專利名稱：人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合短肽系列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用噬菌體肽庫體外篩選所得到的人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合短肽系列GEBPs。
背景技術(shù)：
胃癌是一種常見的惡性腫瘤，傳統(tǒng)的治療方式如手術(shù)、化療和放療，不能取得理想的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，血管生成是實體腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要條件之一，腫瘤血管抑制治療已成為目前腫瘤治療研究領(lǐng)域的一個熱點，并顯示出了良好的治療前景。然而，一些進(jìn)入臨床試驗的血管抑制劑卻難以達(dá)到動物試驗中所顯示的抑癌效果，臨床效果并不令人滿意。究其原因，最突出的問題之一就是這些用于臨床試驗的血管生成抑制劑沒有選擇性，廣泛作用于全身血管，難以在腫瘤局部形成較高的藥物濃度，即治療的腫瘤血管靶向性不強。研究表明，腫瘤血管不同于正常血管，具有異常的解剖特征及分子異質(zhì)性，腫瘤血管表達(dá)一些被稱為“vascular zip codes”的與正常血管不同的特異性蛋白(Cancer Cell.2003；4(5)331-333)。由于胃癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)困難，異質(zhì)性分子的表達(dá)量較低，用常規(guī)的方法難以檢測、分離和純化，所以目前尚未發(fā)現(xiàn)明確的胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種建立胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型、進(jìn)行噬菌體肽庫體外篩選及鑒定篩選結(jié)果結(jié)合活性的方法，特別是提供能與胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合的短肽系列(GEBPs)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合短肽系列，其特征是它們分別由9個氨基酸組成，兩端各一個半胱氨酸形成二二硫鍵，從而形成環(huán)狀，其氨基酸序列如下列之一短肽名稱氨基酸序列(N→C)GEBP11CTKNSYLMCGEBP3 CPPSKMSQCGEBP6 CLSSSLSDCGEBP9 CKNSLTMACGEBP12CTNTMLPQC
GEBP1 CPVSLQALCGEBP2 CDRHNLTFCGEBP4 CSSTTPNACGEBP5 CQPALQMKCGEBP13CTTTDLRACGEBP14CIPTHPRLCGEBP15CNSTKYNQC所述的人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合短肽系列，其實現(xiàn)方法是通過Transwell共培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，利用共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞篩選噬菌體肽庫，進(jìn)而挑取噬菌體單克隆，進(jìn)行測序鑒定。
所述的人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合短肽系列，其實現(xiàn)方法是用于篩選噬菌體肽庫的人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，采用帶有0.4μm孔徑半透膜的Transwell培養(yǎng)皿將人胃腺癌細(xì)胞SGC7901、正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)進(jìn)行間接共培養(yǎng)，它們通過分泌可溶性因子相互作用，誘導(dǎo)相應(yīng)分子表達(dá)的變化。
所述的人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合短肽系列，其實現(xiàn)方法是噬菌體肽庫篩選以經(jīng)典親和篩選方法為基礎(chǔ)，采用了液相結(jié)合、逐漸增加篩選強度、多輪消減等優(yōu)化措施，增加了獲得高親和力、特異結(jié)合噬菌體克隆的概率，并且對投入下一輪篩選噬菌體克隆的挑選和擴(kuò)增方法進(jìn)行改進(jìn)，以大量挑取單克隆和分組進(jìn)行分別擴(kuò)增的方法相結(jié)合，降低了偏態(tài)擴(kuò)增的風(fēng)險，逐漸縮小了篩選庫容量，保證了篩選的順利進(jìn)行。
本發(fā)明的特點是由于目前研究認(rèn)為，血管異質(zhì)性的出現(xiàn)是內(nèi)皮細(xì)胞與組織微環(huán)境相互作用的結(jié)果，同時受全身因素的影響，不同組織內(nèi)皮細(xì)胞所處微環(huán)境不同，其表型及生長特性也出現(xiàn)差異。腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞存在于特殊的腫瘤微環(huán)境中，因此會出現(xiàn)相應(yīng)的異質(zhì)性分子特征，正是這些僅在腫瘤血管表達(dá)而在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞中不表達(dá)或僅痕量級表達(dá)的特異性分子，有可能成為腫瘤血管治療的關(guān)鍵靶標(biāo)。最近的研究提示，與腫瘤細(xì)胞體外共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生類似體內(nèi)腫瘤環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞的變化(Microvascular Res.2002；63316)，腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性因子可能在這一誘導(dǎo)過程中起重要作用。有學(xué)者將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)發(fā)生了變化，出現(xiàn)了Tie2受體、VEGF1受體、FGF2受體等腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特有的基因表達(dá)(J Cell Sci.2003；116(6)1013)；通過前列腺癌細(xì)胞與骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的立體共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞的生長被癌細(xì)胞或其條件培養(yǎng)基抑制，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生明顯形態(tài)學(xué)改變形大，分枝狀，條索狀結(jié)構(gòu)，模仿血管生成，但并不引起非骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，這與臨床上前列腺癌具有向骨髓轉(zhuǎn)移的傾向性相一致(2005 Jan；Epubahead of print)；也有人利用雙層培養(yǎng)皿間接共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞，再現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的單層膜狀結(jié)構(gòu)，成功模擬了腫瘤微環(huán)境pH值較低、血管通透性增加等特征(腫瘤.2004；24(3)226-229)。上述研究表明，通過共培養(yǎng)的方法，不僅可以模擬內(nèi)皮細(xì)胞的生長微環(huán)境，還可以再現(xiàn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞單層膜狀結(jié)構(gòu)的特征及功能，這就為通過共培養(yǎng)技術(shù)建立胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外模型提供了理論依據(jù)，在此基礎(chǔ)上研究胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的異質(zhì)性分子。
近年來，噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)不斷發(fā)展和完善，它將外源蛋白的基因型與表型聯(lián)系在一起，把與其它分子的結(jié)合活性與噬菌體的可擴(kuò)增性統(tǒng)一起來，目前已經(jīng)成功構(gòu)建了多種類型的噬菌體隨機肽庫。進(jìn)行噬菌體肽庫篩選，不需預(yù)先知道受體分子的結(jié)構(gòu)信息，能夠得到與低濃度靶分子特異結(jié)合的短肽，是一種高效的篩選體系，操作簡便，已成功地應(yīng)用于抗原表位篩選、疫苗研制、輔助藥物設(shè)計、復(fù)雜生物系統(tǒng)特異結(jié)合短肽的篩選等領(lǐng)域，為相關(guān)研究提供了全新的思路與先進(jìn)的手段(US.Patent.No.5,866,363)。Arap等采用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)發(fā)現(xiàn)能與前列腺癌血管特異結(jié)合的短肽“SMSIARL”(Proc Natl Acad Sci USA.2002；991527-1531/US.Patent.No.6,610,651)。Hoffman等發(fā)現(xiàn)CGKRK和CDTRL能夠特異結(jié)合于由HPV16誘導(dǎo)的小鼠皮膚鱗癌的新生血管，而與正常皮膚或其它器官的血管不結(jié)合(Cancer Cell.2003；4(5)383-391)。采用此項技術(shù)，可以先獲得胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽，進(jìn)而尋找其結(jié)合受體。
綜上所述，基于共培養(yǎng)技術(shù)建立胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，以及不斷發(fā)展、完善的噬菌體隨機肽庫篩選技術(shù)，為胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性分子的探索和研究提供了可供選擇的解決途徑。目前，由于腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的困難，相關(guān)的噬菌體肽庫篩選多采用基于動物模型的體內(nèi)篩選(專利申請?zhí)?00410026137.0，200310122611.5；Cancer Biol Ther.2004；3(12)1232-5)。但是，進(jìn)行體內(nèi)篩選影響因素較多，篩選條件難以嚴(yán)格控制，并且移植瘤組織中的血管為動物源性或難以確定，這些問題都可能影響到篩選結(jié)果，而體外細(xì)胞篩選則不存在這些問題。采用與胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞代替胃癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行篩選，具有充分的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，這就避開了胃癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的難題，目前還沒有見到將噬菌體肽庫篩選技術(shù)和共培養(yǎng)模型相結(jié)合，進(jìn)行腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性分子研究的報道。如果獲得能與胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合的短肽具有重要的應(yīng)用價值和研究意義，有可能為胃癌的診斷、抗血管靶向治療提供新的候選分子，為進(jìn)一步尋找該短肽的結(jié)合受體并研究其功能奠定實驗基礎(chǔ)。
本發(fā)明應(yīng)用Transwell共培養(yǎng)技術(shù)，建立了胃癌細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型，初步鑒定表明，共培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生了類似體內(nèi)腫瘤環(huán)境中的表型變化，比如，內(nèi)皮細(xì)胞增殖被促進(jìn)，粘附力未見明顯變化，而胃癌細(xì)胞增殖受到抑制，粘附力降低，共培養(yǎng)微環(huán)境呈現(xiàn)出變酸趨勢等，與多數(shù)文獻(xiàn)報道一致。在噬菌體肽庫篩選過程中，采用液相結(jié)合、逐漸增加篩選強度、多輪消減篩選等一系列措施優(yōu)化體外全細(xì)胞篩選方案，更為重要的是，對于投入下一輪篩選噬菌體克隆的挑取及擴(kuò)增方法進(jìn)行了改進(jìn)，結(jié)果噬菌體在靶細(xì)胞上富集明顯，并通過進(jìn)一步實驗鑒定了所得短肽的結(jié)合特異性，取得了理想的結(jié)果。這一方面表明，此程序是一種有效的體外全細(xì)胞篩選方案，另一方面也說明，基于共培養(yǎng)技術(shù)的胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，是一種理想的胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性分子研究的技術(shù)平臺。本發(fā)明采用體外分離、培養(yǎng)及鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，用Transwell雙層培養(yǎng)皿與人胃腺癌細(xì)胞SGC7901共培養(yǎng)，建立胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型；通過噬菌體肽庫篩選，獲得與胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞具有高結(jié)合活性的噬菌體短肽；并利用噬菌體細(xì)胞結(jié)合實驗、免疫細(xì)胞/組織化學(xué)染色、細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗、免疫熒光檢測等方法鑒定了GEBPs的結(jié)合活性及特異性；經(jīng)過氨基酸序列的同源性分析，確認(rèn)所得GEBPs氨基酸序列的唯一性。結(jié)果篩選得到12個噬菌體克隆及其呈現(xiàn)的環(huán)狀短肽序列，其中有5個噬菌體克隆及其呈現(xiàn)短肽在胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞及HUVECs上有明顯的差異性結(jié)合。這些短肽對于胃癌診斷、血管靶向治療及胃癌血管生成相關(guān)分子的研究，具有重要的潛在應(yīng)用價值及重大的理論意義。
下面結(jié)合實施例附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。


圖1是內(nèi)皮細(xì)胞與胃癌細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型示意圖。
圖2是噬菌體肽庫體外篩選流程圖。
圖3是四輪篩選中噬菌體在Co-HUVECs上逐漸富集圖示。
圖4是12個噬菌體克隆與Co-HUVECs結(jié)合特異性的ELISA鑒定結(jié)果圖示。
圖5是IN11噬菌體體外活細(xì)胞結(jié)合實驗結(jié)果圖示。
圖6是IN11噬菌體的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定結(jié)果圖示。
圖7是IN11噬菌體的免疫組織化學(xué)染色鑒定結(jié)果圖示。
圖8是細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗結(jié)果圖示。
圖9是GEBP11合成肽與Co-HUVECs結(jié)合特異性的免疫熒光檢測結(jié)果圖示。
圖10是GEBP11合成肽與胃癌組織血管結(jié)合特異性的免疫熒光檢測結(jié)果圖示。
具體實施例方式
胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞表面分子標(biāo)記物是胃癌血管抑制治療的關(guān)鍵靶標(biāo)，申請人通過噬菌體隨機肽庫體外全細(xì)胞篩選，成功地獲得了一組人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性結(jié)合環(huán)狀短肽GEBPs，并利用噬菌體細(xì)胞結(jié)合實驗、免疫細(xì)胞/組織化學(xué)染色、細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗、免疫熒光檢測等方法鑒定了GEBPs的結(jié)合特異性。
具體方法如下1.人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立1.1.原代分離和培養(yǎng)HUVECs參照J(rèn)affe等人的方法加以改良，進(jìn)行人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的原代分離和培養(yǎng)，新生兒臍帶來源于第四軍醫(yī)大學(xué)第一或第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科。采用倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)及生長特性的觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)染色(VIII因子及CD31，分別購于北京中山公司、美國Bio-Legend公司)、透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察及管狀結(jié)構(gòu)形成試驗(matrigel購于美國BD公司)等方法，鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。
1.2.建立人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型采用Transwell共培養(yǎng)技術(shù)，將HUVECs及人胃腺癌SGC7901細(xì)胞共培養(yǎng)于雙層培養(yǎng)皿(購于美國Corning公司)，兩種細(xì)胞被帶有0.4μm孔徑的半透膜分隔開，它們通過分泌可溶性因子相互作用，誘導(dǎo)分子表達(dá)的變化(見圖1)。通過共培養(yǎng)細(xì)胞生長特性觀察、細(xì)胞消化實驗、MTT細(xì)胞增殖實驗、共培養(yǎng)微環(huán)境酸堿度測定等方法進(jìn)行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生了類似腫瘤環(huán)境中的表型變化，這就為篩選噬菌體肽庫提供了技術(shù)平臺。
2.噬菌體肽庫的體外全細(xì)胞消減篩選2.1.篩選流程以人正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES及正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為陰性消減細(xì)胞，與原始肽庫共孵育(原始肽庫購于New England Biolabs公司)，取未結(jié)合的噬菌體再和共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞(Co-HUVECs)共孵育，回收結(jié)合噬菌體，擴(kuò)增后投入下一輪篩選，4輪后挑取噬菌體單克隆進(jìn)行DNA序列測定(上海華諾公司)及同源性分析(見圖2)。
2.2.體外篩選步驟用EDTA(市售)細(xì)胞分離液收獲對數(shù)生長期的GES細(xì)胞1×107，與取原始肽庫10μl(2×1011pfu)混合，4℃孵育1.5h，800rpm，離心5min，收集上清，以同樣的方法將HUVECs與回收的上清共孵育，再離心，收集上清。用EDTA收獲亞融合狀態(tài)的Co-HUVECs 1×107，與上述回收上清共孵育，離心，棄上清，用BF重懸Co-HUVECs，混旋3min后再離心，重復(fù)洗5遍，0.1％TBST洗1遍，PBS洗2遍。以pH2.2的甘氨酸洗脫緩沖液4℃洗脫10min，加入pH9.1的Tris/HCl中和緩沖液，離心，收集上清，即為膜洗脫噬菌體或膜結(jié)合噬菌體(Mp)。以含PMSF的TEA堿洗脫液4℃裂解洗脫5min，加入pH7.4的Tris/HCl中和緩沖液，離心，收集上清，即為裂解洗脫噬菌體或內(nèi)化噬菌體(INp)。
2.3.噬菌體的體外擴(kuò)增鋪制LB-Tet平板，并加入X-gal/IPTG(購于上海生工)，顛倒培養(yǎng)后，隨機挑取間距0.5cm以上、生長良好的藍(lán)色噬斑400-500個，分為5部分分別加入宿主菌，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)4-6h。將培養(yǎng)物4℃、10000rpm離心15min，上清與1/6體積的PEG/NaCl溶液4℃過夜。再離心，TBS重懸沉淀，微離心，將上清與1/6體積的PEG/NaCl溶液冰浴1h，離心，棄上清，以200μl 0.02％NaN3溶液重懸沉淀物，即為第一輪擴(kuò)增的噬菌體。
2.4.下一輪篩選將擴(kuò)增后的膜洗脫噬菌體和裂解洗脫噬菌體各取1×1011pfu，投入下一輪篩選。篩選過程同前，共進(jìn)行4輪篩選，逐漸增加篩選強度與陰性細(xì)胞孵育的時間增加至2h，與靶細(xì)胞的孵育時間減為1h；BF、TBST、PBS混旋洗滌時間增至5min，TBST濃度漸增為0.2％、0.3％、0.5％。
2.5.陽性噬菌體克隆的挑選及測序經(jīng)過4輪篩選，從Co-HUVECs上回收的噬菌體顯著增高，明顯高于對照細(xì)胞(見圖3)。鋪制LB平板，隨機挑取20個噬菌體單克隆(Mp、INp各10個)，編號為M1-10，IN11-IN20，提取其單鏈DNA(DNA提取試劑盒購于上海華瞬公司)，由上海華諾公司完成測序。除外IN17測序失敗，部分克隆有重復(fù)序列，最終得到12個不同的噬菌體克隆(見表1)，將其呈現(xiàn)短肽命名為GEBPs(Gastric cancer Endothelial cell BindingPeptides)。
表1 測序得到12個隨機插入片段及其編碼的短肽

2.3表示該片段在所有測序克隆中重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)，未注明的均為1次3.GEBPs氨基酸序列的同源性分析3.1.12個GEBPs間的同源性分析12個插入片段中，GEBP6、GEBP11重復(fù)頻率最高，為3次。登陸ClustalW網(wǎng)站(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)，12個短肽氨基酸序列之間進(jìn)行對比分析，部分序列呈現(xiàn)出較高的同源性，但沒有發(fā)現(xiàn)普遍的共有序列(基序)模式。見表2所示。
表212個短肽序列同源性比較片段名稱 N端 插入序列 C端 同源性(％)2GEBP9 C K N S L T M AC3GEBP11 C T K N S Y L M C 57

2GEBP1 C P V S L Q A L C ≤28

2.3表示該肽段在所有測序克隆中的重復(fù)頻率，未注明的均為1次3.2.通過數(shù)據(jù)庫檢索進(jìn)行同源性分析登陸NCBI/BLAST網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)含有與這些短肽氨基酸序列完全一致的蛋白質(zhì)，GEBPs與某些蛋白質(zhì)分子具有較好的同源性(見表3)。其中，GEBP11與腦特異性血管生成抑制分子-3(BAI-3)有5個氨基酸完全一致，而BAI-3分子與血管生成直接相關(guān)，因此GEBP11短肽可能具有潛在的研究價值。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)分析認(rèn)為，GEBP11短肽可能與BAI-3蛋白具有相似的結(jié)合活性，它可能通過與BAI-3配體分子的結(jié)合，阻斷了BAI-3蛋白與其配體分子的結(jié)合，從而終止相應(yīng)的信號傳遞。以上僅是一種推測，GEBP11短肽的結(jié)合受體也完全可能是一種新分子，這都需要進(jìn)一步的實驗來證實。
表3 12個GEBPs短肽的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索同源性分析


注TDE2L(tumor differentially expressed protein 2-like)腫瘤差異表達(dá)蛋白-2類似物；NCOA3(Nuclear receptor coactivator 3)核受體激活劑-3；CDKN(cyclin dependentkinase inhibitor)細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶抑制因子；CCSP-2(colon cancer secretedprotein-2)結(jié)腸癌分泌蛋白-2；TIAM-1(T-cell lymphoma invasion and metastasis 1)T細(xì)胞淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移因子-1；GCYS-20(gastric cancer-related protein GCYS-20)一種胃癌相關(guān)蛋白GCYS-20；ICaBP(intestinal calcium binding protein)腸鈣結(jié)合蛋白；BAI-3(brain-specific angiogenesis inhibitor 3)腦特異性血管生成抑制分子；Syne-1(Synaptic nuclear envelope protein 1)核膜連接蛋白-1；CAD23(cadherin 23)鈣粘蛋白-23；UREB1(upstream regulatory element binding protein 1)上游調(diào)控元件結(jié)合蛋白-1；TNFR腫瘤壞死因子受體；IFN-α2b干擾素-α2b。
4.12個噬菌體克隆結(jié)合活性的ELISA鑒定根據(jù)測序結(jié)果，以單獨培養(yǎng)的HUVECs為對照細(xì)胞，用ELISA法初步鑒定測序成功的噬菌體克隆與Co-HUVECs的結(jié)合活性，排除假陽性或無差異結(jié)合的噬菌體。并設(shè)PBS對照及無關(guān)噬菌體(Unrelatedphages，URPh，原始肽庫的擴(kuò)增液)對照。實驗步驟如下收集處于對數(shù)生長期的HUVECs、Co-HUVECs，鋪于96孔板(每孔細(xì)胞數(shù)為1×105)，培養(yǎng)4h使細(xì)胞貼壁、伸展，0.25％戊二醛(市售)中固定15min，4％H2O2室溫封閉30min，1％BSA(購于北京鼎國公司)37℃封閉30min，分別加入1×1010pfu陽性噬菌體，37℃孵育2h。與HRP-抗M13IgG(購于美國Pharmacia公司)37℃孵育1h，TMB(購于萬泰藥業(yè))顯色30min，終止反應(yīng)，450nm波長下測定OD值。實驗重復(fù)3次，計算平均OD值，實驗組OD值與對照組OD值之比≥2.1判定為陽性。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示，IN11、M3、M6、M9、IN12這5個噬菌體克隆在Co-HUVECs和HUVECs上有明顯的差異性結(jié)合(見圖4)。
5.5個差異結(jié)合噬菌體及其呈現(xiàn)環(huán)肽的結(jié)合特異性鑒定以IN11噬菌體及其呈現(xiàn)短肽GEBP11為例，采用噬菌體細(xì)胞結(jié)合實驗、免疫細(xì)胞/組織化學(xué)染色、細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗、免疫熒光檢測等方法鑒定其結(jié)合活性及特異性。其它噬菌體克隆或短肽的鑒定，以同樣方法進(jìn)行。
5.1.體外細(xì)胞結(jié)合實驗為驗證IN11噬菌體在Co-HUVECs上結(jié)合的特異性，以GES細(xì)胞、HUVECs為對照細(xì)胞，進(jìn)行噬菌體體外結(jié)合實驗。方法如下收獲對數(shù)生長期的GES細(xì)胞、HUVECs、Co-HUVECs各1×107個，將IN11噬菌體1×1010pfu分別與三種細(xì)胞共孵育，洗脫、回收、滴定噬菌體，比較三種細(xì)胞上的回收噬菌體量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從Co-HUVECs上回收的IN11噬菌體滴度分別是對照細(xì)胞HUVECs、GES的5.7、16.9倍(見圖5)。
5.2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定按常規(guī)免疫細(xì)胞化學(xué)染色步驟封閉完成后，先與IN11噬菌體1×1010pfu 4℃孵育過夜，然后依次與鼠抗M13單體(購于美國Pharmacia公司)、抗鼠IgG二抗、SP復(fù)合物孵育，DAB顯色(SP組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京中山公司)。PBS代替噬菌體，作陰性對照。參照Shimizu等的評分方法，依據(jù)棕色反應(yīng)的陽性強度及陽性細(xì)胞的比例綜合判斷，評為陰性(-)，弱陽性(+)，陽性(++)，強陽性(+++)。結(jié)果顯示，IN11噬菌體在Co-HUVECs上呈強陽性，而對照細(xì)胞為陰性或弱陽性(見圖6)。
5.3.免疫組織化學(xué)染色鑒定檢測IN11噬菌體同人胃癌血管的結(jié)合特異性。按常規(guī)免疫組化程序血清封閉結(jié)束后，與IN11噬菌體1×1010pfu 4℃孵育過夜，再依次與抗M13噬菌體單抗、二抗、SP復(fù)合物孵育，DAB顯色。PBS代替一抗作陰性對照，同時用人CD31單抗顯示血管作陽性對照，結(jié)果判定同前。結(jié)果胃癌組織呈陽性，血管結(jié)構(gòu)顯示清楚，而非癌人胃組織未見明顯陽性反應(yīng)(見圖7)。
5.4.體外結(jié)合競爭抑制實驗為明確IN11噬菌體是否通過其表面呈現(xiàn)的GEBP11短肽特異結(jié)合于Co-HUVECs，可以利用GEBP11的人工合成肽對IN11噬菌體的特異性結(jié)合進(jìn)行干預(yù)，通過以下兩種方式進(jìn)行競爭抑制實驗。體外活細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗與體外細(xì)胞結(jié)合實驗相似，收獲7組對數(shù)生長期的Co-HUVECs 1×107，6個實驗組細(xì)胞先與濃度分別為400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml的合成肽GEBP11(上海吉爾生化公司)，4℃孵育2h，BF代替GEBP11為對照組。然后分別與1×1010pfu的IN11噬菌體4℃孵育2h，洗脫、回收并滴定結(jié)合噬菌體。競爭抑制ELISA實驗與ELISA操作相似，在加入1％BSA封閉完成后，各孔先加入濃度分別為400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml的GEBP11合成肽及BF液100μl，37℃孵育30min，再與1×1010pfu的IN11噬菌體37℃孵育2h，然后加一抗、TMB，測定光密度OD值。計算合成肽GEBP11對IN11噬菌體結(jié)合的競爭抑制率抑制率＝(對照組回收噬菌體的數(shù)量或OD值-實驗組回收噬菌體的數(shù)量或OD值)/對照組回收噬菌體的數(shù)量或OD值×100％，作出抑制率-合成肽濃度曲線。結(jié)果隨著GEBP11濃度的增高，抑制率逐漸上升，在100-400μg/ml時，抑制率維持在較高水平，表明GEBP11合成肽對IN11噬菌體在Co-HUVECs上的結(jié)合有競爭抑制作用(見圖8)。
5.5.GEBP11合成肽結(jié)合特異性的免疫熒光檢測采用免疫熒光技術(shù)鑒定FITC-GEBP11合成肽與Co-HUVECs及胃癌血管結(jié)合的特異性，以HUVECs、非癌人胃組織作對照。細(xì)胞爬片及組織切片經(jīng)正常血清封閉后，加入100μg/ml的FITC-GEBP11約100μl，37℃孵育1h，振蕩洗滌5min×3次，于熒光顯微鏡下觀察比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Co-HUVECs及胃癌組織呈陽性，而對照細(xì)胞或組織呈陰性或弱陽性，這表明，GEBP11短肽確實能夠特異性結(jié)合于胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，而與非癌人胃組織血管未見明顯結(jié)合(見圖9、10)。
本發(fā)明采用噬菌體隨機肽庫，篩選得到能與胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的高特異性結(jié)合環(huán)狀短肽GEBPs，經(jīng)體外細(xì)胞結(jié)合實驗、免疫細(xì)胞/組織化學(xué)染色、體外結(jié)合競爭抑制實驗、免疫熒光檢測等方法進(jìn)行鑒定，均顯示GEBPs短肽與胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的特異性。這表明，本發(fā)明所建立的胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型是一種成功的模型，可以作為人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性分子研究的技術(shù)平臺。經(jīng)氨基酸序列的同源性分析，在目前蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)含有與本發(fā)明氨基酸序列完全一致的蛋白分子，因此本發(fā)明具有唯一性。
這些環(huán)肽的發(fā)現(xiàn)，在胃癌的診斷、血管靶向治療以及胃癌血管生成相關(guān)分子的研究等方面，具有的潛在的應(yīng)用價值及理論研究意義?，F(xiàn)可用于以下幾個方面1.胃癌診斷試劑盒的研制將本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀短肽與熒光物質(zhì)、同位素等物質(zhì)偶聯(lián)，或者通過制備其單克隆抗體等方式，研制開發(fā)用于胃癌診斷的試劑盒，如果在更大標(biāo)本范圍內(nèi)通過鑒定，有望成為胃癌早期診斷的一種途徑。
2.血管靶向藥物的構(gòu)建如果短肽具有生物學(xué)活性，那么可以在此基礎(chǔ)上，直接研發(fā)具有血管生成調(diào)節(jié)作用的短肽藥物。如果短肽沒有生物學(xué)活性，也可以用它作為胃癌血管的靶向工具，用于胃癌血管靶向治療，比如構(gòu)建如下的胃癌血管靶向藥物。血管靶向性腺病毒介導(dǎo)siRNA的構(gòu)建將本發(fā)明中這些特異性環(huán)肽用腺病毒pAdeasy系統(tǒng)改造為特異性靶向胃癌血管內(nèi)皮的基因治療載體，并借助該載體將KDR、Raf-1等血管生成相關(guān)分子的siRNA特異性導(dǎo)入胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，干擾其RNA水平的表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，最終達(dá)到血管靶向性抑制胃癌的目的。血管靶向性復(fù)合肽的構(gòu)建將本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的特異性環(huán)肽同一種生物活性肽D(KLAKLAK)2或TNF等分子連接，利用本發(fā)現(xiàn)中環(huán)肽特異性結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力和生物活性肽的細(xì)胞抑制或殺傷作用，使復(fù)合肽靶向破壞胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而達(dá)到胃癌血管抑制治療的目的。
3.GEBPs短肽結(jié)合靶分子的研究通過對血管內(nèi)皮細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫的篩選或親和層析等方法，可以用GEBPs短肽為誘餌釣取其結(jié)合靶分子或其編碼基因，從而闡明短肽與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的分子基礎(chǔ)，并進(jìn)一步研究此靶分子的功能，如果該靶分子在血管發(fā)生中發(fā)揮重要作用，有可能成為胃癌治療新的靶分子。
此外，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索，雖然沒有發(fā)現(xiàn)含有與本發(fā)明GEBPs氨基酸序列完全一致的蛋白質(zhì)分子，但是部分蛋白質(zhì)與某些短肽表現(xiàn)出了較好同源性，其中不乏與腫瘤或血管生成密切相關(guān)的分子，GEBPs可能與這些蛋白具有相似的結(jié)合活性，但也可能沒有任何關(guān)系，而是模擬了某些蛋白質(zhì)分子非相鄰氨基酸經(jīng)空間折疊之后所形成的空間構(gòu)象的結(jié)合能力。通過對GEBPs短肽空間結(jié)構(gòu)的計算機模擬分析，推測其結(jié)合結(jié)構(gòu)域，有可能為其特異性的結(jié)合活性提供合理的解釋或?qū)ふ移浣Y(jié)合受體分子提供有益的線索。
附圖中圖1是內(nèi)皮細(xì)胞與胃癌細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型示意圖，圖中1、TRANSWELL上室；2、TRANSWELL下室；3、0.4μm孔徑的半透膜；4、雙層細(xì)胞通過可溶性分子相互影響；5、培養(yǎng)液；6、HUVECs；7、SGC7901細(xì)胞。HUVECs(6)接種于TRANSWELL上室(1)，SGC7901細(xì)胞(7)接種于TRANSWELL下室(2)，上下兩室培養(yǎng)液(5)保持液面平衡，兩種細(xì)胞被0.4μm孔徑的半透膜(3)分開，雙層細(xì)胞通過分泌可溶性因子相互影響(4)，誘導(dǎo)分子表達(dá)的變化。
圖2是噬菌體肽庫體外篩選流程圖，如圖2所示，與GES細(xì)胞、HUVECs不結(jié)合的噬菌體再與Co-HUVECs共孵育，回收并擴(kuò)增與其結(jié)合的噬菌體，重復(fù)進(jìn)行四輪篩選。
圖3是四輪篩選中噬菌體在Co-HUVECs上逐漸富集結(jié)果圖示，當(dāng)R1→R4，從Co-HUVECs回收的噬菌體滴度增加數(shù)百、上千倍，而噬菌體在對照細(xì)胞HUVECs、GES上保持低水平結(jié)合或逐漸降低。
圖4是12個噬菌體克隆與Co-HUVECs結(jié)合特異性的ELISA鑒定結(jié)果圖示，圖中白色柱表示Co-HUVECs，黑色柱表示HUVECs。在12個噬菌體克隆中，IN11、M3、M6、M9、IN12這5個克隆能特異性結(jié)合于Co-HUVECs。
圖5是體外活細(xì)胞結(jié)合實驗結(jié)果圖示，圖中白色柱表示IN11噬菌體，黑色柱表示URPh，即無關(guān)噬菌體。IN11噬菌體在Co-HUVECs上的回收量分別是對照細(xì)胞HUVECs組、GES組的5.7、16.9倍。這提示IN11噬菌體與Co-HUVECs具有特異結(jié)合活性。
圖6是IN11噬菌體的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定(SP法，×400)，圖中AIN11噬菌體在Co-HUVECs上的染色；BPBS陰性對照；CIN11噬菌體在對照細(xì)胞HUVECs上的染色；DIN11噬菌體在對照細(xì)胞GES上的染色。圖A可見Co-HUVECs中出現(xiàn)棕褐色沉淀顆粒，以胞膜、核周胞漿為著，即為強陽性。圖B中無棕色顆粒，為陰性。圖C，D中出現(xiàn)較弱的棕黃色沉淀顆粒，為弱陽性或陰性。比較A、B、C、D表明，IN11噬菌體能與Co-HUVECs特異性結(jié)合，而與HUVECs或GES細(xì)胞不結(jié)合或弱結(jié)合，兩者相比有顯著差異。
圖7是IN11噬菌體的免疫組織化學(xué)染色鑒定(SP法，A/B×200，C/D×100)圖示，圖中AIN11噬菌體在胃癌組織上的染色；BPBS陰性對照；CCD31陽性對照；DIN11噬菌體在非癌人胃組織(慢性淺表性胃炎，CSG)上的染色。圖A中胃癌組織血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)棕色沉淀顆粒，血管結(jié)構(gòu)顯示清楚，呈陽性，與圖C的CD31陽性對照相似。圖B中無棕色顆粒，為陰性。圖D中非癌人胃組織未見棕色沉淀顆粒，呈陰性。比較A、B、C、D表明，IN11噬菌體能特異結(jié)合于胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，而與非癌人胃組織血管內(nèi)皮細(xì)胞無明顯結(jié)合，兩者相比有顯著差異。
圖8是細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗圖示，圖中實線表示活細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗，虛線表示競爭ELISA實驗。兩種實驗結(jié)果均表明，隨著GEBP11合成肽濃度的增高，抑制率不斷上升，當(dāng)GEBP11濃度在100-400μg/ml時，抑制率維持在較高水平。這說明GEBP11合成肽對IN11噬菌體在Co-HUVECs上的結(jié)合活性有競爭抑制作用。
圖9是GEBP11合成肽與Co-HUVECs結(jié)合特異性的免疫熒光檢測(×200)圖示，圖中AGEBP11合成肽在Co-HUVECs上的免疫熒光檢測；BGEBP11合成肽在HUVECs上的免疫熒光檢測。圖A可見，Co-HUVECs胞膜、胞漿發(fā)出綠色熒光，呈陽性。圖B中HUVECs末見明顯綠色熒光，為陰性。這表明GEBP11合成肽能特異結(jié)合于Co-HUVECs上，而與HUVECs無明顯結(jié)合。
圖10是GEBP11合成肽與胃癌組織血管結(jié)合特異性的免疫熒光檢測(×200)圖示，圖中AGEBP11合成肽在人胃癌組織上的免疫熒光檢測；BGEBP11合成肽在非癌人胃組織(慢性萎縮性胃炎，CAG)上的免疫熒光檢測。圖A可見人胃癌組織血管結(jié)構(gòu)清晰，發(fā)出綠色熒光，呈陽性。而圖B中非癌人胃組織未見綠色熒光，為陰性。這表明GEBP11合成肽能特異結(jié)合于胃癌組織血管，而與非癌人胃組織血管無明顯結(jié)合。
權(quán)利要求
1.人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合短肽系列，其特征是它們分別由9個氨基酸組成，兩端各一個半胱氨酸形成二硫鍵，從而形成環(huán)狀，其氨基酸序列如下列之一短肽名稱 氨基酸序列(N→C)GEBP11 CTKNSYLMCGEBP3 CPPSKMSQCGEBP6 CLSSSLSDCGEBP9 CKNSLTMACGEBP12 CTNTMLPQCGEBP1 CPVSLQALCGEBP2 CDRHNLTFCGEBP4 CSSTTPNACGEBP5 CQPALQMKCGEBP13 CTTTDLRACGEBP14 CIPTHPRLCGEBP15 CNSTKYNQC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合短肽系列，其實現(xiàn)方法是通過Transwell共培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，利用共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞篩選噬菌體肽庫，進(jìn)而挑取噬菌體單克隆，進(jìn)行測序鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合短肽系列，其實現(xiàn)方法是用于篩選噬菌體肽庫的人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，采用帶有0.4μm孔徑半透膜的Transwell培養(yǎng)皿將人胃腺癌細(xì)胞SGC7901、正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)進(jìn)行間接共培養(yǎng)，它們通過分泌可溶性因子相互作用，誘導(dǎo)相應(yīng)分子表達(dá)的變化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合短肽系列，其實現(xiàn)方法是噬菌體肽庫篩選以經(jīng)典親和篩選方法為基礎(chǔ)，采用了液相結(jié)合、逐漸增加篩選強度、多輪消減等優(yōu)化措施，增加了獲得高親和力、特異結(jié)合噬菌體克隆的概率，并且對投入下一輪篩選噬菌體克隆的挑選和擴(kuò)增方法進(jìn)行改進(jìn)，以大量挑取單克隆和分組進(jìn)行分別擴(kuò)增的方法相結(jié)合，降低了偏態(tài)擴(kuò)增的風(fēng)險，逐漸縮小了篩選庫容量，保證了篩選的順利進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用噬菌體肽庫體外篩選所得到的人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合短肽(GEBPs)。本發(fā)明利用Transwell共培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，通過噬菌體肽庫體外篩選，成功獲得能與人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異結(jié)合的短肽，經(jīng)體外細(xì)胞結(jié)合實驗、免疫細(xì)胞/組織化學(xué)染色、體外結(jié)合競爭抑制實驗、免疫熒光檢測等方法進(jìn)行鑒定，證實了短肽與胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的特異性。這些短肽在胃癌診斷、血管靶向治療以及胃癌血管生成相關(guān)分子的研究等方面具有一定的理論意義和重大的潛在應(yīng)用價值。
文檔編號C07K7/00GK1709905SQ200510042810
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月14日
發(fā)明者梁樹輝, 丁杰, 林濤, 潘陽林, 吳開春, 樊代明 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)