專利名稱：：抗cd25的人單克隆抗體的制作方法抗CD25的人單克隆抗體相關(guān)申請本申請要求于2002年11月15日提交的美國臨時(shí)申請序號60/426,690的優(yōu)先權(quán)，該申請的完整內(nèi)容被收作本文參考.發(fā)明背景高親和力白細(xì)胞介素-2受體(IL-2R)是異源三體細(xì)胞表面受體，由ct，p和Yc-多肽鏈組成(Kd10'Um)55kDa的a-鏈，又被稱作IL-2Rct、CD25、p55和Tac(T細(xì)胞活化)抗原，它是IL-2R所特有的.p(CD122;P75)和Yc(CD132)鏈?zhǔn)羌?xì)胞因子受體超家族(血細(xì)胞生成素受體)的一部分并且是其他細(xì)胞因子受體，如IL-15R的功能性成分(Waldmann(1993)Immunol.Today14(6):264-70;Ellery等(2002)CytokineGrowthFactorRev.13(1):27-40).中等親和力受體是由P-和Yc-鏈組成的二聚體(KD10_9M),而低親和力受體由單體a-亞基組成，它沒有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力(KD108M)(Waldmann(1993)Im咖noLToday14(6):264-70).靜息T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞能表達(dá)少量CD25分子.不過，所述受體在激活時(shí)能快速轉(zhuǎn)錄并且表達(dá)(Ellery等(2002)CytokineGrowthFactorRev.13(1):27-40;Morris等(2000)Ann.Rheum.Dis*59(SuppU):il09-14).表達(dá)所述高親和力IL-2R的細(xì)胞，能過量表達(dá)CD25(CD25-亞基)，這會導(dǎo)致高和低親和力11^2的結(jié)合特征(Waldmann等(1993)Blood82(6):1701-12;deJong等(1996)J.Immunol.156(4):1339-48).CD25是在某些自身免疫病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、硬皮病和葡萄膜炎，及皮膚病，例如，牛皮褲和特應(yīng)性皮炎，和多種淋巴樣瘤，例如，T細(xì)胞白血病和何杰金病中由T細(xì)胞高水平表達(dá)的(Waldmann(1993)Immunol.Today14(6):264-70;Kuttler等(1999)J.Mol.Med.77(1):226-9).另外，CD25表達(dá)與同種異體移植物排斥和移植物抗宿主反應(yīng)相關(guān)(J0nes等(2002)J.Immunol.168(3):1123-1130;Anasetti等(1994)Blood84(4):1320-7),因此，CD25是抗體介導(dǎo)的治療的重要目標(biāo)，例如，用于減輕自身免疫病的炎癥，治療腫瘸，以及預(yù)防移植物排斥.不過，盡管所獲得的結(jié)果以及迄今所獲得的臨床經(jīng)驗(yàn)明確確定了CD25是免疫治療的有用目標(biāo)，它們還顯示目前可以獲得的鼠和嵌合抗體不能構(gòu)成理想的治療劑.因此，需要抗CD25的其他治療性抗體，它能有效預(yù)防和/或治療與表達(dá)CD25的細(xì)胞相關(guān)的多種疾病.發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防與表達(dá)CD25的細(xì)胞相關(guān)的疾病的新型抗體治療劑，所述疾病包括器官、組織和細(xì)胞移植物排斥，包括同種異體移植物和異種移植物排斥，移植物抗宿主疾病，自身免疫病，炎性和過度增殖性皮膚病，以及淋巴樣瘤等.本發(fā)明所包含的抗體的改進(jìn)之處在于它們是完全人的，因此，在患者體內(nèi)的發(fā)生免疫原性的可能性較小.根據(jù)它們的出色的功能(例如，治療)特性，所述抗體同樣是有利的.正如本文所顯示的，通過ELISA或流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，本發(fā)明的人抗體能結(jié)合CD25。本發(fā)明的人抗體通常能結(jié)合CD25，其離解平衡常數(shù)(KD)為大約為108M或更低，如10力M或更低，10lftM或更低，或10"M或更低，所述平衡常數(shù)是通過表面等離子體共振(SPR)技術(shù)在BIAcore3000儀器上測定的，用重組人IL"2Ra做配體，并且用所述抗體做分析物.所述抗體通常不與相關(guān)的細(xì)胞表面抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，并因此不會抑制它們的功能.另外，本發(fā)明的人抗體能抑制(例如，阻斷)CD25與它的配體IL-2的相互作用.例如，結(jié)合可以被抑制至少大約10%，20%，30%,40%,50%,60%，70%,80%,90%或100%.因此，可以通過本發(fā)明的人抗體抑制的能表達(dá)CD25的細(xì)胞，以及所迷細(xì)胞的細(xì)胞功能的例子包括，T細(xì)胞，B細(xì)胞和單核細(xì)胞.例如，正如本文所顯示的，本發(fā)明的人抗體能抑制IL-2與CD25結(jié)合。對IL"2與CD25結(jié)合的抑制作用，伴隨著對通過IL-2結(jié)合誘導(dǎo)的多種細(xì)胞機(jī)制的抑制.同樣正如本文所顯示的，本發(fā)明的人抗體能以刑重依賴性形式抑制抗-CD3抗體-誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖.同樣正如本文所顯示的，本發(fā)明的人抗體能以刑量依賴性形式抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR).在所述實(shí)驗(yàn)中對增殖的抑制作用可以通過ELISA測重的細(xì)胞團(tuán)積累的減少或通過BrdU在細(xì)胞DNA中的整合的減少監(jiān)控.本發(fā)明的人抗體包括IgGl(例如，IgGl，K和IgGl，入)和IgG4(例如，IgG4，K和IgG4，入)抗體.不過，本發(fā)明還包括其他抗體同種型，包括IgG2，IgG3，IgM,IgAl，IgA2，分泌型IgA,IgD和IgE.所述抗體可以是完整的抗體或它的抗原結(jié)合片段，包括，例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab，，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)(ab，)2，F(xiàn)v，單鏈Fv(scFv)片段或雙特異性抗體.另外，所述抗原結(jié)合片段包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白，它包栝(i)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽(如重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū))，(ii)與所述鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，和(iii)與CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū).所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白還公開于US2003/0118592和US2003/0133939中.本發(fā)明特定的人抗體包括被稱作AB1，AB7，AB11和AB12的抗體，它們是由在可變區(qū)分別包括如SEQIDNOs:1，5,9或13和SEQIDNOs:3,7,11或15所示出的核苷酸序列以及它們的保守性序列修飾的人重鏈和人K輕鏈核酸編碼的.在另一種實(shí)施方案中，所述人抗體的特征是具有包括分別如SEQIDNOs:2，6，10或14和SEQIDNOs:4，8，12或16所示出的氨基酸序列以及它們的保守性序列修飾的人重鏈和人K輕鏈可變區(qū).本發(fā)明其他特定的人抗體包括這樣的抗體，它們包括具有人重鏈和輕鏈CDR1，人重鏈和輕鏈CDR2，以及人重鏈和輕鏈CDR3的CDR(互補(bǔ)決定區(qū))，其中(a)所述人重鏈CDR1，CDR2和CDR3包括選自下列一組的氨基酸序列在閨l-10中所示出的CDRl，CDR2和CDR3氨基酸序列(SEQIDNOs:17-19，23-25，29-31或35-37),以及它們的保守性序列修飾，和(b)所述人輕鏈CDR1，CDR2和CDR3包括選自下列一組的氨基酸序列如圖l-10所示出的CDRl，CDR2和CDR3氨基酸序列(SEQIDNOs:20^22,26-28,32-34或38-40)，以及它們的保守性序列修飾.在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗-CD25抗體可能以下列特性中的一種或多種為特征a)對人CD25的特異性；b)對CD25的結(jié)合親和力相當(dāng)于KD為大約108M或更低，如109M或更低，10_lflM或更低，或10"M或更低，它是通過表面等離子體共振(SPR)技術(shù)在BIAcore3000儀器上測定的，用重組IL-2Ra做配體，并且用所述抗體做分析物；c)使T細(xì)胞產(chǎn)生耐受性的能力；d)阻斷CD25與它的配體IL^2的相互作用的能力；e)消除表達(dá)CD25的T細(xì)胞的能力；f)抑制表達(dá)CD2S的T細(xì)胞增殖的能力；g)抑制外周血單核細(xì)胞(PBMC)的抗-CD3抗體-誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的能力；h)阻斷混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)的能力；和/或i)使在T細(xì)胞上表達(dá)的CD25內(nèi)在化.在本文中，術(shù)語"使…產(chǎn)生耐受性"表示在用該抗原再次攻擊時(shí)，所述T細(xì)胞不能對該抗原產(chǎn)生反應(yīng).本發(fā)明的人抗-CD25抗體可以是衍生化的，與其他結(jié)合特異性聯(lián)系或與其他結(jié)合特異性共表達(dá).在具體實(shí)施方案中，所述抗體與針對不同靶抗原的一種或多種結(jié)合特異性聯(lián)系，所述靶抗原如效應(yīng)細(xì)胞上的抗原，罔此，本發(fā)明還包括能結(jié)合人CD25和一種或多種不同把抗原的雙特異性和多特異性分子，所述靶抗原如CD3，CD4，IL-15R,膜結(jié)合或受體結(jié)合的TNF-a，或膜結(jié)合或受體結(jié)合的IL-15.在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗-CD25抗體是衍生化的，與另一種功能性分子連接或共表達(dá)，例如，另一種肽或蛋白(例如，F(xiàn)ab片段).例如，所述抗體可以與一種或多種其他分子實(shí)體功能性連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)，.遣傳融合，非共價(jià)結(jié)合等)，如另一種抗體(例如，以便產(chǎn)生雙特異性或多特異性抗體)，細(xì)胞毒素，細(xì)胞配體或抗原(例如，以便產(chǎn)生免疫綴合物，如免疫毒素)。所述抗體還能與其他治療部分連接，例如，放射性同位素，小分子抗癌刑，抗炎劑，或免疫抑制刑.因此，本發(fā)明包含多種抗體綴合物，雙特異性和多特異性分子和融合蛋白，它們都能結(jié)合表達(dá)CD25的細(xì)胞，并且可將它們用于將其他分子靶向所迷細(xì)胞.本發(fā)明的人抗體，免疫綴合物，雙特異性和多特異性分子和組合物可用于多種方法中，所述方法用于抑制，殺傷和/或調(diào)節(jié)表達(dá)CD25的細(xì)胞的活性和/或生長(例如，增殖).在一種實(shí)施方案中，所述方法包括抑制表達(dá)CD25的T細(xì)胞增殖.在另一種實(shí)施方案中，所述方法包括抑制移植物抗宿主反應(yīng)，例如，MLR.在另一種實(shí)施方案中，所述方法包括殺傷表達(dá)CD25的細(xì)胞(例如，通過補(bǔ)體-介導(dǎo)的裂解或通過將所述抗體連接在細(xì)胞毒素上).優(yōu)選殺傷或抑制所述細(xì)胞，而又不殺傷或抑制不能表達(dá)CD25，但可能，例如，表達(dá)結(jié)構(gòu)上相關(guān)的細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞的活性(即，與相關(guān)的但是功能上不同的細(xì)胞表面抗原沒有交叉反應(yīng)性).可以用本發(fā)明的人抗體抑制或殺傷的表達(dá)CD25的細(xì)胞包括，例如，表達(dá)CD25的活化的T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，肝臟的肝巨噬細(xì)胞(Kii卯fercell)，和皮膚的朗格漢斯細(xì)胞.因此，本發(fā)明的人抗體可用于治療和/或預(yù)防多種疾病和狀況，其中，活化的表達(dá)CD25的細(xì)胞在發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮積極作用，所述治療和/或預(yù)防通過包括給患有所述疾病和狀況的患者施用所述抗體來進(jìn)行.可以治療(例如，改善)或預(yù)防的疾病的例子包括，但不局限于，移植物排斥，包括同種異體移植物和異種移植物排斥，出現(xiàn)在正在進(jìn)行或已經(jīng)進(jìn)行過器官或組織移植的患者體內(nèi)，所述移植如心臟，肺，組合的心臟-肺，氣管，腎臟，肝臟，胰腺，食管，腸，皮膚，肢體，肼帶，干細(xì)胞，胰為細(xì)胞移植等.閎此本發(fā)明的抗體可用作同種異體移植物和異種移植物排斥的預(yù)防刑，或用于逆轉(zhuǎn)，治療，或以其他方式改善急性同種異體移植物或異種移植物排斥的發(fā)作.可以治療的其他疾病包括移植物抗宿主疾病，例如，輸血移植物抗宿主疾病和骨拔移植物抗宿主疾病；炎性病、免疫病或自身免疫病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，l型糖尿病，胰烏素依賴性2型糖尿病，多發(fā)性硬化，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，重癥肌無力，炎性腸病，克羅恩病，潰瘍性結(jié)腸炎，皮膚多肌炎，Sjiigren氏綜合征，動脈炎，包括巨細(xì)胞性動脈炎，再生陣礙性貧血，哞喘，硬皮病和葡萄膜炎；炎性或過度增殖性皮膚病，例如，牛皮癬，包括斑塊牛皮褲，掌跖膿疾病(pustulosispalmoplantaris)(PPP),腐蝕性扁平苔蘚，大皰性天皰瘡(pemphigusbullosa)，大皰性表皮松解癥，接觸性皮炎和特應(yīng)性皮炎；和多種淋巴樣瘤，例如，T細(xì)胞白血病，何杰金病，毛細(xì)胞性白血病，或皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，包括萆樣真菌病和Sezary氏綜合征.可以治療的其他疾病包括惡性肺瘤，其中，對浸潤性CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的抑制是有利的，如胃癌，食管癌，惡性黑素瘤，結(jié)腸直煬癌，胰腺癌，乳腺癌，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，子宮頸癌，卯巢癌和腎細(xì)胞癌；血液學(xué)疾病，如成年人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤，退行性大細(xì)胞淋巴瘤，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL),外周T細(xì)胞淋巴痛和繼發(fā)性淀粉樣變性；皮膚病，如壞疽性膿皮病，環(huán)形肉芽腫，過敏性接觸性皮炎，疤痕性類天疾疳和妊娠疾務(wù)(herpesgestationis);肝胃腸疾病，如膠原性結(jié)腸炎，硬化性膽管炎，慢性活動性肝炎，狼瘡樣肝炎，自身免疫性肝炎，酒精性肝炎，慢性胰腺炎和急性胰腺炎；心臟疾病，如心肌炎和心包炎；血管疾病，如動脈硬化，巨細(xì)胞性動脈炎/風(fēng)濕性多肌病，大動脈炎，結(jié)節(jié)性多動脈炎，Kawasaki綜合征，韋格納肉芽胖病，顯微多脈管炎，Clmrg-Straiiss綜合征，白細(xì)胞破碎性脈管炎和繼發(fā)性白細(xì)胞破碎性血管炎；腎病，如急性腎小球性腎炎，慢性腎小球性腎炎，最小改變性腎炎和腎炎-肺出血綜合征；肺病，如肺泡炎，閉塞性細(xì)支氣管炎，硅肺和鈹肺(berylliosis);神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如多發(fā)性硬化，阿爾茨海默病，重癥肌無力，慢性脫tt鞘多發(fā)性神經(jīng)病和多神經(jīng)根炎包括GuiUain-BaiT6綜合征；結(jié)締組織疾病，如復(fù)發(fā)性多發(fā)軟骨炎，肉樣瘤病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，中柩神經(jīng)系統(tǒng)狼瘡，盤狀狼瘡，狼瘡腎炎，慢性疲勞綜合征和纖維肌痛(fibromyalgia);內(nèi)分泌疾病，如Graves氏病，橋本甲狀腺炎和亞急性甲狀腺炎；和病毒感染，如熱帶痙攀性下肢輕癱，在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用一種或多種其他治療刑對施用所述抗體的受試者進(jìn)行其他治療，如免疫抑制劑，抗炎劑，化療刑，細(xì)胞毒性劑或其他能增強(qiáng)所述抗體的治療效果的試劑.另一方面，本發(fā)明提供了用于在體外或體內(nèi)檢測CD25在樣品或個體中的存在的方法，例如，用于診斷CD25-相關(guān)的疾病，優(yōu)選在早期階段診斷.這種方法還可用于監(jiān)控所述疾病和用抗-CD25抗體治療的效果，并且用于確定和調(diào)整要施用的所迷抗體的劑量.在一種實(shí)施方案中，檢測CD25在樣品中的存在是通過讓要檢測的樣品，任選與對照樣品一起與本發(fā)明的人單克隆抗體接觸，接觸條件為使得能夠形成所述抗體和CD25的復(fù)合物.然后檢測復(fù)合物的形式(如，應(yīng)用ELISA、流式細(xì)胞術(shù)或蛋白印跡).當(dāng)應(yīng)用對照樣品連同試驗(yàn)樣品時(shí)，在兩種樣品中都檢測到復(fù)合物，且樣品間復(fù)合物形成中的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異都是試驗(yàn)樣品中存在CD25的指示.體內(nèi)方法可應(yīng)用成像技術(shù)完成，如PET(正電子發(fā)射繼層顯象)或SPECT(單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)化斷層顯象).另一方面，本發(fā)明涉及能結(jié)合本發(fā)明的人單克隆抗體的抗-獨(dú)特型抗體.所述抗-獨(dú)特型抗體可以用作免疫診斷工具，檢測并且定f實(shí)驗(yàn)室或患者樣品中抗CD25的人單克隆抗體的水平.可將它用于檢查所述抗-CD25抗體的藥物代謝動力學(xué)，或用于確定并且調(diào)整抗-CD25抗體的刑量，并且用于監(jiān)控患者的疾病和治療效果.小鼠抗-獨(dú)特型抗體可以通過以下方法制備，例如用本發(fā)明的人單克隆抗體對Balb/C小鼠進(jìn)行免疫，并且通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)與諸如NS1的骨拔瘤細(xì)胞融合，由所述小鼠的脾臟生成雜交瘸.另一方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，如轉(zhuǎn)基因小鼠，它能表達(dá)與CD25結(jié)合的人單克隆抗體.在具體實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因非人動物是轉(zhuǎn)基因小鼠，它的基因組包括編碼本發(fā)明的抗體的全部或一部分的人重鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體(transchromosome)和人輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體.所迷轉(zhuǎn)基因非人動物可以用CD25抗原和/或表達(dá)CD25的細(xì)胞的純化的或富集的制刑免疫。優(yōu)選的是，所述轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠能夠通過進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生針對CD25的多種人單克隆抗體的同種型(例如，IgG，IgA和/或IgM).例如，同種型轉(zhuǎn)換可以通過傳統(tǒng)的或非傳統(tǒng)的同種型轉(zhuǎn)換進(jìn)行.因此，另一方面，本發(fā)明提供了來自上述轉(zhuǎn)基因非人動物例如，轉(zhuǎn)基因小鼠的分離的B細(xì)胞，它能表達(dá)人抗-CD25抗體.然后可以通過與無限增殖化細(xì)胞融合使所述分離的B細(xì)胞無限增殖化，以便提供人抗-CD25抗體的來源(例如，雜交瘤)。所述雜交瘤(即，它能產(chǎn)生人抗CD25抗體)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。正如本文所例示的，本發(fā)明的人抗體可以直接從能表達(dá)所述抗體的雜交瘤中獲得，或者可以克隆(例如，從展示所述抗體的抗原結(jié)合部分的雜交瘤或噬菌體中克隆)并且在宿主細(xì)胞(例如，CHO(中國倉鼠卯巢)細(xì)胞，或NS/0細(xì)胞)中重組表達(dá).宿主細(xì)胞的其他例子是微生物，如大腸桿菌(Eco/O和真菌，如酵母.另外，它們可以在轉(zhuǎn)基因非人動物或植物中重組生產(chǎn).因此，另一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)能結(jié)合人CD25的人單克隆抗體的方法.在一種實(shí)施方案中，所述方法包括用人CD25抗原和/或表達(dá)人CD25的細(xì)胞的純化的或富集的制刑免疫轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，如上文所述的轉(zhuǎn)基因小鼠(例如，具有包含編碼抗-CD25抗體的全部或一部分的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組).然后獲得所迷動物的B細(xì)胞(例如，脾B細(xì)胞)，并且與骨徵瘤細(xì)胞融合，以便形成能分泌抗CD2S的人單克隆抗體的無限增殖化的雜交瘤細(xì)胞.另一方面，本發(fā)明提供了編碼人抗-CD25抗體(例如，它的可變區(qū))的核酸分子，以及包括本發(fā)明核酸的重組表達(dá)栽體，和用所迷栽體轉(zhuǎn)染過的宿主細(xì)胞.本發(fā)明還包含通過培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)所述抗體的方法，本發(fā)明所提供的特定核酸包括SEQIDNOs:1、5、9或13和SEQIDNOs:3、7、11或15所示出的核苷酸序列，它們分別編碼人抗-CD25抗體AB1、AB7、AB11和AB12的重鏈和輕鏈。通過以下詳細(xì)說明和權(quán)利要求書可以理解本發(fā)明的其他特征和優(yōu)附困簡述圖1表示具有標(biāo)明的CDR的人單克隆抗體AB1、AB7、AB11和AB12的輕(K)鏈VJ區(qū)的氨基酸序列(分別為SEQIDNOs:4、8、12和16).圖2表示具有標(biāo)明的CDR的人單克隆抗體AB1、AB7、AB11和AB12的重鏈VDJ區(qū)的氨基酸序列(分別為SEQIDNOs:2、6、10和14)。圖3表示具有標(biāo)明的CDR的人單克隆抗體AB1的重鏈VDJ區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)和相應(yīng)的核苷酸序列(SEQIDNO:1),閨4表示具有標(biāo)明的CDR的人單克隆抗體AB1的輕(k)鏈VJ區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:4)和相應(yīng)的核苷酸序列(SEQIDNO:3)。圖5表示具有標(biāo)明的CDR的人單克隆抗體AB7的重鏈VDJ區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:6)和相應(yīng)的核苷酸序列(SEQIDNO:5),困6表示具有標(biāo)明的CDR的人單克隆抗體AB7的輕(k)鏈VJ區(qū)的氡基酸序列(SEQIDNO:8)和相應(yīng)的核苷酸序列(SEQIDNO:7)，困7表示具有標(biāo)明的CDR的人單克隆抗體AB11的重鏈VDJ區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:10)和相應(yīng)的核苷酸序列(SEQIDNO:9).困8表示具有標(biāo)明的CDR的人單克隆抗體AB11的輕(k)鏈VJ區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:12)和相應(yīng)的核苷酸序列(SEQIDNO:11).困9表示具有標(biāo)明的CDR的人單克隆抗體AB12的重鏈VDJ區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:14)和相應(yīng)的核苷酸序列(SEQIDNO:13).閨10表示具有標(biāo)明的CDR的人羊克隆抗體AB12的輕(k)鏈VJ區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:16)和相應(yīng)的核苷酸序列(SEQIDNO:15),困ll是表示人單克隆抗體AB1、AB7、AB11和AB12的上清液對IL-2與它的受體OW5結(jié)合的抑制作用與Zenapax(daclizumab，重組人源化的IgGl抗-CD25抗體，Roche)對IL2結(jié)合的抑制作用比較的曲線困.圖12是表示人單克隆抗體AB1、AB7、AB11和AB12對Zenapax與CD25結(jié)合的抑制作用的曲線困。圖13是表示人單克隆抗體AB1、AB7、AB12對抗-CD3抗體-誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖(使用PBMC)的抑制作用的曲線困，與對照抗體(hlgG1/k)和Zenapax⑧的抑制作用進(jìn)行比較；困14是表示人單克隆抗體AB1、AB7、AB12對MLR的抑制作用的曲線困，與對照抗體(hlgGl/k)和Zenapax⑧的抑制作用進(jìn)行比較，圖15表示使用FITC濾色片的照片，通過FITC-標(biāo)記的AB12顯現(xiàn)CD25的內(nèi)在化.困15A表示在371C下溫育18小時(shí)之后，用FITC-標(biāo)記的AB12預(yù)溫育的T細(xì)胞母細(xì)胞(blast)的結(jié)果，而困1SB表示在存在FITC-標(biāo)記的AB12的條件下，在371C下培養(yǎng)18小時(shí)之后，T細(xì)胞母細(xì)胞的結(jié)果。為了比較，閨15C表示在存在FITC-標(biāo)記的同種型對照抗體(抗-KHL)的條件下在37TC下培養(yǎng)18小時(shí)之后，T細(xì)胞母細(xì)胞的結(jié)果.困16表示FITC-標(biāo)記的AB12造成的CD25的內(nèi)在化，如通過流式細(xì)胞術(shù)測定的，其中，大于l的平均熒光強(qiáng)度(MFI)的比例表示業(yè)已發(fā)生了內(nèi)在化.困16A表示分別在4TC和37TC下用FITC-標(biāo)記的AB12預(yù)溫育之后T細(xì)胞母細(xì)胞的結(jié)果，而困16B表示分別在4TC和37TC下，在存在FITC-標(biāo)記的AB12的條件培養(yǎng)之后T細(xì)胞母細(xì)胞的結(jié)果.發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于治療和診斷涉及表達(dá)CD25的細(xì)胞的多種疾病的基于抗體的治療方法.本發(fā)明的治療方法采用了能特異性地結(jié)合存在于CD25上的表位的分離的人單克隆抗體.所述抗體包括所有已知同種型，例如，IgA，IgGl-4，IgE，IgM和IgD抗體.在一種實(shí)施方案中，所述抗體是IgGl抗體，更具體是IgGl，k或1gGl，人同種型.在另一種實(shí)施方案中，所述抗體是IgG3抗體，更具體是IgG3，k或lgG3，入同種型.在另一種實(shí)施方案中，所述抗體是IgG4抗體，更具體是IgG4，k或lgG4，入同種型.在另一種實(shí)施方案中，所述抗體是IgAl或lgA2抗體.在另一種實(shí)施方案中，所述抗體是IgM抗體.在一種實(shí)施方案中，所述人抗體是在能夠通過進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生抗CD25的人單克隆抗體的多種同種型的非人轉(zhuǎn)基因動物例如，轉(zhuǎn)基因小鼠中生產(chǎn)的.所述轉(zhuǎn)基因動物還可以是用于生產(chǎn)多克隆抗體的轉(zhuǎn)基因兔，如在US2003/0017534中所公開的.因此，本發(fā)明還包含人多克隆抗體，它能特異性地結(jié)合CD25.因此，本發(fā)明的各個方面不僅包括抗體，抗體片段，和它的藥用組合物，而且還包括能產(chǎn)生單克隆抗體的非人轉(zhuǎn)基因動物，B細(xì)胞，宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤和雜交瘤.還提供了使用本發(fā)明的抗體阻斷或抑制表達(dá)CD25的細(xì)胞的方法，并且所述方法可用于治療與CD25相關(guān)的疾病.本發(fā)明還包含將本發(fā)明的抗體用于檢測能表達(dá)CD25的細(xì)胞的方法.為了能夠更方便地理解本發(fā)明，首先對某些術(shù)語進(jìn)行定義.其他定義在詳細(xì)說明中提供。術(shù)語"CD25"和"CD25抗原"在本文中可以互換使用，并且包括人CD25的任何變體，同種型和物種同系物，它是由細(xì)胞天然表達(dá)的或者是在用CD25基因轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞上表達(dá)的.本領(lǐng)域所了解的CD25的同義詞包括CD25，p55，和Tac(T細(xì)胞活化)抗原.本發(fā)明的抗體與CD25抗原的結(jié)合能抑制和/或阻斷CD25與它的配體IL-2結(jié)合，同時(shí)，抑制和/或阻斷其產(chǎn)生的細(xì)胞功能.例如，在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體能抑制抗-CD3抗體-誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖.在另一種實(shí)施方案中，所述人單克隆抗體能抑制MLR.在本文中，術(shù)語"抑制生長"(例如，關(guān)于細(xì)胞)意在包括和不接觸抗-CD25抗體的相同的細(xì)胞的生長相比，在與抗-CD25抗體接觸時(shí)細(xì)胞生長的任何可檢測的減弱，例如，細(xì)胞培養(yǎng)物的生長的抑制作用至少為大約10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%，99%或100%,在本文中，術(shù)語"抑制結(jié)合"和"阻斷結(jié)合"(例如，關(guān)于抑制/阻斷IL-2與CD25結(jié)合)是可互換使用的，并且包括部分和完全抑制/阻斷.IL-2與CD25的結(jié)合的抑制/阻斷優(yōu)逸能減弱或改變在沒有抑制或阻斷的情況下IL>2結(jié)合CD25時(shí)所出現(xiàn)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)的正常水平或類型.抑制和阻斷還意欲包括與沒有接觸抗-CD25抗體的配體進(jìn)行比較，在與抗-CD25抗體接觸時(shí)IL-2對CD25的結(jié)合親和力的任何可檢測的降低，例如，將IL-2與CD25的結(jié)合阻斷了至少大約10%,20%,30%,40%,50%,60%,70°/。，80%，90%,99%或100%。術(shù)語"抗體"在本文中是指包括完整的抗體和它的任何抗原結(jié)合片段(即，"抗原結(jié)合部分")或單鏈."抗體"是指包括通過二疏鍵相互連接的至少兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈的糖蛋白，或它的抗原結(jié)合部分。每一個重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成.每一個輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)組成.VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分成超變區(qū)，稱之為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，在它們之間分布著更保守的區(qū)域，被成為構(gòu)架區(qū)(FR)每一個Vh和VL由三個CDR和四個FRs組成，按以下順序從氨基末端到羧基末端排列FRl，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4'所述重鏈和輕鏈的可變區(qū)包括與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域.所述抗體的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的笫一種成分(Clq).在本文中，術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡稱為"抗體部分")，表示抗體的一個或多個片段，其保留了特異性結(jié)合抗原(例如，CD25)的能力.業(yè)已發(fā)現(xiàn)，所述抗體的抗原結(jié)合功能可以通過完整的或全長的抗體的片段實(shí)現(xiàn).術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"所包含的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，它是由Vl，Vh，Cl和Cjh結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab，)2片段，是包含通過位于鉸鏈區(qū)的二破鍵連接的兩個Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由Vh和CH1結(jié)構(gòu)城組成的Fd片段；(iv)由VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546),它由VH結(jié)構(gòu)域組成；(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(vii)兩種或更多種分離的CDR的組合，它們可以選擇性地通過合成的接頭連接.另外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH是由獨(dú)立的基因編碼的，但可以通過重組方法，利用合成的接頭將它們結(jié)合在一起，這使得它們能夠成為一個單一的蛋白鏈，其中，VL和VH區(qū)配對，以便形成單價(jià)分子(稱之為單鏈Fv(scFv);參見，例如，Bird等(1988)Science242:423-426;和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci,USA85:5879-5883)。所述單鏈抗體的含義還意欲包括在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"的含義內(nèi).另一種例子是結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白，它包括(i)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽，(ii)與所述鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，和(iii)與CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū).所述結(jié)合結(jié)構(gòu)城多肽可以是重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白還公開于US2003/0118592和US2003/0133939中.所述抗體片段是通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的常規(guī)技術(shù)獲得的，并且篩選所述片段，以便以與完整的抗體相同的方式使用。術(shù)語"表位"表示能夠特異性結(jié)合抗體的蛋白決定簇.表位通常由諸如氨基酸或糖倒鏈的分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)組成，并且通常具有特殊的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特殊的電荷特征.構(gòu)象和非構(gòu)象表位的差別在于，通過用變性溶劑處理，喪失了對前者不是對后者的結(jié)合能力。術(shù)語"雙特異性分子"意在包括任何試刑，例如，蛋白，肽，或蛋白或肽復(fù)合物，其具有兩種不同的結(jié)合特異性.例如，所述分子能夠結(jié)合，或者與(a)細(xì)胞表面抗原和(b)效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fc受體相互作用.術(shù)語"多特異性分子"或"異種特異性分子"意在包括任何試刑，例如，蛋白，肽，或蛋白或肽復(fù)合物，其具有兩種以上的不同的結(jié)合特異性.例如，所述分子能夠結(jié)合或者與(a)細(xì)胞表面抗原，(b)效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fc受體，和(c)至少一種其他成分相互作用.因此，本發(fā)明包括，但不局限于，雙特異性，三特異性，四特異性，和其他多特異性分子，它們是針對CD25和其他目標(biāo)的，如效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體.術(shù)語"雙特異性抗體"還包括徵型雙功能抗體(diabody).微型雙功能抗體是二價(jià)的雙特異性抗體，其中，Vh和Vl結(jié)構(gòu)域是在一個多肽鏈上表達(dá)的，不過使用的接頭太短，以至不能實(shí)現(xiàn)在相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間的配對，從而迫使所迷結(jié)構(gòu)域與另一個鏈上的互補(bǔ)性結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如，參見，Holliger，P.，等(1993)Proc.Na".Acad.Sci.USA卯:6444-6448;Poljak，RJ.，等(1994)Structure2:1121-1123),術(shù)語"人抗體衍生物"表示所述抗體的任何修飾形式，例如，所述抗體和其他制制或抗體的綴合物.在本文中，術(shù)語"人抗體"，意在包括具有來自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體.本發(fā)明的人抗體還可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)專一誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變導(dǎo)入的突變).不過，在本文中，術(shù)語"人抗體"，不意欲包括這樣的抗體，其中，來自諸如小鼠的另一種哺乳動物物種的種系的CDR序列業(yè)已移植到人構(gòu)架序列上.在本文中，術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"表示單一分子組成的抗體分子的制刑.單克隆抗體組合物對某個特定表位展示一種單一結(jié)合特異性和親和力.因此，術(shù)語"人單克隆抗體"表示展示單一結(jié)合特異性的抗體，它具有來自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū).在一種實(shí)施方案中，所述人單克隆抗體是通過雜交瘤生產(chǎn)的，所述雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的與無限增殖化細(xì)胞融合的B細(xì)胞，它具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組.在本文中，術(shù)語"重組人抗體"，包括通過重組方法制備，表達(dá)，產(chǎn)生或分離的所有人抗體，如(a)從對于人免疫球蛋白基因來說是轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動物(例如，小鼠)或由它制備的雜交瘸中分離的抗體(在下面的部分I進(jìn)一步描迷)，(b)從被轉(zhuǎn)化成能表達(dá)所述抗體的宿主細(xì)胞，例如，從轉(zhuǎn)染痗中分離的抗體，(c)從重組的組合人抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過任何其他方法制備，表達(dá)，產(chǎn)生或分離的抗體，這些方法涉及到將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列上.所述的重組人抗體具有來自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū).不過，在某些實(shí)施方案中，所述重組人抗體可以進(jìn)行體外誘變(或在使用轉(zhuǎn)編碼人Ig序列的基因的動物時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此所述重組抗體的Vh和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，盡管該序列來自并且與人種系Vh和VL序列相關(guān)，可能不是在體內(nèi)所述人抗體種系所有組成成分(repertoire)中天然存在的.在本文中，術(shù)語"轉(zhuǎn)染瘸"包括能夠表達(dá)所述抗體的真核宿主細(xì)胞，如CHO細(xì)胞，NS/0細(xì)胞，HEK293細(xì)胞，植物細(xì)胞或真菌，包括酵母細(xì)胞.在本文中，"異種抗體"相對于能生產(chǎn)所述抗體的轉(zhuǎn)基因非人生物進(jìn)行定義.該術(shù)語表示具有如下氨基酸序列或編碼核酸序列的抗體，所述氨基酸序列或編碼核酸序列相應(yīng)于存在于不由所述轉(zhuǎn)基因非人動物組成的生物體內(nèi)的氨基酸序列或編碼核酸序列，并且所述抗體通常來自除了所迷轉(zhuǎn)基因非人動物以外的物種。在本文中，"分離的抗體"意在表示基本上沒有具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，能特異性結(jié)合CD25的分離的抗體基本上沒有能特異性結(jié)合除了CD25以外的抗原的抗體).不過，能特異性結(jié)合人CD25的表位、同種型或變體的分離的抗體可能具有與其他相關(guān)抗原的交叉反應(yīng)性，例如，來自其他物種的抗原(例如，CD25物種同系物).另外，分離的抗體可能基本上沒有其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)制刑.在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，具有不同特異性的"分離的"單克隆抗體的組合是以確定的組成組合的.在本文中，"特異性結(jié)合"表示抗體與預(yù)定的抗原結(jié)合。通常，所述抗體的結(jié)合親和力相當(dāng)于Ko為大約10'8M或更低，如大約10'9M或更低，大約10'1(>M或更低，或大約10"M或更低，它是通過表面等離子體共振(SPR)技術(shù)在BIAcore3000儀器上測定的，用重組IL-2Ra做配體，并且用所述抗體做分析物，并且，所述抗體與所述預(yù)定抗原的結(jié)合親和力相當(dāng)于與對除了所述預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原之外的非特異性抗原(例如，BSA，路蛋白)的結(jié)合親和力相比，KD至少低10倍，優(yōu)選至少低IOO倍.短語"能識別抗原的抗體"和"對抗原特異性的抗體"在本文中可以與術(shù)語"能特異性結(jié)合抗原的抗體"交換使用.在本文中，術(shù)語"ka"(秒")，意在表示特定的抗體抗原相互作用的離解平衡速率常數(shù).所述值還可以被稱作kff值.在本文中，術(shù)語"ka"(M"x秒")，意在表示特定的抗體抗原相互作用的結(jié)合平衡速率常數(shù).術(shù)語"KD"(M)，在本文中，意在表示特定的抗體抗原相互作用的離解平衡常數(shù).術(shù)語"KA"(M'1)，在本文中，意在表示特定的抗體抗原相互作用的結(jié)合平衡常數(shù)，并且是通過用k^除以kd獲得的.在本文中，"同種型"表示由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類型(例如，IgM或IgGl).在本文中，"同種型轉(zhuǎn)換"表示抗體的類型或同種型從一種Ig類型轉(zhuǎn)換成其他Ig類型之一的現(xiàn)象.在本文中，"非轉(zhuǎn)換同種型"表示在沒有發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換時(shí)產(chǎn)生的重鏈的同種型類型；編碼所述非轉(zhuǎn)換同種型的CH基因通常是緊靠功能性重排的VDJ基因下游的笫一個CH基因.業(yè)已將同種型轉(zhuǎn)換劃分成經(jīng)典的或非經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)換。經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)換是通過重組事件發(fā)生的，它涉及所述轉(zhuǎn)基因中的至少一個轉(zhuǎn)換序列區(qū)。非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換可以通過，例如，人a-和人i:-之間的同源重組發(fā)生(5-相關(guān)的缺失).其他非經(jīng)典轉(zhuǎn)換機(jī)制，如轉(zhuǎn)基因間和/或染色體間重組，可能發(fā)生并且完成同種型轉(zhuǎn)換.在本文中，術(shù)語"轉(zhuǎn)換序列"表示負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)換重組的DNA序列."轉(zhuǎn)換供體"序列，通常為H轉(zhuǎn)換區(qū)，它位于轉(zhuǎn)換重組期間要缺失的構(gòu)建體區(qū)的5，(即，上游)。"轉(zhuǎn)換受體"區(qū)位于要缺失的構(gòu)建體區(qū)和取代的恒定區(qū)之間(例如，Y，e等).在本文中，"糖基化模式"被定義為共價(jià)附著在蛋白上的碳水化合物單位的形式，更具體地講，附著在免疫球蛋白(抗體)上.當(dāng)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)為異種抗體的糖基化模式與所述非人轉(zhuǎn)基因動物物種中的糖基化模式的相似性比與來自產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因的CH基因的物種中的糖基化模式的相似性更髙時(shí)，所述異種抗體的糖基化模式的特征基本上類似于由所述非人轉(zhuǎn)基因動物物種產(chǎn)生的抗體上天然出現(xiàn)的糖基化模式.在本文中，術(shù)語"天然存在的"在用于表示對象時(shí)，表示所迷對象可以天然存在這一事實(shí).例如，從天然來源中分離的并且沒有實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行過有意修飾的存在于生物(包括病毒)體內(nèi)的多肽或多核苷酸序列是天然存在的.在本文中，術(shù)語"重排的"表示重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型，其中，V片段在分別基本編碼完整的Vh或VL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象中位于緊靠D-J或J片段處.重排的免疫球蛋白(抗體)基閎基因座可以通過與種系DNA比較來鑒定；重排的基因座具有至少一種重組七聚體/九聚體同源元件.在本文中，術(shù)語"未重排的"或"種系構(gòu)型"在限定V片段時(shí)表示這樣的構(gòu)型，其中，所述V片段不是重組的，以便緊靠D或J片段。在本文中，術(shù)語"核酸分子"，意在包括DNA分子和RNA分子.核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選雙鏈DNA.在本文中，術(shù)語"分離的核酸分子"表示編碼與CD25結(jié)合的完整的抗體或抗體部分(例如，VH，Vl，CDR3)的核酸時(shí)，意在表示這樣的核酸分子，其中，編碼所述完整的抗體或抗體部分的核苷酸序列不含有編碼與除了CD25以外的抗原結(jié)合的完整的抗體或抗體部分的核苷酸序列，在人基因組DNA中，所述其他序列可能天然存在于所述核酸旁側(cè).在一種實(shí)施方案中，所述人抗-CD25抗體包括分別由SEQIDNOs:1、5、9或13以及SEQIDNOs:3、7、11或15所示的核苷酸序列編碼的AB1、AB7、AB11或AB12的重鏈(Vh)和輕鏈(Vl)可變氨基酸區(qū).正如在本文所公開的和要求保護(hù)的，SEQIDNOs:l-40所示出的序列包括"保守性序列修飾"，即，不會顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的或包含所述氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的核苷酸和氨基酸序列修飾.所述保守性序列修飾包括核苷酸和氨基酸取代，添加和缺失.可以通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將修飾導(dǎo)入SEQIDNOs:1-40，如定點(diǎn)突變和PCR-介導(dǎo)的誘變.保守性氨基酸取代包括這樣的取代，其中，所述氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基所取代.在現(xiàn)有技術(shù)中業(yè)已確定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族.這些家族包括具有以下側(cè)鏈的氨基酸堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸，精氦酸，組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬跌胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氡酸)，非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸，緗氨酸，亮氨酸，異亮氣酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲碟氨酸)，p-分支的側(cè)鏈(例如，蘇氛酸，^氨酸，異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸).因此，人抗-CD25抗體上的推測的非必需氨基酸殘基優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基取代。本發(fā)明還包含如SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14、16和17-40所示出的氨基酸序列以及它們的保守性序列修飾的"衍生物"，其中，所述氨基酸殘基中的一個或多個業(yè)已被衍生化，例如，通過酰化或糖基化，而又不會明顯影響或改變所迷抗體對CD25的結(jié)合特征。另外，本發(fā)明包括業(yè)已在它的Fc區(qū)進(jìn)行了一種或多種改變的抗體，以便改變所迷抗體的功能或藥物代謝動力學(xué)特性.所迷改變可以導(dǎo)致Clq結(jié)合和CDC或FcyR結(jié)合以及依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)的增強(qiáng)或減弱.例如，取代可以在重鏈恒定區(qū)的氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320和322中的一個或多個上進(jìn)行，以便與未修飾過的抗體相比，導(dǎo)致效應(yīng)子功能的改變，同時(shí)保留對抗原的結(jié)合，參見US5，624，821和US5，648，260,其他參考文獻(xiàn)包括公開了具有改變了的Fc區(qū)能增強(qiáng)ADCC的抗體的WO00/42072，以及公開了在CH2結(jié)構(gòu)域的N-末端區(qū)具有突變的抗體的WOM/29351，所述突變改變了所述抗體與FcRI結(jié)合的能力并因此減弱所述抗體與Clq的結(jié)合的能力，從而進(jìn)一步減弱所述抗體固定補(bǔ)體的能力.另外，Shields等，J.Biol.Che邁.(2001)276:6591-6604教導(dǎo)了組合變體，例如，T256A/S298A，S298A/E333A，和S298A/E333A/K334A，它們改善了FcyRIII的結(jié)合.所述抗體的體內(nèi)半袞期還可以通過修飾Ig恒定結(jié)構(gòu)域或Ig-樣恒定結(jié)構(gòu)域的補(bǔ)救受體表位改善，以便所述分子不包括完整的CH2結(jié)構(gòu)域或完整的IgFc區(qū)，參見US6,121,022和US6,194,551,還可以通過在Fc區(qū)產(chǎn)生突變進(jìn)一步增加所迷體內(nèi)半衰期，例如，用蘇氨酸代替252號位置上的亮氨酸，用蘇氨酸代替254號位置上的絲氨酸，或用蘇氨酸代替256號位置上的苯丙氨酸，參見US6,277,375.另外，可以改變所述抗體的糖基化棋式，以便改變所述抗體的效應(yīng)子功能.例如，所述抗體可以在轉(zhuǎn)染痛中表達(dá)，它不能添加在正常情況下附著在與Fc的297號位置上的Asn附著的碳水化合物上的海藻糖單位，以便增強(qiáng)Fc對FcyRIII的親和力，從而進(jìn)一步導(dǎo)致在存在NK細(xì)胞的情況下所述抗體的ADCC的增強(qiáng)，參見Shield等(2002)J.Biol.Chem.，2T7:26733.另外，可以進(jìn)行半乳糖基化修飾，以便修飾CDC。其他參考文獻(xiàn)可以參見WO99/54342和Umana等，Nat.BiotechnoI.(1999)17:176,上述文獻(xiàn)公開了被工程改造成能表達(dá)GntIII的CHO細(xì)胞系，導(dǎo)致了具有改變了的糖形和改善了的ADCC活性的單克隆抗體的表達(dá)，另外，本發(fā)明的抗體片段，例如Fab片段可以被聚乙二醇化(pegylated),以便延長半衰期.這一目的可以通過本領(lǐng)域所公知的聚乙二醇化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，例如，參見FocusonGrowthFactors(1992)3:4-10;EP154316和EP401384.另外，在另一種實(shí)施方案中，可以沿抗-CD25抗體編碼序列的全部或一部分隨機(jī)導(dǎo)入突變，如通過飽和誘變，并且可以篩選所得到的修飾過的抗-CD25抗體的結(jié)合活性。因此，由本文所公開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))核脊酸序列編碼的和/或包括本文所公開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))氨基酸序列(即，SEQIDNOs:2，4,6，8，10，12,14，16和17-40)的抗體包括基本上類似的抗體，它們是由業(yè)已進(jìn)行過保守性修飾的類似序列編碼的或包括類似序列的.在下面提供了如何根據(jù)如SEQIDNOs:2，4，6,8，10,12，14，16和17-40所公開的部分(即，重鏈和輕鏈可變區(qū))序列制備所述基本上類似的抗體的進(jìn)一步討論.對于核苷酸和氦基酸序列來說，術(shù)語"同源性"表示在具有合適的插入或缺失的情況下進(jìn)行優(yōu)化比對和比較時(shí)，兩種核酸或氨基酸序列之間的同一性程度.另外，當(dāng)DNA片段能夠在選擇的雜交條件下與所述鏈的互補(bǔ)體雜交時(shí)，就存在顯著的同源性。兩種序列之間的百分同一性是由這兩種序列所共同擁有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，％同源性=相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)目x100)，其中考慮了缺口數(shù)目，每一個缺口的長度，這些缺口是為了優(yōu)化兩種序列的比對而引入的.序列比較和兩種序列之間百分同一性的確定可以使用數(shù)學(xué)算法完成，正如在下面的非限定性實(shí)施例所描述的.兩種核苷酸序列之間的百分同一性可以使用GCG軟件包中的GAP程序確定(可以從以下網(wǎng)址獲得http:〃www*gcg.com)，使用NWSgapdna.CMP距陣，缺口權(quán)重為40，50，60，70或80，長度權(quán)重為l，2，3,4，5或6.兩種核苷酸或氨基酸序列之間的百分同一性還可以使用E*Meyers和W.Miller的算法確定(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(l卯8))，該算法業(yè)已整合到ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120加權(quán)余數(shù)(weightresidue)表，缺口長度罰分(penalty)為12，缺口罰分為4.另外，兩種氨基酸序列之間的百分同一性可以用Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444^453(1970))算法確定，該算法業(yè)已整合到GCG軟件包的GAP程序中(可以從以下網(wǎng)址獲得http:〃www.gcg.com)，使用Blossum62距陣或PAM250距陣，缺口權(quán)重為16，14，12，10，8，6或4,而長度權(quán)重為1，2，3，4，5或6。還可將本發(fā)明的核酸和蛋白序列用作"查詢序列"，以便對公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，以用于例如，鑒定相關(guān)序列.所述檢索可以用Altschul等(19卯)J,Mol.Biol.215:403-10中的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進(jìn)行.BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序進(jìn)行，得分(score)=100，字長(wordlength)-12，以便獲得與本發(fā)明核酸分子同源的核苦酸序列。BLAST蛋白檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，得分=50，字長=3，以便獲得與本發(fā)明蛋白分子同源的氨基酸序列。為了用于比較目的而獲得帶缺口的比對，可以采用描述于以下文獻(xiàn)中的缺口BLAST,AHschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402.在使用BLAST和缺口BLAST程序時(shí)，可以使用相應(yīng)程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù).參見http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。所述核酸可以存在于完整細(xì)胞，細(xì)胞裂解液中，或以部分純化的或基本上純化的形式存在.當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將核酸從其他細(xì)胞成分或其他污染物，例如，其他細(xì)胞核酸或蛋白中純化時(shí)它就是"分離的"或"基本上被純化的"，所述技術(shù)包括南SDS處理，CsCl顯帶，柱層析，瓊脂糖凝膠電泳以及本領(lǐng)域其他熟知的方法.參見F.Ausubel等，ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987).本發(fā)明的核酸組合物盡管通常是來自cDNA，基因組或它們的混合物的天然序列(修飾過的限制位點(diǎn)等除外)，但可以按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行突變，以便提供基因序列.對于編碼序列來說，所述突變可以根據(jù)需要影響氨基酸序列.具體地講，預(yù)期與天然V，D，J,恒定序列，轉(zhuǎn)換序列和本文所描述的其他此類序列基本上同源或來自這些序列的DNA序列(其中，"衍生的"表示一種序列與另一種序列相同或者是由另一種序列修飾而成).當(dāng)一種核酸與另一種核酸序列處于功能性相關(guān)位置時(shí)，這種核酸就是"可採作地連接的".例如，如果啟動子或增強(qiáng)子能影響序列的轉(zhuǎn)錄的話，它們就是可搮作地連接在該序列上的.對于調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄來說，可操作地連接表示被連接的DNA序列是鄰接的，并且如果必要的話結(jié)合兩個鄰接的并且在讀框內(nèi)的蛋白編碼區(qū).對于轉(zhuǎn)換序列來說，可搮作地連接表示所述序列能夠影響轉(zhuǎn)換重組，在本文中，術(shù)語"栽體"，意在表示能夠轉(zhuǎn)運(yùn)業(yè)已與它連接的另一種核酸的核酸分子.一種類型的栽體是"質(zhì)粒"，它表示環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，在它上面連接了其他DNA片段.另一種栽體類型是病毒栽體，其中，其他DNA片段可以連接在所述病毒基因組中.某些栽體能夠在它所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌栽體和附加型哺乳動物栽體).在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，其他栽體(例如，非-附加型哺乳動物栽體)可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并因此可以與宿主基因組一起復(fù)制.另外，某些栽體能夠指導(dǎo)與它可搮作地連接的基因的表達(dá).所述栽體在本文中被稱為"重組表達(dá)栽體"(或簡單地稱為"表達(dá)栽體")。一般，可用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)栽體通常是質(zhì)粒形式的.在本說明書中，"質(zhì)粒"和"栽體"可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的栽體形式.不過，本發(fā)明意在包括其他形式的表達(dá)栽體，如病毒栽體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)，它們能發(fā)揮相同的功能.在本文中，術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"(或簡單地稱為"宿主細(xì)胞")，意在表示業(yè)已導(dǎo)入了重組表達(dá)栽體的細(xì)胞.應(yīng)當(dāng)理解的是，所迷術(shù)語不僅意在表示特定的受試者細(xì)胞，而且還表示所述細(xì)胞的后代，亊實(shí)上，因?yàn)橥蛔兓颦h(huán)境影響，在后續(xù)世代中可能出現(xiàn)了某些修飾，所以所迷后代可能與親代細(xì)胞不同，不過仍然包括在本文中的術(shù)語"宿主細(xì)胞"的范閨內(nèi).例如，重組宿主細(xì)胞包括，轉(zhuǎn)染瘤，如CHO細(xì)胞和NS/0細(xì)胞.在本文中，術(shù)語"受試者"包括任何人或非人動物.術(shù)語"非人動物"包括所有脊推動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類，綿羊，狗，母牛，雞，兩棲動物，爬行動物等.術(shù)語"轉(zhuǎn)基因非人動物"表示具有包括一個或多個人重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體(整合或者未整合到所述動物的天然基因組DNA中)的基因組的非人動物，并且它能夠表達(dá)完整的人抗體.例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可以具有人輕鏈轉(zhuǎn)基罔和人重鏈轉(zhuǎn)基因或人重鏈轉(zhuǎn)染色體，以便在用CD25抗原和/或表達(dá)CD25的細(xì)胞免疫時(shí)，所述小鼠能產(chǎn)生人抗-CD25抗體.所述人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因和/或轉(zhuǎn)染色體可以整合到小鼠的染色體DNA中或保持在染色體外.所述轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠(本文統(tǒng)稱為"轉(zhuǎn)基因小鼠")通過進(jìn)行VD-J重組和同種型轉(zhuǎn)換，能夠生產(chǎn)針對CD25的人單克隆抗體的多種同種型(例如，IgG,IgA，IgM，IgD和/或IgE).還可通過導(dǎo)入編碼此種特異性抗-CD25抗體的基因而將轉(zhuǎn)基因的非人動物用于生產(chǎn)特異性抗-CD25抗體，例如，通過將所述基因可搮作地連接在能在所述動物的乳中表達(dá)的基因上。在下面的各個小部分對本發(fā)明的各個方面作更詳細(xì)地說明I.生產(chǎn)針對CD25的人抗體本發(fā)明的人單克隆抗體可以通過多種技術(shù)生產(chǎn)，包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如，描述于以下文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)Kohler和Milstdn，Nature256:495(1975)盡管原則上講，體細(xì)胞雜交方法是優(yōu)選的，但也可以采用用于生產(chǎn)單克隆抗體的其他技術(shù)，例如，B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌性轉(zhuǎn)化或使用人抗體基因文庫的噬菌體展示技術(shù)。用于制備能分泌人單克隆抗體的雜交瘤的優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠類系統(tǒng)。在小鼠體內(nèi)生產(chǎn)雜交瘤是一種非常完善的方法.免疫方法和用于分離用來融合的免疫的脾細(xì)胞的技術(shù)為本領(lǐng)域所公知.融合配偶體(例如，鼠骨拔癌細(xì)胞)和融合方法同樣是公知的.在優(yōu)逸實(shí)施方案中，針對CD25的人單克隆抗體可以用攜帶有部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠制備.所述轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在本文中被稱為HuMAb小鼠的小鼠，分別如HCo7和HCol2小鼠，和KM小鼠，并且在本文中可以統(tǒng)稱為"轉(zhuǎn)基因小鼠"，所述HuMAb小鼠包括人免疫球蛋白基因徵型基因座(miniloci)，它編碼未重排的人重鏈(M和Y)和K輕鏈免疫球蛋白序列，同時(shí)具有定向突變，這種突變使內(nèi)源li和K鏈基因座失活(Lonberg，N.等(1994)Nature368(6474):856-859).因此，所述小鼠表現(xiàn)出小鼠IgM或k輕鏈的減弱了的表達(dá)，并且對免疫有反應(yīng)，導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因通過發(fā)生類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變以產(chǎn)生髙親和力人IgG，K單克隆抗體(Lonberg，N.等(l外4)，同上；綜述參見Lonberg，N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101;Lonberg,N,和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13:65-93，和Harding,F,和Lonberg,N.(1995)Ann*N.Y.Acad*Sci536-546)HuMAb小鼠的制備詳細(xì)描述于以下文獻(xiàn)中Taylor,L.等(1992)NucleicAcidsResearch20:6287-6295;Chen,J,等(1993internationalImmunology5:647-656;Tuaillon等(1994)J.Immunol.152:2912-2920;LonbergN.等，(1994)Nature368(6474):856-859;Lonberg,N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101;Taylor,L.等(1994)InternationalImmunology6:579-591;Lonberg,N.和Huszar，D.(1995)Intern,Rev,Immunol.Vol.13:65-93;Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764:536-546;Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology14:845-851.還可參見US5，545，806;US5，569，825;US5,625,126;US5，633，425;US5，789，650;US5，877，397;US5，661，016;US5,814,318;US5，874，299;和US5,770,429;以上專利均屬于Lonberg和Kay，以及屬于Surani等的US5,545,807;WO98/24884，WO94/25585，WO93/1227，WO92/22645，WO92/03918和WO01/09187.所述HCo7小鼠具有在它們的內(nèi)源輕鏈(k)基因上的JKD破壞(參見Che邁等(1993)EMBOJ,12:821-830)，在它們的內(nèi)源重鏈基因上的CMD破壞(參見WO01/14424的實(shí)施例1),KC05人k輕鏈轉(zhuǎn)基因(參見Fishwild等(1996)NatureBiotechnology14:845-851),和HCo7人重鏈轉(zhuǎn)基因(參見US5,770，"9).所述Hco12小鼠具有在它們的內(nèi)源輕鏈(k)基因上的JKD破壞(參見Chen等(1993)EMBOJ.12:821-830),在它們的內(nèi)源重鏈基因上的CMD破壞(參見Korman等的WO01/14424的實(shí)施例1)，KCo5人k輕鏈轉(zhuǎn)基因(參見Fishwild等(1996)NatureBiotechnology14:845-851)，和HCo12人重鏈轉(zhuǎn)基因(參見Korman等的WO01/14424的實(shí)施例2).在KM小鼠品系中，內(nèi)源小鼠k輕鏈基因業(yè)已進(jìn)行了純合破壞，正如Chen等(1993)EMBOJ.12:811-820所描述的，并且內(nèi)源小鼠重鏈基因業(yè)已進(jìn)行了純合破壞，正如在WO01/09187的實(shí)施例1中所描述的.該小鼠品系攜帶有人k輕鏈轉(zhuǎn)基因KCo5，參見Fishwild等(1996)NatureBiotechnology14:845>851.該小鼠品系還攜帶有人重鏈轉(zhuǎn)染色體，它由14號染色體片段hCF(SC20)組成，如WO02/43478所述.免疫為了制備針對CD25的全人的單克隆抗體，可以用CD25抗原，重組CD25,和/或表達(dá)CD25的細(xì)胞富集的制刑對含有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠(例如，HCo12，HCo7或KM小鼠)進(jìn)行免疫，例如，在以下文獻(xiàn)中所描述的Lonberg等(1994)，同上；Fishwild等(1996)，同上，和W098/24884,另外，可以用編碼人CD25的DNA對小鼠進(jìn)行免疫。優(yōu)選的是，在首次輸注時(shí)，所述小鼠為6-16周齡。例如，可以將CD25抗原或重組CD25抗原的富集的制劑用于腹膜內(nèi)免疫HiiMAb小鼠.在用CD25抗原的純化的或富集的制刑進(jìn)行免疫不會產(chǎn)生抗體的情況下，還可以用表達(dá)CD25的細(xì)胞對小鼠進(jìn)行免疫，例如，細(xì)胞系，以便促進(jìn)免疫反應(yīng).用各種抗原積累的經(jīng)驗(yàn)業(yè)已顯示，HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠在通過以下方式免疫時(shí)具有最佳反應(yīng)首先用存在于完全或不完全弗氏佐劑中的表達(dá)CD25的細(xì)胞進(jìn)行腹膜內(nèi)(IP)或皮下(SC)免疫，然后用存在于，例如礴酸緩沖鹽溶液(PBS)中的表達(dá)CD25的細(xì)胞進(jìn)行IP免疫(最高達(dá)總共10次).在所述免疫過程中，用通過眼眶后放血獲得的血清樣品監(jiān)控免疫反應(yīng).可以通過FACS分析(參見下文)篩選所述血清，并且可以將具有足夠的抗-CD25人免疫球蛋白效價(jià)的小鼠用于融合?？梢栽谠讱⒅埃缭谠讱⑶?和2天通過靜脈內(nèi)注射表達(dá)CD25的細(xì)胞對小鼠進(jìn)行強(qiáng)化免疫，然后取出脾臟和淋巴結(jié).生成能產(chǎn)生抗CD25的人單克隆抗體的雜交瘤為了生成能產(chǎn)生抗人CD25的人單克隆抗體的雜交瘤，可以分離來自免疫過的小鼠的脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞，并且與合適的無限增殖化細(xì)胞系，如小鼠骨號瘤細(xì)胞系融合.然后可以篩選所得到的雜交痛的抗原特異性抗體的產(chǎn)生.例如，可以將來自免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液與SP2/0-Ag14骨拔裙細(xì)胞(ATCC，CRL1581)用50%PEG(w/v)融合.能夠以大約1x105/孔的密度在平底微量滴定板上將細(xì)胞進(jìn)行鋪平板，然后在選擇培養(yǎng)基上溫育兩周時(shí)間，所述培養(yǎng)基除了常用試刑之外還含有10%fetalCloneSemm，5Origen雜交瘤克隆因子(IGEN)和IXHAT(Sigma)在大約兩周之后，可以在用HT(Sigma)取代了HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后可以通過ELISA篩選每一個孔中含有人K-輕鏈的抗體，并且通過用表達(dá)CD25的細(xì)胞進(jìn)行FACS分析來篩選CD25特異性.一旦出現(xiàn)了廣泛的雜交瘤生長，就可以篩選所述克隆的IgG生產(chǎn)，通常是在7-10天之后.所述分泌抗體的雜交癌可以再次鋪平板，再次篩選，并且如果仍然是人IgG陽性的話，就可以通過有限稀釋將抗-CD25單克隆抗體亞克隆至少兩次.然后可以在體外培養(yǎng)所述穗定的亞克隆，以便在組織培養(yǎng)基中生成抗體用于進(jìn)行表征.生成能產(chǎn)生抗CD25的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤本發(fā)明的人抗體還可以在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中生產(chǎn)，例如，使用重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合，正如本領(lǐng)域眾所周知的(Morrison,S,(1985)Science229:1202).例如，為了表達(dá)所述抗體，或它的抗體片段，可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，PCR擴(kuò)增，定點(diǎn)誘變)獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA，并且可以插入表達(dá)栽體，以便所述基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可操作地連接.在本文中，術(shù)語"可操作地連接"意在表示抗體基因連接在栽體上，以便所述栽體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列能發(fā)揮它們預(yù)期的功能，調(diào)控所述抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯.所述表達(dá)栽體和表達(dá)控制序列是經(jīng)過選擇的，以便與使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容.所述抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入不同的栽體中，或者更一般的是，將這兩種基因插入相同的表達(dá)栽體上.通過標(biāo)準(zhǔn)方法將所述抗體基因插入表達(dá)栽體(例如，將抗體基因片段和栽體上的互補(bǔ)性限制位點(diǎn)連接，或者如果不存在限制位點(diǎn)的話進(jìn)行平端連接).可以將本文所描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)用于制備任何抗體同種型的全長抗體基因，這通過將它們插入業(yè)已編碼預(yù)期同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)栽體上來實(shí)現(xiàn)，以便所述VH片段可搮作地與所述栽體上的CH片段連接，并且VL片段可操作地與所述栽體上的CL片段連接.作為補(bǔ)充或替代，所述重組表達(dá)栽體可編碼信號肽，它有利于所述抗體鏈從宿主細(xì)胞中分泌.可以將所述抗體鏈基因克隆到所述栽體上，以便所述信號肽以框內(nèi)形式連接在所述抗體鏈基因的氨基末端.所述信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非-免疫球蛋白的信號肽).除了所述抗體鏈基因之外，本發(fā)明的重組表達(dá)栽體還攜帶有能控制所述抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控序列.術(shù)語"調(diào)控序列"意在包括能控制所迷抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(例如，多腺香酸化信號).例如，所述調(diào)控序列描述于以下文獻(xiàn)中Goeddel;GeneExpressionTechnology,MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990),本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，所述表達(dá)栽體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)控序列的選擇可能依賴于以下因素，如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，期望的蛋白表達(dá)水平等.用于哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選的調(diào)控序列包括病毒元件，它能在哺乳動物細(xì)胞中指導(dǎo)高水平的蛋白表達(dá)，如來自來自巨細(xì)胞病毒(CMV)，猿猴病毒40(SV仰)，腺病毒，(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多形瘤(polyoma)的啟動子和/或增強(qiáng)子.另外，可以使用非病毒調(diào)控序列，如遍在蛋白啟動子和P-珠蛋白啟動子.除了所述抗體鏈基因和所述調(diào)控序列之外，本發(fā)明的重組表達(dá)栽體可以攜帶其他序列，如能調(diào)控所述栽體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因。所述選擇標(biāo)記基因有利于選擇業(yè)已導(dǎo)入了所述栽體的宿主細(xì)胞(例如，參見，美國專利號4，399，216、4,634,665和5,179,017，均屬于Axel等)例如，選擇標(biāo)記基因通常能賦予業(yè)已導(dǎo)入了所述栽體的宿主細(xì)胞對諸如G418、潮審素或氦甲蝶呤的藥物抗性.優(yōu)選的選捧標(biāo)記基因包括二氬葉酸還原醃(DHFR)基因(用于他fr-宿主細(xì)胞，進(jìn)行氨甲蟝呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選擇).為了表達(dá)所述輕鏈和重鏈，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼所述重鏈和輕鏈的表達(dá)栽體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中.術(shù)語"轉(zhuǎn)染"的各種形式意在包括常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞的各種技術(shù)，例如，電穿孔、褲酸鈣沉淀和DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等.盡管理論上講可以在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但在真核細(xì)胞中的抗體表達(dá)，最優(yōu)選在哺乳動物宿主細(xì)胞中的抗體表達(dá)是最優(yōu)選的，因?yàn)樗稣婧思?xì)胞，特別是哺乳動物細(xì)胞與原核細(xì)胞相比更有可能裝配并且分泌正確折疊和免疫學(xué)上有活性的抗體.用于表達(dá)本發(fā)明重組抗體的優(yōu)選的哺乳動物宿主細(xì)胞包括CHO細(xì)胞(包括dhfr-CHO細(xì)胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl*Acad.Sci.USA77:4216-4220，與DHFR選擇標(biāo)記一起使用，例如，描述于ILJ.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621)，NS/0骨號痛細(xì)胞，COS細(xì)胞，HEK293細(xì)胞和SP2細(xì)胞.特別是在使用NS/0骨絨瘤細(xì)胞時(shí)，另一種優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是GS(谷氨跣胺合成酶)基因表達(dá)系統(tǒng)，公開于以下文獻(xiàn)中WO87/04462，WO89/01036和EP338841.在將編碼抗體基因的重組表達(dá)栽體導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞時(shí)，通過以下方式產(chǎn)生了所述抗體，即，將所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時(shí)間，以使得所述抗體能夠在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)，或者更優(yōu)選，讓所述抗體分泌到所述宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)蛋白純化方法將抗體從所述培養(yǎng)基中回收.用于生產(chǎn)抗CD25的人單克隆抗體的其他重組方法另外，所述克隆的抗體基因可以在其他表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，包括原核細(xì)胞，藻類以及昆蟲細(xì)胞，所述原核細(xì)胞如微生物，例如大腸桿菌，用于生產(chǎn)scFv抗體.另外，所述抗體可以在轉(zhuǎn)基因非人動物體內(nèi)生產(chǎn)，如在綿羊和兔的乳中，或在來自母雞的印中，或在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn).參見例如，Verma，R.等(1998)Antibodyengineering:Comparisonofbacterial,yeast，insectandmammalianexpressionsystems*J.Immnunol.Meth.216:165-181;Pollock,等(1999)Transgenicmilkasamethodfortheproductionofrecombinantantibodies.J.ImmunolMeth.231:147-157;和Fischer,R"等(1999)Molecularfarmingofrecombinantantibodiesinplants.Biol.Chem.380:825-839,將部分抗體序列用于表達(dá)完整的抗體.抗體與靶抗原的相互作用主要是通過位于六個重鏈和輕鏈CDR上的氨基酸殘基進(jìn)行的.為此，與CDR外面的序列相比，單獨(dú)的抗體之間的CDR內(nèi)的氨基酸序列更趨多樣性.由于CDR序列決定大部分抗體抗原相互作用，所以可能通過構(gòu)建表達(dá)栽體來表達(dá)能模擬特定天然存在的抗體的特性的重組抗體，所述表達(dá)栽體包括來自特定天然存在的抗體的CDR序列，所迷CDR序列移植到來自具有不同特性的不同抗體的構(gòu)架序列上(參見，例如，Riech邁ann，L,等(1998)Nature332:323-327;Jones,P.等(1986)Nature321:522-525;和Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci..U,S.A,86:10029-10033)。所述構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公開的DNA數(shù)據(jù)庫中獲得.所述種系序列不同于成熟抗體基罔序列，因?yàn)樗鼈儾话ㄍ耆b配的V基因，它是在B細(xì)胞成熟期間通過V(D)J連接形成的.種系基因序列還有別于高親和力笫二所有組成部分的抗體，它在整個所述V基因上包括突變，不過通常集中在CDR中.例如，體細(xì)胞突變在構(gòu)架區(qū)1的氨基末端部分，以及在構(gòu)架區(qū)4的羧基-末端部分相對稀少.另外，很多體細(xì)胞突變不會顯著改變所述抗體的結(jié)合特性.為此，沒有必要獲得特定抗體的完整的DNA序列，以便再生具有類似于原始抗體的結(jié)合特性的完整的重組抗體(參見WO99/45962).橫跨CDR區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列對于該目的來說通常是足夠的.將所述部分序列用于確定哪一種種系V基因和J基因片段對所述重組的抗體V基因有貢獻(xiàn).然后將所述種系序列用于填充所述可變區(qū)的缺少的部分.重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列在蛋白成熟期間被切割，并且不會對所述最終抗體的特性有貢獻(xiàn).為了添加缺少的序列，可以通過連接或PCR擴(kuò)增將克隆的cDNA序列與合成的寡核苷酸組合.另外，完整的可變區(qū)可以作為一組短的、重疊的寡核苷酸合成，并且通過PCR擴(kuò)增組合，以便產(chǎn)生完整的合成的可變區(qū)克隆.這種方法具有某些優(yōu)點(diǎn)，如消除或包括特定限制位點(diǎn)，或最優(yōu)化特定密碼子.將來自雜交痛的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物的核普酸序列用于設(shè)計(jì)一組重疊的合成的寡核苷酸，以便制備合成的V序列，它與天然序列具有相同的氨基酸編碼能力.所述合成的重鏈和k鏈序列與天然序列可能存在三方面的差別中斷了一段重復(fù)的核苷酸堿基，以便有利于寡核苷酸合成和PCR擴(kuò)增；按照Kozak氏規(guī)則整合了最佳翻譯起始位點(diǎn)(Kozak(1991)J.Biol,Chem.266:19867-19870);并且在翻譯起始位點(diǎn)上游工程化形成了HindIII位點(diǎn).對于重鏈和輕鏈可變區(qū)來說，將最優(yōu)化的編碼鏈和相應(yīng)的非編碼鏈序列打斷成30-50個核苷酸，約接近相應(yīng)的非編碼寡核苷酸的中點(diǎn).因此，對每一個鏈來說，可以將所述寡核苷酸裝配成重疊的雙鏈組，所述雙鏈組跨越150-400個核苷酸的片段.然后將所述庫用作生產(chǎn)具有150-400個核苷酸的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的模板.通常，一組單一的可變區(qū)寡核苷酸被打斷成兩個庫，分別對它們進(jìn)行擴(kuò)增，以便生成兩種重疊的PCR產(chǎn)物。然后通過PCR擴(kuò)增組合所述重疊的產(chǎn)物，以便形成完整的可變區(qū).可能還預(yù)期在PCR擴(kuò)增中包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)的片段(包括k輕鏈的BbsI位點(diǎn)，或Y重鏈的AgeI位點(diǎn))，以便產(chǎn)生能方便地克隆到所述表達(dá)栽體構(gòu)建體中的片段.然后將重構(gòu)的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動子，前導(dǎo)序列，翻譯起始，恒定區(qū)，3，非翻譯，多腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止序列組合在一起，以便形成表達(dá)栽體構(gòu)建體.可以將所述重鏈和輕鏈表達(dá)構(gòu)建體組合成一個栽體，共轉(zhuǎn)染、連續(xù)轉(zhuǎn)染或分別轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，然后融合，以便形成能表達(dá)這兩種鏈的宿主細(xì)胞.可以采用類似的方法，將新型的抗原特異性移植到現(xiàn)有成熟抗體上.優(yōu)選的是，選擇受體抗體，它來自與CDR-供體抗體相同的可變種系基因.然后采用上文所描述的技術(shù)轉(zhuǎn)移來自所述供體抗體的一個或多個CDR,下面描述用于構(gòu)建人IgGK的表達(dá)栽體的示例性質(zhì)粒.構(gòu)建所述質(zhì)粒，以便可以將PCR擴(kuò)增的V重鏈和Vk輕鏈cDNA序列用于重構(gòu)完整的重鏈和輕鏈小基因.可以將所述質(zhì)粒用于表達(dá)完整的人IgGl，k或IgG4，k抗體.可以構(gòu)建類似的質(zhì)粒，以便表達(dá)其他重鏈同種型，或表達(dá)包括k輕鏈的抗體.因此，在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備人抗-CD25抗體的各種方法.在一種實(shí)施方案中，所述方法包括制備一種抗體，它包括U)人重鏈構(gòu)架區(qū)和人重鏈CDR，其中，至少一個人重鏈CDR包括選自困1-10所示出的CDR的氨基酸序列的氨基酸序列(或SEQIDNOs:17-19，23-25，29-31或35-37中相應(yīng)的氨基酸殘基)；和(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)和人輕鏈CDR,其中，至少一個人輕鏈CDR包括選自困1-10所示出的CDR的氨基酸序列的氨基酸序列(或SEQIDNOs:20-22，26-28,32-34或38曙40中相應(yīng)的氨基酸殘基)；其中，所述抗體保留了結(jié)合CD25的能力.然后可以采用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測定方法確定所述抗體結(jié)合CD25的能力，如在實(shí)施例中所提供的方法(例如，F(xiàn)ACS分析).由于本領(lǐng)域眾所周知抗體重鏈和輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域在抗體對抗原的結(jié)合特異性/親和力方面起著特別重要的作用，按上述方法制備的本發(fā)明的重組抗體優(yōu)選包括AB1,AB7，AB11或AB12的重鏈和輕鏈CDR3.所述抗體還可以包括AB1，AB7，AB11或AB12的CDR2,所述抗體還可以包括AB1,AB7，AB11或AB12的CDR1.因此，本發(fā)明還提供了抗-CD25抗體，它包括(l)人重鏈構(gòu)架區(qū)，人重鏈CDR1區(qū)，人重鏈CDR2區(qū)和人重鏈CDR3區(qū)，其中，所迷人重鏈CDR3區(qū)是如困1-10所示出的AB1，AB7，AB11或AB12的CDR3(或在SEQIDNOs:19，25，31或37中所示出的相應(yīng)的氨基酸殘基)；和(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)，人輕鏈CDR1區(qū)，人輕鏈CDR2區(qū)和人輕鏈CDR3區(qū)，其中，所述人輕鏈CDR3區(qū)是如困1-10所示出的AB1，AB7，AB11或AB12的CDR3(或在SEQIDNOs:22，28，34或40中所示出的相應(yīng)的氨基酸殘基)，其中，所述抗體能結(jié)合CD25.所述抗體還可以包括AB1，AB7，AB11或AB12的重鏈CDR2和/或輕鏈CDR2.所述抗體還可以包括AB1,AB7,AB11或AB12的重鏈CDR1和/或輕鏈CDR1.優(yōu)選的是，上述工程產(chǎn)生的抗體的CDR1、2和/或3包括與本文所公開的AB1，AB7，AB11或AB12完全相同的氡基酸序列。不過，普通技術(shù)人員可以理解的是，相對ABl,AB7，AB11或AB12的完全相同的CDR序列的某些差異是可能的，同時(shí)仍然保留了所迷抗體有效結(jié)合CD25的能力(例如，保守性取代).因此，在另一種實(shí)施方案中，所述工程產(chǎn)生的抗體可以由一個或多個CDR組成，所述CDR例如與AB1，AB7，AB11或AB12的一個或多個CDR具有卯0/0，95%，98%或99*5%的同源性.作為簡單地結(jié)合CD25的補(bǔ)充或替代，可以根據(jù)保留了本發(fā)明抗體的其他功能性質(zhì)來選擇如上文所述的工程產(chǎn)生的抗體，所述性質(zhì)如(1)結(jié)合CD25的高親和力；(2)抑制或阻斷CD25與IL-2結(jié)合；(3)消除表達(dá)CD25的T細(xì)胞；(4)使T細(xì)胞產(chǎn)生耐受性；(5)對表達(dá)CD25的T細(xì)胞增殖的抑制；(6)對PBMC的抗-CD3抗體-謙導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的抑制；(7)MLR的抑制；和/或(8)使在T細(xì)胞上表達(dá)的CD25內(nèi)在化.人單克隆抗體對CD25的結(jié)合的表征可以用多種不同的途徑分離并表征本發(fā)明的人抗-CD25抗體.例如，選擇的雜交瘤可以在合適的用于單克隆抗體純化的燒瓶中生長.然后在用A蛋白-瓊脂糖(用于IgGl同種型抗體)(Pharmacia,Piscataway,NJ)或?qū)τ贗gG3同種型抗體來說，使用抗-人IgG涂表的瓊脂糖或G蛋白珠脂糖進(jìn)行親和層析之前過濾和濃縮上清液.可以通過凝膠電泳和高效液相層析檢查洗脫的IgG，以便確保純度.可以將所述緩沖溶液交換到PBS,并且可以通過OD瀏測定濃度，使用1.43的消光系數(shù).可以將單克隆抗體等分試樣，并且在-80TC下保存。為了確定所述選摔的人抗-CD25單克隆抗體是否能結(jié)合獨(dú)特的表位，可以采用定點(diǎn)誘變或多重定點(diǎn)資變.為了確定純化的抗體的同種型，可以進(jìn)行同種型ELISA.徵量滴定板的孔可以用10|ig/ml的抗-人Ig在41C下涂復(fù)過夜。在用5%BSA(牛血清清蛋白)封閉之后，讓所迷平板與lOpg/ml的單克隆抗體或純化的同種型對照在環(huán)境溫度下反應(yīng)2小時(shí)，然后讓所述孔與人IgGl,IgG2，IgG3或lgG4，IgE，IgAl，IgA2或人IgM-特異性堿性褲酸酶-綴合的探針起反應(yīng).在洗滌之后，用pNPP底物(1mg/ml)對所述平板進(jìn)行顯影，并且通過在405nm下通過OD進(jìn)行分析'為了證實(shí)抗-CD25抗體在免疫的小鼠血清中的存在或單克隆抗體與能表達(dá)CD25的活細(xì)胞的結(jié)合，可以使用流式細(xì)胞術(shù).簡單地講，可以將能表達(dá)CD25的細(xì)胞系(在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下生長)與存在于含有0.1%BSA和0.02%疊氮化鈉的PBS中的各種濃度的單克隆抗體混合，并且在4TC下溫育30分鐘.在洗滌之后，讓所述細(xì)胞與熒光素標(biāo)記的抗-人IgG抗體在與笫一抗體染色相同的條件下反應(yīng).可以用流式細(xì)胞儀(例如，BectonDickinsonFACS儀器)通過流式細(xì)胞術(shù)分析所述樣品，其中利用光線和側(cè)面反射特性來門控單一的活細(xì)胞.可以采用使用了熒光顯微術(shù)的其他測定方法(作為所述流式細(xì)胞術(shù)測定方法的補(bǔ)充或替代).可以按照與上述方法完全相同的方式對細(xì)胞進(jìn)行染色，并且通過熒光顯微術(shù)進(jìn)行檢查.這種方法可以顯現(xiàn)單個細(xì)胞，不過具有依賴于所述抗原的密度的較低的靈敏度.還可以通過蛋白印跡進(jìn)一步測定抗-CD25人IgG與CD25抗原的反應(yīng)性。簡單地講，可以制備來自表達(dá)CD25的細(xì)胞的細(xì)胞提取物，并且進(jìn)行十二烷基碟酸鈉(SDS)聚丙烯跣胺凝膠電泳.在電泳之后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用20%脫脂乳封閉，并且用要試驗(yàn)的單克隆抗體進(jìn)行探測，可以用抗人IgG堿性褲酸睞檢測人IgG結(jié)合，并且用BCIP/NBT底物片刑顯影(SigmaChem.Co,,St.Louis，MO).抑制表達(dá)CD25的細(xì)胞的活性除了特異性結(jié)合CD25之外，可以檢測人單克隆抗CD25抗體抑制細(xì)胞的各種活性的能力，所述細(xì)胞如能表達(dá)CD25的T細(xì)胞和其他淋巴細(xì)胞.例如，T細(xì)胞增殖測定可以用已知技術(shù)進(jìn)行。在一種技術(shù)中，用合適的培養(yǎng)基稀釋人PBMC，然后用，例如，抗-CD3抗體刺激，然后添加各種濃度的實(shí)驗(yàn)抗體，以便測定它們對T細(xì)胞增殖的作用。還可以在存在抗-CD3和抗-CD28單克隆抗體的情況下估計(jì)純化的T細(xì)胞的T細(xì)胞增殖.對MLR的測定也可以用已知技術(shù)進(jìn)行。例如，可以輻射來自笫一個供體的PBMC，并且與來自第二個供體的PBMC混合.然后將各種濃度的抗體添加到所述細(xì)胞中，隨后測重MLR反應(yīng)'II,能產(chǎn)生人單克隆抗-CD25抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物的生產(chǎn)另一方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人動物，如轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠，它能表達(dá)特異性結(jié)合CD25的人抗體.在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠，它具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，以便在用表達(dá)CD25的細(xì)胞免疫時(shí)，所述小鼠能產(chǎn)生人抗-CD25抗體.可以將所述人重鏈轉(zhuǎn)基因整合到小鼠的染色體DNA上，轉(zhuǎn)基因的，例如，HuMAb小鼠的情況即是如此，正如在本文中詳細(xì)描述和解釋的.另外，所述人重鏈轉(zhuǎn)基因可以保持在染色體外，在WO02/43478中所描述的轉(zhuǎn)染色體(例如，KM)的小鼠的情況即是如此.所述轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體動物能夠通過V-D-J/V-J重組和同種型轉(zhuǎn)換生產(chǎn)抗CD25的人單克隆抗體的多種同種型(例如，IgG，IgA和/或IgE).能對用異種抗體所有組成部分進(jìn)行外源抗原剌激作出反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人動物的設(shè)計(jì)，需要在所述轉(zhuǎn)基因動物中所包含的異源免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因能夠在B細(xì)胞發(fā)育的整個途徑中正確發(fā)揮功能.例如，這包括異源重鏈轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換，因此，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因，以便能夠誘導(dǎo)同種型轉(zhuǎn)換和下列抗體基因特征的一種或多種(1)高水平和細(xì)胞類型特異性表達(dá)，(2)功能性基閎重排，(3)等位基因排斥的激活和對等位基因排斥的反應(yīng)，(4)足夠的笫一所有組成部分的表達(dá)，(5)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，(6)體細(xì)胞超突變，和(7)在免疫反應(yīng)期間轉(zhuǎn)基因抗體基因座的顯性化(domination).并非是上述所有標(biāo)準(zhǔn)都必須滿足.例如，在所述轉(zhuǎn)基因動物的內(nèi)源免疫球蛋白基因座發(fā)生功能性破壞的實(shí)施方案中，所迷轉(zhuǎn)基因沒有必要激活等位基因排斥.另外，在所述轉(zhuǎn)基因包括功能性重排的重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因的實(shí)施方案中，功能性基因重排的第二個標(biāo)準(zhǔn)是不必要的，至少對于業(yè)已重排的轉(zhuǎn)基閎來說是這樣的，有關(guān)分子免疫學(xué)的背景，參見FundamentalImmunology,2ndedition(1989)，PaulWilliamE.，ed.RavenPress,N.Y,在某些實(shí)施方案中，用于生成本發(fā)明的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人動物包括所述轉(zhuǎn)基因動物的種系中重排的、未重排的或重排的和未重排的異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的組合.每一個重鏈轉(zhuǎn)基因包括至少一個CH基因.另外，所述重鏈轉(zhuǎn)基因可以包括功能性同種型轉(zhuǎn)換序列，所述序列支持所述轉(zhuǎn)基因動物的B細(xì)胞編碼多個CH基因的異源轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換.所述轉(zhuǎn)換序列可能是天然存在于來自被用作轉(zhuǎn)基因CH基因來源的物種的種系免疫球蛋白基因座，或所述轉(zhuǎn)換序列可以來自存在于要接受所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的物種(所述轉(zhuǎn)基因動物)中的序列。例如，如果被用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠的人轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體整合了與在所述小鼠重鏈基因座上天然存在的序列類似的轉(zhuǎn)換序列，那么所述構(gòu)建體可以產(chǎn)生較高頻率的同種型轉(zhuǎn)換事件，因?yàn)橥茰y所述小鼠轉(zhuǎn)換序列進(jìn)行了最優(yōu)化，以便與小鼠轉(zhuǎn)換重組酶系統(tǒng)發(fā)揮作用，而所述人轉(zhuǎn)換序列則沒有.可以分離轉(zhuǎn)換序列，并且通過常規(guī)克隆方法克隆，或者可以用重疊的合成的寡核苷酸從頭合成，所述寡核苷酸是根據(jù)與免疫球蛋白轉(zhuǎn)換區(qū)序列相關(guān)的公開的序列信息設(shè)計(jì)的(Mills等，Nucl.AcidsRes.15:7305-7316(1991);Sideras等，In.Immunol.1:6:31-642(l卯9)),對上述轉(zhuǎn)基園動物中的每一種來說，功能性重排的異源重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基閨存在于所述轉(zhuǎn)基因動物的B細(xì)胞的主要級分中(至少10%).用于生成本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動物的轉(zhuǎn)基罔包括重鏈轉(zhuǎn)基因，它包括編碼至少一種V基因片段，一種D基因片段，一種J基因片段和至少一種恒定區(qū)基因片段的DNA。所述免疫球蛋白輕鏈轉(zhuǎn)基因包括編碼至少一種V基因片段，一種J基因片段和至少一種恒定區(qū)基因片段的DNA.編碼所述輕鏈和重鏈基因片段的基因片段對產(chǎn)生它們的轉(zhuǎn)基因動物來說是異源的，或者相當(dāng)于來自不是由所述轉(zhuǎn)基因非人動物組成的物種的編碼免疫球蛋白重鏈和輕後基因片段的DNA.在本發(fā)明的一個方面，構(gòu)建了所述轉(zhuǎn)基因，以便單獨(dú)的基因片段是未重排的，即沒有重排的，以便能編碼功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈.所述未重排的轉(zhuǎn)基因能支持V，D和J基因片段重組(功能性重排)，并且在暴露于CD25抗原時(shí)優(yōu)選支持D區(qū)基因片段的全部或一部分整合到轉(zhuǎn)基因動物中所得到的重排的免疫球蛋白重鏈上.在其他實(shí)施方案中，所迷轉(zhuǎn)基因包括未重排的"微型-基因座".所述轉(zhuǎn)基因通常包括C，D和J片段的主要部分，以及V基因片段的亞型.在所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體上，各種調(diào)控序列，例如，啟動子，增強(qiáng)子，類別轉(zhuǎn)換區(qū)，用于RNA加工的剪接供體和剪接受體序列，重組信號等，包括來自所述異源DNA的相應(yīng)的序列.可以將所述調(diào)控序列整合到來自與用于本發(fā)明的非人動物物種相同的或相關(guān)的非人動物物種的轉(zhuǎn)基因上.例如，可以將人免疫球蛋白基因片段在轉(zhuǎn)基因上與嚙齒類動物免疫球蛋白增強(qiáng)子序列組合，以便用于轉(zhuǎn)基因小鼠.另外，合成的調(diào)控序列可整合到所述轉(zhuǎn)基因上，其中，所述合成的調(diào)控序列不是與已知天然存在于所述哺乳動物的基因組中的功能性DNA序列同源的.按照公認(rèn)的規(guī)則設(shè)計(jì)合成的調(diào)控序列，例如，規(guī)定剪接受體位點(diǎn)或啟動子/增強(qiáng)子基序的允許序列的規(guī)則.例如，徵型基因座包括基因組免疫球蛋白基因座的一部分，其與天然存在的種系lg基因座相比，具有至少一個內(nèi)在(即，不是在所迷郜分的末端)非必須DNA部分(例如，間插序列；內(nèi)含子或它的一部分)的缺失.優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人動物，例如，小鼠，展示具有極大所有組成部分的免疫球蛋白生產(chǎn)，在調(diào)整體積后理想地基本上類似于人的情形.在進(jìn)行體積調(diào)整時(shí)，所述所有組成部分理想地接近在人中所示出的，通常具有至少大約10%的多樣性，優(yōu)選25-50%或更高.通常，會產(chǎn)生至少大約一千種不同的免疫球蛋白(理想地為IgG)，優(yōu)選104-106或更多，這依賴于導(dǎo)入所述小鼠基因組中的不同的V,J和D區(qū)的數(shù)目，并且是由通過V(-D-)J基因片段重排和在連接區(qū)進(jìn)行的隨機(jī)核苷酸添加產(chǎn)生的類外多樣性驅(qū)動的.通常，所述免疫球蛋白對預(yù)先選擇的抗原的親和力(KD)低于108M，如低于10'9M，10'lflM或10"M或更低.例如，可以按上述所述，用表達(dá)CD25的細(xì)胞對轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人動物，例如，小鼠進(jìn)行免疫.另外，可以用編碼人CD25的DNA對所述轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行免疫.所述動物然后產(chǎn)生B細(xì)胞，它能通過轉(zhuǎn)換重組(順式-轉(zhuǎn)換)發(fā)生類別轉(zhuǎn)換，并且表達(dá)能與CD25起反應(yīng)的免疫球蛋白.所述免疫球蛋白可以是人抗體(又被稱作"人序列抗體")，其中，所述重鏈和輕鏈多肽是由人轉(zhuǎn)基鉺序列編碼的，它可以包括通過體細(xì)胞突變和V區(qū)重組結(jié)合驅(qū)動的序列，以及種系-編碼的序列；所述人抗體被稱為是與人VL和JL或VH，DH和JH基因片段編碼的多肽序列基本上相同的，即使可能由于體細(xì)胞突變和不同的V-J和V-D-J重組結(jié)合出現(xiàn)了其他非種系序列.每一個抗體鏈的可變區(qū)通常與人種系V和J基因片段具有至少80%的相似性，并且對于重鏈來說，與人種系V，D和J基因片段具有這種相似性；通常與出現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因上的人種系序列具有至少85%的相似性；通常與存在于所述轉(zhuǎn)基因上的人種系序列具有卯％或95%或更高的相似性.不過，由于非種系序列是通過體細(xì)胞突變和VJ和VDJ結(jié)合導(dǎo)入的，所以所述人序列抗體通常具有某些可變區(qū)序列，這些序列不是由存在于小鼠種系中的人轉(zhuǎn)基因上的人V，D或J基因片段編碼的.通常，所述非種系序列(或單獨(dú)的核苷酸位置)是在CDR中或者靠近CDR，或者在已知體細(xì)胞突變聚簇的區(qū)域中聚簇.本發(fā)明的另一方面包括本文所描述的來自轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人動物的B細(xì)胞.可以將所述B細(xì)胞用于生成能表達(dá)人單克隆抗體的雜交瘤，所述抗體能以高親和力結(jié)合人CD25(例如，離解平衡常數(shù)(KD)為低于IO'8M).閎此，在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了能產(chǎn)生人抗體的雜交痏，所述抗體具有低于10-SM的親和力(KD)，如低于1(T9M,1(T1()M或1(T"M或更低，它是通過使用放射性標(biāo)記的單克隆抗體對表達(dá)CD25的細(xì)胞進(jìn)行斯卡查德分析，或通過采用FACS分析測定1/2最大結(jié)合濃度，或通過如在BIAcore儀器上測量的采用表面等離子體共振的分析來確定的.在這里，所述單克隆抗體包括人序列輕鏈，它由(l)輕鏈可變區(qū)，它的多肽序列與由人Vl基因片段和人Jl片段編碼的多肽序列基本上相同，和(2)由人cl基因片段編碼的輕鏈恒定區(qū)組成；以及人序列重鏈，它由(1)重鏈可變區(qū)，它的多肽序列與由人Vh基罔片段，D區(qū)和人jh片段編碼的多肽序列基本上相同；和(2)由人Ch基因片段編碼的恒定區(qū)組成.應(yīng)當(dāng)指出的是，人D基因可以通過重組和體細(xì)胞突變亊件顯著改變，以致于原始的人種系序列不能夠容易地識別.通過在具有包括整合的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物中擴(kuò)增人可變區(qū)基因片段的所有組成部分的方法，能夠促進(jìn)高親和力抗CD25的人單克隆抗體的開發(fā)，所述方法包括將包括V區(qū)基因片段的V基罔轉(zhuǎn)基因?qū)胨龌蚪M，所述基因片段不存在于所述整合的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因上。通常，所述V區(qū)轉(zhuǎn)基因是酵母人工染色體(YAC)，它包括一部分人Vh或VL(Vk)基因片段陣列，正如可能在人基因組中天然存在的或可以通過重組方法分別剪接在一起的，它可以包括無序的或省略的V基因片段.通常，在所述YAC上包括至少五個或更多個功能性V基因片段.在這種變化形式中，可以制備通過所述V所有組成部分?jǐn)U增方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物，其中，所述動物能表達(dá)免疫球蛋白鏈，它包括由存在于V區(qū)轉(zhuǎn)基因上的V區(qū)基因片段編碼的可變區(qū)序列，以及在所述人Ig轉(zhuǎn)基因上編碼的C區(qū)。通過所述V所有組成部分?jǐn)U增方法，可以生成具有至少5個不同的V基因的轉(zhuǎn)基因動物；同樣可生成包括至少約24個V基因或更多的動物.某些V基因片段可能是無功能的(例如，假基因等)；這些片段可以是保留的，或者如果需要的話，可以通過技術(shù)人員可以獲得的重組方法選擇性地去掉.一旦將所述小鼠種系工程改造成包括具有擴(kuò)增的V片段所有組成部分的功能性YAC,所述部分基本不存在于包括J和C基因片段的人Ig轉(zhuǎn)基因上，就可以繁殖所述性狀，并且培育到其他遣傳背景中，包括這樣的遣傳背景，其中，具有擴(kuò)增的V片段所有組成部分的功能性YAC被培育到具有不同的人Ig轉(zhuǎn)基因的非人動物種系中.可以將具有擴(kuò)增的V片段所有組成部分的多種功能性YAC培育到一個種系中，以便與人Ig轉(zhuǎn)基因(或多個人Ig轉(zhuǎn)基因)一起發(fā)揮作用.盡管在這里被稱為YAC轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因在整合到基因組中時(shí)，可能基本上缺乏酵母序列，如在酵母中自主復(fù)制所需要的序列；在不再需要在酵母中復(fù)制之后(即，在導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞或小鼠前合子(prozygote)之前)，所述序列任選可以通過遣傳工程去掉(例如，限制醉切消化和脈沖場凝膠電泳或其他合適方法)。繁殖人序列免疫球蛋白表達(dá)的性狀的方法，包括培育具有人Ig轉(zhuǎn)基因且任選還具有功能性YAC的轉(zhuǎn)基因動物，所迷YAC具有擴(kuò)增的V片段所有組成部分.Vh和Vl基因片段可以同時(shí)存在于YAC上.技術(shù)人員可以將所述轉(zhuǎn)基因動物培育到任何需要的背景中，包括獲得了其他人轉(zhuǎn)基因的背景，包括人Ig轉(zhuǎn)基因和/或編碼其他人淋巴細(xì)胞蛋白的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明還提供了由具有擴(kuò)增的V區(qū)所有組成部分YAC轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)的高親和力人序列免疫球蛋白，盡管上面描述了本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)選實(shí)施方案，但預(yù)期業(yè)已劃分成以下三種類型的其他相關(guān)的實(shí)施方案I.包括未重排的重鏈和重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；II.包括未重排的重鏈和未重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；和ill.包括重排的重鏈和未重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物，在這些類型的轉(zhuǎn)基因動物中，優(yōu)先選擇的優(yōu)選順序如下II>I>in，其中，業(yè)已通過同源重組(或其他方法)剔除了內(nèi)源輕鏈基因(或至少K基因)，以及1>11>111，其中，尚未剔除所述內(nèi)源輕鏈基因，并且所述基因必須通過等位基因排斥顯性化.III.能結(jié)合CD25的雙特異性/多特異性分子在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，可以將抗CD25的人單克隆抗體衍生化或者與另一種功能性分子連接，例如，與另一種肽或蛋白(例如，F(xiàn)ab，片段)連接，以便產(chǎn)生能結(jié)合多個結(jié)合位點(diǎn)或目標(biāo)表位的雙特異性或多特異性分子.例如，本發(fā)明的抗體可以功能性連接(例如，通過化學(xué)偶聯(lián)、遣傳融合、非共價(jià)結(jié)合等)到一個或多個其他結(jié)合分子上，如另一種抗體，肽或結(jié)合模擬物.因此，本發(fā)明包括雙特異性和多特異性分子，它包括至少一種針對CD25的第一種結(jié)合特異性，以及針對笫二種目標(biāo)表位的笫二種結(jié)合特異性.在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，所迷笫二目標(biāo)表位是CD3，CD4,IL-15R,膜結(jié)合或受體結(jié)合的TNF-a,或膜結(jié)合或受體結(jié)合的IL-15。在另一種實(shí)施方案中，所述笫二目標(biāo)表位是Fc受體，例如，人FcyRI(CD64)或人FcaRI(CD89)或T細(xì)胞受體.因此，本發(fā)明包括雙特異性和多特異性分子，其能結(jié)合FcyR，F(xiàn)cotR或能表達(dá)FceR的效應(yīng)細(xì)胞(例如，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞(PMN)),以及結(jié)合能表達(dá)CDM的靶細(xì)胞.所述雙特異性和多特異性分子能將表達(dá)CD25的細(xì)胞靶向效應(yīng)細(xì)胞，并且與本發(fā)明的人單克隆抗體類似，觸發(fā)Fc受體-介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性，如表達(dá)CD25的細(xì)胞的吞噬作用，ADCC,細(xì)胞因子釋放，或超氣陰離子的產(chǎn)生.除了抗-Fc結(jié)合特異性和抗-CD25結(jié)合特異性之外，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子還可以包括第三種結(jié)合特異性.在一種實(shí)施方案中，所述笫三種結(jié)合特異性是抗-增強(qiáng)因子(EF)部分，例如，能結(jié)合參與細(xì)胞毒性活性的表面蛋白并因此增強(qiáng)對靶細(xì)胞的免疫反應(yīng)的分子.所述"抗-增強(qiáng)因子部分"可以是抗體，功能性抗體片段或能結(jié)合特定分子，例如，抗原或受體，并因此導(dǎo)致Fc受體或靶細(xì)胞抗原的所述結(jié)合決定族的作用的增強(qiáng).所述"抗-增強(qiáng)因子部分"可以結(jié)合Fc受體或靶細(xì)胞抗原.另外，所述抗-增強(qiáng)因子部分可以結(jié)合的實(shí)體不同于所述第一和第二結(jié)合特異性結(jié)合的實(shí)體.例如，所述抗-增強(qiáng)因子部分可以結(jié)合細(xì)胞毒性T細(xì)胞(例如通過CD2，CD3，CD8，CD28，CD4，CD40,ICAM-1或其他免疫細(xì)胞，能導(dǎo)致針對所述靶細(xì)胞的增強(qiáng)了的免疫反應(yīng)).在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包括作為結(jié)合特異性的至少一種抗體，包括例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab，，F(xiàn)(ab，)2，F(xiàn)v或scFv.所述抗體還可以是輕鏈或重鏈二聚體，或它們的任何最小片段，如描述于以下文獻(xiàn)中的Fv或單鏈構(gòu)建體Ladner等US4，946，778.所述抗體還可以是公開于以下文獻(xiàn)中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白US2003/0118592和US2003/0133939.在一種實(shí)施方案中，對Fc受體的結(jié)合特異性是通過人單克隆抗體提供的，它們的結(jié)合不會受到人免疫球蛋白G(IgG)的阻斷。在本文中，術(shù)語"IgG受體"表示位于1號染色體上的八個y-鏈基因中的任何一個。這些基因共編碼十二種跨膜或可溶性受體同種型，這些同種型可以劃分成三種類型的Fcy受體FcyRI(CD64)，F(xiàn)cyRII(CD32)和FcyRIII(CD16).在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所迷Fcy受體是人高親和力的FcyRI.所述優(yōu)選單克隆抗體的生產(chǎn)和表征由Fanger等描述于以下文獻(xiàn)中WO88/00052和US4,954,617.所述抗體能在不同于所述受體的Fcy結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)上結(jié)合FcyRI，F(xiàn)cyRII或FcyRIII上的表位，因此，它們的結(jié)合不會受到生理學(xué)水平的IgG的顯著阻斷.用于本發(fā)明的特定抗-FcyRI抗體是MAb22,MAb32，MAb44，MAb62和MAbl97,在其他實(shí)施方案中，所述抗-FcyRI抗體是MAb22(H22)的人源化形式.H22抗體的生產(chǎn)和表征描述于以下文獻(xiàn)中Graziano，R.F.等(1995)JImmunol.155(10):4996-5002以及WO94/10332,所述生產(chǎn)H22抗體的細(xì)胞系于l992年11月4日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，名稱為HA022CL1，保藏號為No.CRL11177.在另一種實(shí)施方案中，對Fc受體的結(jié)合特異性是通過結(jié)合在人1gA受體上的抗體提供的，所述受體例如，F(xiàn)caRI(CD89)，它們的結(jié)合優(yōu)選不會受到人免疫球蛋白A(IgA)的阻斷.術(shù)語"IgA受體"意在包括位于19號染色體上的一個a-基因(FcttRI)的基因產(chǎn)物.已知該基因編碼幾種55-110kDa的可變剪接的跨膜同種型，F(xiàn)caRI(CD89)是在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞上以組成型形式表達(dá)的，但不能在非-效應(yīng)細(xì)胞群體上表達(dá).FcaRI具有對IgAl和IgA2的中等親和力，這種親和力在暴露于諸如G-CSF或GM-CSF的細(xì)胞因子時(shí)提高(Morton,H,C.等(1996)CriticalReviewsinImmunology16:423-440).業(yè)已公開了被鑒定為A3，A59,A62和A77的四種FcaRI-特異性單克隆抗體，其能在IgA配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域外面結(jié)合FcaRI(Monteiro，R.C.等，1992，J.Immunol.148:1764).FcaRI和FcyRI是用于本發(fā)明的優(yōu)選的觸發(fā)受體，因?yàn)樗鼈?1)主要是在免疫效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)的，例如，單核細(xì)胞，PMN,巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞；(2)是高水平表達(dá)的(例如，每個細(xì)胞5，000-100,000);(3)是細(xì)胞毒性活性(例如，ADCC,吞噬作用)的介質(zhì)；和(4)介導(dǎo)了靶向它們的抗原，包括自身抗原的增強(qiáng)了的抗原呈遞作用.在本文中，"效應(yīng)細(xì)胞特異性抗體"表示能結(jié)合所述效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體的抗體或功能性抗體片段.用于本發(fā)明的優(yōu)選的抗體能在不能被內(nèi)源免疫球蛋白結(jié)合的位點(diǎn)上結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體.在本文中，術(shù)語"效應(yīng)細(xì)胞"表示包含在免疫反應(yīng)的效應(yīng)期中的免疫細(xì)胞，與免疫反應(yīng)的識別期(cognitivephase)和活化期相對，示例性的免疫細(xì)胞包括骨lt或淋巴樣來源的細(xì)胞，例如，淋巴細(xì)胞(例如，B細(xì)胞和T細(xì)胞，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL))，殺傷細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜中性白細(xì)胞，多形核細(xì)胞，粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞和嗜械性粒細(xì)胞.某些效應(yīng)細(xì)胞能表達(dá)特殊的Fc受體，并且完成特殊的免疫功能.在優(yōu)選實(shí)施方案中，效應(yīng)細(xì)胞能夠誘導(dǎo)ADCC,例如，嗜中性粒細(xì)胞能夠誘導(dǎo)ADCC,例如，能表達(dá)FcR的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞參與了靶細(xì)胞的特異性殺傷，并且將抗原呈遞給免疫系統(tǒng)的其他成分，或者與呈遞抗原的細(xì)胞結(jié)合.在其他實(shí)施方案中，效應(yīng)細(xì)胞能夠呑噬靶抗原，把細(xì)胞或微生物.特定FcR在效應(yīng)細(xì)胞上的表達(dá)可以通過諸如細(xì)胞因子的體液因子調(diào)控.例如，業(yè)已發(fā)現(xiàn)FeyRI的表達(dá)能被干擾素y(IFN-y)上調(diào).這種增強(qiáng)了的表達(dá)提高了具有FcyRI的細(xì)胞對靶的細(xì)胞毒性活性。效應(yīng)細(xì)胞能夠吞噬或裂解靶抗原或靶細(xì)胞。"把細(xì)胞"表示受試者(例如，人或動物)體內(nèi)的能夠被本發(fā)明的組合物(例如，人單克隆抗體，雙特異性或多特異性分子)靶向的任何細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述靶細(xì)胞是能表達(dá)或超表達(dá)CD25的細(xì)胞.表達(dá)CD25的細(xì)胞一般包括活化的T細(xì)胞，單核細(xì)胞和B細(xì)胞。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子可以用化學(xué)技術(shù)(參見，例如，D，M.Kranz等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:5807)，"polydoma"技術(shù)(參見授予Reading的US4，474，893)，或重組DNA技術(shù)制備.具體地講，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子可以使用本領(lǐng)域已知的并且在本文的實(shí)施例中所描述的方法，通過綴合所述組分性(constituent)結(jié)合特異性，例如，抗-FcR和抗-CD25結(jié)合特異性制備.例如，所述雙特異性和多特異性分子的每一種結(jié)合特異性可以分別產(chǎn)生，然后彼此綴合在一起.當(dāng)所述結(jié)合特異性是蛋白或肽時(shí)，可以將多種偶聯(lián)刑或交聯(lián)刑用于共價(jià)綴合.交聯(lián)刑的例子包括A蛋白，碳二亞胺，N-坑珀酰亞胺-S-乙跣基-硤代乙酸醱(SATA),5，5，-二砥代雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB),鄰亞苯基雙馬來酰亞胺(oPDM),]\-琥珀酰亞胺-3-(2-吡淀基二碟代)丙酸酹(SPDP)，和橫基琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-l-羧酸(橫基-SMCC)(參見，例如，Karpovsky等(1984)JExp,Med.160:1686;Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8648).其他方法包括描述于以下文獻(xiàn)中的方法Paulus,BehringIns.Mitt.(1985)No.78，118-132;Brennan等，Science(1985)229:81-83，和GIennie等，J.Immunol.(1987)139:2367-2375.優(yōu)選的綴合度刑是SATA和磺基-SMCC,這兩種試劑都可以從PierceChemicalCo.(Rockford，IL)獲得，當(dāng)所述結(jié)合特異性是抗體時(shí)，它們可以通過兩個重鏈的C-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵綴合.在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鉸鏈區(qū)在綴合之前修飾成包括奇數(shù)數(shù)目的巰基，優(yōu)選一個。另外，兩種結(jié)合特異性可以在相同的栽體上編碼，并且在相同的宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配.當(dāng)所述雙特異性和多特異性分子是MAbxMAb，MAbxFab，F(xiàn)abxF(ab，)2或配體xFab融合蛋白時(shí)，該方法尤其適用。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子，例如，雙特異性分子可以是單鏈分子，如單鏈雙特異性抗體，單鏈雙特異性分子包括一個單鏈抗體和一個結(jié)合決定簇，或單鏈雙特異性分子包括兩個結(jié)合決定簇.雙特異性和多特異性分子還可以是單鏈分子，或者可以包括至少兩個單鏈分子.用于制備這種雙特異性和多特異性分子的方法描述于以下文獻(xiàn)中，例如，US5,260,203;US5,455,030;US4，881，175;US5,132,405;US5,091,513;US5,476,786;US5,013,653;US5,258,498和US5，482，858,所述雙特異性和多特異性分子與它們的特定靶的結(jié)合可以通過以下方法證實(shí)醃聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，放射免疫測定(RIA)，F(xiàn)ACS分析，生物測定(例如，生長抑制作用)，BIAcore分析或蛋白印跡分析.上述每一種測定方法通常檢測特別感興趣的蛋白-抗體復(fù)合物的存在，包括采用對感興趣的復(fù)合物特異性的標(biāo)記過的試劑(例如，抗體).例如，所述FcR-抗體復(fù)合物可以采用例如，酶聯(lián)抗體或抗體片段檢測，所述抗體或抗體片段能識別并且特異性地結(jié)合所述抗體-FcR復(fù)合物.或者，可以用多種其他免疫測定方法中的任意一種檢測所述復(fù)合物.例如，所述抗體可以進(jìn)行放射性標(biāo)記，然后用于放射免疫測定(RIA)(參見，例如，Wehitraub，B.，PrinciplesofRadioimmunoassays,SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques,TheEndocrineSociety,March,1986).可以通過以下方法檢測放射性同位素，如使用Y計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或通過放射自顯影法.IV.免疫綴合物在本發(fā)明的另一方面，人抗-CD25抗體與治療部分綴合，如細(xì)胞毒素，藥物(例如，免疫抑制刑)或放射性同位素。所述綴合物在本文中被稱作"免疫綴合物".包括一種或多種細(xì)胞毒素的免疫綴合物被稱作"免疫毒素".細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對細(xì)胞有害(例如殺傷)的任何試劑.其例子包括紫杉醇，松胞菌素B,短桿菌肽D，溴化乙錠，吐根械，絲裂霉素，足葉乙戒，鬼臼^吩甙(tenoposide)，長春新堿，長春械，秋水仙堿，阿審素，柔紅霉素，二羥基炭疽菌素二嗣(dihydroxyanthracindione)，米托蒽敏，光神審素，放線菌素D,l-去氛睪嗣，糖皮質(zhì)激素，普香卡因，丁卡因，利多卡因，心得安和嘌呤霉素及其類似物或同系物.適合形成本發(fā)明的免疫綴合物的合適的治療刑包括，但不局限于，抗代謝物(例如，氨甲蝶呤，6-巰基嘌呤，6-硤鳥嘌呤，阿糖胞苷，氣達(dá)拉濱(fludarabin),5-氟尿嗜咬decarbazine)，烷化劑(例如，氮芥，thioepa苯丁酸氮芥，美法侖，卡氮芥(BSNU)和環(huán)己亞硝脲(CCNU)，環(huán)褲酰胺，白消安，二溴甘露醇，鏈脲審素，絲裂審素C和順拍(cis-dichlorodiamineplatinum(II)(DDP)),蒽環(huán)審素(例如，柔紅審素(以前稱之為daunomycin)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素D(以前稱之為actinomycin)，博來審素，光神霉素和氨苗審素(AMC)),和抗-有絲分裂刑(例如，長春新堿和長春械).可以與本發(fā)明的抗體綴合的治療性細(xì)胞毒素的其他例子包括卡奇霉素(calicheamicin)和duocarmycin.本發(fā)明的抗體還可以與放射性同位素，例如，碘-131，釔-卯或銦-111綴合，以生成用于治療諸如癌癥的與相關(guān)的疾病的細(xì)胞毒性放射性藥物.本發(fā)明的抗體綴合物可用于改變特定的生物學(xué)反應(yīng)，并且所述藥物部分不應(yīng)當(dāng)被理解成局限于典型化學(xué)治療劑.例如，所述藥物部分可以是具有需要的生物學(xué)活性的蛋白或多肽.例如，所述蛋白可以包括醉促活性毒素，或它的活性片段，如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，假單胞菌外毒素A或白喉毒素，或在細(xì)胞表面上有活性的試劑，如礴脂酶，例如，褲脂醉C.用于將所述治療部分綴合在抗體上的技術(shù)是眾所周知的，例如，參見Arnon等，"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy"，inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等(eds.)，pp*243-56(AlanR.Liss，Inc，1985);Hellstrom等,"AntibodiesForDrugDelivery"，inControlledDrugDelivery(2ndEd.)，Robinson等(eds,)，pp.623-53(MarcelDekker，Inc,1987)jThorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview"，inMonoclonalAntibod:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等(eds.)，pp.475-506(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseofRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy"，inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等(eds,)，pp*303-16(AcademicPress1985);和Thorpe等，"ThePreparationandCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates"，ImmunoLRev"62:119-58(1982)。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體被附著在接頭螯合劑(例如，tiu狄tan)上，它使得所述抗體能夠與放射性同位素綴合.V,藥用組合物另一方面，本發(fā)明提供了組合物，包括藥用組合物，它含有一種本發(fā)明的人羊克隆抗體或其組合.所述組合物還可以用藥學(xué)上可接受的栽體或稀釋劑或任何其他已知的佐刑和賦形刑按照常規(guī)技術(shù)制備，如公開于如下文獻(xiàn)中的技術(shù)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thEdition,Gennaro，Ed"MackPublishingCo"Easton，PA，1995.本發(fā)明的組合物還可施用于組合治療，即與要治療的疾病或狀況相關(guān)的其他試刑組合.例如，所述組合治療可以包括本發(fā)明的組合物與至少一種免疫抑制劑，至少一種抗炎劑，至少一種牛皮褲試刑，或至少一種化療刑，在一種實(shí)施方案中，所述治療刑包括一種或多種免疫抑制劑，如環(huán)孢菌素，咪唑硫嚷呤，審酚酸，麥考酚酸嗎啉乙醋，皮質(zhì)類固醇，如潑尼松，氨甲堞呤，氣金酸鈉，柳氮磺吡啶，抗瘧刑，白瑞夸爾，來氣洛米，咪唑立賓，15-deoxyspergualine，6-就基嚷呤，環(huán)褲酰胺，瑞帕審素，他克莫司(FK-506)，OKT3，抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白等。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物是與兩種或更多種免疫抑制劑組合施用的，如潑尼松和環(huán)孢苗素；潑尼松，環(huán)孢苗素和咪唑硫嚷呤；或潑尼松，環(huán)孢菌素和麥考盼酸嗎淋乙癍.在另一種實(shí)施方案中，所述治療刑包括一種或多種抗炎刑，如類固醇藥物或NSAID(非類固醇抗炎藥物)。例如，優(yōu)選的試劑包括阿司匹林和其他水楊酸鹽，Cox-2抑制刑，如羅非克西(rofecoxib)和塞來昔布(celecoxib)，NSAID，如布洛芬，非諾洛芬鉀，萘普生，舒林酸，雙氯酚酸鈉，吡羅昔康，酮洛芬，雙氣尼酸，萘丁美稱，依托度奧沙普嗪和吲哚美辛.在另一種實(shí)施方案中，所述治療劑包括一種或多種DMARD，如氨甲蝶呤，幾氣喹，柳氮磺吡啶，嘧啶合成抑制刑，例如，來氟洛米，IL畫1受體封閉劑，例如，阿那白滯素(anakinra)，和TNF-a封閉刑，例如，依那西普(etanercept),infliximab和adalim咖ab。其他合適的DMARD是抗-IL^6R抗體，CTLA4Ig和抗-IL-15抗體.在另一種實(shí)施方案中，所述治療刑包括一種或多種用于治療炎性或過度增殖性皮膚病的試劑，如局部藥物，包括煤焦油，維生素A，蒽林，calcipotrien，tarazotene，和皮質(zhì)類閨醇，口服或注射藥物，如皮質(zhì)類固醇，氨甲蟝呤，類視黃醇，例如acicretin,環(huán)孢菌素，依那西普，alefac印t，efaluzimab，6-破鳥嚷呤，麥考盼酸嗎啉乙酶，他克莫司(FK-幼6)和祭基脲.其他例子有CTLA4Ig和infliximab.其他治療方法可以包括暴露于陽光或光線治療，包括UVB(寬帶和窄帶紫外線B),UVA(紫外線A)和PUVA(補(bǔ)骨脂素8-甲氣基補(bǔ)骨脂素加紫外線A).在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物是以與兩種或更多種上述治療劑組合的形式施用的，如氨甲蟝呤+光線治療(PUVA或UVA);氨曱蝶呤+阿昔曲丁；阿昔曲丁+光線治療(PUVA或UVA);氨甲蝶呤+阿昔曲丁+光線治療(PWA或UVB);羥基脲+光線治療(PUVA或UVB);羥基脲+阿昔曲??；環(huán)孢菌素+氨甲蝶呤；或calcipotrien+光線治療(UVB).在另一種實(shí)施方案中，所述治療刑包括一種或多種化學(xué)治療刑，如阿審素，順鉑，博來審素，卡氣芥，環(huán)礴酰胺，長春耽胺，長春新堿和苯丁酸氮芥.在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以與放療和/或骨號移植組合施用.在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以與其他抗體組合施用，例如，其他免疫抑制性人單克隆抗體，如與IL-2受體的p75結(jié)合的抗體，或能與例如MHC,CD2，CD3，CD4，CD7,CD28，B7，CD40,CD45，IFN圃y，TNF-ct，IL-4,IL^5，I"R，IL-7，H8，ILIO，CDlla，CD20或CD58結(jié)合的抗體，或能與它們的配體結(jié)合的抗體；或與其他免疫調(diào)節(jié)化合物組合，例如，可溶性IL-15R或IL-10.在本文中，"藥學(xué)上可接受的栽體"包括生理學(xué)上相容的任何和所有溶刑，分散介質(zhì)，涂層，抗細(xì)菌刑和抗真菌劑，等滲劑和吸收延援劑等.優(yōu)選的是，所述栽體適合靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，腸胃外，脊髄或表皮施用，(例如，通過注射或輸注)。"藥學(xué)上可接受的鹽"表示保留了母體化合物的理想的生物學(xué)活性，并且不會產(chǎn)生任何不希望的毒理學(xué)作用的鹽(參見，例如，Berge,S.M.,等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19).所述鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括來自無毒性無機(jī)酸的鹽，如鹽酸，硝酸，褲酸，硪酸，氬溴酸，氫硤酸和亞磷酸等，以及來自無毒性有機(jī)酸的鹽，如脂族酸一元-和二元羧酸，苯基取代的鏈烷酸，羥基鏈烷酸，芳族酸，脂族酸和芳族橫酸等。堿加成鹽包括來自堿土金屬的鹽，如鈉，鐘，鎂，鈣等，以及來自無毒性有機(jī)胺的鹽，如N，N，-二芐基-乙二胺，N-甲基葡糖胺，氣普魯卡因，膽堿，二乙醇胺，乙二胺和普魯卡因等.包括藥學(xué)(治療性)組合物在內(nèi)的本發(fā)明的組合物可以通過多種本領(lǐng)域公知的方法施用.正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，施用途徑和/或方式依賴于希望的結(jié)果而變化.所迷活性化合物可以用能防止所述化合物快速釋放的栽體制備，如控釋的制劑，包括植入物，經(jīng)皮的貼劑和微囊化的送遞系統(tǒng).可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，膠原，聚原酸BS和聚乳酸.用于制備所迷制劑的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所普遍公知，參見，例如，SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems，J.R.Robinson,ed"MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978,為了通過某些施用途徑施用本發(fā)明的組合物，可能需要用能防止它失活的材料對所述化合物進(jìn)行涂覆或與所述化合物同時(shí)施用.例如，所述化合物能夠在合適的栽體中給受試者施用，例如，脂質(zhì)體或稀釋刑.藥學(xué)上可接受的稀釋刑包括鹽水和含水緩沖溶液.脂質(zhì)體包括水-包-油-包-水(water-in-oil-in-water)CGF乳劑以及常規(guī)脂質(zhì)體(Strejan等(1984)J.Neuroimm咖I.7:27),藥學(xué)上可接受的栽體包括無菌水溶液或分散體，以及用于臨時(shí)制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末.將所述介質(zhì)和試刑用作藥學(xué)活性物質(zhì)的用途為本領(lǐng)域所公知.除非任何常規(guī)介質(zhì)或試刑與所述活性化合物不相容，都可以預(yù)期將它們用于本發(fā)明的藥用組合物中.還可以將補(bǔ)充性活性化合物整合入組合物中.治療性組合物通常必須是無菌的，并且在生產(chǎn)和貯藏條件下是穩(wěn)定的。所述組合物可以制備成溶液，微乳狀液，脂質(zhì)體或其他適合高的藥物濃度的有序結(jié)構(gòu).所述栽體可以是溶刑或分散介質(zhì)，包括例如水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇和液體聚乙二醇等)，以及它們的合適的混合物.可以保持合適的流動性，例如，通過使用諸如卵砩脂的涂褒，對于分散體來說通過保持需要的粒度，以及通過使用表面活性劑，在很多情況下在所述組合物中優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖，多元醇，如甘油，甘露糖醇，山梨糖醇或氣化鈉.可以通過在所述組合物中包括能延緩吸收的試劑使所述注射組合物吸收時(shí)間延長，所述試刑例如，單硬脂酸鹽和明膠.在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體是以結(jié)晶形式通過皮下注射施用的，參見Yang等(2003)PNAS,100(12):6934-6939,所述無菌注射溶液是通過以下方法制備的將需要量的活性化合物整合入合適的溶刑中，該溶劑根據(jù)需要可以包括上述列舉的一種或多種成分，然后進(jìn)行微量過濾滅菌.一般，分散體是通過以下方法制備的，將所述活性化合物整合入無菌栽體中，所述栽體含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自上面所列舉的需要的其他成分.對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉末來說，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，它能產(chǎn)生來自前面的無菌過濾溶液的活性成分加上任何其他需要的成分的粉末.調(diào)整刑重方案，以便提供最佳的需要的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng)).例如，可以施用快速灌注，可以在一定時(shí)間施用若干分開的刑童或根據(jù)治療情形的緊急情況按比例減少或增加劑童.特別有利的是，制備劑量單位形式的煬胃外組合物，以便于刑重的施用和一致性.在本文中，刑量單位形式表示物理形態(tài)上不連續(xù)的單位，適合用作要治療的受試者的單位劑量；每一個單位包括預(yù)定量的活性化合物，根據(jù)計(jì)算，它能與需要的藥學(xué)栽體一起產(chǎn)生需要的治療效果。有關(guān)本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)定遵循并且直接依賴于(a)所述活性化合物的獨(dú)特特征和要獲得的特定治療效果，和(b)復(fù)合這樣的活性化合物以治療個體中的敏感性的領(lǐng)域所固有的限制.藥學(xué)上可接受的抗氣化刑的例子包括(l)水溶性抗氣化刑，如抗壞血酸，半胱氨酸鹽酸鹽，疏酸氬鈉，焦亞碟酸鈉和亞碟酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸癍，丁基化鞋基苯甲鍵(BHA)，丁基化幾基甲苯(BHT)，印砩脂，梧酸丙醋，a-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸等。本發(fā)明的治療組合物可以制備成用于特定的施用途徑，如經(jīng)口，經(jīng)鼻，局部(包括口腔和舌下)，直腸，陰道和/或腸胃外施用。所述制劑可方便地以單位刑量形式提供，并且可以通過藥刑學(xué)領(lǐng)域所公知的任何方法制備.可以與栽體材料組合以便生產(chǎn)單一刑量形式的活化成分的重依賴于接受治療的受試者，和特定施用模式而變化.可以與栽體材料組合以便生產(chǎn)單一劑量形式的活化成分的量通常是能產(chǎn)生治療效果的所述組合物的量。一般，以百分單位計(jì)算，該用量為大約0.01%-大約99%的活性成分，優(yōu)選大約0.1%-大約70°/。，最優(yōu)選大約1%-大約30%.適合陰道施用的本發(fā)明的制刑還包括陰道栓刑，棉塞，乳骨，凝膠，糊刑，泡沫或噴霧制刑，其含有本領(lǐng)域公知為合適的栽體.用于局部或經(jīng)皮施用本發(fā)明組合物的劑型包括粉末，噴霧刑，軟骨，糊刑，乳貴，洗劑，凝膠，溶液，貼刑和吸入刑。所述活性化合物還可以在無菌條件下與藥學(xué)上可接受的栽體混合，并且與任何防腐刑，緩沖劑，或可能需要的推進(jìn)劑混合.在本文中，短語"腸胃外施用"和"腸胃外地施用"表示除了腸道和局部施用之外的施用方式，通常通過注射施用，并且包括，但不局限于靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，動脈內(nèi)，鞘內(nèi)，囊內(nèi)，眼眶內(nèi)，心臟內(nèi)，皮內(nèi)，腹膜內(nèi)，經(jīng)氣管，皮下，表皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)，囊下，蛛網(wǎng)膜下，脊柱內(nèi)，硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注.可用于本發(fā)明的藥用組合物中的合適的含水和無水栽體的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)，以及它們的合適的混合物，植物油，如揪欖油和可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯.可以保持合適的流動性，例如，通過使用涂褒材料，如卵礴脂，對于分散體來說通過保持需要的粒度，以及通過使用表面活性刑.所述組合物還可以包括佐刑，如防腐刑，濕潤刑，乳化劑和分散刑。預(yù)防微生物的出現(xiàn)可以通過滅菌方法保證，同上，并且通過包括各種抗細(xì)菌劑和抗真菌刑，例如，對羥基苯甲酸醋類，氯代丁醇，苯盼，山梨酸等?？赡苓€需要在所述組合物中包括等滲刑，如糖，氯化鈉等。另外，可注射藥物形式的延長的吸收可以通過包括能延遲吸收的試劑實(shí)現(xiàn)，如一硬脂酸鋁和明膠。當(dāng)本發(fā)明的化合物作為藥物給人和動物施用時(shí)，它們可以單獨(dú)提供或者作為藥用組合物形式提供，該組合物包括，例如0.01-99.5%(更優(yōu)選0.1-90%)活性成分和藥學(xué)上可接受的栽體的組合。無論選掙的施用途徑如何，能夠以合適的水合形式使用的本發(fā)明的化合物，和/或本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的常規(guī)方法制備成藥學(xué)上可接受的刑量形式.本發(fā)明藥用組合物中活性成分的實(shí)際刑量水平可以改變，以便獲得一定量的活性成分，它能有效實(shí)現(xiàn)對特定患者，組合物和施用模式來說理想的治療反應(yīng)，而又對所述患者無毒.選擇的刑量水平依賴于多種藥物代謝動力學(xué)因素，包括所采用的本發(fā)明的特定組合物或它的酯，鹽或耽胺的活性，施用途徑，施用時(shí)間，所采用的特定化合物的排泄速度，治療持續(xù)時(shí)問，用于與所采用的特定組合物組合的其他藥物，化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡，性別，體重，狀況，一般健康狀況和以前的病史，和醫(yī)學(xué)領(lǐng)城所熟知的類似因素.具有本領(lǐng)域普通技能的醫(yī)生或善醫(yī)可以容易地確定并且開出需要的藥用組合物的有效量的處方.例如，醫(yī)生或善醫(yī)可以開始于給出的用于所述藥用組合物中的本發(fā)明化合物的刑量低于為了獲得理想的治療效果所需要的劑量，并且逐漸加大劑重，直到獲得需要的效果.一般，本發(fā)明的組合物的合適的每日刑量是所迷化合物能有效產(chǎn)生治療效果的最低刑重.所述有效刑量通常依賴于上述因素.施用優(yōu)選是靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)或皮下施用，優(yōu)選在靠近靶的位點(diǎn)施用.盡管本發(fā)明的化合物可能單獨(dú)施用，但優(yōu)選將所述化合物作為藥用制刑(組合物)施用.所述刑量可以通過以下方法確定或調(diào)整，即在施用之后的不同時(shí)間點(diǎn)測量生物學(xué)樣品中的循環(huán)單克隆抗-CD25抗體的重，這通過利用靶向抗-CD25抗體的抗-獨(dú)特型抗體來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的人單克隆抗體可用于通過誘導(dǎo)治療預(yù)防移植物排斥，即在移植之前以及在移植之后的極早期作為一次或多次施用的預(yù)防性短期治療，例如，在移植之前不久和在移植之后最多三個月.在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體可以，例如，以大約20-100mg的總刑量用于預(yù)防移植物排斥，例如，作為15或20mg靜脈內(nèi)輸注施用，笫一刑在手術(shù)之前施用，而隨后的劑次在手術(shù)之后前10天時(shí)間.另外，所述劑量可以通過彈丸注射施用.在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體可以以靜脈內(nèi)施用0.5-1.5mg/kg的刑重用于預(yù)防移植物排斥，每隔一周施用一次，最多5刑，笫一刑在手術(shù)之前施用，所述施用可以與免疫抑制治療組合，例如類固醉，如潑尼松或甲強(qiáng)龍和環(huán)孢菌素；類固醉，如潑尼松或甲強(qiáng)龍，環(huán)孢菌素和咪唑疏嘌呤；或類固醇，如潑尼松或甲強(qiáng)龍，環(huán)孢菌素和麥考酴酸嗎淋乙癍.所述人抗體的施用可有利地節(jié)約類固醇或?qū)е驴焖兕愗璐纪Ｓ?在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體可用于治療或預(yù)防移植物排斥，這通過兩刑的靜脈內(nèi)輸注方案實(shí)現(xiàn)(在移植當(dāng)天每刑大約20mg，以及在移植之后4天大約20mg)所述施用可以與先疫抑制治療組合，例如，按上文所公開的方法進(jìn)行.例如，可以在手術(shù)之前口服施用1g麥考酚酸嗎啉乙酯，并且在麻醉誘導(dǎo)時(shí)施用500mg甲強(qiáng)龍.可以在移植之后第二天導(dǎo)入環(huán)孢苗素，并且在移植之后繼續(xù)導(dǎo)入1g麥考盼酸嗎啉乙酯.在手術(shù)之后第四天可以將類固醉減少到口服潑尼松20mg。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體可用于治療或預(yù)防移植物排斥，這通過兩刑的誘導(dǎo)治療實(shí)現(xiàn)，第一劑lmg/kg在手術(shù)之前l(fā)小時(shí)提供，而笫二刑在移植之后4天提供.所述施用可以與克疫抑制治療組合，正如上文所^^開的.本發(fā)明的人單克隆抗體可用于通過長期治療預(yù)防移植物排斥，例如通過施用10^150mg范閨內(nèi)的刑量，如20"40mg，每周一次施用或每月一次施用，例如，3-8次每周一次的施用，隨后為任選的一次或多次每月一次的施用.通過長期治療，可以減少或避免環(huán)孢菌素維持療法.治療性抗體組合物可以借助于本領(lǐng)域已知的醫(yī)學(xué)裝置施用.例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物可以用無針頭皮下注射裝置施用，如公開于以下文獻(xiàn)中的裝置，US5，399，163;US5,383,851;USS，312，335;US5,064,413;US4,941,880;US4，7卯，824;或US4，596，556.用于本發(fā)明的眾所周知的植入物和組件的例子包括US4，487，603,它公開了用于以受控制的速度分配藥物的可植入的微型-輸注泵；US4，486，194，它公開了用于通過皮膚施用藥物的治療裝置；US4,447,233公開了用于以精確的榆注速度送遞藥物的輸注泵；US4，447，224，它公開了用于連續(xù)藥物送遞的可變流量的可植入式輸注裝置；US4，439，196，它公開了具有多個腔室的滲透壓藥物送遞系統(tǒng)；以及US4，475，196，它公開了滲透壓藥物送遞系統(tǒng).很多其他這樣的植入物，送遞系統(tǒng)和組件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知.在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體可以制備成能確保在體內(nèi)正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)排除了很多髙親水性化合物為了確保本發(fā)明的治療性化合物可以穿過BBB(如果需要的話)，可以將它們制備在，例如脂質(zhì)體中.有關(guān)生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，參見，例如，US4,522,811;US5，374，548;和US5,399,331.脂質(zhì)體可以包括一種或多種部分，它們能選擇性地轉(zhuǎn)移到特定細(xì)胞或器官中，因此增強(qiáng)定向藥物送遞(參見，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685).示例性的定向部分包括葉酸或生物素(參見，例如，授予Low等的US5，416，016);甘露糖苦(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBSLett.357:140;M,Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180);表面活性劑A蛋白受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134)，其中不同的類型可以包括本發(fā)明的制刑，以及本發(fā)明分子的成分；p120(Schrder等(1994)J.Biol.Chem.269:9090);還可參見K.Keinanen;M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123;J.J.Kimon;I.J.Fidler(1994)Immunometliods4:273.在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療化合物可以在脂質(zhì)體中配制；在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷脂質(zhì)體包括定向部分.在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在于脂質(zhì)體中的治療化合物是通過彈丸注射送遞到靠近理想?yún)^(qū)域的位點(diǎn)的，例如，發(fā)炎或感染位點(diǎn)，或肺癍位點(diǎn).所述組合物必須為便于可注射地存在的程度的流體.在生產(chǎn)和貯藏條件下它必須是穩(wěn)定的，并且必須能防止諸如細(xì)菌和真菌的微生物的污染作用。本發(fā)明的人單克隆抗體的有效劑量和劑重方案依賴于要治療的疾病或狀況，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定.用于預(yù)防移植物排斥的"治療有效劑量"優(yōu)選能減少早期移植物排斥發(fā)作的數(shù)目和嚴(yán)重性。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的"治療有效刑重"優(yōu)選能導(dǎo)致患者中ACR20的改善初步定義(ACR20PreliminaryDefinitionoflmprovement)，更優(yōu)選導(dǎo)致ACR50的改善初步定義，更優(yōu)選導(dǎo)致ARC70的改善初步定義，ACR20的改善初步定義的含義如下在觸痛關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)(TenderJointCount)(TSC)和腫脹關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)(SwollenJointCount)(SJC)中>20%的改善以及在下述5種評價(jià)的3種中的>20%的改善患者疼痛評價(jià)(PatientPainAssessment)(VAS)，患者總體評價(jià)(PatientGlobalAssessment)(VAS)，醫(yī)師總體評似PhysicianGlobalAssessmentXVAS)，患者自我評價(jià)的能力喪失(PatientSelf-AssessedDisability)(HAQ)和急性期反應(yīng)物(AcutePhaseReactant)(CRP或ESR)。ACR50和ACR70是以相同的方式定義的，分別具有>50%和>70%的改善，有關(guān)進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可以參見Fdson等mAmericanCollegeofRheumatologyPreliminaryDefinitionofImprovementinRheumatoidArthritis;ArthritisRheumatism(1995)38:727-735.另外，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療有效刑量可以通過DAS(疾病活性得分)測量，包括DAS28和，更優(yōu)選DAS56，正如EULAR所定義的.牛皮姅?shù)?治療有效刑量"優(yōu)選在患者體內(nèi)導(dǎo)致PASI50，更優(yōu)選PASI75，更優(yōu)選PASI卯，或與治療前的狀況相比，導(dǎo)致在藥物治療之后的總體牛皮癬評估改善比較印象的降低.PASI(牛皮癬面積和嚴(yán)重性指數(shù))是用于評估疾病的面積和嚴(yán)重性的評分系統(tǒng).PASI50被定義為>50%改善的得分.用相同方法將PASI75和PASI卯定義為>75%和>90%改善的得分.腫瘤治療的"治療有效刑量"可以通過客觀肺瘤反應(yīng)測量，它可以是全面的或部分的。全面反應(yīng)(CR)被定義為沒有臨床上的，放射學(xué)上的或其他疾病跡象.部分反應(yīng)(PR)是由于聚集的肺瘤大小的縮小超過50%所導(dǎo)致的發(fā)展的時(shí)間中值是表征客觀腫瘤反應(yīng)的持久性的量度.腫瘤治療的"治療有效刑量"還可以通過它的穗定疾病發(fā)展的能力測量.化合物抑制癌的能力可以在用于預(yù)測在人體腫瘤上的效力的動物模型系統(tǒng)中評估。另外，組合物的這種特性可以通過檢查化合物抑制細(xì)胞生長或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力評估，所述檢查通過本技術(shù)人員所公知的體外測定進(jìn)行.治療有效量的治療化合物可以縮小肺瘤尺寸，或者以其他方式緩解受試者的癥狀.本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠根據(jù)諸如受試者的大小，受試者癥狀的嚴(yán)重性，以及特定組合物或所選擇的施用途徑的因素確定所述用量，VI.本發(fā)明的用途和方法本發(fā)明的人抗體，以及它的衍生物/綴合物和組合物具有多種用途，包括CD25介導(dǎo)的疾病或表達(dá)CD25的細(xì)胞相關(guān)的疾病的治療。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的人抗體可以在體內(nèi)給受試者施用，以便阻斷或抑制CD25與它的配體(IL"2)的結(jié)合.這反過來又可用于預(yù)防或抑制多種與具有CD25的細(xì)胞相關(guān)的疾病.可以治療(例如，改善)或預(yù)防的示例性的疾病包括，但不局限于，移植物排斥，包括同種異體移植物和異種移植物排斥，出現(xiàn)在正在進(jìn)行或業(yè)已進(jìn)行過器官或組織移植的患者體內(nèi)，所述移植如心臟，肺，組合的心臟-肺，氣管，腎臟，肝臟，胰腺，食管，煬，皮膚，肢體移植，臍帶移植，干細(xì)胞移植，胰烏細(xì)胞移植等.所述患者包括成年人，不過還可以是兒科患者.因此，本發(fā)明的抗體可用于預(yù)防同種異體移植物和異種移植物排斥或用于恢復(fù)，治療，或以其他方式改善急性同種異體移植物或zenograft排斥的發(fā)作.可以治療的其他疾病包括移植物抗宿主疾病，例如，輸血移植物抗宿主疾病和骨號移植物抗宿主疾??；炎性病、免疫病或自身免疫病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎，牛皮褲性關(guān)節(jié)炎，l型糖尿病，胰為素依賴性2型糖尿病，多發(fā)性硬化，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，重癥肌無力，炎性腸病，克羅恩病，潰癌性結(jié)腸炎，皮膚多肌炎，Sjiigren氏綜合征，動脈炎，包括巨細(xì)胞性動脈炎，再生陣礙性貧血，哮喘，硬皮病和葡菊膜炎；炎性或過度增殖性皮膚病，例如，牛皮褲，包括斑塊牛皮褲，掌跖膿皰病(PPP)，腐燭性扁平苔蘚，大皰性天皰瘡，大皰性表皮松解癥，接觸性皮炎和特應(yīng)性皮炎；和多種淋巴樣瘤，例如，T細(xì)胞白血病，何杰金病，毛細(xì)胞性白血病，或皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，包括萆樣真菌病和Sezary氏綜合征.可以治療的其他疾病包括惡性腫瘤，其中對浸潤性CD25十調(diào)節(jié)T細(xì)胞的抑制是有利的，如胃癌，食管癌，惡性黑素瘤，結(jié)腸直煬癌，胰腺癌，乳腺癌，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，子宮頸癌，卵巢癌和腎細(xì)胞癌；血液學(xué)疾病，如成年人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤，退行性大細(xì)胞淋巴瘤，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL)，外周T細(xì)胞淋巴瘤和繼發(fā)性淀粉樣變性；皮膚病，如壞疽性膿皮病，環(huán)形肉芽腫，過敏性接觸性皮炎，疤痕性類天皰瘡和妊娠皰務(wù)；肝胃煬道疾病，如膠原性結(jié)腸炎，硬化性膽管炎，慢性活動性肝炎，狼瘡樣肝炎，自身免疫性肝炎，酒精性肝炎，慢性胰腺炎和急性胰腺炎；心臟疾病，如心肌炎和心包炎；血管疾病，如動脈硬化，巨細(xì)胞性動脈炎/風(fēng)濕性多肌病，大動脈炎，結(jié)節(jié)性多動脈炎，Kawasaki綜合征，韋格納肉芽肺病，顯微多脈管炎，Churg-Strauss綜合征，白細(xì)胞破碎性脈管炎和繼發(fā)性白細(xì)胞破碎性血管炎；腎病，如急性腎小球性腎炎，慢性腎小球性腎炎，最小改變性腎炎和腎炎-肺出血綜合征；肺病，如肺泡炎，閉塞性細(xì)支氣管炎，硅肺和鈹肺；神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如多發(fā)性硬化，阿爾茨海默病，重癥肌無力，慢性脫拔鞘多發(fā)性神經(jīng)病和多神經(jīng)根炎，包括GuiUain-Barr6綜合征；結(jié)締組織疾病，如復(fù)發(fā)性多發(fā)軟骨炎，肉樣瘤病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，中樞神經(jīng)系統(tǒng)狼瘡，盤狀狼瘡，狼瘡腎炎，慢性疲勞綜合征和纖維肌痛；內(nèi)分泌疾病，如Graves氏病，橋本甲狀腺炎和亞急性甲狀腺炎；和病毒感染，如熱帶痙攣性下肢輕癱。在體內(nèi)和體外施用本發(fā)明抗體組合物(例如，人抗體和免疫綴合物)的合適的途徑為本領(lǐng)域所公知，并且可以由普通技術(shù)人員選擇.例如，所述抗體組合物可以通過注射施用(例如，靜脈內(nèi)或皮下注射).所施用的分子的合適的劑量依賴于受試者的年齡和體重以及所述抗體組合物的濃度和/或制刑.所述抗體可以單獨(dú)施用或者與其他治療刑同時(shí)施用，如免疫抑制劑，抗炎刑，用于治療炎性或過度增殖性皮膚病的試劑，化療刑或能夠與所述抗體組合物組合或協(xié)同發(fā)揮作用的細(xì)胞毒素，用于治療或預(yù)防與表達(dá)CD25的細(xì)胞，特別是活化的T細(xì)胞相關(guān)的疾病.正如以前所描述的，本發(fā)明的人抗-CD25抗體可以與一種或多種其他治療刑同時(shí)施用，例如，免疫抑制劑或抗炎劑，以便提高總體抗炎作用，所述抗體可以與所述試劑連接(作為免疫復(fù)合物)或者可以與所述試劑分開施用.在后一種情況下(分開施用)，所述抗體可以與在所述試刑之前，之后或同時(shí)施用.本發(fā)明的范閨還包括包含本發(fā)明的抗體組合物(例如，人抗體和免疫綴合物)的試刑盒和使用說明書.所述試劑盒還可以包括一種或多種其他試刑，如免疫抑制刑，或一種或多種其他本發(fā)明的人抗體。因此，向用本發(fā)明的抗體組合物治療的患者還可以施用另一種治療劑(在施用本發(fā)明的人抗體之前，同時(shí)，或之后施用)，如免疫抑制劑，抗炎劑，用于治療炎性或過度增殖性皮膚病的試刑或化療刑，這些試劑能改善或增強(qiáng)所述人抗體的治療作用.在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫綴合物可用于將化合物(例如，治療刑，標(biāo)記，細(xì)胞毒素，免疫抑制刑等)靶向在表面上結(jié)合了CD25的細(xì)胞，這通過將所述化合物連接在所述抗體上來實(shí)現(xiàn).因此，本發(fā)明還提供了用于離體(exvivo)或體外定位表達(dá)CD25的細(xì)胞的方法(例如，使用可檢測標(biāo)記，如放射性同位素，熒光化合物，醃或蘇輔因子).在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于殺傷在表面上結(jié)合了CD25的細(xì)胞的方法，這通過施用本發(fā)明的免疫毒素來實(shí)現(xiàn).在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于體內(nèi)或體外診斷活化的表達(dá)CD25的細(xì)胞在發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮積極作用的疾病，這通過檢測CD25的水平，或在膜表面上包括CD25的細(xì)胞的水平來實(shí)現(xiàn).這一目的可以通過以下方法實(shí)現(xiàn)，例如，通過讓要檢測的樣品任逸和對照樣品一起與人抗體在可以形成抗體和CD25的復(fù)合物的條件下接觸.然后檢測復(fù)合物形成(例如，使用ELISA).在將對照樣品與檢測樣品同時(shí)使用時(shí)，在這兩種樣品中檢測復(fù)合物，并且將兩種樣品之間復(fù)合物形成的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差別用作在測試樣品中存在CD25的指還通過以下實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被理解為進(jìn)一步的限定.實(shí)施例實(shí)施例l抗CD25的人抗體的生產(chǎn)抗原開發(fā)了能表達(dá)細(xì)胞表面CD25的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，以便用作對HuMAb小鼠進(jìn)行免疫和表征抗CD25抗體的試劑.該細(xì)胞系是CHO細(xì)胞系，它被工程改造成能表達(dá)CD25的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與血小板衍生生長因子受體的跨膜結(jié)構(gòu)域偶聯(lián).用由HUT102細(xì)胞制備的cDNA擴(kuò)增所述CD25序列，并且從pDISPLAY栽體(InvitrogenCorporation)獲得血小板衍生生長因子受體序列.將編碼所述融合蛋白的表達(dá)構(gòu)建體工程化插入表達(dá)栽體.所述CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞系在5nM和S0nM氨甲蝶呤中進(jìn)行兩輪氨甲蝶呤擴(kuò)增，以便提髙CD25的表達(dá)水平.CHO-CD25轉(zhuǎn)染癌培養(yǎng)CHO-CD25轉(zhuǎn)染病細(xì)胞(MedarexInc.,NJ,美國)是在CHO-S-SFMII培養(yǎng)基(GibcoBRL)中培養(yǎng)的，不含次黃嚷呤，不含胸苷，含有音審素(5000U/ml)，鏈審素(5000mg/ml;BioWhittaker，比利時(shí))和氨甲蝶呤(終濃度50nM,Sigma).每兩到三天更新細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因小鼠將HCo7和HCo12小鼠圉養(yǎng)在過濾籠子(filtercage)里，并且在免疫，放血，和融合當(dāng)天評估為處在良好物理狀態(tài)下.能產(chǎn)生選擇的雜交瘤的小鼠都是雄性.小鼠ID23185，23196，23197和23198具有(CMD)++;(HCo7)11952+;(JKD)++;(KCo5)9272+基因型.小鼠ID23175具有(CMD)++;(HCo12)15087+;(JKD)++;(KCo5)9272+基因型.單獨(dú)的轉(zhuǎn)基西名稱在括號中表示，隨后是隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)基因的品系編號.符號++和+表示純合的或半合子的。不過，由于所述小鼠是使用基于PCR的測定方法常規(guī)篩選的，不可能區(qū)分隨機(jī)整合的人Ig轉(zhuǎn)基因的雜合性和純合性.十符號可能表示對于這些元件來說實(shí)際上純合的小鼠.免疫方法和方案通過兩種形式的抗原對小鼠進(jìn)行免疫活細(xì)胞(上迷CD25轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞)和純化蛋白(重組人CD25(rhCD25)，購自R&DSystems的NS/0表達(dá)的重組蛋白(cat#223-2A/CF)，Minneapolis,MN).將可溶性rhCD25與完全弗氏佐劑(CFA)或不完全弗氏佐劑(1FA)混合*弗氏佐劑是從Gibco-BRL，Rockville,MD獲得的.將0.2ml制備的抗原注射到小鼠的腹膜腔內(nèi)，最終的尾靜脈免疫是用存在于無菌PBS或鹽水(0.9%NaCl)中的可溶性CD25進(jìn)行的.將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的免疫使用到腹膜腔內(nèi)(i.P.)，用量為無菌鹽水中2ml每只小鼠1.0-2.0x107細(xì)胞。將所有免疫注射到腹膜腔內(nèi).在融合之前三-兩天進(jìn)行靜脈內(nèi)(i.v.)強(qiáng)化免疫.所述免疫方案如表l所示.所有小鼠都包括在十二只(l2)小鼠組成的群組中，這些小鼠來自HCo7和HCo12基因型.表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>*有關(guān)效價(jià)，參見表2.小鼠效價(jià)在下面的表2中示出了小鼠#23175，231S5，23196,23197和23198的效價(jià).在表2中所示出的效價(jià)表示血清稀釋物，它們在CD25特異性測試中顯示是陽性的.在重復(fù)免疫之后對所述抗原的反應(yīng)表現(xiàn)出可靠的反應(yīng)水平，并且將所述小鼠用于融合.表2<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>融合方法將SP2/0-ag14骨號痛細(xì)胞系(ATCCCRL1581，lotF-15087)用于所述融合.將原始ATCC小瓶解凍，并且在培養(yǎng)物中擴(kuò)增.用該擴(kuò)增產(chǎn)物制備接種母液的冷凍小瓶.將細(xì)胞保持在培養(yǎng)物中6-8周時(shí)間，每周傳代兩次.將含有10%FBS(Hyclonecat#SH30071)，抗生素-抗真菌刑(lOOx)(Gibco，#15240062)和0.1%L-谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM:(MediatechCellgro，#1001233)用于培養(yǎng)骨絨癌細(xì)胞，將其他培養(yǎng)基補(bǔ)料添加到雜交瘤生長培養(yǎng)基中，包括5%Origen-雜交瘤克隆因子(Igen),4*5x10"M丙嗣酸鈉，HAT(1.0xlO"M次黃嚷呤，4.0xl0"M氨基蝶呤，1.6xlOsM胸苷；Sigma)和胎牛血清(Hyclone，Logan,Utah).來自小鼠編號#23197的脾臟的尺寸是正常的，并且能產(chǎn)生4.0x108活細(xì)胞.來自小鼠編號#23175的脾臟的大小是正常的，并且能產(chǎn)生2.6x108活細(xì)胞.來自小鼠#23196和#23198的脾臟的大小是正常的，并且能分別產(chǎn)生2.4x108和2.0xl08活細(xì)胞.來自小鼠#23185的最后的脾臟的大小是正常的，并且產(chǎn)生1.9x108活細(xì)胞.所述脾細(xì)胞是按照標(biāo)準(zhǔn)方法融合的.用于雜交瘤生成(融合)的培養(yǎng)基將含有10%胎牛血清(FBS);(Hyclone，Logan，Utah,SH30071lot#AJE10321)抗生素-抗真菌刑(GibcoBRL，lot#15240062)和0.1%L-谷氨酰胺(Gibco,1o悄1013845)的高葡萄糖DMEM(Mediatech，lot#10013264)用于培養(yǎng)骨跋瘤細(xì)胞。將其他培養(yǎng)基補(bǔ)料添加到所述雜交瘤生長培養(yǎng)基中，其中包括5%Origen墨雜交瘸克隆因子(Igen，1o悄36600和36782和36684),4.5x104M丙嗣酸鈉，HAT(Sigma，H0262):l.Ox104M次黃嘌呤，4.0xl07M氨基蝶呤，l*6xlOsM胸苷，或HT(Sigma，H0137):1.0xlO"M次黃嘌呤，1.6xl05M胸苷.將脾臟和淋巴結(jié)從免疫的小鼠體內(nèi)取出，并且將所述器官放入裝有DMEM+10%FBS的試管中.將所述試管中轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)室中，并且用所述脾和淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸浮液，并且對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù).轉(zhuǎn)移合適體積的SP2/0細(xì)胞(ATCCCRL1581，lotF-15087;每一個SP2/0細(xì)胞6個脾臟或淋巴結(jié)細(xì)胞)，并且將所迷細(xì)胞混合和重新懸浮.添加大約1.2ml的PEG(l分鐘，同時(shí)在裝有37TC水的燒杯中輕輕回蕩所述試管).將所述試管放置卯秒，添加15mlDMEM，并且用培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌.在通過離心使所述細(xì)胞沉淀之后，去除上清液，并且重新懸浮所述細(xì)胞.將10ml含有HAT的培養(yǎng)基添加到所述試管中.在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30-60分鐘之后，將所述細(xì)胞涂布到96孔培養(yǎng)平板上，200y1/孔(每一個96孔平板大約1X107細(xì)胞).在笫7天，用含有HT的培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞，2幼nl/孔(HT培養(yǎng)基是去拌了氨基蝶呤的HAT培養(yǎng)基).對人IgG，k抗體進(jìn)行的初步的ELISA篩選是在融合之后7-10天進(jìn)行的，然后在可溶性CD25涂褒的人ELISA平板上對人IgG，k陽性孔進(jìn)行篩選.然后將抗原陽性雜交瘸轉(zhuǎn)移到24孔平板上，并最終轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)燒瓶中.通過在OrigenDMSO冷凍介質(zhì)(FisherCat#IG-50-0715)中冷凍將抗原陽性雜交瘤細(xì)胞保存在發(fā)育過程中的若干階段.用于1gG/k檢測的ELISA方法(用于篩選融合體)用抗-人-k，lpg/ml(Immunotech，1o悄0173)或抗-人-y，1Mg/ml(Jackson，10悄l(W-OO6-O98)，50pg/孔將EUSA平板涂褒過夜.將平板倒空，并且在室溫(RT)下用補(bǔ)充了tween-20(0.05。/。)和5。/。雞血清(PBSTC)的PBS封閉其余的結(jié)合位點(diǎn)1小時(shí).用補(bǔ)充了0.05%tween-20的PBS(PBST)洗滌平板3次.來自所述融合體和亞克隆的上清液通常是以1:2的稀釋比例在PBSTC中測試的.作為正對照，使用了人IgG(Calbiochem)。在將所述樣品溫貫大約2小時(shí)之后，用PBST洗滌所述平板，并且將以1:5000的稀釋比例稀釋在PBSTC中的抗-人-IgG-Fc-HRP綴合的笫二抗體(Jackson,lot#l09-036-098)添加到所述孔中(100M1).在室溫下溫育1小時(shí)之后，按照生產(chǎn)商的推薦，用ABTS(Sigma)對所述ELISA進(jìn)行顯影.通過ELISA進(jìn)行同種型測定用小鼠-抗-人IgGl(CLB，荷蘭，以1:5,000的比例稀釋自母液)或用小鼠-抗-人IgG3(CLB，以1:IO，OOO的比例稀釋自母液)將96孔ELISA平板(Greiner,德國)涂褒過夜(100pI/孔，室溫(RT))在用PBST洗涂所述平板3次之后(150fil/孔)，在室溫下用PBSTC溫育平板1小時(shí).然后添加人CD25單克隆抗體克隆的上清液(100jil/孔；室溫下2小時(shí)).將抗-KLHIgGl(1jig/ml)和抗-KLHIgG3(1jig/ml)上清液用作正對照.將培養(yǎng)基和PBSTC用作負(fù)對照.在用PBST洗滌(3x)之后，添加山羊-抗-hlgG^HRP(Fc特異性；JacksonLabs,Maine,美國)(室溫下1小時(shí)).為了檢測IgGl，以1:500的比例稀釋綴合物，而為了檢測IgG3，以1:2000的比例稀釋所述綴合物.在用PBST洗滌之后(3x)，制備10mgABTS(Roche)/10mlABTS緩沖液(Roche),并且向每一個孔中添加100n1.在20分鐘之后，用ELISA讀出器(EL808，Bio-TekInstruments,Vermont,美國)在405nm讀出吸收值.根據(jù)所迷免疫方法，選擇4種抗原特異性雜交痏，它們都來自HCo小鼠ABl，AB7，AB11和AB12。發(fā)現(xiàn)這四種克隆的同種型都是IgGl，K*本發(fā)明的抗體可以作為其他同種型重組表達(dá)，例如IgG2，IgG3，IgG4，IgM和IgA.用于在選擇之后維持所述雜交瘸的培養(yǎng)基所有的人CD25單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系都是在Dulbecco氏修飾的Eagle培養(yǎng)基(Biowhmaker,lot弁BE12-709F)中培養(yǎng)的，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了10o/oFCS(WisentMulticelloptimumC241)，2mML谷氨酖胺(Glutamax陽II)，50IU/ml青審素，50|ig/ml鏈審素(pen/strep)，2fiMp-ME(均來自GibcoBRL,LifeTechnologies,蘇格蘭)，24%HCF(Origen，IgenInternationalInc.,Gaithersburg，美國)》抗體的純化在從所述培養(yǎng)物上清液純化或濃縮人CD25特異性抗體之前，細(xì)胞培養(yǎng)物上清液必須通過真空驅(qū)動的一次性瓶頂過濾器(bottletopfilter)過濾，以便去除粗材料，如細(xì)胞殘余物或其他雜質(zhì)。如果樣品的體積超過500ml的話，可以使用Prq)/scaleTMTFF，1平方英尺柱體(cartridge)(Millipore,美國)將所述樣品濃縮到低于500ml的體積.CD25特異性抗體的A蛋白純化是通過親和層析進(jìn)行的.用PBS，pH7.4平衡5mlA蛋白柱(ProtA5mlSP,version041201，AmershamPharmaciaBiotechAB，瑞典)，并且用PBS，pH7.4引發(fā)樣品-泵A之后，將含有CD25特異性抗體的上清液加樣到所述柱上，洗掉未結(jié)合的樣品，并且用0,1M檸樣酸，pH5(洗脫緩沖液1)漂洗系統(tǒng)-泵B.然后，通過系統(tǒng)-泵B用洗脫緩沖液l洗脫牛IgG(存在于培養(yǎng)物上清液中).在用0.1M檸樣酸，pH3(洗脫援沖液2)漂洗系統(tǒng)-泵A之后，用洗脫援沖液2通過系統(tǒng)-泵A洗脫人CD25特異性抗體.然后用(UM檸樣酸，pH2(洗脫援沖液3)漂洗系統(tǒng)泵B,并且用洗脫緩沖液3通過系統(tǒng)-泵B將與所述柱結(jié)合的所有剩余的IgG洗脫.用10%(v/v)2MTris-HCl(Sigma)，pH9中和洗脫的CD25特異性抗體，并且合并峰值-級分.在4TC下用PBS(30ml純化材料對51PBS)透析來自洗脫步驟2的合并峰值-級分18小時(shí).為了保護(hù)并且保存所迷純化的材料，對樣品進(jìn)行濃縮a通過比濁測定方法(Dade-Behring，BNII)，使用多克隆抗-IgG抗體(CLB，Amsterdam,荷蘭，1o拚M10卯)測定人IgG的濃度.對所述抗體進(jìn)行等份試樣，稞凍，并且在-801C下保存.實(shí)施例2抗CD25的人抗體的抗體測序抗體的V^和V^區(qū)的測序測序在克隆到pGEMT-VectorSystemII中之后，對VDJ-區(qū)進(jìn)行測序。測序是在Baseclear(Leiden,荷蘭)進(jìn)行的.將所述序列與Vbase中的種系V-基因序列進(jìn)行比對fwww*證畫cpe.cam-ac-lik/imt-dnc/puhlic/intrn.htni、,RNA制備使用Rneasy試刑盒(Qiagen,Westburg，Leusden，荷蘭)按照生產(chǎn)商的方法用4種不同的人CD25雜交瘤細(xì)胞系(AB1，AB7，ABll，AB12)的5x106細(xì)胞制備總RNA。cDNA制備從3ng總RNA制備來自人CD25雜交瘤細(xì)胞的RNA的互補(bǔ)DNA(cDNA),使用AMV逆轉(zhuǎn)錄醉和緩沖液(RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim,德國)，寡聚d(T)is(Promega，Madison,WI，美國)，dNTP(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,德國)和RNAsin(Promega),按照生產(chǎn)商推薦的方法進(jìn)行(2000，version3),VH和VL區(qū)是用以下PCR引物擴(kuò)增的VH:FR15'引物AB62CAggTKCAgCTggTgCAgTC(SEQIDNO:41)AB63SAggTgCAgCTgKTggAgTC(SEQIDNO:42)AB65gAggTgCAgCTggTgCAgTC(SEQIDNO:43)Vh前導(dǎo)序列5'引物AB85ATggACTggACCTggAgCATC(SEQIDNO:44)AB86ATggAATTggggCTgAgCTg(SEQIDNO:45)AB87ATggAgTTTggRCTgAgCTg(SEQIDNO:46)AB88ATgAAACACCTgTggTTCTTC(SEQIDNO:47)AB89ATggggTCAACCgCCATCCT(SEQIDNO:48)Vh3'引物AB卯TgCCAgggggAAgACCgATgg(SEQIDNO:49)VK:FR15'引物AB8RACATCCAgATgAYCCAgTC(SEQIDNO:50)AB9gYCATCYRgATgACCCAgTC(SEQIDNO:51)AB10gATATTgTgATgACCCAgAC(SEQIDNO:52)AB11gAAATTgTgTTgACRCAgTC(SEQIDNO:53)AB12gAAATWgTRATgACACAgTC(SEQIDNO:54)AB13gATgTTgTgATgACACAGTC(SEQIDNO:55)AB14gAAATTgTgCTgACTCAgTC(SEQIDNO:56)Vic前導(dǎo)序列5'引物AB123CCCgCTCagCTCCTggggCTCCTg(SEQIDNO:57)AB124CCCTgCTCAgCTCCT鵬gCTgC(SEQIDNO:58)AB125CCCAgCgCAgCTTCTCTTCCTCCTgC(SEQIDNO鄰AB126ATggAACCATggAAgCCCCAgCACAgC(SEQIDNO:60)AB16CgggAAgATgAAgACAgATg(SEQIDNO:61)在以上引物序列中，K，S，R，Y和W具有以下含義K-G或TS-C或GR-A或GY-C或TW-A或T用于擴(kuò)增克隆使用的Vh和VL區(qū)的PCR條件用AmpliTaq聚合酶(PerkinElmer)在TlThermocycler96(Biometra，Westburg，Leusden，荷蘭)上進(jìn)行聚合錄鏈反應(yīng)(PCR),PCR循環(huán)方案941C2分鐘11個循環(huán)94TC30秒65TC30秒，每個循環(huán)降低1。721C30秒30個循環(huán)94TC30秒55TC30秒72TC30秒72TC10分鐘冷卻到4TC將VH和VL克隆到pGEMT-VVectorSystemII中在瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物之后，用QIAEXII凝膠提取試刑盒(Qiagen，Westburg，Leusden，荷蘭)純化所述產(chǎn)物。按照生產(chǎn)商的方法(1999，version6)，始終將在每個Vh和VL區(qū)使用FR1或前導(dǎo)序列引物得到的2個獨(dú)立擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆到pGEMT-VectorSystemII(Promega)中.在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中之后，通過菌落PCR篩選單獨(dú)的克隆，使用T7和SP6引物，在551C下進(jìn)行30次退火循環(huán).用QiaprepSpin小量制備試刑盒(Qiagen)從所述苗落中純化質(zhì)粒DNA.為了進(jìn)一步分析所述Vh和VL區(qū)，進(jìn)行Ncol/Notl(NEBiolabs，Westburg，Leusden,荷蘭)消化，并且在瓊脂糖凝膠上分析.所述四種選擇的雜交瘤細(xì)胞系能表達(dá)以下抗體序列AB1:具有以下氨基酸序列的人單克隆IgGl,k抗體SEQIDNOs:2和4;AB7:具有以下氨基酸序列的人單克隆IgGl，k抗體SEQIDNOs:6和8;ABll:具有以下氨基酸序列的人單克隆IgGl,k抗體SEQIDNOs:10和12;和ABU:具有以下氨基酸序列的人單克隆IgGl，k抗體SEQIDNOs:14和16.所獲得的序列如困1-10所示.實(shí)施例3抗CD25的人抗體的結(jié)合特征人CD25單克隆抗體的上清液與在CHO細(xì)胞上組成型表達(dá)的CD25的結(jié)合AB1，AB7，ABll和AB12在通過流式細(xì)胞術(shù)測定時(shí)都能結(jié)合在轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上表達(dá)的CD25上(參見表3).在ELISA測定中人CD25單克隆抗體上清液與hrCD25的結(jié)合在用hrCD25作為涂夜抗原進(jìn)行ELISA測定時(shí)，AB1，AB7，ABll和AB12都能結(jié)合CD25.在室溫下用rhCD25(100ng/ml;R&D)將96孔平板(Greiner)涂覆過夜，隨之通過在室溫下用PBSTC涂復(fù)所述平板來阻斷非特異性結(jié)合。在用PBST洗滌(3次)所述平板之后，添加lOOpl的樣品抗體.在洗滌所述平板3次(PBST)之后，用存在于PBS中的鏈審抗生物素蛋白-聚-HRP(1:IO，OOO)溫育平板，并且向每一個孔中添加lOO^il(1小時(shí)，RT)。在洗滌所述平板(用PBST洗滌3次)之后，制備每10mlABTS援沖液(Roche)中10mg的ABTS(Roche)，并且向每一個孔中添加100nl.20分鐘之后，用ELISA讀出器(EL808，Bio-TekInstruments)在405mn讀出吸收值.表3克隆名稱，同種型以及與CD25的結(jié)合<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>通過rhCD25ELISA測定的克隆培養(yǎng)物上清液的結(jié)合2通過流式細(xì)胞術(shù)測定的與在轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上表達(dá)的CD25的結(jié)合通過人CD25單克隆抗體的上清液抑制生物素化的IL"2與它的受體結(jié)合為了檢查人單克隆抗體阻斷或抑制IL-2結(jié)合CD25的程度，在室溫下用rhCD25(100ng/ml;R&Dsystems,MN,美國)將96-孔平板(Greiner)涂夜過夜，隨之通過在室溫下用PBSTC將所述平板涂在1小時(shí)，來阻斷非特異性結(jié)合.在用PBST洗滌(3次)所述平板之后，添加lOOjil的樣品抗體(濃度范圍10，33和100ng/ml).為了進(jìn)行比較，還添加了Zenapax⑧。10分鐘之后，添加rIL-2-生物素(50ng/ml)(1.5小時(shí)，RT).在洗滌平板3次(用PBST)之后，用存在于PBS中的鏈審抗生物素蛋白-聚-HRP(以1:10,000的比例稀釋自母液)溫育平板，并且向每一個孔中添加100nl(1小時(shí)，RT).在洗滌所述平板(用PBST洗滌3次之后)，制備每10mlABTS緩沖液(Roche)中10mg的ARTS(Roche)，并且向每一個孔中添加100H，.20分鐘之后，用ELISA讀出器(EL808，Bio-TekInstruments)在405nm讀出吸收值.數(shù)據(jù)表示兩次代表性實(shí)驗(yàn)之一.如圖11所示，與Zenapax⑧相比，人CD25單克隆抗體AB1，AB7，AB11和AB12的上清液能夠更有效地抑制生物素化的IL"2與CD25結(jié)合.通過人CD25單克隆抗體上清液抑制Zenapax⑧與CD25結(jié)合為了檢查人單克隆抗體阻斷或抑制Zenapax敏與CD25結(jié)合的程度，在室溫下用rhCD25(100ng/ml;R&Dsystems,MN，美閨)將96-孔平板(Greiner)涂覆過夜，隨之通過在室溫下用PBSTC將所述平板進(jìn)行l(wèi)小時(shí)時(shí)間的涂褒，以阻斷非特異性結(jié)合.在用PBST洗滌(3次)所述平板之后，添加100pl樣品(濃度范圍10，33和100ng/ml).10分鐘之后，添加生物素化的Zenapax(5ng/ml)(1,5小時(shí)，RT).在洗滌所述平板3次(用PBST)之后，用存在于PBS中的鏈霉抗生物素蛋白-聚-HRP(以1:IO，OOO的比例從母液秭釋)溫育平板，并且向每一個孔中添加100nl(1小時(shí)，RT).在洗滌所述平板(用PBST洗滌3次之后)，制備每10mlABTS緩沖液(Roche)中l(wèi)Omg的ABTS(Roche)，并且向每一個孔中添加10020分鐘之后，用ELISA讀出器(EL808,Bio誦TekInstruments)在405mn讀出吸收值.數(shù)據(jù)表示兩次代表性實(shí)驗(yàn)之一.如困12所示，人單克隆抗體AB1，AB7，AB11和AB12的上清液能阻斷Zenapax⑧與CD25結(jié)合.實(shí)施例4抗CD25的人單克隆抗體能抑制抗-CD3抗體-誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖利用T細(xì)胞增殖測定檢測人抗體抑制T細(xì)胞增殖的能力.為了進(jìn)行比較，還測試了Zenapax⑧和同種型對照抗體(hlgGl/ic).PBMC分離將人血細(xì)胞(從棕黃層中獲得，來自DutchRedCrossBloodBank^Utrecht,荷蘭)放置在ficoll梯度(Pharmacia,2500rpm，25分鐘)上.用移液管將PBMC收集到RPMI1640中(補(bǔ)充了10%FCS(WisentMulticelloptimumC241)，2mML^谷氨跣胺，50IU/ml音霉素，50|ig/ml鏈審素，25mMHEPES(均來自BioWhittaker，歐洲))。T細(xì)胞增殖測定將人PBMC稀釋在RPMI1640中(補(bǔ)充了10%FCS(WisentMulticelloptimumC241)，2mML^谷氨耽胺，50IU/ml青霉素，50Mg/mI鏈審素，25mMHEPES(均來自BioWhittaker,歐洲))，在96-孔平底平板(Greiner)上的密度為1.5x105細(xì)胞/孔(一式三份)。用抗-CD3抗體(CLB-T3/4.E，cat#M1654，10ng/ml)刺激所述細(xì)胞.然后，將50n1逐漸稀釋的實(shí)驗(yàn)抗體添加到所述細(xì)胞中(從500ng/ml到7.8ng/ml，通過兩個步驟的稀釋).在五天之后(371C，5%C02)，通過使用BrdU(終濃度IOjliM，Roche)按照下面所描述的方法對增殖進(jìn)行定重。BrdU標(biāo)記測定(RocheBrdU-染色試劑盒，catno1647229):將BrdU標(biāo)記溶液(100pM)添加到所述孔中，并且溫育細(xì)胞過夜(37TC，5%C02).將細(xì)胞重新懸浮在孔中，并且離心(10分鐘，300g).棄掉上清液，并且干燥細(xì)胞沉淀(l小時(shí)，60TC).然后將沉淀與FixDenat一起溫育(200jiI/孔；30分鐘，RT).在溫育之后，將FixDenat棄掉，并且將100pl/孔的抗-BrdU-POD(將lOOfil抗-BrdU母液添加到10mlAb-稀釋溶液中)添加到所述沉淀中(l小時(shí)，RT).在棄掉上清液之后，用洗滌溶液(200jil/孔)洗滌平板(3次).最后，將100ml/孔底物溶液添加到所述沉淀中(5分鐘，RT).通過H2S04終止著色反應(yīng)(25jil/孔，1M)，并且通過ELISA讀出器(Bio-TekInstruments)在450n邁讀出光密度.如圖13所示，人單克隆抗體AB1，AB7和AB12能以劑量依賴性形式抑制抗-CD3抗體-誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖.與Zenapax⑩相比，所述人抗體的抑制作用更有效.數(shù)據(jù)表示三個代表性實(shí)驗(yàn)之一.實(shí)施例5抗CD25的人單克隆抗體能抑制MLR利用MLR測定檢測了人抗體抑制MLR的能力.為了進(jìn)行比較，還檢測了Zenapax⑧和同種型對照抗體(hlgGl/k).將來自兩個非-MHC-匹配供體的人PBMC(在棕黃層中獲得，來自DutchRedCrossBloodBankUtrecht,荷蘭)稀釋在RPMI1640中(補(bǔ)充了10%FCS(WisentMulticelloptimumC241)，2mML-谷氨跣胺，50IU/ml青霉素，50jig/ml鏈審素(均來自GibcoBRL，LifeTechnologies,Paisley,蘇格蘭))，達(dá)到2,0xl0^細(xì)胞/孔。對來自笫一個供體的PBMC進(jìn)行輻射(2000拉德(rads))，并且在恥-孔平底平板(Greiner)上與來自第二個供體的PBMC(1.0x105細(xì)胞/孔)混合(1.0x10s細(xì)胞/孔)，一式三份，然后將50nl逐漸稀釋的實(shí)驗(yàn)抗體添加到所述細(xì)胞中(從50ng/ml到0.8ng/ml，分兩個步驟稀釋)在培養(yǎng)六天之后(37TC，5%C02)，通過使用BrdU(終濃度10jiM，Roche)按照上文描述的方法對增殖進(jìn)行定量.如圖14所示，人單克隆抗體AB1，AB7和AB12以刑量依賴性形式抑制MLR.與Zenapax⑧相比，AB1,AB7和AB12對MLR的抑制作用更有效(劑量為大約l-3ng/ml).數(shù)據(jù)表示三次代表性實(shí)驗(yàn)之實(shí)施例6在Biacore3000儀器上進(jìn)行的AB12的動力學(xué)分析通過利用BIAcore3000儀器監(jiān)控表面等離子體共振的改變來估計(jì)親和力分析.使用BIAcore3000和BIAcore3000軟件控制(BIAcore，Uppsala，瑞典，lot#BR-110(M3).使用胺偶聯(lián)化學(xué)方法，按照生產(chǎn)商的推薦將人CD25(R&DSystems,lot#223-2A/CFO)固定到CM-5低密度傳感器芯片(BIAcore,lot#BR-100(M4)上.在利用乙醉-胺-HCl封閉所述活化傳感器芯片的殘留結(jié)合位點(diǎn)之后，在25TC下(按照生產(chǎn)商的推薦)用人單克隆抗體AB12進(jìn)行動力學(xué)分析，并且為了比較還使用了Zenapax.分別讓含有AB12和Zenapax⑧的樣品流過所述涂覆的傳感器芯片的表面，使AB12和Zenapax⑧與rhCD25結(jié)合.利用表面等離子體共振(SPR)監(jiān)控AB12和Zenapax⑧分別在所述傳感器芯片上的結(jié)合和分離.利用BIAcore3000(Bio-tekInstruments)顯現(xiàn)所述結(jié)果，并且用BIAevaluation軟件3,1(BIAcore，Uppsala,瑞典)進(jìn)行分析，并且將Languir結(jié)合l:l用作預(yù)先固定的模型.通過BIAcore分析確定的AB12結(jié)合rhCD25的KD:4.74x1011±0.43x10".通過BIAcore分析確定的Zenapax②結(jié)合rhCD25的KD:1,52x1010±0.27x1010,實(shí)施例7AB12-處理T細(xì)胞母細(xì)胞導(dǎo)致了CD25的內(nèi)在化檢測了AB12誘導(dǎo)CD25內(nèi)在化的能力.作為同種型對照抗體，包括抗-KLH(人IgGl/K同種型抗體，對匙孔血藍(lán)蛋白具有特異性).T細(xì)胞母細(xì)胞的誘導(dǎo)在利用淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)梯度從肝素血液樣品中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)之后，用5ng/ml植物凝集素(PHA;Difco，cat#211796)在培養(yǎng)基中刺激PBMC3-4天(37TC，5%C02)。刺激T細(xì)胞母細(xì)胞，以便檢查內(nèi)在化在收獲細(xì)胞并且用PBS洗滌之后，用錐蟲藍(lán)對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù).將一份T-細(xì)胞母細(xì)胞(lx106細(xì)胞/ml)與FITC-標(biāo)記的AB12(2fig/邁lAB12-FITC)或作為同種型對照的FITC-標(biāo)記的抗-KLH(2ng/ml)，或不加抗體一起預(yù)溫育(4TC,15分鐘).在預(yù)溫育后，用PBS洗滌細(xì)胞，并且將11106細(xì)胞(存在于1ml培養(yǎng)基中)添加到24孔平板上，并且溫育18小時(shí)(37TC，5%C02).其余的T細(xì)胞母細(xì)胞在沒有或有FITC-標(biāo)記的AB12(2jng/ml)或FITC-標(biāo)記的抗-KLH(2ng/ml)的條件下溫育18小時(shí)(37TC，5%co2).在溫育之后，收集細(xì)胞，并且用羅丹明-標(biāo)記的麥胚凝集素Ung/ml,membranelabeling;MolecularProbes,catNo.W-849)標(biāo)記，在4TC下標(biāo)記15分鐘.然后，用PBS洗滌細(xì)胞，并且重新懸浮在25p1的VectashieldDAPI(VectorLaboratories,Burlingame，CA，美國)中.然后，將10nl的細(xì)胞懸浮液通過移液管轉(zhuǎn)移到組織栽玻片上，蓋片，并且通過熒光顯微鏡分析(CarlZeiss),并且對于羅丹明染色來說用TRITC濾色片照相(濾色片設(shè)定為15,Zeiss)，或?qū)τ贔ITC染色來說用FITC濾色片照相(濾色片設(shè)定為09,Zeiss).用羅丹明-標(biāo)記的麥胚凝集素獲得的膜染色沒有示出.如困MA和15B所示，在培養(yǎng)18小時(shí)之后，可以在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)ABU-FITC信號.困15A表示在培養(yǎng)所述細(xì)胞18小時(shí)之后的結(jié)果，之前用AB12-FITC進(jìn)行了預(yù)溫育(15分鐘)和洗滌，而困15B表示在存在AB12-FITC的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞18小時(shí)之后的結(jié)果.用不相關(guān)的FITC-綴合的抗-KLH抗體進(jìn)行的對照實(shí)驗(yàn)(困15C)沒有出現(xiàn)FITC-標(biāo)記的抗體的內(nèi)在化。實(shí)施例8通過流式細(xì)胞術(shù)測量AB12-處理T細(xì)胞母細(xì)胞導(dǎo)致了CD25的內(nèi)在化在另一個實(shí)驗(yàn)中，將流式細(xì)胞術(shù)用于確定在不同的時(shí)間間隔上FITC-標(biāo)記的AB12在T細(xì)胞母細(xì)胞中的內(nèi)在化.在利用淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)梯度(Ficoll)從肝素血液樣品中分離周圍血單核細(xì)胞(PBMC)之后，用5ng/ml植物凝集素(PHA;Difco，catNo211796)在培養(yǎng)基中刺激PBMC3-4天(37"，5%C02).在培養(yǎng)三天之后，收獲t細(xì)胞母細(xì)胞，用pbs洗滌，并且用錐蟲藍(lán)進(jìn)行計(jì)數(shù).向所述T細(xì)胞母細(xì)胞(2,5xl06細(xì)胞，存在于2ml培養(yǎng)基中)添加2mg/mlfito標(biāo)記的AB12或fitc-標(biāo)記的抗-klh(同種型對照抗體)。在預(yù)溫育細(xì)胞之后(4"C,1小時(shí))，將細(xì)胞分成兩部分.一部分用培養(yǎng)基洗涂，而另一部分不進(jìn)行洗滌.在洗滌之后，將預(yù)溫育的樣品重新懸浮在培養(yǎng)基中，這兩部分都在41C或37TC下溫育。在溫育0,0.5,1或4.5小時(shí)之后(在4TC或371C下)，將3mlFACS援沖液(補(bǔ)充了0.05%BSA和0.01jjg/ml疊氮化鈉的PBS緩沖液)添加到所述細(xì)胞中，并且以300g(41C)的速度對所述細(xì)胞進(jìn)行離心沉淀.在一部分中，將細(xì)胞重新懸浮在200^1FACS緩沖液中，而在另一部分中，將細(xì)胞重新懸浮在200M1FACS緩沖液和lmg/ml溴化乙錠(Sigma，catNo.E8751)中.在即將通過流式細(xì)胞術(shù)獲得細(xì)胞之前添加澳化乙錠，將溴化乙錠用于猝滅細(xì)胞表面上的熒光信號，如困16所示，用或不用溴化乙錠測量在4TC溫育的樣品的熒光比例接近1.這表明了沒有發(fā)生內(nèi)在化.在37TC下培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出該熒光比例隨時(shí)間的增加.這表明業(yè)已發(fā)生ABU-FITC內(nèi)在化.正如所預(yù)料的，在連續(xù)存在FITC-標(biāo)記的AB12的情況下溫育細(xì)胞，導(dǎo)致了與僅用fitc-標(biāo)記的AB12預(yù)溫育的細(xì)胞相比(閨16A)具有較高水平的內(nèi)在化(閨16B).閨16A表示預(yù)溫育1小時(shí)并洗拌了多余FITC-標(biāo)記的-AB12的細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(MFI)的比例.困16B表示在存在FITC-標(biāo)記的AB12的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞之后的結(jié)果iMFI的比例是通過用0小時(shí)的樣品的MFI除測試樣品的mfi測定的.用同種型對照抗體(抗-klh-fitc，數(shù)據(jù)未發(fā)表)沒有觀察到染色.本發(fā)明抗體的這種內(nèi)在化特征，使得它們適合與毒素級合以用于治療如下疾病，例如，成年人T細(xì)胞白血病/淋巴痛，退行性大細(xì)胞淋巴瘤，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(包括萆樣真菌病和Sezary氏綜合征)，外周T細(xì)胞淋巴瘤，何杰金淋巴瘤，毛細(xì)胞性白血病和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL).在另一種方案中，用合適的放射性同位素對本發(fā)明的抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記，以便治療以下疾病，例如，成年人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤，退行性大細(xì)胞淋巴瘤，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(包括萆樣真菌病和Sezary氏綜合征)，外周T細(xì)胞淋巴瘤，何杰金淋巴瘤，毛細(xì)胞性白血病，和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL).另外，可以用"4ii標(biāo)記所述抗體，以便測定腫瘤負(fù)擔(dān)，并因此判斷要施用的放射性標(biāo)記的抗體的劑童.等同方案本領(lǐng)域技術(shù)人員只需進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)就可以了解或確定本文所描述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的很多等同方案.這些等同方案被認(rèn)為包括在以下權(quán)利要求書中.在從屬權(quán)利要求書中所公開的任何實(shí)施方案的組合都被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍.引入作為參考的文獻(xiàn)本文所引用的所有專利，未決的專利申請和其他出版物都被以它們的全文形式收作本文參考.權(quán)利要求1.一種分離的人單克隆抗體，其能結(jié)合人CD25，并且抑制IL^2與CD25結(jié)合，2.如權(quán)利要求l的抗體，選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗體.3.如權(quán)利要求2的抗體，其中，所述抗體是IgGl抗體.4.如權(quán)利要求2的抗體，其中，所述抗體是IgG4抗體。5.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體，其中，所述抗體與人CD25離解的離解平衡常數(shù)(Ko)為大約1(T8m或更低，優(yōu)選大約1(K9m或更低，且更優(yōu)選大約10""M或更低，或10'"M或更低，它是通過表面等離子體共振(SPR)技術(shù)，在BIAcore3000儀器上確定的，用人重組CD25做配體，并且用所述抗體傲分析物.6.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體，其中，所述抗體具有下列特征中的一種或多種(a)對人CD25的特異性；(b)抑制IL"2與CD25結(jié)合；(c)消除表達(dá)CD25的T細(xì)胞；(d)使T細(xì)胞產(chǎn)生耐受性；(e)抑制表達(dá)CD25的T細(xì)胞的增殖；(f)抑制外周血單核細(xì)胞(PBMC)的抗-CD3抗體-誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖；(g)抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR);(h)使在T細(xì)胞上表達(dá)的CDM內(nèi)在化.7.前述權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的抗體，所述抗體由在可變區(qū)分別包括SEQIDNO:5和SEQIDNO:7，或其保守性序列修飾的核苷酸序列的人重鏈和人k輕鏈核酸編碼.8.前述權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的抗體，所述抗體由在可變區(qū)分別包括SEQIDNO:13和SEQIDNO:15，或其保守性序列修飾的核苷酸序列的人重鏈和人k輕鏈核酸編碼.9.前述權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的抗體，所述抗體由在可變區(qū)分別包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:3，或其保守性序列修飾的核苷酸序列的人重鏈和人k輕鏈核酸編碼.10.前述權(quán)利要求l-6中任意一項(xiàng)的抗體，所述抗體由在可變區(qū)分別包括SEQIDNO:9和SEQIDNO:11,或其保守性序列修飾的核苷酸序列的人重鏈和人k輕鏈核酸編碼，11.前述權(quán)利要求l-6中任意一項(xiàng)的抗體，具有分別包括SEQIDNO:6和SEQIDNO:8，或其保守性序列修飾的氨基酸序列的人重鏈和人k輕鏈可變區(qū).12.如權(quán)利要求ll的抗體，具有人重鏈和人k輕鏈可變區(qū)，其與SEQIDNO:6和SEQIDNO:8所示氨基酸序列的同源性分別為至少90%同源，優(yōu)選至少95%同源，更優(yōu)選至少98%，或至少99%同源.13.*前述權(quán)利要求l-6中任意一項(xiàng)的抗體，具有分別包括SEQIDNO:14和SEQIDNO:16,或其保守性序列修飾的氦基酸序列的人重鏈和人k輕鏈可變區(qū).14.如權(quán)利要求13的抗體，具有人重鏈和人k輕鏈可變區(qū)，其與SEQIDNO:14和SEQIDNO:16所示氨基酸序列的同源性分別為至少卯％同源，優(yōu)選至少95%同源，更優(yōu)選至少98%，或至少99%同源.15.前述權(quán)利要求l-6中任意一項(xiàng)的抗體，具有分別包括SEQIDNO:2和SEQIDNO:4，或其保守性序列修飾的氨基酸序列的人重鏈和人k輕鏈可變區(qū).16.如權(quán)利要求15的抗體，具有人重鏈和人k輕鏈可變區(qū)，其與SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示氨基酸序列的同源性分別為至少卯％同源，優(yōu)選至少95%同源，更優(yōu)選至少98%，或至少99%同源.17.前述權(quán)利要求l-6中任意一項(xiàng)的抗體，具有分別包括SEQIDNO:10和SEQIDNO:12，或其保守性序列修飾的氨基酸序列的人重鏈和人k輕鏈可變區(qū).18.如權(quán)利要求17的抗體，具有人重鏈和人k輕鏈可變區(qū)，其與SEQIDNO:10和SEQIDNO:12所示氨基酸序列的同源性分別為至少卯°/同源，優(yōu)選至少95°/。同源，更優(yōu)選至少98%,或至少99%同源.19.前述權(quán)利要求l-6中任意一項(xiàng)的抗體，包括選自下列一組的至少一種人可變區(qū)(i)SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12、14和16;和(ii)與(i)中所示任意一種氨基酸序列的同源性至少為90%同源，優(yōu)選至少為95%同源，更優(yōu)選至少為98%，或至少99%同源的序列.20.—種分離的人單克隆抗體，它能結(jié)合由權(quán)利要求7-19中任意一項(xiàng)的抗體所限定的人CD25上的表位.21.—種分離的人單克隆抗體，它具有權(quán)利要求7-19中任意一項(xiàng)所述抗體的結(jié)合特征.22.—種分離的人單克隆抗體，它能結(jié)合包括選自下列一組的至少一個CDR序列的人CD25:(i)SEQIDNOs:23、24、25、26、27或28;或(ii)(i)中所限定的任來一種序列的保守性序列修飾.23.如權(quán)利要求22的抗體，包括SEQIDNO:25的VHCDR3，其保守性序列修飾，或與SEQIDNO:25的VHCDR3相比真有1-3個氨基酸取代、缺失或添加的序列.24.如權(quán)利要求23的抗體，包括具有以下氨基酸序列的VHCDR3:X!-Asp墨Trp-X2-Asp-X3其中，Xi是Arg、His或Lys;X2是Gly、Ala、Val、Leu、lle、Tyr、Trp或Phe;而Xs是Pro、Tyr、Phe或Trp.25.如權(quán)利要求24的抗體，其中，Xt是Arg或Lys;Xjt是Gly或Phe;而Xs是Pro或Tyr,26.如權(quán)利要求22的抗體，包括選自下列一組的至少四個CDR:(i)SEQIDNOs:23、24、25、26、27和28的VHCDR1、CDR2和CDR3以及VlCDR1、CDR2和CDR3;或(ii)(i)中所限定的任意一種序列的保守性序列修飾.27，如權(quán)利要求22的抗體，包括(i)SEQIDNOs:23、24、25、26、27和28的VHCDR1、CDR2和CDR3以及VLCDR1、CDR2和CDIU;或(ii)(i)中所限定的任意一種序列的保守性序列修飾.28.分離的人單克隆抗體，它能結(jié)合包括逸自下列一組的至少一個CDR序列的人CD25:(i)SEQIDNOs:29、30、31、32、33或34;或(ii)(i)中所限定的任意一種序列的保守性序列修飾.29.如權(quán)利要求28的抗體，包括SEQIDNO:31的VHCDR3，其保守性序列修飾，或與SEQIDNO:31的VHCDR3相比具有1-3個氨基酸取代、缺失或添加的序列.30.如權(quán)利要求28的抗體，包括選自下列一組的至少四個CDR序列(i)SEQIDNos:29、30、31、32、33和34的VHCDR1、CDR2和CDR3以及VlCDR1、CDR2和CDR3;或(ii)(i)中所限定的任意一種序列的保守性序列修飾.31.如權(quán)利要求28的抗體，包括(i)SEQIDNOs:29、30、31、32、33和34的VhCDR1、CDR2和CDR3以及VLCDR1、CDR2和CDR3;或(ii)(i)中所限定的任意一種序列的保守性序列修飾.32.—種分離的人單克隆抗體，它能結(jié)合包括選自下列一組的至少一個CDR序列的人CD25:(i)SEQIDNOs:35、36、37、38、39或40;或(ii)(i)中所限定的任意一種序列的保守性序列修飾.33.如權(quán)利要求32的抗體，包括SEQIDNO:37的VHCDR3，其保守性序列修飾，或與SEQIDNO:37的VHCDR3相比具有1-3個氨基酸取代、缺失或添加的序列.34.如權(quán)利要求32的抗體，包括選自下列一組的至少四個CDR序列(i)SEQIDNps:35、36、37、38、39和40的VHCDR1、CDR2和CDR3以及VlCDR1、CDR2和CDR3;或(ii)(i)中所限定的任意一種序列的保守性序列修飾.35.如權(quán)利要求32的抗體，包括(i)SEQIDNOs:35、36、37、38、39和40的VHCDR1、CDR2和CDR3以及VLCDR1、CDR2和CDR3;或(H)(i)中所限定的任意一種序列的保守性序列修飾.36.—種分離的人單克隆抗體，它能結(jié)合包括選自下列一組的至少一個CDR序列的人CD25:(i)SEQIDNOs:17、18、19、20、21或22;或(ii)(i)中所限定的任意一種序列的保守性序列修飾.37.如權(quán)利要求36的抗體，包括SEQIDNO:19的VHCDR3，其保守性序列修飾，或與SEQIDNO:19的VHCDR3相比具有1-3個氨基酸取代、缺失或添加的序列.38.如權(quán)利要求36的抗體，包括選自下列一組的至少四個CDR序列(i)SEQIDNOs:17、18、19、20、21和22;或(ii)(i)中所限定的任意一種序列的保守性序列修飾。39.如權(quán)利要求36的抗體，包括(i)SEQIDNOs:17、18、19、20、21和22的VHCDR1、CDR2和CDR3以及VLCDR1、CDR2和CDR3;或(ii)(i)中所限定的任意一種序列的保守性序列修飾。40.前述權(quán)利要求l-6中任意一項(xiàng)的抗體，包括具有以下氨基酸序列的VhCDR1結(jié)構(gòu)域X,曙Tyr-X2-Ile-X3其中，Xt、X2和X3是天然氨基酸；并且其中，Xi不同于Ser;或X2不同于Ala;或Xj不同于Ser.41.如權(quán)利要求40的抗體，其中，&是Arg、Lys或His;X2是Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro;而X3是Asn或Gln.42.如權(quán)利要求41的抗體，其中，Xi是Arg;X2是Ala、Ile或Pro;而X3是Asn,43.前述權(quán)利要求l-6中任意一項(xiàng)的抗體，包括具有以下氨基酸序列的VhCDR2結(jié)構(gòu)城Arg-Ile-Ile-Pro-Ile-Leu-Gly-X'HTyr-Ala-Gln-X^Phe^Gln-Xs其中，X2、X3、X4和Xs是天然氨基酸；并且，其中，&不同于lie;或Xi不同于Ala;或X3不同于Asn;或X4不同于Lys;或X5不同于Gly.44.如權(quán)利要求43的抗體，其中，Xi是Ile、Val、Gly、Ala或Leu;X2是AIa、Ile、Val、Gly、Leu、Glu或Asp;Xs是Asp、Glu、Asn或Gin;X《是Lys、Arg或His;而Xs是Gly、Ile、Val、Ala、Leu、Asp或Glu*45.如權(quán)利要求44的抗體，其中，Xt是Ile或Val;X2是Ala或Glu;X3是Asp或Asn;X4是Lys或Arg;而Xs是Gly或Asp。46.前述權(quán)利要求l-6中任意一項(xiàng)的抗體，包括具有以下氨基酸序列的VlCDR1結(jié)構(gòu)域Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Xi-Ser-Ser-X2-Leu-Ala其中，Xi和X2是天然氨基酸；并且，其中，Xi不同于Val;或X2不同于Tyr。47,如權(quán)利要求46的抗體，其中，Xi是Vai、Ala、Leu、lie或Gly;而Xz是Phe、Trp或Tyr.48.如權(quán)利要求47的抗體，其中，X，是Val或Gly;而X2是Phe或Tyr'49.前迷權(quán)利要求l-6中任意一項(xiàng)的抗體，包括具有以下氨基酸序列的VlCDR3結(jié)構(gòu)域'Gln-Gln-Tyr-XrSer-Ser-Pro陽X2-X3其中，Xi是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr;Xz是Leu、Gly、Ala、Val或lie;而Xa是Thr或Ser.50.如權(quán)利要求49的抗體，其中，Xi是Gly或Ser,Xz是Leii或lie;而X3是Thr.51.—種分離的人抗體，包括源于人VHl-69/JH4b或Vul-69/JH5b種系序列的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和源于人A27/JK4或A27/JK5種系序列的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，其中，所述人抗體能結(jié)合人CD25。52.—種分離的人抗體，包括源于人VHl-69/D7-27/JH4b或VH1-69/D7-27/JH5b種系序列的重鏈可變區(qū)氡基酸序列和源于人A27/JK4或A27/JK5種系序列的輕鏈可變區(qū)氡基酸序列，其中，所述人抗體能結(jié)合人CD25.53.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體，它是選自下列一組的完整的抗體完整的IgGl抗體，完整的IgG2抗體，完整的IgG3抗體，完整的IgG4抗體，完整的IgM抗體，完整的IgAl抗體，完整的IgA2抗體，完整的分泌型IgA抗體，完整的IgD抗體和完整的IgE抗體，其中，所述抗體是在真核細(xì)胞中糖基化的.54.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體，它是選自下列一組的完整的抗體完整的IgGl，k抗體，完整的IgGl，入抗體，完整的IgG4，k抗體和完整的IgG4，入抗體，其中所述抗體是在真核細(xì)胞中糖基化的.55.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體，它是抗體片段或單鏈抗體，56.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體，它是結(jié)合結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白融合蛋白，包括(i)如權(quán)利要求19所限定的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)，它是與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的，(ii)與所述鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，和(iii)與所述CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)，57.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體，它是通過包括從轉(zhuǎn)基因非人動物獲得的B細(xì)胞的雜交瘤產(chǎn)生的，其中，V-(D)-J基因片段重排業(yè)已導(dǎo)致了與無限增殖化細(xì)胞融合的功能性人重鏈轉(zhuǎn)基因和功能性人輕鏈轉(zhuǎn)基因的形成.58.包括從轉(zhuǎn)基因非人動物獲得的B細(xì)胞的雜交痛，其中，V-(D)-J基因片段重排業(yè)已導(dǎo)致了與無限增殖化細(xì)胞融合的功能性人重鏈轉(zhuǎn)基因和功能性輕鏈轉(zhuǎn)基因的形成，其中，所述雜交瘤能產(chǎn)生可檢測量的前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的單克隆抗體.59.能產(chǎn)生如權(quán)利要求1-54中任意一項(xiàng)所述的人單克隆抗體的雜交瘤。60.前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體，它是由包括編碼人重鏈和人輕鏈的核酸的轉(zhuǎn)染瘤生產(chǎn)的。61.—種轉(zhuǎn)染瘤，包括編碼人重鏈和人輕鏈的核酸，其中，所述轉(zhuǎn)染瘤能產(chǎn)生可檢測童的如權(quán)利要求1-55中任意一項(xiàng)所述的抗體。62.—種真核或原核宿主細(xì)胞，它包括編碼人重鏈和人輕鏈的核酸，其中，所述宿主細(xì)胞能產(chǎn)生可檢測量的如權(quán)利要求1-55中任意一項(xiàng)所述的抗體。63.—種轉(zhuǎn)基因非人動物或植物，包括編碼人重鏈和人輕鏈的核酸，其中，所述動物或植物能產(chǎn)生可檢測量的如權(quán)利要求1-55中任意一項(xiàng)所述的抗體.64.—種生產(chǎn)能結(jié)合人CD25的人單克隆抗體的方法，包括用人CD25或能表達(dá)人CD25的細(xì)胞免疫具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物，以便由所述動物的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體；分離所述動物的B細(xì)胞；讓所述B細(xì)胞與骨拔癌細(xì)胞融合，以便形成無限增殖化的雜交瘤細(xì)胞，它能分泌對人CD25特異性的人單克隆抗體；和從雜交瘤的培養(yǎng)物上清液中分離或從源于所述雜交瘤的轉(zhuǎn)染瘤中分離對CD25特異性的人單克隆抗體.65.—種組合物，包括如權(quán)利要求l-S5中任意一項(xiàng)的抗體和藥學(xué)上可接受的栽體.66.如權(quán)利要求65的組合物，還包括治療劑.67.如權(quán)利要求1-55中任意一項(xiàng)的抗體，還包括用于附著放射性同位素的螯合劑接頭.68—種免疫綴合物，包括與細(xì)胞毒性刑、放射性同位素或藥物連接的如權(quán)利要求1-55中任意一項(xiàng)的抗體.69.—種雙特異性或多特異性分子，包括如權(quán)利要求1-55中任意一項(xiàng)的抗體、和對CD3、CD4、IL^15R、膜結(jié)合的或受體結(jié)合的TNF-a、或膜結(jié)合的或受體結(jié)合的1L"15的結(jié)合特異性.70.—種抑制能表達(dá)CD25的細(xì)胞生長和/或增殖的方法，包括施用前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體、組合物、免疫綴合物、雙特異性或多特異性分子，以便抑制所述細(xì)胞的生長和/或增殖，71.—種消除能表達(dá)CD25的細(xì)胞的方法，包括施用前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體、組合物、免疫級合物、雙特異性或多特異性分子，以便殺傷能表達(dá)CD2S的細(xì)胞.72.如權(quán)利要求70或71的方法，其中，所述能表達(dá)CD25的細(xì)胞是活化的T細(xì)胞.73—種治療或預(yù)防與表達(dá)CD25的細(xì)胞相關(guān)的疾病的方法，包括施用前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體、組合物、免疫綴合物、雙特異性、或多特異性分子，或如權(quán)利要求90-94中任意一項(xiàng)的表達(dá)栽體或如權(quán)利要求95的藥用組合物，其用量能有效治療或預(yù)防所述疾病.74.如權(quán)利要求73的方法，其中，所述疾病選自下列一組移植物排斥、移植物抗宿主疾病、免疫病、自身免疫病或炎性疾病、炎性或過度增殖性皮膚病和淋巴樣瘸.75.如權(quán)利要求74的方法，其中，所述移植物排斥是進(jìn)行器官或組織移植的患者的同種異體移植物或異種移植物排斥，所述移植如心臟、肺、組合的心臟-肺、氣管、腎臟、肝臟、胰腺、食管、腸、皮膚、肢體、臍帶、干細(xì)胞或胰烏細(xì)胞移植，76.如權(quán)利要求75的用于預(yù)防移植物排斥的方法，包括用前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的抗體進(jìn)行預(yù)防性治療.77.如權(quán)利要求75的方法，其中，所述移植物抗宿主疾病選自下列一組榆血移植物抗宿主疾病和骨號移植物抗宿主疾病.78.如權(quán)利要求74的方法，其中，所述免疫病、自身免疫病或炎性疾病選自下列一組類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎，牛皮褲性關(guān)節(jié)炎，l型糖尿病，狹島素依賴性2型棘尿病，多發(fā)性硬化，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，重癥肌無力，炎性腸病，克羅恩病，清瘍性結(jié)腸炎，皮膚多肌炎，Sjiigren氏綜合征，動脈炎，包括巨細(xì)胞性動脈炎，再生陣礙性貧血，孝喘，硬皮病和葡菊膜炎.79.如權(quán)利要求74的方法，其中，所述炎性或過度增殖性皮膚病選自下列一組牛皮褲，包括斑塊牛皮褲，掌跖膿皰病(PPP),腐蝕性扁平苜薄，大皰性天皰瘡，大皰性表皮松解癥，接觸性皮炎和特應(yīng)性皮炎.80.如權(quán)利要求74的方法，其中，所述淋巴樣瘤選自下列一組T細(xì)胞白血病，何杰金病，毛細(xì)胞性白血病或皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，包括覃樣真菌病和Sezary氏綜合征.81.如權(quán)利要求73的方法，其中，所述疾病是惡性腫瘤，其中，對浸潤性CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的抑制是有利的，并且所述疾病選自下列一組胃癌，食管癌，惡性黑素瘸，結(jié)脈直腸癌，胰腺癌，乳腺癌，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，子宮頸癌，卵巢癌和腎細(xì)胞癌.82.如權(quán)利要求73的方法，其中，所述疾病是選擇下列一組的血液學(xué)疾病成年人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤，退行性大細(xì)胞淋巴瘤，慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)/小淋巴細(xì)胞性淋巴痗(SLL)，外周T細(xì)胞淋巴瘤和繼發(fā)性淀粉樣變性.83.如權(quán)利要求70-82中任意一項(xiàng)的方法，還包括給所述患者獨(dú)立地施用另一種治療劑和/或治療.84.如權(quán)利要求83的方法，其中，所述治療刑是選自下列一組的免疫押制刑環(huán)孢菌素，咪唑碟嚷呤，審酚酸，麥考紛酸嗎啉乙薛，皮質(zhì)類固醇，如潑尼松，氨曱蝶呤，氯金酸鈉，柳氮磧吡啶，抗瘧劑，白瑞夸爾，來氟洛米，咪峻立賓，15-deoxyspergualine，6-巰基嘌呤，環(huán)砩酰胺，瑞帕審素，他克莫司(FK-506)，OKT3，和抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白.85.如權(quán)利要求83的方法，其中，所述治療刑是選自下列一組的抗炎劑類固醇類藥物，NSAID(非類固醉抗炎藥物)，和DMARD，如氨甲蝶呤，羥氣喹，柳氮磺吡啶，來氟洛米，IL-1受體封閉劑，例如，阿那白滯素，TNF-a封閉刑，例如，依那西普，infliximab,和adalimumab，抗-II^6R抗體，CTLA4Ig和抗-IL-15抗體86.如權(quán)利要求83的方法，其中，所述治療刑是用于治療炎性或過度增殖性皮膚病的選自下列一組的試劑或治療煤焦油，維生素A，蒽林，calcipotrien，tarazotene，皮質(zhì)類固醇，氨甲蝶呤，類視黃醇,例如，acicretin，環(huán)孢菌素，依那西普，alefacept，efaluzimab，6-碟烏嚷呤，麥考酚酸嗎啉乙酴，他克莫司(FK-506)，羥基脲和光線治療，如UVB(寬帶和窄帶紫外線B),UVA(紫外線A)和PUVA(補(bǔ)骨脂素8-甲氣基補(bǔ)骨脂素加紫外線A).87.如權(quán)利要求83的方法，其中，所述治療刑逸自下列一組阿霉素，順鉑，博來霉素，卡氮芥，苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺.88.—種用于檢測CD25抗原或能表達(dá)CD25的細(xì)胞在樣品中存在的方法，包括讓所迷樣品與權(quán)利要求1-55中任意一項(xiàng)的抗體在可以形成所述抗體和CD25復(fù)合物的奈件下接觸；和檢測復(fù)合物的形成.89.—種用于檢測CD25抗原或能表達(dá)CD25的細(xì)胞在包括如上述權(quán)利要求l-55中任意一項(xiàng)的抗體的樣品中存在的試劑盒，其中，所述抗體任選地與可檢測標(biāo)記連接.90.一種表達(dá)栽體，包括編碼與人CD25結(jié)合的人抗體的輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈兩者的可變區(qū)的核苦酸序列.91.如權(quán)利要求卯的表達(dá)栽體，還包括編碼與人CD25結(jié)合的人抗體的輕鏈、重鏈或輕鏈和重鏈兩者的恒定區(qū)的核苷酸序列.92.—種表達(dá)栽體，包括編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，其包含選自SEQIDNOs:1、5、9或13的核苷酸序列，或它們的保守性修飾，以及包括編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，其包含選自SEQIDNOs:3、7、11或15的核苷酸序列，或它們的保守性修飾.93.—種表達(dá)栽體，包括一種核苷酸序列，它編碼包括選自SEQIDNOs:2、6、IO或14所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，以及包括選自SEQIDNOs:4、8、12或16所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，以及它的保守性序列修飾.94.一種表達(dá)栽體，它編碼前述權(quán)利要求l-5S中任意一項(xiàng)的人單克隆抗體.95.—種藥用組合物，它包括如權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的表達(dá)栽體和藥學(xué)上可接受的栽體.96.—種抗-獨(dú)特型抗體，它能結(jié)合前述權(quán)利要求1-55中任意一項(xiàng)的抗體。97.—種抗-獨(dú)特型抗體，它能結(jié)合AB1、AB7、AB11或AB12.98.權(quán)利要求96或97的抗-獨(dú)特型抗體在用于檢測樣品中抗CD2S的人單克隆抗體水平中的用途.全文摘要公開了能結(jié)合并且抑制人CD25的分離的人單克隆抗體，以及相關(guān)的基于抗體的組合物和分子。所述人抗體可以由雜交瘤，轉(zhuǎn)染瘤生產(chǎn)或者在非人轉(zhuǎn)基因動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)生產(chǎn)，所述雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤或非人轉(zhuǎn)基因動物通過進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換，能夠生產(chǎn)人單克隆抗體的多種同種型。還公開了包括所述人抗體的藥用組合物，能生產(chǎn)所述人抗體的非人轉(zhuǎn)基因動物，雜交瘤和轉(zhuǎn)染瘤，以及使用所述人抗體的治療和診斷方法。文檔編號C07H21/04GK101124244SQ200380108864公開日2008年2月13日申請日期2003年11月14日優(yōu)先權(quán)日2002年11月15日發(fā)明者C·E·G·哈維尼思,D·L·威廉斯,J·G·J·范德溫克爾,J·彼得森,J·舒爾曼,O·D·M·S·巴德斯加德,P·帕倫申請人:根馬布股份公司