專利名稱：具有偶聯(lián)到b細(xì)胞表位上的人造t輔助細(xì)胞表位的分枝合成肽免疫原構(gòu)建體的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域一般來說，本發(fā)明涉及無載體的合成肽免疫原的構(gòu)建，更具體的說，涉及多種不同類型的新型多抗原肽系統(tǒng)的構(gòu)建，該系統(tǒng)包含具有連接到B細(xì)胞表位(B表位)上的特定T輔助細(xì)胞表位(Th表位)的單體，其能有效的引發(fā)針對此B表位的免疫反應(yīng)。這些新型多抗原肽系統(tǒng)在機(jī)體功能的免疫治療和免疫調(diào)節(jié)方面是理想的疫苗候選物。
2.相關(guān)領(lǐng)域說明脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)通過許多種方法保護(hù)機(jī)體使之免受抗原性侵略者的攻擊。通常，免疫反應(yīng)可以被分為兩類，即(1)涉及B淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞分泌的抗體的體液反應(yīng)和(2)涉及一類被稱為細(xì)胞毒(殺傷)T細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。體液反應(yīng)是通過抗體對抗原的識別和結(jié)合從而觸發(fā)免疫系統(tǒng)的其他成分來摧毀抗原而實(shí)現(xiàn)的。整個(gè)機(jī)制首先由被抗原呈遞細(xì)胞加工過的抗原啟動(dòng)，抗原呈遞細(xì)胞通過蛋白水解作用加工抗原產(chǎn)生肽片段，肽片段然后與MHC II類分子一起以復(fù)合物的形式暴露在細(xì)胞表面。當(dāng)B細(xì)胞通過它們的特異表面免疫球蛋白受體吞噬抗原后，它們可以作為高效的抗原呈遞細(xì)胞。接下來，T細(xì)胞受體(TCR)識別B細(xì)胞表面由MHC II類分子呈遞的肽上的T輔助細(xì)胞(Th)表位，這種識別導(dǎo)致指導(dǎo)T細(xì)胞幫助B細(xì)胞，最終導(dǎo)致針對完整的抗原的抗體的產(chǎn)生。由于細(xì)胞表面受體與配體結(jié)合后的二聚化或寡聚化是啟動(dòng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的通常的機(jī)制，或許，TCR對MHC/肽抗原復(fù)合物的結(jié)合啟動(dòng)了信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。T輔助細(xì)胞為B細(xì)胞提供了信號，從而使它們分泌特異于抗原的抗體。
由于免疫系統(tǒng)能產(chǎn)生具有高特異性分子識別能力的分子而且其適用于任何的分子靶標(biāo)，抗體技術(shù)已成為治療疾病和免疫調(diào)整機(jī)體調(diào)節(jié)過程的一個(gè)有力工具。但是，這種方法亦有缺陷，即，當(dāng)抗原是“自身”抗原時(shí)，其免疫原性差。通過使用包含促性腺激素釋放激素(GnRH)的免疫去勢疫苗的長期經(jīng)驗(yàn)，這一點(diǎn)已經(jīng)得到很好的說明。GnRH通過調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌，在繁殖中起到關(guān)鍵性的作用。它在下丘腦中產(chǎn)生，并通過專門的血管系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到垂體前葉腺。它負(fù)責(zé)選擇性地導(dǎo)致促卵泡激素(FSH)和促黃體素(LH)自垂體前葉腺釋放。FSH和LH控制精子發(fā)生、排卵和發(fā)情期并最終指導(dǎo)雄性激素(雄激素和睪酮)和雌性激素(雌激素和黃體激素)的分泌。已知針對GnRH的有效免疫能減少這些性激素并可以用作可逆避孕的方法。并且，抑制GnRH并進(jìn)而抑制性激素可以成為一種治療手段，用于治療激素依賴性的疾病，例如前列腺癌、乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位——雌激素介導(dǎo)的子宮內(nèi)膜組織在子宮外部的生長。此外，GnRH可以被用于雄性動(dòng)物的免疫去勢，以避免發(fā)情氣味(boar taint)——一種在未閹割的雄性動(dòng)物食品中出現(xiàn)的、由于高水平的雄甾酮而產(chǎn)生的令人討厭的氣味或味道，這通常通過機(jī)械閹割來消除，然而機(jī)械閹割會(huì)削弱去勢動(dòng)物的生長性狀。因而，免疫去勢具有在保持正常的生長性狀的同時(shí)消除發(fā)情氣味的優(yōu)點(diǎn)。
然而，就算是進(jìn)行多次免疫接種，免疫去勢疫苗也并非對所有的接種動(dòng)物都產(chǎn)生同樣的效果。只有在使用最小量的接種能對所有的動(dòng)物達(dá)到相同效果時(shí)，免疫去勢疫苗才會(huì)被接受作為外科閹割的替代方案。然而，以GnRH肽本身為基礎(chǔ)的疫苗無法達(dá)到此目標(biāo)，因?yàn)樵撘呙鐭o法誘導(dǎo)有效數(shù)量的對抗此自身分子的抗體。
已經(jīng)進(jìn)行了一些嘗試來誘導(dǎo)對抗自身分子的抗體。有報(bào)告顯示，當(dāng)小鼠用共價(jià)偶聯(lián)載體蛋白(以提供和B表位連接的新T輔助表位)的抗原免疫時(shí)，在小鼠體內(nèi)，抗原特異性B細(xì)胞可以被激發(fā)以產(chǎn)生高效價(jià)的高親和性IgG中和抗體；這種類型的抗體出現(xiàn)在許多自身免疫性疾病，例如重癥肌無力、紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等中。因此，一般是將包含B表位的小肽(其獨(dú)自施用時(shí)是弱免疫原)與外來蛋白載體(決定簇的來源)偶聯(lián)以刺激T輔助細(xì)胞。但是，一些問題伴隨著載體蛋白的使用而產(chǎn)生，即，1)肽與載體蛋白的化學(xué)偶聯(lián)可能會(huì)造成目的決定簇的改變并且隨機(jī)的反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致制品在大小和組成方面不均一，2)載體蛋白也許會(huì)導(dǎo)致不想要的免疫反應(yīng)，和3)肽-載體綴合物可能會(huì)激發(fā)不相關(guān)的免疫反應(yīng)，錯(cuò)誤地針對載體蛋白而非目標(biāo)位點(diǎn)。為了避免這些問題，Th表位被用于替換載體蛋白來引發(fā)T輔助細(xì)胞反應(yīng)。Th表位可以與B表位串聯(lián)連結(jié)形成合成肽構(gòu)建體。作為選擇方案，多抗原性肽(multiple antigenic peptide，MAP)的合成已經(jīng)被描述(Fitzmaurice等人，包含T細(xì)胞和B細(xì)胞決定簇的非線性合成免疫原的組裝和免疫學(xué)特性，vol 14，Vaccine 1996，pp553-560)，在多抗原性肽中，同一個(gè)肽(連接至B表位的Th表位)以多個(gè)拷貝通過α和ε氨基基團(tuán)組裝在賴氨酸核心上。
目前亦有理論假設(shè)，一般，具有多個(gè)拷貝的B表位的分枝免疫原是優(yōu)良的免疫原(Fitzmaurice等人，包含T細(xì)胞和B細(xì)胞決定簇的非線性合成免疫原的組裝和免疫學(xué)特性，vol 14，Vaccine 1996，pp553-560)。然而，有例外的情況，當(dāng)B細(xì)胞決定簇由序列TLKLATG決定、T細(xì)胞決定簇為ALNNRFQIKGVELKS或PKYVKQNTLKLA時(shí)，分枝的決定簇不象其串聯(lián)對應(yīng)物那樣能在CBA小鼠體內(nèi)引發(fā)出可檢測的抗體水平(Fitzmaurice等人，包含T細(xì)胞和B細(xì)胞決定簇的非線性合成免疫原的組裝和免疫學(xué)特性，vol 14，Vaccine 1996，pp553-560)。附圖7顯示了一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中分枝形式的GnRH B表位沒能在小鼠體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)。并且，在組裝設(shè)計(jì)的免疫原時(shí)，Th表位的選擇會(huì)影響合成的免疫原的效能。通過截短、添加和/或修飾已知的Th表位來仿造已知的天然Th表位所獲得的人工Th表位，已經(jīng)用于實(shí)驗(yàn)中與通常的弱免疫原偶聯(lián)以引發(fā)有效的免疫反應(yīng)。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及多種不同類型的新型非線性的、分枝的合成肽免疫原構(gòu)建體。每一個(gè)構(gòu)建體使用不同的人工Th表位。所述Th表位以MAP形式連接到B表位上，用來誘導(dǎo)靶向其所連接的B表位的抗體。這些新型肽免疫原構(gòu)建體引發(fā)高效價(jià)的特異地靶向所述B表位的抗體，并產(chǎn)生可測量的生物效力結(jié)果。本發(fā)明的組合物可以用于制備疫苗，以針對感染性疾病產(chǎn)生免疫保護(hù)，或用于免疫療法治療由于正常生理過程的失調(diào)導(dǎo)致的病癥，或用于免疫療法治療癌癥，以及干預(yù)和修飾正常生理過程。
附圖的簡要說明1.

圖1顯示了在用T1G和GT1免疫的雄性BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗G4抗體的數(shù)量和相應(yīng)的血清睪酮的水平。
2.圖1A顯示了所產(chǎn)生的抗體在結(jié)合G4，(T1)8，(sT1)8和(tT1)8方面的精細(xì)特異性。
3.圖2顯示了在用T1G和GT1免疫的雄性大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗G4抗體的數(shù)量。
4.圖2A顯示了所產(chǎn)生的抗體在結(jié)合G4，(T1)8，(sT1)8和(tT1)8方面的精細(xì)特異性。
5.圖2B顯示了在用T1G，GT1和PEK8G免疫的雄性大鼠體內(nèi)的血清睪酮水平。
6.圖3顯示了在用T1G免疫的小獵犬(beagle)體內(nèi)產(chǎn)生的抗G4抗體的數(shù)量和血清睪酮的水平。
7.圖4顯示了在用sT1G免疫的雄性BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗G4抗體的數(shù)量和血清睪酮的水平。
8.圖4A顯示了在用sT1G免疫的雄性BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體在結(jié)合G4，(T1)8，(sT1)8和(tT1)8方面的精細(xì)特異性。
9.圖5顯示了在用tT1G免疫的雄性BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗G4抗體的數(shù)量和血清睪酮的水平。
10.圖5A顯示了在用tT1G免疫的雄性BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體在結(jié)合G4，(T1)8，(sT1)8和(tT1)8方面的精細(xì)特異性。
11.圖6顯示了在用PG和GP免疫的雄性BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗G4抗體的數(shù)量和血清睪酮的水平。
12.圖7顯示了在用G4免疫的雄性BALB/c小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗G4抗體的數(shù)量和血清睪酮的水平。
13.圖8是包含4和8個(gè)通過賴氨酸核心連接的單體的MAP構(gòu)建體的示意圖。每一個(gè)單體包括一個(gè)拷貝的GnRH和/或一個(gè)拷貝的來源于流感病毒血細(xì)胞凝集素重鏈(T1，sT1，和tT1)或I型脊髓灰質(zhì)炎病毒VP1蛋白(P)的T細(xì)胞表位。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及多種不同的新型肽免疫原構(gòu)建體。在每一個(gè)構(gòu)建體中，與B表位(例如，免疫沉默表位)偶聯(lián)的Th表位被共價(jià)連接到一個(gè)分枝的樹狀核心上，這個(gè)核心由一個(gè)或多個(gè)雙官能單元例如賴氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和鳥氨酸構(gòu)成，每一類型的構(gòu)建體使用不同的Th表位。在這里使用的術(shù)語“肽免疫原”是指分枝的嵌合Th表位/B表位肽。通過將B表位連接到人工的Th表位上，可以誘導(dǎo)指向所述B表位的免疫反應(yīng)。因而，肽免疫原可以作為誘導(dǎo)針對自身分子的抗體的有用工具，以達(dá)到免疫治療和免疫調(diào)整機(jī)體調(diào)節(jié)過程的目的。
在某些實(shí)施方案中，Th表位衍生自流感病毒血細(xì)胞凝集素蛋白的重鏈。例如，SEQ ID NO 1(T1)能被用于引發(fā)針對以MAP形式連接到其上的B表位的抗體反應(yīng)。在所述肽免疫原中，SEQ ID NO 1通過常規(guī)的肽鍵共價(jià)連接到B表位的氨基端(N末端)或羧基端(C末端)，形成一個(gè)單體亞單位。在每一個(gè)單體中，Th表位可以直接地或通過一個(gè)間隔物連接到B表位上，間隔物通常包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基例如甘氨酸。間隔物在物理上將Th表位和B表位分隔開來，使得TCR可以更好地實(shí)現(xiàn)結(jié)合。間隔物還可以打斷由串聯(lián)的Th表位/B表位形成的人為二級結(jié)構(gòu)，并且由此消除對T輔助細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)可能造成的干擾。如圖8所示，在MAP形式中，四個(gè)或八個(gè)單體亞單位可以作為樹枝臂分布在樹狀核心基體上。四聚體和八聚體的MAP肽的合成可以利用Fmoc策略通過逐步的固相步驟人工完成，例如，分別在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上和在[Fmoc-Lys(Fmoc)]4-Lys2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上合成。Fmoc氨基酸的偶聯(lián)是通過使用二環(huán)己基碳二亞胺/羥基苯并三唑方法在N-甲基吡咯烷酮中完成的。在MAP合成完成以后，可以通過用三氟醋酸處理來解保護(hù)和從樹脂支持物上裂解合成的肽。最終的產(chǎn)物通過反相高效液相色譜和MALDI TOF質(zhì)譜來鑒定。
作為一個(gè)實(shí)例，SEQ ID NO 1能通過肽鍵直接連接在促性腺激素釋放激素(GnRH)的N末端(T1G)或C末端(GT1)形成單體，所述促性腺激素釋放激素(GnRH)為一個(gè)十氨基酸肽，即，SEQ ID NO 5。優(yōu)選連接在N末端。然后四個(gè)單體聚合成四聚體MAP形式。四聚體MAP形式中，T1G和GT1都誘導(dǎo)高效價(jià)的抗GnRH抗體。發(fā)現(xiàn)具有在N末端優(yōu)選連接的肽免疫原能降低雄性動(dòng)物體內(nèi)的睪酮水平。
另一個(gè)肽免疫原構(gòu)建體利用衍生自流感病毒血細(xì)胞凝集素蛋白的縮短的重鏈的Th表位，SEQ ID NO 2(sT1)。如上所述，SEQ ID NO 2既可以直接地也可以通過間隔物利用肽鍵與B表位共價(jià)連接。與B表位連接的SEQ ID NO 2的多個(gè)拷貝可以被聚合成四聚體或八聚體的MAP形式，見圖8，所述聚合可以通過Fmoc策略分別在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上或在[Fmoc-Lys(Fmoc)]4-Lys2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上利用逐步的固相合成方法來實(shí)現(xiàn)。Fmoc氨基酸的偶聯(lián)是通過使用二環(huán)己基碳二亞胺/羥基苯并三唑方法在N-甲基吡咯烷酮中完成的。在MAP肽合成完成以后，解保護(hù)和從樹脂支持物上裂解通過用三氟醋酸處理來完成。最終的產(chǎn)物通過反相高效液相色譜和MALDI TOF質(zhì)譜來鑒定。
例如，SEQ ID NO 2可以通過肽鍵直接連接到GnRH B表位的N末端(sT1G)。此肽免疫原可以聚合成四聚體MAP形式。它能夠誘導(dǎo)針對GnRH B表位的免疫反應(yīng)。
源自流感病毒血細(xì)胞凝集素蛋白的截短重鏈的人工Th表位，SEQ IDNO 3(tT1)，也能夠引發(fā)針對其所連接的B表位的免疫反應(yīng)。如上述，SEQ ID NO 3可以直接或通過間隔物連接到B表位上。肽免疫原可以聚合形成四聚體或八聚體MAP形式，見圖8。四聚體和八聚體的MAP形式可以通過Fmoc策略分別在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上或在[Fmoc-Lys(Fmoc)]4-Lys2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上利用逐步的固相方法來合成。Fmoc氨基酸的偶聯(lián)通過使用二環(huán)己基碳二亞胺/羥基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中完成。在MAP肽合成完成以后，解保護(hù)和從樹脂支持物上裂解通過用三氟醋酸處理來完成。最終的產(chǎn)物通過反相高效液相色譜和MALDI TOF質(zhì)譜來鑒定。
例如，SEQ ID NO 3可以通過肽鍵直接連接到GnRH B表位的N末端(tT1G)，肽免疫原以四聚體MAP形式聚合。它能夠誘導(dǎo)針對所述B表位的免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明的另一個(gè)肽免疫原構(gòu)建體中，源自I型脊髓灰質(zhì)炎病毒VP1蛋白的Th表位，SEQ ID NO 4(P)，可以連接到B表位的N末端或C末端以引發(fā)免疫反應(yīng)。SEQ ID NO 4可以在B表位的N末端或C末端被直接地或通過間隔物連接到B表位。這個(gè)肽免疫原構(gòu)建體可以采取四聚體或八聚體MAP聚合物形式，見圖8。此四聚體或八聚體的MAP聚合物可以通過Fmoc策略分別在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上或在[Fmoc-Lys(Fmoc)]4-Lys2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上利用逐步的固相過程來合成。Fmoc氨基酸的偶聯(lián)可以通過使用二環(huán)己基碳二亞胺/羥基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中完成。在MAP肽合成完成以后，解保護(hù)和從樹脂支持物上裂解通過用三氟醋酸處理來完成。最終的產(chǎn)物通過反相高效液相色譜和MALDITOF質(zhì)譜來鑒定。
作為實(shí)例，SEQ ID NO 4被連接到GnRH B表位上，在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中連接到N末端(PG)，在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中連接到C末端(GP)。在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，SEQ ID NO 4通過肽鍵直接連接GnRH B表位，而肽免疫原以四聚體MAP形式聚合。
由于Th表位可以由連續(xù)的或不連續(xù)的氨基酸片段組成，因此并非每一個(gè)Th表位的氨基酸片段都必然參與MHC識別。前述的Th表位可以包括免疫功能性同系物，包括免疫增強(qiáng)同系物，交叉反應(yīng)同系物，保守性替換、添加、缺失和插入，Th表位的片段，和與前述的Th表位序列有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或95％同源性(一致性)的序列。這里所使用的兩個(gè)氨基酸或核酸序列的同源性或一致性百分比使用Karlin和Aitschul修改(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90-5873-5877，1993)的Karlin和Altschul的運(yùn)算法則(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990)來確定。這一算法被加入Altschul等人的XBLAST程序中(J.Mol.Biol.215403-410，1990)?？梢杂肵BLAST程序進(jìn)行BLAST蛋白檢索，得分＝50，字長＝3，以獲得與參照多肽同源的氨基酸序列。當(dāng)使用XBALST程序時(shí)，使用該程序的默認(rèn)參數(shù)。
本發(fā)明還涉及包含免疫學(xué)有效量的肽免疫原和藥學(xué)上可接受的載體的組合物的遞送系統(tǒng)。肽免疫原的合適劑量通常包括每千克體重約0.005mg到約1.5mg肽免疫原。這一劑量可以分成多次施用，此時(shí)，每一劑中分到合適的量。正如免疫和治療領(lǐng)域所熟知的，給藥量依賴于患者的年齡、體重和健康狀況。合適量的肽免疫原可以以疫苗組合物的形式配制在佐劑、乳化劑、或其他任何可藥用載體，如明礬、不完全弗氏佐劑和ISA206(Montanide)中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地確定此制劑，包括立即和/或持續(xù)釋放的制劑。該制劑可以通過任何一種便利的途徑施用，包括皮下的、口服的、肌內(nèi)的、腹膜內(nèi)的，或其他腸胃外的或腸道的途徑。
作為一個(gè)具體實(shí)例，本發(fā)明提供一種方法誘導(dǎo)抗GnRH抗體以使睪酮降低到一個(gè)可以實(shí)現(xiàn)小鼠有效避孕的水平，該方法涉及向哺乳動(dòng)物施用一段合適時(shí)間的包含含有GnRH的肽免疫原的藥物組合物。適當(dāng)?shù)膭┝渴敲壳Э梭w重約1.428mg肽免疫原。
實(shí)施例1A.肽的合成。包含連接到GnRH B表位的N末端和C末端的SEQID NO 1的Th表位的肽免疫原，以四聚體MAP形式被合成。四聚體MAP肽的合成是通過逐步的固相方法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶聯(lián)通過使用二環(huán)己基碳二亞胺/羥基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中進(jìn)行。在MAP肽合成完成以后，解保護(hù)和從樹脂支持物上裂解通過用三氟醋酸處理來完成。最終的產(chǎn)物通過反相高效液相色譜和MALDI TOF質(zhì)譜來鑒定。
B.免疫方案。使用三組每組五只4-5周齡雄性BALB/c小鼠，其中一組是對照組。它們在特殊的無病原體條件下飼養(yǎng)，之后被轉(zhuǎn)移到常規(guī)的動(dòng)物房用于實(shí)驗(yàn)。所有工作，包括動(dòng)物的籠養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)和處理，一般都是按照動(dòng)物相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究的國際施行準(zhǔn)則(CIOMS Publication No.ISBN92 90360194，1985)來實(shí)施的。首先，小鼠被稱重。4-5周齡雄性BALB/c小鼠的平均重量是35克。第二步，對于第一組，50μg的免疫原肽(具有連接到GnRH B表位N末端的SEQ ID NO 1的四聚體MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用相等體積的佐劑ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小時(shí)。對于第二組，50μg的免疫原肽(具有連接到GnRH B表位C末端的SEQ ID NO1的四聚體MAP肽)被溶解在100μl PBS中，在100μl ISA206(Montanide)中乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小時(shí)。對于對照組，使用佐劑加上PBS。第三步，在第0周時(shí)，第一組和第二組中的每一只小鼠使用各自的肽免疫原以50μg/200μl的劑量進(jìn)行皮下接種。對照組的小鼠注射200μl包括PBS和佐劑(1∶1)的溶液。在第2周和第4周，皮下加增注射相同接種物。第四步，在第6周和第10周通過眼眶后血管叢穿刺收集血液進(jìn)行ELISA分析。收集到的血液在5000r.p.m.下離心10分鐘，血清在冰箱中以-20℃保存。
C.免疫原性測定。血清樣品通過ELISA檢驗(yàn)對抗不同肽——G4(GnRH的四聚體MAP形式)、八聚體MAP形式的T1(T1)8，八聚體MAP形式的sT1(sT1)8，和八聚體MAP形式的tT1(tT1)8——的抗體。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)來進(jìn)行。各種肽抗原被吸附在ELISA板上，濃度為0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氫鹽包被緩沖液(1.378g Na2CO3，2.94g NaHCO3于1L ddH2O中)中，并在4℃下孵育過夜。然后，包被緩沖液被丟棄，使用洗滌緩沖液(0.5ml Tween-20于1升1X PBS中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封閉并在4℃下孵育過夜。丟棄封閉溶液，ELISA板保存在-20℃供使用。測試血清在5％BSA中以1∶100X稀釋，每孔放置100μl。使測試血清在室溫反應(yīng)2小時(shí)。然后丟棄測試血清稀釋物，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。然后，山羊抗小鼠IgG(Sigma，F(xiàn)ab特異性，A-1293，Lot 28H4859，堿性磷酸酶綴合物)以1∶5000X稀釋，每孔放置100μl，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。然后棄去血清稀釋物，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。100μl/孔的顯色緩沖液(15mg pNPP(對硝基苯磷酸)(3片，Pierce的產(chǎn)品號34047)于15ml的10mM二乙醇胺緩沖液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下顯色半小時(shí)。吸光值，即光密度，在405nm處測量。
D.免疫原生物效能檢測。三組小鼠的睪酮水平在6wpi和10wpi時(shí)使用Ciba Corning自動(dòng)化學(xué)發(fā)光(ACSTM)睪酮檢測試劑盒來測定。ACS睪酮檢測試驗(yàn)的睪酮測量濃度最高可以達(dá)到1500ng/dL而最小可測濃度為10ng/dL(＝0.347nmol/L)。血清睪酮水平低于10ng/dL被認(rèn)為是“去勢”水平，而，低于57.6ng/dL(2nmol/L)被認(rèn)為是所研究的免疫避孕疫苗的應(yīng)答者。
E.結(jié)果。如圖1所示，在免疫后第10周，肽免疫原T1G和GT1都引發(fā)了針對G4的高抗體反應(yīng)，然而，GT1引起更強(qiáng)的針對G4的抗體反應(yīng)。所激發(fā)的抗體的精細(xì)特異性見圖2，與GT1比，T1G產(chǎn)生了抗(T1)8及其衍生物(sT1)8和(tT1)8的高抗體反應(yīng)。至于睪酮的降低，T1G在降低雄性小鼠的睪酮水平方面具有顯著的結(jié)果，如圖1所示，讀數(shù)為46ng/dL。
實(shí)施例2A.肽的合成。包含連接到GnRH B表位的N末端和C末端的SEQID NO 1的Th表位的肽免疫原，以四聚體MAP形式被合成。四聚體MAP肽的合成是通過逐步固相方法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶聯(lián)通過使用二環(huán)己基碳二亞胺/羥基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中進(jìn)行。在MAP肽合成完成以后，解保護(hù)和從樹脂支持物上裂解通過用三氟醋酸處理來完成。最終的產(chǎn)物通過反相高效液相色譜和MALDI TOF質(zhì)譜來鑒定。
B.免疫方案。使用五組4-5周齡雄性大鼠，三組為對照組。除第五組包括5只閹割的大鼠外，所有的組都包括4只大鼠。它們在特殊的無病原體條件下飼養(yǎng)，并被轉(zhuǎn)移到常規(guī)的動(dòng)物房用于實(shí)驗(yàn)。所有工作，包括動(dòng)物的籠養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)和處理，一般都是按照動(dòng)物相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究的國際施行準(zhǔn)則(CIOMS Publication No.ISBN92 90360194，1985)來實(shí)施的。首先，大鼠被稱重。4-5周齡雄性大鼠的平均重量是100克。第二步，對于第一組，每100μg的免疫原肽(具有連接到GnRH B表位N末端的SEQ ID NO 1的四聚體MAP肽)被溶解在200μl PBS中，用相等體積的佐劑ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小時(shí)。對于第二組，每100μg的免疫原肽(具有連接到GnRH B表位C末端的SEQ ID NO 1的四聚體MAP肽)被溶解在200μl PBS中，在200μl的ISA206(Montanide)中乳化，并使用POLYTRONPT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小時(shí)。對于第一個(gè)對照組(第三組)，使用化學(xué)偶聯(lián)到GnRH上的載體蛋白PEK8(有附加的C末端8個(gè)賴氨酸的假單胞菌外毒素)(PEK8G)。對于第二個(gè)對照組(第四組)，使用佐劑加PBS。對于第三個(gè)對照組(第五組)，這些被閹割的大鼠不接受注射。第三步，在第0、2和4周，第一組和第二組中的每一只大鼠用相應(yīng)的肽免疫原以100μg/400μl的劑量進(jìn)行皮下接種。第三組中的大鼠注射400μl的佐劑加PEK8G。在一個(gè)對照組(第四組)中的大鼠注射400μl的佐劑加PBS。另一個(gè)對照組中的被閹割的大鼠不進(jìn)行任何注射。在2wpsb，也就是第二次加強(qiáng)注射后的2周，收集血液。血液在5000r.p.m.下離心10分鐘，血清被保存在-20℃的冰箱中。
C.免疫原性測定。用血清樣品來檢測抗不同肽——G4(GnRH的四聚體MAP形式)、(T1)8，(sT1)8和(tT1)8——的抗體。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)來進(jìn)行。各種肽抗原被吸附到ELISA板上，濃度為0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氫鹽包被緩沖液(1.378g Na2CO3，2.94gNaHCO3于1L ddH2O中)中，并在4℃下孵育過夜。然后，包被緩沖液被丟棄，使用洗滌緩沖液(0.5ml Tween-20于1升1X PBS中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封閉并在4℃下孵育過夜。封閉溶液被丟棄，ELISA板被保存在-20℃供使用。測試血清在5％BSA中以1∶100X稀釋，每孔放置100μl。測試血清在室溫反應(yīng)2小時(shí)。然后丟棄測試血清稀釋物，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。然后，山羊抗大鼠IgG(Sigma，全分子，A-8438，Lot 95H8940，堿性磷酸酶綴合物)以1∶10000X稀釋，每孔放置100μl，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。然后血清稀釋物丟棄，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。100μl/孔的顯色緩沖液(15mg pNPP(3片，Pierce產(chǎn)品No.34047)于15ml的10mM二乙醇胺緩沖液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下顯色半小時(shí)。吸收值，即光密度，在405nm處測量。
D.免疫原生物效能檢測。四組大鼠的睪酮水平在2wpb時(shí)，也就是加強(qiáng)注射后2周，使用Ciba Corning自動(dòng)化學(xué)發(fā)光(ACSTM)睪酮檢測試劑盒來測定。ACS睪酮檢測試驗(yàn)的睪酮測量濃度最高可達(dá)到1500ng/dL，最小可測濃度為10ng/dL(＝0.347nmol/L)。
E.結(jié)果。如圖2所示，在2wpb時(shí)，肽免疫原T1G和GT1都激發(fā)了針對G4的抗體反應(yīng)。在激發(fā)的抗體的精細(xì)特異性方面，與GT1相比，T1G產(chǎn)生了抗(T1)8及其衍生物(sT1)8和(tT1)8的高抗體反應(yīng)，見圖2A。至于睪酮的降低，所有四只注射了T1G的大鼠均具有在應(yīng)答者水平上的降低的睪酮水平，見圖2B。
實(shí)施例3A.肽的合成。包含連接到GnRH B表位的N末端的SEQ ID NO 1的Th表位的肽免疫原，以四聚體MAP形式被合成。四聚體MAP肽的合成是通過逐步固相方法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶聯(lián)通過使用二環(huán)己基碳二亞胺/羥基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中進(jìn)行。在MAP肽合成完成以后，解保護(hù)和從樹脂支持物上裂解通過用三氟醋酸處理來完成。最終的產(chǎn)物通過反相高效液相色譜和MALDI TOF質(zhì)譜來鑒定。
B.免疫方案。使用五只3.5月齡的小獵犬。它們在特殊的無病原體條件下飼養(yǎng)，并被轉(zhuǎn)移到常規(guī)的動(dòng)物房用于實(shí)驗(yàn)。所有工作，包括動(dòng)物的籠養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)和處理，一般都是按照動(dòng)物相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究的國際施行準(zhǔn)則(CIOMS Publicaiton No.ISBN92 90360194，1985)來實(shí)施的。首先，獵犬被稱重。3.5月齡獵犬平均重量為5.83kg。第二步，對于測試組1(獵犬號B83，B87)，40μg的免疫原肽(具有連接到GnRH B表位的N末端的SEQ ID NO 1的四聚體MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用相等體積的佐劑ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematicmodel)在2000rpm下混合1小時(shí)。對于測試組2，(獵犬號B84，B85，B86)，160μg的免疫原肽(連接到GnRH B表位的N末端的SEQ ID NO1的四聚體MAP肽)被溶解在200μl PBS中，用相等體積的佐劑ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小時(shí)。第三步，在0月時(shí)，測試組1和測試組2中的獵犬分別以40μg/200μl和160μg/400μl的劑量皮下接種T1G肽免疫原。第3月時(shí)用相同接種物進(jìn)行皮下加強(qiáng)注射。第四步，每個(gè)月從肘正中靜脈收集血液。血液在5000r.p.m.下離心10分鐘，血清被保存在-20℃的冰箱中。
C.免疫原性測定。用血清樣品來檢測抗G4的抗體。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)來進(jìn)行。各種肽抗原被吸附到ELISA板上，濃度為0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氫鹽包被緩沖液(1.378g Na2CO3，2.94g NaHCO3于1L ddH2O中)中，并在4℃下孵育過夜。然后，包被緩沖液被丟棄，使用洗滌緩沖液(0.5ml Tween-20于1升1X PBS緩中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封閉并在4℃下孵育過夜。封閉溶液被丟棄，ELISA板被保存在-20℃供使用。測試血清在5％BSA中以1∶100X稀釋，每孔放置100μl。測試血清在室溫反應(yīng)2小時(shí)。然后測試血清稀釋物被棄去，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。然后，與堿性磷酸酶綴合的兔抗狗IgG(全分子)(Sigma，A0793)以1∶4000X稀釋，每孔放置100μl，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。然后抗體稀釋物被棄去，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。100μl/孔的顯色緩沖液(15mg pNPP(3片，Pierce產(chǎn)品No.34047)于15ml的10mM二乙醇胺緩沖液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下顯色半小時(shí)。吸收值，即光密度，在405nm處測量。
D.免疫原生物效能檢測。兩組獵犬的睪酮水平在2mpi(第一次接種后的月份數(shù))，3mpi，4mpi和5.5mpi時(shí)，使用Ciba Corning自動(dòng)化學(xué)發(fā)光(ACSTM)睪酮檢測試劑盒來測定。ACS睪酮檢測試驗(yàn)的睪酮測量濃度最高可達(dá)到1500ng/dL，最小可測濃度為10ng/dL(＝0.347nmol/L)。血清睪酮水平低于10ng/dL被認(rèn)為是“去勢”水平，然而，低于57.6ng/dL(2nmol/L)被認(rèn)為是所研究的免疫避孕疫苗的應(yīng)答者。
E.結(jié)果。如圖3所示，在以劑量160μg首次接種后的第4個(gè)月T1G產(chǎn)生了針對G4的最高抗體反應(yīng)。在首次接種后的第4個(gè)月，T1G也顯著地降低了獵犬B85和B86的睪酮水平，讀數(shù)分別是9和7ng/dL。
實(shí)施例4
A.肽的合成。包含連接到GnRH的SEQ ID NO 2的Th表位的肽免疫原，以四聚體MAP形式被合成。四聚體MAP肽的合成是通過逐步固相方法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-β Ala-Wang樹脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶聯(lián)通過使用二環(huán)己基碳二亞胺/羥基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中進(jìn)行。在MAP肽合成完成以后，解保護(hù)和從樹脂支持物上裂解通過用三氟醋酸處理來完成。最終的產(chǎn)物通過反相高效液相色譜和MALDITOF質(zhì)譜來鑒定。
B.免疫方案。使用兩組每組五只4-5周齡雄性BALB/c小鼠，一組作為對照組。它們在特殊的無病原體條件下飼養(yǎng)，并被轉(zhuǎn)移到常規(guī)的動(dòng)物房用于實(shí)驗(yàn)。所有工作，包括動(dòng)物的籠養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)和處理，一般都是按照動(dòng)物相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究的國際施行準(zhǔn)則(CIOMS Publicaiton No.ISBN9290360194，1985)來實(shí)施的。小鼠被稱重。4-5周齡雄性BALB/c小鼠的平均重量是35克。第二步，對于測試組，50μg的免疫原肽(具有連接到GnRH B表位N末端的SEQ ID NO 2的四聚體MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用相等體積的佐劑ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小時(shí)。對于對照組，使用佐劑加PBS。第三步，在第0周時(shí)，測試組中的每一只小鼠使用相應(yīng)肽免疫原以50μg/200μl的劑量進(jìn)行皮下接種。對照組的小鼠注射200μl PBS加佐劑。在第2周和第4周，用同樣的接種物進(jìn)行皮下的加強(qiáng)注射。第四步，在第6周、第8周和第10周通過眼眶后叢穿刺收集血液進(jìn)行ELISA分析。收集到的血液在5000r.p.m.下離心10分鐘，血清在冰箱中以-20℃保存。
C.免疫原性測定。血清樣品通過ELISA來檢測抗不同肽——G4、(T1)8，(sT1)8和(tT1)8的抗體。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)來進(jìn)行。各種肽抗原被吸附到ELISA板上，濃度為0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氫鹽包被緩沖液(1.378g Na2CO3，2.94g NaHCO3于1L ddH2O中)中，并在4℃下孵育過夜。然后，包被緩沖液被丟棄，使用洗滌緩沖液(0.5mlTween-20于1升1X PBS中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封閉并在4℃下孵育過夜。封閉溶液被丟棄，ELISA板被保存在-20℃供使用。測試血清在5％BSA中以1∶100X稀釋，每孔放置100μl。測試血清在室溫反應(yīng)2小時(shí)。然后測試血清稀釋物被丟棄，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。然后，山羊抗小鼠IgG(Sigma，F(xiàn)ab特異性，A-1293，Lot 28H4859，堿性磷酸酶綴合物)以1∶5000X稀釋，每孔放置100μl，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。然后抗體稀釋物被丟棄，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。100μl/孔的顯色緩沖液(15mg pNPP(3片，Pierce產(chǎn)品No.34047)于15ml的10mM二乙醇胺緩沖液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下顯色半小時(shí)。吸收值，即光密度，在405nm處測量。
D.免疫原生物效能檢測。兩組小鼠的睪酮水平在6wpi、8wpi和10wpi時(shí)使用Ciba Corning自動(dòng)化學(xué)發(fā)光(ACSTM)睪酮檢測試劑盒來測定。ACS睪酮檢測試驗(yàn)的睪酮測量濃度最高可達(dá)到1500ng/dL，最小可測濃度為10ng/dL(＝0.347nmol/L)。血清睪酮水平低于10ng/dL被認(rèn)為是“去勢”水平，而，低于57.6ng/dL(2nmol/L)被認(rèn)為是所研究的免疫避孕疫苗的應(yīng)答者。
E.結(jié)果。如圖4所示，在首次接種后第10周，sT1G引發(fā)了針對G4的最高抗體反應(yīng)。在所激發(fā)的抗體的精細(xì)特異性方面，sT1G也引起了抗(T1)8及其衍生物(sT1)8和(tT1)8的抗體反應(yīng)，其中抗(tT1)8反應(yīng)更強(qiáng)。至于睪酮的降低，sT1G沒有顯示在降低雄性小鼠體內(nèi)睪酮水平方面有顯著的結(jié)果。
實(shí)施例5A.肽的合成。包含連接到GnRH的SEQ ID NO 3的Th表位的肽免疫原，以四聚體MAP形式被合成。四聚體MAP肽的合成是通過逐步固相法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶聯(lián)通過使用二環(huán)己基碳二亞胺/羥基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中進(jìn)行。在MAP肽合成完成以后，解保護(hù)和從樹脂支持物上裂解通過用三氟醋酸處理來完成。最終的產(chǎn)物通過反相高效液相色譜和MALDITOF質(zhì)譜來鑒定。
B.免疫方案。使用兩組每組五只4-5周齡雄性BALB/c小鼠，一組作為對照組。它們在特殊的無病原體條件下飼養(yǎng)，并被轉(zhuǎn)移到常規(guī)的動(dòng)物房用于實(shí)驗(yàn)。所有工作，包括動(dòng)物的籠養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)和處理，一般都是按照動(dòng)物相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究的國際施行準(zhǔn)則(CIOMS Publicaiton No.ISBN9290360194，1985)來實(shí)施的。首先，小鼠被稱重。4-5周齡雄性BALB/c小鼠的平均重量是35克。第二步，對于測試組，50μg的免疫原肽(具有連接到GnRH B表位N末端的SEQ ID NO 3的四聚體MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用相等體積的佐劑ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小時(shí)。對于對照組，使用佐劑加PBS。第三步，在第0周時(shí)，測試組中的每一只小鼠使用相應(yīng)的肽免疫原以50μg/200μl的劑量進(jìn)行皮下接種。對照組的小鼠注射200μl PBS加佐劑。在第2周和第4周，用同樣的接種物進(jìn)行皮下加強(qiáng)注射。第四步，在第6周、第8周和第10周通過眼眶后叢穿刺收集血液進(jìn)行ELISA分析。收集到的血液在5000r.p.m.下離心10分鐘，血清在冰箱中-20℃保存。
C.免疫原性測定。血清樣品通過ELISA來檢測抗不同肽——G4、(T1)8，(sT1)8和(tT1)8的抗體。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)來進(jìn)行。各種肽抗原被吸附到ELISA板上，濃度為0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氫鹽包被緩沖液(1.378g Na2CO3，2.94g NaHCO3于1L ddH2O中)中，并在4℃下孵育過夜。然后，包被緩沖液被丟棄，使用洗滌緩沖液(0.5mlTween-20于1升1X PBS中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封閉并在4℃下孵育過夜。封閉溶液被丟棄，ELISA板被保存在-20℃供使用。測試血清在5％BSA中以1∶100X稀釋，每孔放置100μl。測試血清在室溫反應(yīng)2小時(shí)。然后測試血清稀釋物被丟棄，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。然后，山羊抗小鼠IgG(Sigma，F(xiàn)ab特異性，A-1293，Lot 28H4859，堿性磷酸酶綴合物)以1∶5000X稀釋，每孔放置100μl，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。然后抗體稀釋物丟棄，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。100μl/孔的顯色緩沖液(15mg pNPP(3片，Pierce產(chǎn)品No.34047)于15ml的10mM二乙醇胺緩沖液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下顯色半小時(shí)。吸收值，即光密度，在405nm處測量。
D.免疫原生物效能檢測。兩組小鼠的睪酮水平在6wpi、8wpi和10wpi時(shí)使用Ciba Corning自動(dòng)化學(xué)發(fā)光(ACSTM)睪酮檢測試劑盒來測定。ACS睪酮檢測試驗(yàn)的睪酮測量濃度最高可達(dá)到1500ng/dL，最小可測濃度為10ng/dL(＝0.347nmol/L)。血清睪酮水平低于10ng/dL被認(rèn)為是“去勢”水平，而，低于57.6ng/dL(2nmol/L)被認(rèn)為是所研究的免疫避孕疫苗的應(yīng)答者。
E.結(jié)果。如圖5所示，在首次接種后第6周，tT1G引發(fā)了針對G4的最高抗體反應(yīng)。在所激發(fā)的抗體的精細(xì)特異性方面，sT1G也引起了抗(T1)8及其衍生物(sT1)8和(tT1)8的抗體反應(yīng)，其中抗(tT1))8的反應(yīng)更強(qiáng)。至于睪酮的降低，tT1G在首次接種后第10周顯著降低雄性小鼠體內(nèi)的睪酮水平，讀數(shù)是34ng/dL。
實(shí)施例6A.肽的合成。包含連接到GnRH B表位的N末端和C末端的SEQID NO 4的Th表位的肽免疫原，以四聚體MAP形式被合成。四聚體MAP肽的合成是通過逐步固相法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang樹脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶聯(lián)通過使用二環(huán)己基碳二亞胺/羥基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中進(jìn)行。在MAP肽合成完成以后，解保護(hù)和從樹脂支持物上裂解通過用三氟醋酸處理來完成。最終的產(chǎn)物通過反相高效液相色譜和MALDI TOF質(zhì)譜來鑒定。
B.免疫方案。使用三組每組五只4-5周齡雄性BALB/c小鼠，一組作為對照組。它們在特殊的無病原體條件下飼養(yǎng)，并被轉(zhuǎn)移到常規(guī)的動(dòng)物房用于實(shí)驗(yàn)。所有工作，包括動(dòng)物的籠養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)和處理，都是按照動(dòng)物相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究的國際施行準(zhǔn)則(CIOMS Publicaiton No.ISBN9290360194，1985)來實(shí)施的。首先，小鼠被稱重。4-5周齡雄性BALB/c小鼠的平均重量是35克。第二步，對于第一組，50μg的免疫原肽(具有連接到GnRH B表位N末端的SEQ ID NO 4的四聚體MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用相等體積的佐劑ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小時(shí)。對于第二組，50μg的免疫原肽(具有連接到GnRH B表位C末端的SEQ ID NO4的四聚體MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用100μl ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小時(shí)。對于對照組，使用佐劑加PBS。第三步，在第0周時(shí)，第一組和第二組中的每一只小鼠使用相應(yīng)的肽免疫原以50μg/200μl的劑量進(jìn)行皮下接種。對照組的小鼠注射200μl PBS加佐劑。在第2周和第4周，用同樣的接種物進(jìn)行皮下加強(qiáng)注射。第四步，在第6周、第8周和第10周通過眼眶后叢穿刺收集血液進(jìn)行ELISA分析。收集到的血液在5000r.p.m.下離心10分鐘，血清在冰箱中以-20℃保存。
C.免疫原性測定。血清樣品通過ELISA來檢測抗各種肽——G4、(T1)8，(sT1)8和(tT1)8的抗體。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)來進(jìn)行。各種肽抗原被吸附到ELISA板上，濃度為0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氫鹽包被緩沖液(1.378g Na2CO3，2.94g NaHCO3于1L ddH2O中)中，并在4℃下孵育過夜。然后，包被緩沖液被丟棄，使用洗滌緩沖液(0.5mlTween-20于1升1X PBS中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封閉并在4℃下孵育過夜。封閉溶液被丟棄，ELISA板被保存在-20℃供使用。測試血清在5％BSA中以1∶100X稀釋，每孔放置100μl。測試血清在室溫反應(yīng)2小時(shí)。然后丟棄測試血清稀釋物，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。然后，山羊抗小鼠IgG(Sigma，F(xiàn)ab特異性，A-1293，Lot 28H4859，堿性磷酸酶綴合物)以1∶5000X稀釋，每孔放置100μl，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。然后抗體稀釋物丟棄，用洗滌緩沖液洗ELISA板三次。100μl/孔的顯色緩沖液(15mg pNPP(3片，Pierce產(chǎn)品No.34047)于15ml的10mM二乙醇胺緩沖液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下顯色半小時(shí)。吸收值，即光密度，在405nm處測量。
D.免疫原生物效能檢測。這三組小鼠的睪酮水平在6wpi、8wpi和10wpi時(shí)使用Ciba Corning自動(dòng)化學(xué)發(fā)光(ACSTM)睪酮檢測試劑盒來測定。ACS睪酮檢測試驗(yàn)的睪酮測量濃度最高可達(dá)到1500ng/dL，最小可測濃度為10ng/dL(＝0.347nmol/L)。血清睪酮水平低于10ng/dL被認(rèn)為是“去勢”水平，而，低于57.6ng/dL(2nmol/L)被認(rèn)為是所研究的免疫避孕疫苗的應(yīng)答者。
E.結(jié)果。如圖6所示，在首次接種后第10周，肽免疫原PG和GP都引發(fā)了針對G4的高抗體反應(yīng)，但，PG具有更強(qiáng)的抗G4的抗體反應(yīng)。至于睪酮的降低，PG和GP都沒有在降低雄性小鼠體內(nèi)睪酮水平方面顯示出顯著結(jié)果。
序列表<110>創(chuàng)生生物科技股份有限公司<120>具有偶聯(lián)到B細(xì)胞表位上的人造T輔助細(xì)胞表位的分枝合成肽免疫原構(gòu)建體<130>87155176-002001<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>13<212>PRT<213>流感病毒(Influenza virus)<220>
<221>肽<222>(1)..(13)<400>1Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr1 5 10<210>2<211>10<212>PRT<213>流感病毒<220>
<221>肽<222>(1)..(10)<400>2Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu1 5 10<210>3<211>8<212>PRT
<213>流感病毒<220>
<221>肽<222>(1)..(8)<400>3Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr1 5<210>4<211>13<212>PRT<213>Enterovirus Poliovirus<220>
<221>肽<222>(1)..(13)<400>4Lys Leu Phe Ala Val Trp Lys Ile Thr Tyr Lys Asp Thr1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>哺乳動(dòng)物<220>
<221>肽<222>(1)..(10)<400>5Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly1 5 10
權(quán)利要求
1.一種肽免疫原，其包含式[(Th)-(B)o-(靶抗原性位點(diǎn))]4K2K-βA或[(Th)-(B)o-(靶抗原性位點(diǎn))]8K4K2K-βA或[(靶抗原性位點(diǎn))-(B)o-(Th)]4K2K-βA或[(靶抗原性位點(diǎn))-(B)o-(Th)]8K4K2K-βA其中Th是具有與SEQ ID NO1有至少50％相同性的序列的T輔助細(xì)胞表位；B是間隔物；靶抗原性位點(diǎn)是B表位；K是雙官能單元；βA是β丙氨酸；o是從0到1的整數(shù)。
2.權(quán)利要求1的肽免疫原，其中所述間隔物包含三個(gè)或更少的甘氨酸殘基。
3.權(quán)利要求1的肽免疫原，其中所述B表位是GnRH。
4.權(quán)利要求1的肽免疫原，其中所述雙官能單元包括選自半胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和鳥氨酸的氨基酸。
5.一種組合物，其包含免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求1的肽免疫原。
6.權(quán)利要求5的組合物，其還包含藥學(xué)上可接受的載體。
7.按照權(quán)利要求5的組合物，其中所述肽免疫原的免疫學(xué)有效量是每劑每千克體重約0.005mg至1.5mg。
8.一種生產(chǎn)特異于權(quán)利要求1的肽免疫原的抗體的方法，包括將包含權(quán)利要求1的肽免疫原的組合物導(dǎo)入動(dòng)物的步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述B表位來自自身分子。
10.一種特異結(jié)合權(quán)利要求1的肽免疫原的抗體。
11.一種選擇性地結(jié)合SEQ ID NO5的序列中的表位的抗體。
12.一種特異于促性腺激素并且可將血清睪酮水平降低到少于57.6ng/dL的抗體，其通過以約0.005mg/kg至約1.43mg/kg的劑量給哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求1的肽免疫原而產(chǎn)生。
13.一種降低動(dòng)物體內(nèi)血清睪酮水平的方法，包括給動(dòng)物施用包含權(quán)利要求10、11或12的抗體的組合物。
14.一種肽免疫原，其包含式[(Th)-(B)o-(靶抗原性位點(diǎn))]4K2K-βA或[(Th)-(B)o-(靶抗原性位點(diǎn))]8K4K2K-βA或[(靶抗原性位點(diǎn))-(B)o-(Th)]4K2K-βA或[(靶抗原性位點(diǎn))-(B)o-(Th)]8K4K2K-βA其中Th是具有與SEQ ID NO2有至少50％相同性的序列的T輔助細(xì)胞表位；B是間隔物；靶抗原性位點(diǎn)是B表位；K是雙官能單元；βA是β丙氨酸；o是從0到1的整數(shù)。
15.權(quán)利要求14的肽免疫原，其中所述間隔物包含三個(gè)或更少的甘氨酸殘基。
16.權(quán)利要求14的肽免疫原，其中所述B表位是GnRH。
17.權(quán)利要求14的肽免疫原，其中所述雙官能單元包括選自半胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和鳥氨酸的氨基酸。
18.一種組合物，其包含免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求14的肽免疫原。
19.權(quán)利要求18的組合物，其還包含藥學(xué)上可接受的載體。
20.按照權(quán)利要求18的組合物，其中所述肽免疫原的免疫學(xué)有效量是每劑每千克體重約0.005mg至1.5mg。
21.一種生產(chǎn)特異于權(quán)利要求14的肽免疫原的抗體的方法，包括將包含權(quán)利要求14的肽免疫原的組合物導(dǎo)入動(dòng)物的步驟。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述B表位來自自身分子。
23.一種特異性結(jié)合權(quán)利要求14的肽免疫原的抗體。
24.一種肽免疫原，其包含式[(Th)-(B)o-(靶抗原性位點(diǎn))]4K2K-βA或[(Th)-(B)o-(靶抗原性位點(diǎn))]8K4K2K-βA或[(靶抗原性位點(diǎn))-(B)o-(Th)]4K2K-βA或[(靶抗原性位點(diǎn))-(B)o-(Th)]8K4K2K-βA其中Th是具有與SEQ ID NO3有至少50％相同性的序列的T輔助細(xì)胞表位；B是間隔物；靶抗原性位點(diǎn)是B表位；K是雙官能單元；βA是β丙氨酸；o是從0到1的整數(shù)。
25.權(quán)利要求24的肽免疫原，其中所述間隔物包含三個(gè)或更少的甘氨酸殘基。
26.權(quán)利要求24的肽免疫原，其中所述B表位是GnRH。
27.權(quán)利要求24的肽免疫原，其中所述雙官能單元包括選自半胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和鳥氨酸的氨基酸。
28.一種組合物，其包含免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求24的肽免疫原。
29.權(quán)利要求28的組合物，其還包含藥學(xué)上可接受的載體。
30.按照權(quán)利要求28的組合物，其中所述肽免疫原的免疫學(xué)有效量是每劑每千克體重約0.005mg至1.5mg。
31.一種生產(chǎn)特異于權(quán)利要求24的肽免疫原的抗體的方法，包括將包含權(quán)利要求24的肽免疫原的組合物導(dǎo)入動(dòng)物的步驟。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述B表位來自自身分子。
33.一種特異性結(jié)合權(quán)利要求24的肽免疫原的抗體。
34.一種特異于促性腺激素并且可以將血清睪酮水平降低到少于57.6ng/dL的抗體，其通過以約1.43mg/kg的劑量給哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求24的肽免疫原而產(chǎn)生。
35.一種降低動(dòng)物體內(nèi)血清睪酮水平的方法，包括給動(dòng)物施用包含權(quán)利要求33或34的抗體的組合物。
36.一種肽免疫原，其包含式[(Th)-(B)o-(靶抗原性位點(diǎn))]4K2K-βA或[(Th)-(B)o-(靶抗原性位點(diǎn))]8K4K2K-βA或[(靶抗原性位點(diǎn))-(B)o-(Th)]4K2K-βA或[(靶抗原性位點(diǎn))-(B)o-(Th)]8K4K2K-βA其中Th是具有與SEQ ID NO4有至少50％相同性的序列的T輔助細(xì)胞表位；B是間隔物；靶抗原性位點(diǎn)是B表位；K是雙官能單元；βA是β丙氨酸；o是從0到1的整數(shù)。
37.權(quán)利要求36的肽免疫原，其中所述間隔物包含三個(gè)或更少的甘氨酸殘基。
38.權(quán)利要求37的肽免疫原，其中所述B表位是GnRH。
39.權(quán)利要求36的肽免疫原，其中所述雙官能單元包括選自半胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和鳥氨酸的氨基酸。
40.一種組合物，其包含免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求36的肽免疫原。
41.權(quán)利要求40的組合物，其還包含藥學(xué)上可接受的載體。
42.按照權(quán)利要求40的組合物，其中所述肽免疫原的免疫學(xué)有效量是每劑每千克體重約0.005mg至1.5mg。
43.一種生產(chǎn)特異于權(quán)利要求36的肽免疫原的抗體的方法，包括將包含權(quán)利要求36的肽免疫原的組合物導(dǎo)入動(dòng)物的步驟。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述B表位來自自身分子。
45.一種特異性結(jié)合權(quán)利要求36的肽免疫原的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及合成肽免疫原的構(gòu)建以誘導(dǎo)特異于指定B表位的抗體的產(chǎn)生，所述B表位通常是自身分子。采用人工Th表位以分枝形式合成肽免疫原，其中所述Th表位以特定的方向直接或通過一個(gè)間隔物連接到B表位上。設(shè)計(jì)這種新型肽免疫原以引發(fā)高水平的抗體用于免疫治療或免疫調(diào)整機(jī)體調(diào)節(jié)過程。
文檔編號C07K14/11GK1603336SQ20041004512
公開日2005年4月6日 申請日期2004年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月8日
發(fā)明者黃仁斌 申請人:創(chuàng)生生物科技股份有限公司