分開。設(shè)定實(shí)驗(yàn)溫度為25℃。采用TBE-300A型高速逆流色譜儀，柱容積119ml，進(jìn)樣圈為10ml，AKTA purifier P-900泵，ELSD檢測器，HX-1050恒溫循環(huán)器。
稱取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。進(jìn)樣前，先用AKTA purifier P-900泵把固定相和流動相充滿整個柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速800r/min，轉(zhuǎn)動主機(jī)，流動相以1.2mL/min的流速泵入柱內(nèi)，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣。然后根據(jù)ELSD(蒸發(fā)光散射檢測儀)檢測圖譜，接收目標(biāo)成分。HSCCC-ELSD圖譜如圖2所示，其中，peak3為貝母素乙，peak4為貝母素甲。目標(biāo)成分收集后經(jīng)蒸干、氯仿溶解后，水洗三次，可得貝母素甲和貝母素乙的白色固體，兩者經(jīng)HPLC-ELSD檢測純度均高于95％。并經(jīng)過核磁共振氫譜(1HNRM)、質(zhì)譜(MS)測試鑒定了結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例3取浙貝母粉(過60目篩)20g，加入20ml氨水浸潤1h后，加入氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液100ml，置于80℃水浴加熱2h，過濾，將濾液蒸干，殘?jiān)鼈溆谩?br> 從體系中選取氯仿-乙醇-0.2mol/l磷酸溶液在半制備型高速逆流色譜儀上來分離制備貝母素甲和貝母素乙。按6∶4∶2的體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻靜置分層。待平衡一定時間后，將上相(固定相)和下相(流動相)分開。設(shè)定實(shí)驗(yàn)溫度為25℃。采用TBE-300A型高速逆流色譜儀，柱容積119ml，進(jìn)樣圈為10ml，AKTA purifier P-900泵，ELSD檢測器，HX-1050恒溫循環(huán)器。
稱取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。進(jìn)樣前，先用AKTA purifier P-900泵把固定相和流動相充滿整個柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速700r/min，轉(zhuǎn)動主機(jī)，流動相以2mL/min的流速泵入柱內(nèi)，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣。然后根據(jù)ELSD(蒸發(fā)光散射檢測儀)檢測圖譜，接收目標(biāo)成分。HSCCC-ELSD圖譜如圖3所示，其中，peak3為貝母素乙，peak4為貝母素甲。目標(biāo)成分收集后經(jīng)蒸干、氯仿溶解后，水洗三次，可得貝母素甲和貝母素乙的白色固體，兩者經(jīng)HPLC-ELSD檢測純度均高于95％。并經(jīng)過核磁共振氫譜(1HNRM)、質(zhì)譜(MS)測試鑒定了結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例4取浙貝母粉(過60目篩)20g，加入20ml氨水浸潤1h后，加入氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液100ml，置于80℃水浴加熱2h，過濾，將濾液蒸干，殘?jiān)鼈溆谩?br> 從體系中選取四氯甲烷-甲醇-0.05mol/l磷酸溶液在半制備型高速逆流色譜儀上來分離制備貝母素甲和貝母素乙。按4∶3∶2的體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻靜置分層。待平衡一定時間后，將上相(固定相)和下相(流動相)分開。設(shè)定實(shí)驗(yàn)溫度為15℃。采用TBE-300A型高速逆流色譜儀，柱容積119ml，進(jìn)樣圈為10ml，AKTA purifier P-900泵，ELSD檢測器，HX-1050恒溫循環(huán)器。
稱取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。進(jìn)樣前，先用AKTA purifier P-900泵把固定相和流動相充滿整個柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速500r/min，轉(zhuǎn)動主機(jī)，流動相以3mL/min的流速泵入柱內(nèi)，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣。然后根據(jù)ELSD(蒸發(fā)光散射檢測儀)檢測圖譜，接收目標(biāo)成分。HSCCC-ELSD圖譜如圖4所示，其中，peak2為貝母素乙，peak3為貝母素甲。目標(biāo)成分收集后經(jīng)蒸干、氯仿溶解后，水洗三次，可得貝母素甲和貝母素乙的白色固體，兩者經(jīng)HPLC-ELSD檢測純度均高于95％。并經(jīng)過核磁共振氫譜(1HNRM)、質(zhì)譜(MS)測試鑒定了結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例5取浙貝母粉(過60目篩)20g，加入20ml氨水浸潤1h后，加入氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液100ml，置于80℃水浴加熱2h，過濾，將濾液蒸干，殘?jiān)鼈溆谩?br> 從體系中選取氯仿-丙酮-0.5mol/l鹽酸溶液在半制備型高速逆流色譜儀上來分離制備貝母素甲和貝母素乙。按4∶1.5∶2的體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻靜置分層。待平衡一定時間后，將上相(固定相)和下相(流動相)分開。設(shè)定實(shí)驗(yàn)溫度為30℃。采用TBE-300A型高速逆流色譜儀，柱容積119ml，進(jìn)樣圈為10ml，AKTA purifier P-900泵，ELSD檢測器，HX-1050恒溫循環(huán)器。
稱取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。進(jìn)樣前，先用AKTA purifier P-900泵把固定相和流動相充滿整個柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速999r/min，轉(zhuǎn)動主機(jī)，流動相以3mL/min的流速泵入柱內(nèi)，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣。然后根據(jù)ELSD(蒸發(fā)光散射檢測儀)檢測圖譜，接收目標(biāo)成分。HSCCC-ELSD圖譜如圖5所示，其中，peak2為貝母素乙，peak4為貝母素甲。目標(biāo)成分收集后經(jīng)蒸干、氯仿溶解后，水洗三次，可得貝母素甲和貝母素乙的白色固體，兩者經(jīng)HPLC-ELSD檢測純度均高于95％。并經(jīng)過核磁共振氫譜(1HNRM)、質(zhì)譜(MS)測試鑒定了結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其采用高速逆流色譜技術(shù)，包括如下步驟制備浙貝母粗提物作為進(jìn)樣物；配置構(gòu)成固定相和流動相的溶劑系統(tǒng)；固定相和流動相同時泵入柱內(nèi)；主機(jī)轉(zhuǎn)動，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，檢測洗脫溶劑，接收目標(biāo)組分，收集得到產(chǎn)品；其特征在于所采用的溶劑系統(tǒng)由氯代烷烴，脂肪醇或脂肪酮，稀酸性溶液組成。
2.如權(quán)利要求1所述的高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其特征在于，所述固定相和流動相同時泵入柱內(nèi)時，控制固定相保留值為0.4-0.8。
3.如權(quán)利要求1所述的高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其特征在于所述的氯代烷烴為氯仿，所述的脂肪醇或脂肪酮為乙醇，所述的稀酸性溶液為稀鹽酸溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其特征在于所述的溶劑系統(tǒng)各組分氯代烷烴，脂肪醇或脂肪酮，稀酸性溶液的體積比為(2-6)∶(1-4)∶2。
5.如權(quán)利要求4所述的高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其特征在于所述的溶劑系統(tǒng)各組分氯代烷烴，脂肪醇或脂肪酮，稀酸性溶液的體積比為4∶3∶2。
6.如權(quán)利要求1所述的高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其特征在于所述的稀酸性溶液的濃度在0.05-0.5mol/l之間。
7.如權(quán)利要求6所述的高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其特征在于所述的稀酸性溶液的濃度為0.2mol/l。
8.如權(quán)利要求1所述的高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其特征在于所述收集得到的產(chǎn)品經(jīng)過蒸干、氯仿溶解后，采用水洗三次，可得到貝母素甲和貝母素乙的白色固體。
9.如權(quán)利要求1所述的高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其特征在于所述制備步驟中，溫度為15-30℃，主機(jī)轉(zhuǎn)速為500-999r/min，流動相泵入柱內(nèi)的流速為0.5-3mL/min。
10.如權(quán)利要求9所述的高純度貝母素甲、貝母素乙的制備方法，其特征在于所述的主機(jī)轉(zhuǎn)速為800r/min，所述的流動相流速為1.2mL/min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高純度貝母素甲和貝母素乙的制備方法，其采用高速逆流色譜技術(shù)，包括如下步驟制備浙貝母提取物作為進(jìn)樣物；配置構(gòu)成固定相和流動相的溶劑系統(tǒng)；固定相和流動相同時泵入柱內(nèi)；主機(jī)轉(zhuǎn)動，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，檢測洗脫溶劑，接收目標(biāo)組分，收集得到產(chǎn)品。所用的溶劑系統(tǒng)可以是由氯代烷烴，脂肪醇或脂肪酮，稀酸性溶液所構(gòu)成。本方法可以從浙貝母粗提物中獲得高純度的單體生物堿貝母素甲和貝母素乙，純度分別高達(dá)98％，95％。該方法操作簡單方便，成本低廉，回收率高，較易于推廣使用。
文檔編號C07J75/00GK1982328SQ20051011154
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日
發(fā)明者沈平孃, 張繼全, 劉峻, 金艷 申請人:上海中藥制藥技術(shù)有限公司, 國家中藥制藥工程技術(shù)研究中心