專利名稱：血栓診斷和/或治療用含氣干粉活性劑及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽分子導(dǎo)向的活性劑及其制備工藝，特別涉及一種血栓診斷和/或治療用含氣干粉活性劑及其制備工藝。
背景技術(shù)：
血栓靶向診斷和治療的藥物(超聲造影劑)用于研究和臨床早已顯出其作為診斷工具的價(jià)值，并已有幾十年的歷史了，例如用于心血管系統(tǒng)以及組織微循環(huán)灌流等。也有利用各種造影劑增強(qiáng)診斷聲學(xué)圖像的方法，包括固體微顆粒懸液，乳化的大納米顆粒，氣泡，其它物質(zhì)包被的氣泡、液體或其干粉制劑。靶向藥物(超聲造影劑)應(yīng)該具有(1)能夠與超聲波輻射相互作用產(chǎn)生可檢測的信號(hào)；(2)有特異性的靶點(diǎn)(例如病理學(xué)的特定組織細(xì)胞結(jié)構(gòu))，并與靶分子具有親和力和特異性；(3)保持藥物的活性。
超聲造影劑為許多公開的資料所記載，并有部分產(chǎn)品上市銷售，如Bracco公司的產(chǎn)品Sonovue。這些聲學(xué)造影劑由類似紅細(xì)胞大小的含氣微泡組成，注入靜脈后在超聲下，具有線性散射和非線性散射的特性，可使血流豐富的實(shí)質(zhì)器官產(chǎn)生較強(qiáng)的對比顯影。
導(dǎo)向的超聲造影劑的例子有例如EP-A-0727225描述了導(dǎo)向的超聲造影劑，該報(bào)道組分與表面活性劑或白蛋白載體有關(guān)，包括作為載體的蛋白質(zhì)、肽、糖—基質(zhì)的細(xì)胞粘附分子配體，現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到這種方法會(huì)產(chǎn)生微泡的生長無法控制的問題，有潛在的引起血栓的可能(例如心腦血管血栓)。
WO-A-9320802描述了組織特異性配體(如抗體、肽)連接的單層脂質(zhì)體用于增強(qiáng)超聲成像，為沒有氣體的超聲增強(qiáng)造影劑。本技術(shù)也描述了在血纖維蛋白，血栓，動(dòng)脈粥樣硬化癥區(qū)域的導(dǎo)向造影應(yīng)用。也有一些導(dǎo)向超聲造影劑的出版物，談到可利用單克隆抗體作為載體材料的，但都沒有給出細(xì)節(jié)，例如WO-A-9300933，WO-A-9401140，WO-A-9428874。
CN1234742A和CN1302211A描述了由形成膜的表面活性劑物質(zhì)單分子層所穩(wěn)定的充氣微泡，包括導(dǎo)向的診斷和/或治療劑的組分，報(bào)道為水懸液，該組分表面活性劑采用磷脂及其衍生物、脂肽，可與受體結(jié)合的多種公開資料中的功能基團(tuán)，其中也敘述了與血液粘度，出血，血栓，溶栓相關(guān)的已知的配體和受體，另外也給出了一個(gè)血栓導(dǎo)向脂肽和溶組織纖溶酶原激活物微泡的制備。這些報(bào)道組分的受體和配體為公開，其主要通過其組份的表面活性劑的特殊功能基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合以形成穩(wěn)定的微泡。對導(dǎo)向分子(即靶分子特異性結(jié)合到體內(nèi)某位置或組織的分子)，具體的說就是結(jié)合到血栓的有效分子，沒有給出詳細(xì)的重要的實(shí)際細(xì)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可保證長時(shí)間多肽，蛋白，藥物的穩(wěn)定性和活性，且具有使用的方便性的高親和力的血栓診斷和/或治療含氣干粉活性劑及其制備工藝。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是1)多肽H-Pro-A-B-C-Asp-D-Oh的合成首先采用1mmol的氨基酸試劑瓶，在自動(dòng)化肽合成儀上用Fmoc樹脂以0.1mmol的規(guī)模將氨基酸合成多肽，在合成多肽之前用HBTU預(yù)活化氨基酸，將合成的多肽置于TFA溶液中2-3小時(shí)，得到粗品，再以5ml/分鐘的流量及20-40％B梯度，用制備型HPLC純化所得的粗品；2)脂質(zhì)-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH的合成先將所述的多肽融入預(yù)冷的PBS中攪拌直至完全溶解，使多肽的終濃度為0.1mol/L，室溫放涼，在4℃下預(yù)冷2小時(shí)，在預(yù)冷的多肽PBS溶液中按脂質(zhì)H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH為1∶99～99∶1的摩爾比加入脂質(zhì)，在4℃條件下攪拌4小時(shí)，待完全成乳白色混懸液后，4℃以下冷凍干燥；3)DPPG和脂質(zhì)-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH含氣凍干粉的制備將脂質(zhì)-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH與DPPG按20∶1～1∶20的摩爾比溶解在水中，使脂質(zhì)-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH和DPPG混合后的質(zhì)量百分比濃度為0.5％，在40℃條件充分?jǐn)嚢杌靹蚣s40～60分鐘后，加入表面活性劑使表面活性劑的質(zhì)量百分比濃度為1～20PPm的，室溫下攪拌混勻后加入穩(wěn)定劑，使穩(wěn)定劑的質(zhì)量百分比濃度為1-10％，混勻30分鐘后加入凍干瓶中4℃以下低溫下冷凍干燥，完全干燥后，加入0.01-1.0Mpa個(gè)大氣壓的氣體封閉即可。
本發(fā)明所述的多肽H-Pro-A-B-C-Asp-D-Oh中的A為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬酰胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺酰胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；B為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬酰胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺酰胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；C為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬酰胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺酰胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；D為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬酰胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺酰胺)或Gly(甘胺酸)或rp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基。Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)；脂質(zhì)為二硬脂酸磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酸磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、膽固醇、神經(jīng)鞘脂類、神經(jīng)鞘氨醇，神經(jīng)磷脂，神經(jīng)酰胺，腦苷脂類，腦硫脂類，神經(jīng)節(jié)苷脂，葡萄糖苷(脂)酰鞘氨醇，4-羥雙氫(神經(jīng))鞘氨醇；L-a-磷酸卵磷脂、血小板激活因子、磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇-4-磷酸、磷脂酰肌醇-4、5-二磷酸鹽、心磷脂，磷脂酸，溶血磷脂、與生物有關(guān)的磷脂的衍生物、磷脂酰乙醇胺的衍生物、磷酸卵磷酯的衍生物、磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇磷酸的衍生物、磷脂酸的衍生物、磷脂酰甘油的衍生物、心磷脂衍生物、甘油二酯的衍生物、磷脂酰乙醇胺-NH2末端基團(tuán)、己酰胺基團(tuán)、十二烷基酰胺基團(tuán)、磷脂酰巰乙胺、丁二酰基團(tuán)、戊二?；鶊F(tuán)、十二烷羧基基團(tuán)、生物素基團(tuán)、磷脂酰乙二醇、生物素化的磷脂帽、脂肪酸修飾的衍生物、溶血磷脂膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷酸甘油酯、溶血磷脂酸、烷基磷酸膽堿、氧化的脂質(zhì)、生物素化的脂質(zhì)、縮醛磷脂、聚合的磷脂、鹵代磷脂、氟化磷脂、同位素標(biāo)記磷脂、聚PEG化的磷脂、PEG末端有功能基團(tuán)的聚PEG化磷脂DSPE-mPEG-CarboxylicAcid、DSPE-mPEG-Maleimide、DSPE-mPEG-PDP、DSPE-mPEG-Amine、DSPE-mPEG-Biotin或DSPE-mPEG-BCT；表面活性劑為棕櫚酸、油酸或亞麻酸；穩(wěn)定劑為甘露醇、丙三醇或聚乙二醇；氣體為氮?dú)?、氧氣、二氧化碳、氫氣、惰性氣體、硫氟化物、全氟碳，全氟化的酮、全氟化的醚、六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷或全氟戊烷。
按照本發(fā)明的制備方法制成的含氣干粉活性劑每支藥物含1-25mg的脂質(zhì)-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH、25-1mg的DPPG、0.01-0.4mg的表面活性劑、0.1-5.0mg的穩(wěn)定劑和0.01-1.0Mpa的氣體。
本發(fā)明基于血栓的特異性結(jié)合分子，篩選合成了系列血栓特異性高親和力的多肽分子，基于該分子的凍干粉報(bào)道物，其中凍干粉在一定的容器內(nèi)并密封含有一定壓力的氣體。這樣，例如，采用混合脂質(zhì)形成彈性增強(qiáng)的微泡，其增強(qiáng)超聲回波性能，其中高親和力的活性分子的作用使聚集濃度增加，回波性加強(qiáng)。這樣，應(yīng)用的多肽分子是強(qiáng)烈的血小板抑制劑，有抗血栓形成作用。這樣可保證長時(shí)間多肽，蛋白，藥物的穩(wěn)定性和活性，且具有使用的方便性。


圖1是本發(fā)明樣品鑒定的質(zhì)譜圖，其中橫坐標(biāo)為分子量，縱坐標(biāo)為百分比強(qiáng)度；
圖2是本發(fā)明高效液相色譜圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為強(qiáng)度；圖3是影像強(qiáng)度圖，其中橫坐標(biāo)為注射前后，縱坐標(biāo)為顯影強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
本發(fā)明的一個(gè)有利的實(shí)施方案是基于另外的發(fā)現(xiàn)，即與病變組織血栓特異性結(jié)合的導(dǎo)向分子——合成多肽，能與血小板活化時(shí)的一個(gè)糖蛋白受體結(jié)合GPIIIa/IIb的有效部位結(jié)合，阻止血小板的進(jìn)一步活化和聚集，該性質(zhì)使它成為有效的顯影溶栓劑。該性質(zhì)是利用受體、配體結(jié)合，多肽分子拮抗了配體的激活作用而實(shí)現(xiàn)的。這些靶向藥物可以借助合成的多肽分子有效的結(jié)合到正在形成的血栓表面，血栓的超聲顯影增強(qiáng)或原來不能顯影的部位的血栓顯影。另外一個(gè)利用該導(dǎo)向分子的有利的一個(gè)方面是能夠在血栓形成的早期提供增強(qiáng)超聲回波，血栓形成后(即陳舊性血栓)，血小板激活漸弱或消失，導(dǎo)向分子結(jié)合漸弱，不提供增強(qiáng)的回波信號(hào)。本發(fā)明特別適于血栓的早期靶向定位診斷和新舊血栓的鑒別。
任何生物兼容性的氣體均可存在于報(bào)道物內(nèi)，并被密封在容器內(nèi)。本發(fā)明所使用的氣體包括在正常人體溫37℃下實(shí)質(zhì)上或完全為氣體的任何物質(zhì)，包括它們的混合物。例如，這些氣體包括，空氣；氮?dú)猓谎鯕?；二氧化碳；氫氣；惰性氣體；硫氟化物；六氟化硒；鹵代硅烷；低分子量的碳?xì)浠衔?；?如甲、乙、丙、丁、戊烷)；環(huán)烷(如環(huán)丙烷，環(huán)丁烷，環(huán)戊烷)；烯(如乙烯，丙烯，丙二烯或丁烯)；炔(如乙炔，丙炔)；醚；酮；酯；低分子量鹵代碳?xì)浠衔?；鹵代氣體中的至少一個(gè)鹵原子為氟所取代。本發(fā)明優(yōu)選六氟化硫。
本發(fā)明報(bào)道物內(nèi)的脂質(zhì)原則上是任何在液相中可成膜的天然或人工合成脂質(zhì)、類脂。有效的磷脂的例子包括腦磷脂和卵磷脂及其合成、半合成物，如二硬脂酸磷脂酰乙醇胺，二棕櫚酸磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油；天然的磷脂包括去毒的脂質(zhì)A；膽固醇；神經(jīng)鞘脂類，如神經(jīng)鞘氨醇，神經(jīng)磷脂，神經(jīng)酰胺，腦苷脂類，腦硫脂類，神經(jīng)節(jié)苷脂，葡萄糖苷(脂)酰鞘氨醇，植物鞘氨醇及其衍生物(如4-羥雙氫(神經(jīng))鞘氨醇)；丙三醇為基本結(jié)構(gòu)的脂類，如膽堿類(如L-a-磷酸卵磷脂，血小板激活因子)，如磷脂酰甘油，如乙醇胺類(如磷脂酰乙醇胺)，如肌醇類(如磷脂酰肌醇，磷脂酰肌醇-4-磷酸，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸鹽)，心磷脂，磷脂酸，溶血磷脂。
合成類脂質(zhì)包括1、與生物有關(guān)的脂質(zhì)衍生物，(1)如磷脂酰乙醇胺的衍生物(如不對稱酰基基團(tuán)上面為不同的碳鏈長度的脂肪酸所取代，對稱的為相同的不同碳鏈長度的脂肪酸所取代)；如下表所列含有不對稱碳鏈的磷脂酰乙醇胺的衍生物

含有對稱碳鏈的磷脂酰乙醇胺的衍生物碳數(shù)目 衍生物6:0 Dicaproyl二己?；?
8:0 Dioctanoyl二辛酰10:0Dicapryl二辛酸的12:0Dilauroyl二十二(烷)酰14:0Dimyristoyl二肉豆蔻酰16:0Dipalmitoyl二棕櫚酰16:0[(CH3)4]Diphytanoyl二植烷酰16:1Dipalmitoleoyl二棕櫚油酰(基)17:0Diheptadecanoyl二-十七烷酰18:0Distearoyl二硬脂酰18:1(delta 9-cis) Dioleoyl二油酰18:1(delta 9-trans) Dielaidoyl二反油酰18:2Dilinoeoyl二亞油酰18:3Dilinolenoyl二亞麻油酰20:4Diarachidonoyl二花生四烯酰Docosa-hexaenoyl22:6二二十二-六乙基(2)磷酸卵磷酯的衍生物含有不對稱脂肪酸鏈的磷酸卵磷酯的衍生物

含有對稱脂肪酸鏈的磷酸卵磷酯的衍生物




(3)磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇磷酸的衍生物1，2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-[Phosphoinositol-4，5-Bisphosphate]1，2-二辛酰-甘油-3-[磷酸肌醇-4，5-二磷酸鹽(酯)]1，2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-[Phosphoinositol-3，5-Bisphosphate]1，2-二辛酰-甘油-3-[磷酸肌醇-3，5-二磷酸鹽(酯)]1，2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-[Phosphoinositol-3，4-Bisphosphate]1，2-二辛酰-甘油-3-[磷酸肌醇-3，4-二磷酸鹽(酯)]1，2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-[Phosphoinositol-3，4，5-Trisphosphate]1，2-二辛酰-甘油-3-[磷酸肌醇-3，4，5-三磷酸鹽(酯)]L-α-Phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate(brain)L-α-磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸鹽(酯)(腦)L-α-Phosphatidylinositol-4-phosphate(brain)L-α-磷脂酰肌醇-4-磷酸鹽(酯)(腦)
L-α-Phosphatidylinositol(liver)L-α-磷脂酰肌醇(肝)L-α-Phosphatidylinositol(soy)L-α-磷脂酰肌醇(大豆)(4)磷脂酸的衍生物含不對稱脂肪酸鏈的磷脂酸的衍生物

含對稱脂肪酸鏈的磷脂酸的衍生物

(5)磷脂酰甘油的衍生物含不對稱脂肪酸鏈的磷脂酰甘油的衍生物

含對稱脂肪酸鏈的磷脂酰甘油的衍生物碳數(shù)目衍生物Dicaproyl二6:0己?；鵇ioctanoyl8:0二辛酰Dicapryl二10:0辛酸的12:0 Dilauroyl二十二(烷)酰Dimyristoyl二14:0肉豆蔻酰
Dipalmitoyl二16:0棕櫚酰Diphytanoyl二16:0[(CH3)4]植烷酰Dipalmitoleoyl二16:1棕櫚油酰(基)Diheptadecanoyl二-十七17:0烷酰Distearoyl二18:0硬脂酰Dioleoyl二18:1(delta 9-cis)油酰18:1(delta 9-trans) Dielaidoyl二反油酰18:2 Dilinoeoyl二亞油酰Dilinolenoyl二亞麻油18:3酰Diarachidonoyl二20:4花生四烯酰Docosa-hexaenoyl22:6二-二十二-六乙基(6)心磷脂衍生物

(7)甘油二酯的衍生物


2.頭部含有修飾基團(tuán)的衍生物具有與蛋白、肽、藥物連接的功能基團(tuán)的衍生物，如下圖所示(1)磷脂酰乙醇胺Phosphatidylethanolamine，-NH2末端基團(tuán)Phosphatidylethanolamine

(2)、N-Caproylamine-PE，己酰胺基團(tuán)N-Caproylamine-PE

(3)、N-Dodecanylamine-PE十二烷基酰胺基團(tuán)N-Dodecanylamine-PE

4、Phosphatidyl thioethanol 磷脂酰巰乙胺Phosphatidylthioethanol 5、N-MCC-PEN-MCC-PE 6、N-MPB-PEN-MPB-PE 7、N-PDP-PEN-PDP-PE 8、N-Succinyl-PE丁二?；鶊F(tuán)N-Succinyl-PE 9、N-Glutaryl-PE戊二?；鶊F(tuán)
N-Glutaryl-PE 10、N-Dodecanyl-PE十二烷羧基基團(tuán)N-Dodecanyl-PE 11、N-Biotinyl-PE生物素基團(tuán)N-Biotinyl-PE 12、Phosphatidyl Ethylene Glycol磷脂酰乙二醇Phosphatidyl Ethylene Glycol 13、N-Biotinyl Cap-PE生物素化的磷脂帽N-Biotinyl Cap-PE 3.另外含有兩個(gè)以上功能首基的衍生物如烷基磷酸鹽衍生物，甲基衍生物。PH敏感的脂質(zhì)，如二葡基甘油二酯-琥珀酸鹽(丁二酸鹽)。
本發(fā)明優(yōu)選的功能基團(tuán)為苯丙三唑碳酸酯(BCT)，如下圖 脂肪酸修飾的衍生物溶解磷脂類，如溶血磷脂膽堿，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰甘油，溶血磷酸甘油酯，溶血磷脂酸；烷基磷酸膽堿；氧化的脂質(zhì)；生物素化的脂質(zhì)；縮醛磷脂；聚合的磷脂(如丁二炔磷脂)；鹵代磷脂；氟化磷脂；同位素標(biāo)記磷脂(如氘標(biāo)記)；聚PEG化的磷脂；PEG末端有功能基團(tuán)的聚PEG化磷脂，如(DSPE-mPEG-CarboxylicAcid，DSPE-mPEG-Maleimide，DSPE-mPEG-PDP，DSPE-mPEG-Amine，DSPE-mPEG-Biotin，DSPE-mPEG-BCT)。本發(fā)明優(yōu)選DSPE-mPEG-BCT。另外，本發(fā)明優(yōu)選兩種、兩種以上的脂質(zhì)按比例混合形成干粉劑的主要成分，優(yōu)選的另外一種脂質(zhì)為DPPG。
本發(fā)明報(bào)道物內(nèi)所說的表面活性劑原則上可以是任何形式的膜形成材料。例如，陰離子表面活性劑(如羧酸鹽類，硫酸酯鹽類，磺酸鹽類，磷酸酯鹽類)；陽離子表面活性劑(如胺鹽類，季銨鹽型，氨基酸型，甜菜堿型)；非離子型表面活性劑(如聚乙二醇型，多元醇型)；葡萄糖酸鈉；硬脂酸鋅；脂肪酸類(如油酸，亞油酸，棕櫚酸)。
本發(fā)明優(yōu)選棕櫚酸。
本發(fā)明報(bào)道物所說的穩(wěn)定劑(保護(hù)劑)原則上可以是任何凍干粉針劑的保護(hù)劑。例如醇類(如脂肪族醇，丁醇，丙三醇)；多羥基化合物(如甘油)；糖類(如蔗糖，甘露糖醇，葡聚糖)；聚乙二醇(如聚乙二醇1000-10000)。優(yōu)選聚乙二醇。
本發(fā)明報(bào)道物的干粉制劑在水中相當(dāng)容易的重構(gòu)，加入溶劑(例如無菌蒸餾水)，在密閉的容器內(nèi)(優(yōu)選5-20ml注玻璃瓶)，用手振蕩約30秒。產(chǎn)生的微泡的大小是均勻的，達(dá)到了相當(dāng)好的可控的大小和比利分配范圍。冷凍干燥物的優(yōu)勢，在于蛋白、多肽類的藥物可以保存相當(dāng)長的時(shí)間活性，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)在4℃條件下，藥物活性可以穩(wěn)定保存18個(gè)月以上。水中重構(gòu)產(chǎn)生的微泡彌散物可在密閉的容器內(nèi)保存至少數(shù)個(gè)小時(shí)。
本發(fā)明提供了多肽導(dǎo)向的血栓靶向定位成象的報(bào)道物，另一個(gè)有效地實(shí)施例通過該報(bào)道物攜帶溶栓性治療性藥物。雖然在例如CN1234742A、CN1302211A和WO-A-9507072中已經(jīng)提出了將超聲造影劑和藥物組合，但這些產(chǎn)品缺乏與位點(diǎn)具特異性的載體，或已有載體(配體)，但載體(配體)均為公開。本發(fā)明配體(多肽)為本發(fā)明所專有，對血栓上的糖蛋白受體具有高度親和力和特異性。按照本發(fā)明所利用的溶栓治療性藥物可在微泡的內(nèi)部被攜帶，或附著在或摻入到微泡的膜上，部分藥物可在干粉劑中最終溶于溶劑中。這樣，治療藥物可通過本文提到的活性基團(tuán)共價(jià)結(jié)合或離子鍵結(jié)合，或物理性的與報(bào)道物混合在一起。
本發(fā)明有用的藥物的代表性例子包括組織抑制因子如單克隆抗體及其片段；血小板抑制劑如凝血酶受體抑制劑，GP IIb/IIIa受體抑制劑(如阿昔單抗)，ADP受體抑制劑，前列腺素，阿司匹林，磷酸二酯酶抑制劑；組織因子，肝素，水蛭素；t-PA，尿激酶，纖溶酶，鏈激酶，rt-纖溶酶原激活物，r-葡萄球菌激酶，阿尼普酶。
按照本發(fā)明的產(chǎn)品，可用于體外診斷系統(tǒng)，如體外血栓診斷試劑盒。在體外本發(fā)明利用有效的靶分子和那些已知的血栓診斷技術(shù)、方法，利用熒光標(biāo)記技術(shù)、納米標(biāo)記技術(shù)等實(shí)現(xiàn)體外血栓診斷。
按照本發(fā)利用的脂質(zhì)(衍生物)具有連接基團(tuán)，官能團(tuán)則與連接基團(tuán)相連，模式為脂質(zhì)-連接基團(tuán)-官能團(tuán)，本發(fā)明優(yōu)選脂質(zhì)-mPEG(聚乙二醇)-官能團(tuán)。mPEG為目前生物技術(shù)和生物藥物應(yīng)用中研究較多的一種聚合物，PEG在水中有良好的溶解性，每個(gè)PEG與兩個(gè)或三個(gè)水分子結(jié)合而高度水化，可阻止PEG修飾物表面被其它聚合物或蛋白質(zhì)吸附或遮蓋，另外PEG對蛋白質(zhì)和細(xì)胞的活性無損，共價(jià)結(jié)合的PEG為非免疫原性和非抗原性，PEG修飾對修飾分子的化學(xué)性質(zhì)、活性影響很小，PEG連接物可使體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取減少。本發(fā)明所用的PEG選用合適的分子量，例如200道爾頓和20千道爾頓之間。優(yōu)選3400道爾頓。
由于本發(fā)明的導(dǎo)向分子及其成分可以允許其它造影劑組件如X線造影劑，光造影劑，放射性造影劑，磁共振造影劑連接在報(bào)道物上，因此本發(fā)明的診斷和/或治療藥物也包括上述情況。
實(shí)施例1DSPE DPPG含氣凍干粉的制備與微泡重建將DSPE∶DPPG按1∶5(摩爾比)溶解在水中，在40℃條件充分混勻約40-60分鐘。顯微鏡鏡檢沒有大的顆粒后，加入8PPm的棕櫚酸表面活性劑，室溫下混勻15分鐘；后加入PEG4000作為穩(wěn)定劑，混勻30分鐘；后加入凍干瓶中低溫下冷凍干燥，完全干燥后，加入1個(gè)大氣壓的六氟化硫氣體封閉。重新加入溶劑(蒸餾水)約10倍體積，振蕩形成含有微泡的懸液，粒度分析儀分析微泡特性。如下·濃度 2-5×108/ml·D504.0μm·90％閾值 8μm·SF6包被體積 8μl/ml·pH 6.0 to 6.5·重構(gòu)后穩(wěn)定性 6hours實(shí)施例2包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH含氣凍干粉及生物評估該實(shí)施例為導(dǎo)向型微泡，該微泡含有線性結(jié)構(gòu)的本發(fā)明權(quán)利要求的多肽分子。
1)多肽H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-Oh的合成首先采用1mmol的氨基酸試劑瓶，在自動(dòng)化肽合成儀上用Fmoc樹脂以0.1mmol的規(guī)模將氨基酸合成多肽，在合成多肽之前用HBTU預(yù)活化所有氨基酸，將合成的多肽置于TFA溶液中2-3小時(shí)，可從樹脂上同時(shí)移走肽和側(cè)鏈保護(hù)基，得到100mg粗品，再以5ml/分鐘的流量及20-40％B梯度，用制備型HPLC純化所得的粗品得89mg；冷凍干燥后，將獲得純品進(jìn)行分析型HPLC分析和質(zhì)譜法鑒定，如圖1，預(yù)期分子量656.6，實(shí)測656.57，參見圖2，其純度為98.2％。
2)DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH的合成先將多肽溶入預(yù)冷的PBS中攪拌直至完全溶解，使多肽的終濃度為0.1mol/L，室溫放涼，在4℃下預(yù)冷2小時(shí)，在預(yù)冷的多肽PBS溶液中按DSPE-PEG3400-BTCH-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH摩爾比為5∶1的摩爾比加入脂質(zhì)，在4℃條件下攪拌4小時(shí)，待完全成乳白色混懸液后，冷凍干燥，由質(zhì)譜法和磁共振確認(rèn)形成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)；3)DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH含氣凍干粉的制備將DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH與DPPG按1∶5的摩爾比溶解在水中，使DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH和DPPG混合后的質(zhì)量百分比濃度為0.5％，在40℃條件充分?jǐn)嚢杌靹蚣s40-60分鐘后，加入8Ppm的棕櫚酸表面活性劑，室溫下攪拌混勻后加入1mgPEG4000作為穩(wěn)定劑，混勻30分鐘后加入凍干瓶中低溫下冷凍干燥，完全干燥后，加入0.01-1.0Mpa個(gè)大氣壓的六氟化硫氣體封閉，重新加入溶劑(蒸餾水)約10倍體積，振蕩形成含有微泡的懸液，粒度分析儀分析微泡特性。如下·濃度 2-5×108/ml·D504.0μm·90％閾值 8μm·SF6包被體積 8μl/ml·pH 6.0 to 6.5·重構(gòu)后穩(wěn)定性 6hours具有導(dǎo)向分子的含有DSPE、DPPG的干粉劑重構(gòu)后的充氣微泡的體外研究血栓結(jié)合試驗(yàn)研究取人外周靜脈血，將靜脈血涂于玻片上，室溫下干燥。取c)所形成的微泡懸液，懸液逐滴滴于玻片，懸液完全覆蓋玻片上形成的血栓。37℃孵育10分鐘，PBS沖洗三次，顯微鏡下觀察微泡結(jié)合血栓情況。
狗體內(nèi)血栓成像實(shí)驗(yàn)用戊巴比妥麻醉20公斤左右的雜種狗。分離暴露兩側(cè)髂靜脈，兩側(cè)髂靜脈內(nèi)人工造血栓。取c)所形成的微泡懸液經(jīng)上肢靜脈注射后，分別在注射0，1，3，5，10，15，25分鐘采用多普勒超聲成像觀察血栓強(qiáng)度變化。并與實(shí)施例1的干粉劑重構(gòu)后的微泡進(jìn)行比較，參見圖3，采用本發(fā)明的影像強(qiáng)度達(dá)到1200。
實(shí)施例3包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-抗纖維蛋白原單抗的含氣凍干粉利用實(shí)施例2中所描述的相同的方法制備含有抗纖維蛋白原單克隆抗體的凍干粉。另外，抗纖維蛋白原單克隆抗體可以物理性或通過離子鍵分散在干粉劑中。
實(shí)施例4包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-抗纖維蛋白單抗的含氣凍干粉利用實(shí)施例2中所描述的相同的方法制備含有抗纖維蛋白單克隆抗體的凍干粉。另外，抗纖維蛋白單克隆抗體可以物理性或通過離子鍵分散在干粉劑中。
實(shí)施例5包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-抗GP IIb/IIIa單抗的含氣凍干粉利用實(shí)施例2中所描述的相同的方法制備含有抗GP IIb/IIIa受體的單克隆抗體的凍干粉。另外，抗GP IIb/IIIa受體的單克隆抗體可以物理性或通過離子鍵分散在干粉劑中。
實(shí)施例6包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH和t-PA官能團(tuán)化的含氣凍干粉A、血栓親和性的脂肽DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH的合成利用實(shí)施例21)和22)中所描述的相同的方法制備合成血栓親和脂肽。
B、具有的t-PA的修飾1mg t-PA溶于0.2ml碳酸銨緩沖液中(a)。0.4mg硫-SMPB溶解在0.5mlDMSO中(b)。a液與b液室溫下混合振蕩反應(yīng)1小時(shí)。層析柱純化分離收集，質(zhì)譜法，磁共振鑒定合成物，冷凍干燥成干粉狀。
C、磷脂酰巰乙胺-硫-SMPB-t-PA的合成室溫下磷脂酰巰乙胺與B按摩爾比3∶1比例溶于PBS中振蕩1-2小時(shí)，制備型HPLC分離純化，質(zhì)譜法鑒定純化產(chǎn)物。
D、包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH和t-PA官能團(tuán)化的含氣凍干粉的制備利用施例23)中所描述的相同的方法制備含有t-PA官能團(tuán)化的含氣凍干粉。t-PA可以物理性或通過離子鍵分散在干粉劑中。
實(shí)施例7包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH和尿激酶官能團(tuán)化的含氣凍干粉利用實(shí)施例6中所描述的相同的方法制備含有尿激酶官能團(tuán)化的，或離子鍵，或物理性分散的含氣凍干粉劑。
實(shí)施例8包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH和鏈激酶官能團(tuán)化的含氣凍干粉利用實(shí)施例6中所描述的相同的方法制備含有鏈激酶官能團(tuán)化的，或離子鍵，或物理性分散的含氣凍干粉劑。
實(shí)施例9包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-凝血酶的含氣凍干粉利用實(shí)施例2中所描述的相同的方法，多肽分子被凝血酶取代合成包含DPPG和DSPE-PEG3400-BTC-凝血酶的含氣凍干粉，分離純化鑒定方法也同實(shí)施例2的方法。
權(quán)利要求
1.一種血栓診斷和/或治療用含氣干粉活性劑的制備工藝，其特征在于1)多肽H-Pro-A-B-C-Asp-D-Oh的合成首先采用1mmol的氨基酸試劑瓶，在自動(dòng)化肽合成儀上用Fmoc樹脂以0.1mmol的規(guī)模將氨基酸合成多肽，在合成多肽之前用HBTU預(yù)活化氨基酸，將合成的多肽置于TFA溶液中2-3小時(shí)，得到粗品，再以5ml/分鐘的流量及20-40％B梯度，用制備型HPLC純化所得的粗品；2)脂質(zhì)-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH的合成先將所述的多肽融入預(yù)冷的PBS中攪拌直至完全溶解，使多肽的終濃度為0.1mol/L，室溫放涼，在4℃下預(yù)冷2小時(shí)，在預(yù)冷的多肽PBS溶液中按脂質(zhì)H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH為1∶99～99∶1的摩爾比加入脂質(zhì)，在4℃條件下攪拌4小時(shí)，待完全成乳白色混懸液后，4℃以下冷凍干燥；3)DPPG和脂質(zhì)-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH含氣凍干粉的制備將脂質(zhì)-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH與DPPG按20∶1～1∶20的摩爾比溶解在水中，使脂質(zhì)-H-Pro-A-B-C-Asp-D-OH和DPPG混合后的質(zhì)量百分比濃度為0.5％，在40℃條件充分?jǐn)嚢杌靹蚣s40～60分鐘后，加入表面活性劑使表面活性劑的質(zhì)量百分比濃度為1～20PPm的，室溫下攪拌混勻后加入穩(wěn)定劑，使穩(wěn)定劑的質(zhì)量百分比濃度為1-10％，混勻30分鐘后加入凍干瓶中4℃以下低溫下冷凍干燥，完全干燥后，加入0.01-1.0Mpa個(gè)大氣壓的氣體封閉即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣干粉活性劑的制備工藝，其特征在于所說的多肽H-Pro-A-B-C-Asp-D-Oh中的A為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬酰胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺酰胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；B為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬酰胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺酰胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；C為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬酰胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺酰胺)或Gly(甘胺酸)或Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基；D為Ala(丙胺酸)或Arg(精胺酸)或Asn(天門冬酰胺)或Asp(天門冬胺酸)或Cys(半光胺酸)或Glu(麩胺酸)或Gln(麩胺酰胺)或Gly(甘胺酸)或rp(色胺酸)或Tyr(酪胺酸)或Val(纈胺酸)殘基。Hi(組胺酸)或Ile(異白胺酸)或Leu(白胺酸)或Lys(離胺酸)或Met(甲硫胺酸)或Phe(苯丙胺酸)或Pro(脯胺酸)或Ser(絲胺酸)或Thr(酥胺酸)或Trp(色胺酸)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣干粉活性劑的制備工藝，其特征在于所說的脂質(zhì)為二硬脂酸磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酸磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、膽固醇、神經(jīng)鞘脂類、神經(jīng)鞘氨醇，神經(jīng)磷脂，神經(jīng)酰胺，腦苷脂類，腦硫脂類，神經(jīng)節(jié)苷脂，葡萄糖苷(脂)酰鞘氨醇，4-羥雙氫(神經(jīng))鞘氨醇；L-a-磷酸卵磷脂、血小板激活因子、磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇-4-磷酸、磷脂酰肌醇-4、5-二磷酸鹽、心磷脂，磷脂酸，溶血磷脂、與生物有關(guān)的磷脂的衍生物、磷脂酰乙醇胺的衍生物、磷酸卵磷酯的衍生物、磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇磷酸的衍生物、磷脂酸的衍生物、磷脂酰甘油的衍生物、心磷脂衍生物、甘油二酯的衍生物、磷脂酰乙醇胺-NH2末端基團(tuán)、己酰胺基團(tuán)、十二烷基酰胺基團(tuán)、磷脂酰巰乙胺、丁二?；鶊F(tuán)、戊二?；鶊F(tuán)、十二烷羧基基團(tuán)、生物素基團(tuán)、磷脂酰乙二醇、生物素化的磷脂帽、脂肪酸修飾的衍生物、溶血磷脂膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷酸甘油酯、溶血磷脂酸、烷基磷酸膽堿、氧化的脂質(zhì)、生物素化的脂質(zhì)、縮醛磷脂、聚合的磷脂、鹵代磷脂、氟化磷脂、同位素標(biāo)記磷脂、聚PEG化的磷脂、PEG末端有功能基團(tuán)的聚PEG化磷脂DSPE-mPEG-Carboxylic Acid、DSPE-mPEG-Maleimide、DSPE-mPEG-PDP、DSPE-mPEG-Amine、DSPE-mPEG-Biotin或DSPE-mPEG-BCT。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣干粉活性劑的制備工藝，其特征在于所說的表面活性劑為棕櫚酸、油酸或亞麻酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣干粉活性劑的制備工藝，其特征在于所說的穩(wěn)定劑為甘露醇、丙三醇或聚乙二醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣干粉活性劑的制備工藝，其特征在于所說的氣體為氮?dú)?、氧氣、二氧化碳、氫氣、惰性氣體、硫氟化物、全氟碳，全氟化的酮、全氟化的醚、六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷或全氟戊烷。
7.按照權(quán)利要求1所述的血栓診斷和/或治療用含氣干粉活性劑的制備工藝制得的活性劑，其特征在于每支藥物含1-25mg的脂質(zhì)-H-Pro-Ser-Nva-Gly-Asp-Trp-OH、25-1mg的DPPG、0.01-0.4mg的表面活性劑、0.1-5.0mg的穩(wěn)定劑和0.01-1.0Mpa的氣體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種血栓診斷和/或治療用含氣干粉活性劑及其制備工藝，該活性劑為凍干粉，由多肽分子，脂質(zhì)，表面活性劑，穩(wěn)定劑和氣體構(gòu)成；活性分子為多肽，能與血栓形成時(shí)活化的血小板高親和力特異性結(jié)合，并對其有強(qiáng)烈的抑制作用，兼具血栓的靶向高親和力和強(qiáng)的溶栓作用。使用時(shí)加入溶劑振蕩形成藥液，經(jīng)靜脈注射給藥，可實(shí)現(xiàn)血栓靶向超聲成像，同時(shí)有強(qiáng)的溶栓活性。
文檔編號(hào)C07K7/00GK1727008SQ20051004276
公開日2006年2月1日 申請日期2005年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月7日
發(fā)明者王冰, 王梅, 艾紅, 李義平, 王亞文, 鄭黎明, 臧偉進(jìn) 申請人:西安交通大學(xué), 陜西嘉維科技發(fā)展有限公司