專利名稱：：人單克隆抗體人cd134(ox40)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法人單克隆抗體人CD134(OX40)及其制備方法和應(yīng)用相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2005年11月25日提交的申請序列號60〃39,659的優(yōu)先權(quán)，在此特別并入作為參考。、己、監(jiān)，？、、，、、，"，，成。其取決于對外來抗原的識別以及區(qū)分自身抗原和非自身抗原的能力。有時自身抗原和非自身抗原之間的屏障會被破壞，造成由我們自身免疫系統(tǒng)所導(dǎo)致的組織破壞。這些自身免疫應(yīng)答能引起使人虛弱的疾病如糖尿病、多發(fā)性硬化和炎性腸病。一種這些自身免疫應(yīng)答的主要介質(zhì)是T淋巴細胞或T細胞。一般地，T細胞耐受自身抗原，但在某些自身免疫性疾病中，該耐受消失并且T細胞發(fā)動針對健康組織的免疫應(yīng)答。除去自身免疫T細胞或阻斷它們的活化或生存改善了疾病癥狀。然而，該T細胞的一般耗竭或阻止它們的活化引起了免疫抑制，由此患者變得對傳染物高度易感。因此，需要能特異性靶向效應(yīng)T細胞并只減少自身反應(yīng)性T細胞的新療法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了特異性結(jié)合OX40胞外域氨基酸序列(如SEQIDNO:50)中的表位的分離或純化的抗體?？贵w包括結(jié)合哺乳動物(如靈長類動物或人)OX40序列(如SEQIDNO:49)的人、人源化和嵌合抗體?？贵w還包括具有OX40拮抗活性的那些抗體?？贵w進一步包括具有OX40激動活性的那些抗體。在具體的實施方案中，一種抗體具有OX40拮抗活性并減少或增加細胞因子或干擾素的產(chǎn)生，活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞的生存或增殖，抗凋亡蛋白或凋亡前體蛋白的表達。在具體的非限制性方面中，細月包因子選自IL-1、IL國2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL國10、IL誦14、IL-16、IL-17、IL-23、IL-26、TNF-a、干擾素y和GM-CSF;以及抗凋亡蛋白或凋亡前體蛋白選自Bcl-xL、Bcl-2、Bad和Bim。在其他具體的實施方案中，OX40抗體由稱為112F32(ATCC編號PTA-7217，2005年11月17日保藏的)、112V8(ATCC編號PTA畫7219,2005年11月17日保藏的)、112Y55(ATCC編號PTA-7220,2005年11月17日保藏的)、112Y131(ATCC編號PTA誦7218,2005年11月17日保藏的)和112Z5(ATCC編號PTA-7216,2005年11月17日保藏的)雜交瘤細胞系所產(chǎn)生。在另外的實施方案中，OX40抗體結(jié)合由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體結(jié)合的氨基酸序列；具有在由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的約1-5000倍范圍內(nèi)的OX40結(jié)合親和力；具有與由稱為112F32、U2V8、U2Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體相比更大或更小的OX40結(jié)合親和力；具有在由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的約KD1(^M-約KD10"M范圍內(nèi)的OX40結(jié)合親和力；具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性；與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體竟?fàn)幣cOX40結(jié)合；如在ELISA測定法中所測定的，抑制或阻止由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體與OX40結(jié)合(如抑制至少50%的由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體與OX40結(jié)合)；或結(jié)合與112V8、112Y55和Y131所結(jié)合的表位相同的表位，以及抑制或阻止OX40與OX40配體(OX40L)結(jié)合(如85%或更多)?？贵w額外包括特異性結(jié)合細胞上表達的OX40的那些抗體。在具體的實施方案中，抗體特異性結(jié)合非T細胞(如自然殺傷細胞、粒細胞、單核細胞、B細胞)，或用OX40轉(zhuǎn)染的細胞系(如CHO細胞、L929細胞或HELA細胞)上表達的0X40。在具體的方面中，抗體特異性結(jié)合活化的人T細胞，而非靜息的T細胞?？贵w包括如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列?？贵w還包括如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的抗體成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列的修飾和可變形在具體的方面中，取代包括保守氨基酸取代。在另外的具體方面中，取代包括l-3個、3-5個、5-10個或更多個氨基酸殘基的氨基酸取代。在另外的具體方面中，抗體與如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列的序列具有80%-85%、85%-90%、90%-95%、96%、97%、98%、99%或更多的同一性?？贵w還包括如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列的子序列。在具體的方面中，子序列選自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、單鏈Fvs(scFv)、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)和Vi^或VH。抗體還包括異源結(jié)構(gòu)域。在具體的方面中，異源結(jié)構(gòu)域包括標簽、可檢測的標記或細胞毒素劑。諸如取代、子序列和添加的修飾和可變的抗體能保留可^r測的如本文中所述的OX40抗體的活性。在一個實施方案中，修飾的抗體保留可才企測的由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的活性。在另一個實施方案中，修飾的抗體調(diào)節(jié)T細胞增殖或生存，或調(diào)節(jié)活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞的數(shù)量，或耗竭活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞。在具體的方面中，修飾的抗體抑制OX40信號傳導(dǎo)或減少或耗竭特異性針對自身抗原(如諸如髓磷脂堿蛋白、髓磷脂少突膠質(zhì)細胞糖蛋白、含蛋白脂質(zhì)蛋白、膠原、滑膜關(guān)節(jié)組織抗原、胰島素、谷氨酸脫羧酶、腸抗原、曱狀腺抗原、組蛋白、肌肉抗原和皮膚抗原的自身抗原)的自身反應(yīng)性T細胞的數(shù)量。抗體還包括與抗體L106竟?fàn)幓虿慌c其竟?fàn)幣cOX40結(jié)合的那些抗體。在一個具體的實施方案中，如在ELISA測定法中所測定的，抗體不抑制或阻止抗體L106與OX40結(jié)合?？贵w進一步包括影響OX40功能或活性的那些抗體。在具體的實施方案中，抗體抑制或阻止OX40配體與OX40結(jié)合；抑制或阻止OX40配體與活化T細胞結(jié)合；調(diào)節(jié)OX40介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)(如抑制或阻止)；調(diào)節(jié)OX40介導(dǎo)的細胞應(yīng)答；或OX40介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)(如抑制或阻止)。在具體的方面中，OX40介導(dǎo)的細胞應(yīng)答包括淋巴細月包增殖、細胞因子表達、淋巴細胞生存、NF-kB活化、PKB(Akt)活性的維持或存活蛋白的增量調(diào)節(jié)。在另外的實施方案中，抗體通過自然殺傷細胞、巨噬細胞或嗜中性白細胞介導(dǎo)，誘導(dǎo)EL4-人OX40表達細胞或活化的人T細胞溶解，例如，在10pg/ml抗體下誘導(dǎo)的特異性細胞溶解百分率(％)為約15-75%、25-65%、或30-60%、或50-100%?？贵w進一步包括具有體內(nèi)功能或活性的那些抗體。在具體的實施方案中，抗體減輕、減少或預(yù)防急性或慢性異種移植物宿主病模型中的移植物抗宿主病的癥狀，或使急性或慢性異種移植物宿主疾病模型(如在給予抗-IL2R卩鏈抗體和亞致死劑量輻射后接受人外周血單核細胞(PBMC)的免疫缺陷型(SCID)小鼠)中的移植物抗宿主病緩解或消退。在具體的方面中，移植物抗宿主病的癥狀是體重減輕，脫發(fā)，皮滲，血尿，腹水和肝、腸道、肺、皮膚中炎性細胞浸潤或死亡。在另外的實施方案中，抗體減輕、減少或預(yù)防肺、皮膚或腸中的炎癥，或減輕、減少或預(yù)防自身免疫性疾病的癥狀。在具體的方面中，抗體緩解或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病、克羅恩氏病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉、銀屑病、增生性狼瘡性腎炎、肉芽肺性肌病、或多發(fā)性肌炎的癥狀?？贵w包括單克隆和多克隆抗體，其的任何同種型或亞類。在具體的方面中，抗體是IgG(如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA、IgM、IgE或IgD同種型?？贵w可包含在藥物組合物中。在一個實施方案中，抗體包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑?？贵w可由核酸序列編碼。在一個實施方案中，核酸編碼如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列的序列或其子序列。在具體的方面中，核酸序列包括SEQIDNO:3-6和SEQIDNO:38-43,或SEQIDNO:3畫6和SEQIDNO:38-43的簡并序列。在另外的具體方面中，核酸編碼具有如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列經(jīng)一個或多個氨基酸殘基取代、添加或缺失的氨基酸序列。在另外的具體方面中，核酸編碼具有如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列經(jīng)一個或多個氨基酸殘基取代、添加或缺失的氨基酸序列，所屬氨基酸序列具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的活性(如具有針對OX40胞外域表位的結(jié)合親和力)。在更進一步的具體實施方案，核酸序列包括表達控制序列或載體?？贵w可由宿主細胞和分離的細胞所產(chǎn)生。在具體的實施方案中，宿主或分離的細胞是雜交瘤細胞或CHO細胞。在另外的具體實施方案中，分離的細胞表達具有與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體一樣的結(jié)合特異性的抗體。本發(fā)明提供了試劑盒。在具體的實施方案中，試劑盒包括由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體，和用于將抗體給予需要用該抗體治療的個體的說明書。本發(fā)明提供了包括處理和治療方法的體內(nèi)方法。在具體的實施方案中，一種用于治療需要治療的個體中慢性或急性免疫性疾病或病效治^個體-慢性^急性免疫';生疾病或病癥、、或慢性或急性免疫性疾病或病癥的癥狀的抗體或藥物組合物。在具體的方面中，治療導(dǎo)致緩解或改善一種或多種與慢性或急性免疫性疾病或病癥相關(guān)的不利癥狀或身體后果。在另外的具體實施方案中，一種用于治療移植物抗宿主病的方法包括給予需要治療的個體能有效治療移植物抗宿主病的抗體或藥物組合物。在具體的方面中，治療減輕、減少或預(yù)防一種或多種與移植物抗宿主病相關(guān)的不利癥狀或身體后果(如體重減輕、脫發(fā)、皮滲、血尿、腹水、肝、腸道、肺中炎性細胞浸潤或死亡)的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性，引起移植物抗宿主病的緩解或消退，或造成預(yù)防移植物抗宿主病。在另外的方面中，移植物可包括骨髓、造血干細胞、外周血干細胞或臍帶血干細胞。在另外的具體實施方案中，一種用于治療移植排斥的方法包括給予需要治療的個體能有效治療移植排斥的抗體或藥物組合物。在具體的方面中，治療減輕、減少或預(yù)防一種或多種與移植排斥(如針對移植物或移植細胞的免疫應(yīng)答或組織破壞)相關(guān)的不利癥狀或身體后果(如體重減輕、脫發(fā)、皮滲、血尿、腹水、肝、腸道、肺中炎性細胞浸潤或死亡)的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性，引起移植排斥的緩解或消退，或造成預(yù)防移植排斥。在另外的方面中，移植物可包括腎、心、肺、皮膚、肝或胰臟細胞、組織或器官。在更進一步的具體實施方案中，一種用于減輕、減少或預(yù)防炎癥的方法包括給予需要治療的個體能有效減輕、減少或預(yù)防炎癥的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性的抗體或藥物組合物。在具體的方面中，炎癥存在于肺、關(guān)節(jié)、肌肉、皮膚、中樞或末梢神經(jīng)系統(tǒng)或腸中。在另外的方面中，治療導(dǎo)致減輕一種或多種與炎癥相關(guān)的不利癥狀或身體后果的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性。還在另外的具體實施方案中，一種用于治療自身免疫性疾病的方法包括給予需要治療的個體能有效減輕、減少或預(yù)防自身免疫性疾病的癥狀的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性的抗體或藥物組合物。在具體的方面中，自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病、克羅恩氏病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉、銀屑病、增生性狼瘡性腎炎、肉芽腫性肌病或多發(fā)性肌炎。在另外的方面中，治療導(dǎo)致減輕、減少或預(yù)防一種或多種與自身免疫性疾病相關(guān)的不利癥狀或身體后果的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性。當(dāng)在體內(nèi)實施時，能導(dǎo)致處理或治療的另外的方法包括調(diào)節(jié)OX40活性或功能。在具體的實施方案中，一種用于抑制或阻止OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的方法包括給予需要抑制或阻止OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的個體能有效抑制或阻止OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答(如淋巴細胞增殖、細胞因子表達或淋巴細胞生存)的抗體或藥物組合物。在另外的實施方案中，一種用于抑制或封閉OX40配體與活化T細胞結(jié)合的方法包括給予需要封閉、抑制或阻止OX40配體與活化T細胞結(jié)合的個體能有效抑制或阻止OX40配體與活化T細胞結(jié)合的抗體或藥物組合物。在另外的實施方案中，一種用于抑制或封閉OX40配體與OX40結(jié)合的方法包括給予需要封閉、抑制或阻止OX40配體與OX40結(jié)合的個體能有效抑制或阻止OX40配體與OX40結(jié)合的抗體或藥物組合物。在更進一步的具體實施方案中，一種用于調(diào)節(jié)OX40-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)的方法包括給予需要調(diào)節(jié)OX40-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)的個體能有效調(diào)節(jié)OX40-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)的抗體或藥物組合物。還在另外的具體實施方案中，一種用于減少活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量的方法包括給予需要減少活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量的個體足以減少活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量的量的抗體。還在另外的具體實施方案中，一種用于減少急性或慢性異種移植物宿主疾病沖莫型的血、脾、淋巴結(jié)、腸、肝、肺或皮膚中活化T細胞數(shù)量的方法包括將足以減少血、脾、淋巴結(jié)、腸、肝、肺或皮膚中活化T細胞數(shù)量的量的抗體給予急性或慢性異種移植物宿主疾病模型。還在另外的具體實施方案中，一種用于治療由活化、效應(yīng)、記減少或預(yù)防由活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞所引起的疾病或病癥的進展或耗竭活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞的量的抗體。在具體的方面中，疾病或病癥包4舌移才直物抗宿主病、炎癥或自身免疫性疾病。根據(jù)本發(fā)明可治療的個體包括哺乳動物(如人)。在具體的實施方案中，個體是慢性或急性免疫性疾病或病癥的候選人或已進行慢性或急性免疫性疾病或病癥治療；個體是移植物抗宿主病的候選人或已進行移植物抗宿主病治療；個體是移植排斥的候選人或已進行移植排斥治療；個體是炎癥的候選人或已進行炎癥治療；或個體是自身免疫性疾病的候選人或已進行自身免疫性疾病治療；個體是OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的候選人或已進行OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答治療?？赏ㄟ^任何可接受的方法實施包括給予或遞送OX40抗體的本發(fā)明的方法。在具體的實施方案中，OX40抗體局部、區(qū)域或全身性給予個體。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生具有OX40拮抗活性的人OX40抗體的方法。在一個實施方案中，一種方法包括將綴合有人Fc重組蛋白的人OX40胞外域或活化的人T細胞給予能表達人免疫球蛋白的動物(如轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)基因牛)；篩選表達人OX40抗體的動物；選擇產(chǎn)生人OX40抗體的動物；從所選擇的動物中分離抗體；以及確定人OX40抗體是否具有OX40拮抗活性。本發(fā)明進一步提供了用于產(chǎn)生抑制或阻止OX40與OX40配體(OX40L)結(jié)合的人OX40抗體的方法。在一個實施方案中，一種方法包括將綴合有人Fc重組蛋白的人OX40胞外域或活化的人T細胞給予能表達人免疫球蛋白的動物(如轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)基因牛)；篩選表達人OX40抗體的動物；選4奪產(chǎn)生人OX40抗體的動物；從所選才奪的動物中分離抗體；以及確定人OX40抗體是否抑制或阻止OC40與OX40配體(OX40L)結(jié)合。此外，本發(fā)明提供了表達OX40抗體的非人轉(zhuǎn)基因動物。在多個實施方案中，所表達的OX40抗體與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體相同；結(jié)合由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體所結(jié)合的OX40胞外域氨基酸序列中的表位；具有在由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的約1-5000倍范圍內(nèi)的OX40結(jié)合親和力；具有在由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的約KDl(T6M-約KDl(T12M范圍內(nèi)的OX40結(jié)合親和力；具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性；或與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體竟?fàn)幣cOX40結(jié)合。附圖簡述圖1A-F:用人抗-人OX40抗體進行的流式細胞檢測分析。A.在用PHA和IL2刺激3天后，人CD4T細胞的前向散射對側(cè)向散射分布圖。B-F.用人抗-人OX40抗體或?qū)φ諛擞浀幕罨娜薚細胞。粗線表示在活化的門限中染色的細胞，而細線表示在靜息門限中的細胞。在頻率分布圖中同種型對照IgG抗體標記的活化細胞以點線表示。B.112F32、C.112V8、D.112Y55、E.112Y131和F.112Z5。圖2:活化的人T細胞的人抗-人OX40單克隆抗體染色。所呈現(xiàn)的幾何平均熒光強度數(shù)據(jù)來源于類似于圖1A中所描述的活化T細胞門限。這些數(shù)據(jù)用于測定示于表3中的KD和BMAX。圖3A-B:5種OX40抗體竟?fàn)幗Y(jié)合OX40。A.用抗-小鼠IgG-HRP檢測hOX40:mFc與包被的抗體結(jié)合的抑制百分數(shù)。B.用綿羊抗-人IgG-HRP檢測hOX40:hFc與小鼠抗體結(jié)合的抑制百分數(shù)。陰性數(shù)量未顯示。圖4A-B:5種OX40抗體竟?fàn)幗Y(jié)合0X40。A.用SA-PE檢測的用封閉抗體和生物素化的抗-OX40抗體染色的活化T細胞的抑制百分數(shù)。B.用SA-PE檢測用小鼠抗-人OX40抗體和生物素化的抗-OX40抗體標記的活化的人T細胞的抑制百分數(shù)。陰性數(shù)量未顯示。圖5A-B:通過ELISA和流式細胞術(shù)測定的人抗-人OX40單克隆抗體對OX40L與OX40結(jié)合的封閉。A.通過ELISA用抗-FLAG-HRP第二抗體檢測配體結(jié)合的抑制百分數(shù)。B.通過流式細胞術(shù)用抗-FLAG-PE抗體檢測OX40L結(jié)合的抑制百分數(shù)。圖6A-C:圖A-C代表使用三種不同的供體對的三個研究，并描述了抗-OX40抗體對T細胞增殖的效應(yīng)。圖7A-C:抗體112V8G1重組抗體改善了急性異種移植物抗宿主病。A.總宏觀病理學(xué)評分。B.通過流式細胞儀分析脾的單一細胞懸浮液中人T細胞的存在。顯示了T細胞的平均數(shù)和每一處理組中每個群體的標準偏差。c.測定了小鼠血清中的人干擾素y。顯示了每組小鼠以pg/ml計的干擾素y的平均數(shù)量加標準偏差。圖8A-C:抗體112V8G1改善了慢性異種移植物抗宿主病。A.小鼠個體的總的宏觀病理學(xué)評分。B.通過流式細胞儀測定的小鼠脾中人T細胞的平均數(shù)加標準偏差。C.在CD4T細胞移植后第48天，SCID小鼠外周淋巴節(jié)中人T細胞的平均數(shù)量。圖9A-C:當(dāng)在第0、3或6天給予時，抗體112V8G4PE改善了急性異種移植物抗宿主病。A.在第0天處理的小鼠個體的總宏觀病理學(xué)評分。B.在第0天處理的小鼠中第12天脾中人T細胞的平均數(shù)加組平均偏差。C.在第3天或第6天處理的小鼠個體的總宏觀病理學(xué)評分。圖10:抗-人OX40人IgGl抗體的特異性溶解百分數(shù)。抗-人OX40人IgGl抗體介導(dǎo)EL4-人OX40靶的ADCC。發(fā)明詳述本發(fā)明至少部分基于特異性結(jié)合OX40(CD134)的抗體，其例如可稱為OX40抗體、抗-OX40或抗-OX40抗體。特異性結(jié)合OX40的本發(fā)明的抗體包括哺乳動物(人、靈長類動物等)、人源化和嵌合的抗-OX40抗體。特異性結(jié)合OX40的本發(fā)明的抗體和抗體子序列(片段)包括純化和分離的抗體及其藥物配方。OX40是一種50千道爾頓(KDa)的糖蛋白和肺瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)成員。已報道了在內(nèi)皮細胞、活化的抗原呈遞細胞包括巨噬細胞、樹突細胞、B細胞和自然殺傷細胞上表達OX40的配體一OX40L(也稱為TNFSF4、CD252)。盡管不希望受理論約束，但如同對脂多糖(LPS)—樣，抗原呈遞細胞上CD40之間的結(jié)合增加了OX40L的表達。在通過T細胞抗原受體傳導(dǎo)信號之后，可誘導(dǎo)T細胞上OX40表達。例如，在炎癥部位處OX40在新近活化的T細胞上表達。在炎性環(huán)境下CD4和CD8T細胞可上調(diào)節(jié)0X40。OX40抗體、抗-OX40和抗-OX40抗體指特異性結(jié)合OX40的抗體。特異性結(jié)合是抗體對OX40上所存在表位的選擇。使用本領(lǐng)域已知的測定法(如免疫沉淀、ELISA、流式細胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡)可區(qū)分特異性結(jié)合和非特異性結(jié)合。當(dāng)抗體特異性結(jié)合的所有或部分抗原表位存在于不同的蛋白之上時，OX40抗體可結(jié)合不同的蛋白。因此，取決于OX40表位序列或結(jié)構(gòu)同源性的程度，OX40抗體可特異性結(jié)合另一種與該OX40表位具有高序列或結(jié)構(gòu)同源性的蛋白。因此，當(dāng)足夠的序列或結(jié)構(gòu)同源性表位存在于不同的蛋白之上時，OX40抗體可結(jié)合不同的蛋白。本發(fā)明的OX40抗體包括分離的和純化的抗體。因此，包括分離或純化的OX40抗體的本發(fā)明的抗體不包括人類抗體。用作組合物修飾詞的術(shù)語"分離的"意指該組合物為人工制備或與一種或多種天然存在于體內(nèi)環(huán)境中的其他成分分離，通常通過一步或多步操縱的步驟或過程。一般而言，這樣分離的組合物基本上不含有一種或多種在自然界中與它們通常相關(guān)的物質(zhì)，例如一種或多種蛋白、核酸、脂類、碳水化合物、細胞膜。因此，分離的組合物與該組合物天然存在的生物體細胞中其他生物成分分離，或與產(chǎn)生其(如合成或通過細胞培養(yǎng))的人工培養(yǎng)基分離。例如，分離的OX40抗體可獲得自其中產(chǎn)生該抗體的動物(如非轉(zhuǎn)基因哺乳動物或轉(zhuǎn)基因哺乳動物，例如嚙齒類動物(小鼠)或有蹄類動物(牛))并與其他多肽和核酸分離。因此，含有獲得自該動物的抗體的血清被認為是分離的。術(shù)語"分離的，，并不排除可選的物質(zhì)形式，例如，分離的抗體可包括抗體子序列、嵌合體、多聚體或衍生形式。用作為組合物修飾語的術(shù)語"純化的"指組合物幾乎或基本上不含有在自然界中所有與之通常相關(guān)的物質(zhì)。純化的抗體通常除去了抗體環(huán)境中一般存在的成分。因此，與產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞培養(yǎng)物分離的抗體上清液被認為是純化的。因此，純化的無需絕對的純度且該純度是處于特定的范圍中。此外，"純化的"組合物可與一種或多種其他分子結(jié)合。因此，術(shù)語"純化的"并不排除組合物的結(jié)合?？赏ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒y定純度，包括例如UV光譜法、層析法(如HPLC,氣相)、凝膠電泳(如銀或考馬斯染色)以及序列分析(肽和核酸)。"純化的"蛋白和核酸包括通過標準的純化方法產(chǎn)生的蛋白和核酸。該術(shù)語還包括通過在宿主細胞中重組表達以及化學(xué)合成產(chǎn)生的蛋白和核酸。"純化的"還可指其中污染物水平低于管理機構(gòu)例如美國食品和藥物管理局(FDA)對于人或非人動物用藥的可接受的水平的組合物。本發(fā)明的OX40抗體包括特異性結(jié)合OX40胞外域氨基酸序列中表位的抗體。在具體的實施方案中，如通過交叉封閉測定法所測定的，例證性的OX40抗體特異性結(jié)合OX40上三個"表位，，。例證性的非限制性人OX40胞外域序列如下所示MCVGARRLGRGPCAALLLLG;GLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGF甘NDVVSSKPtKPCTWCNLRSGSERKQLCT-ATQDTV-CRCRAGTQPLDS-YKPG-VDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTjSfCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRpPPATQPQETQGPPARPETVQPTEAWPRTSQGPS(SEQIDNO:50).肽表位通常是短的氨基酸序列，如長度為約5-15個氨基酸的氨基酸序列。用于鑒定表位的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的并描述于例如美國專利號4,708,871中。筒言之，可合成來源于OX40多肽的一組重疊寡肽并將其結(jié)合在固相陣列的引腳上，每個引腳上的寡肽都是不同的。引腳陣列可包含96孔微量滴定板，使得一次可同時測定96種寡肽。同樣地，可利用以高密度固定在膜載體上的不同長度(如6-15個單體)的高度重疊肽掃描鑒定不連續(xù)表位。使用高抗體濃度，并且通過間接的免疫測定檢測結(jié)合。如果多條結(jié)合序列被鑒定并為間隔序列所分隔，但單條肽不被識別，則已鑒定出不連續(xù)表位。分隔的表位將預(yù)計能在靶蛋白表面上形成連續(xù)區(qū)域并代表著一種構(gòu)象表位(Reineke,等ProteinSci.7:951(1998))?？蛇x地，商業(yè)上可獲得的噬菌體展示肽文庫試劑盒(NewEnglandB10Labs)能用于表位作圖。這些方法和其他方法可用于測定對可能的每一亞組相鄰氨基酸的結(jié)合親和力，以便鑒定特定抗體結(jié)合的表位。當(dāng)表位長度肽序列被用于免疫接種動物，由該動物獲得結(jié)合該肽序列的抗體時，還可通過推斷鑒定表位。還可使用計算機程序如BEPITOPE預(yù)測連續(xù)表位(Odorico等，J.Mo/.Wecog"".16:20(2003》。本發(fā)明的抗體是屬于任何抗體類型如IgM、IgG、IgA、IgE、IgD及其任何亞類的單克隆或多克隆免疫球蛋白分子。例證性的IgG亞類是IgG!、IgG2、IgG3和IgG4。"單克隆"抗體指一種基于、獲得自或來源于單一克隆包括任何真核、原核或噬菌體克隆的抗體。因此，"單克隆"抗體在結(jié)構(gòu)上得到了定義，而非通過產(chǎn)生其的方法進行定義。具體例證性的與OX40特異性結(jié)合的抗體稱為112F32(ATCC編號PTA-7217，2005年11月17日保藏的)、112V8(ATCC編號PTA-7219,2005年11月17日保藏的)、112Y55(ATCC編號PTA-7220,2005年11月17日保藏的)、112Y131(ATCC編號PTA-7218,2005年11月17日保藏的)和112Z5(ATCC編號PTA-7216。2005年11月17日保藏的)，其是人單克隆抗-人OX40抗體(結(jié)合人OX40的人抗體)。例證性的本發(fā)明的OX40抗體112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5具有如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列。112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5的名稱可指抗體或產(chǎn)生該OX40抗體的細胞系(如雜交瘤、CHO細胞或其他宿主細月包)。使用經(jīng)不同類型的可溶性重組人OX40(OX40-hlgGl)、融合蛋白(hOX40:hFc或表達OX40的活化的人T細胞免疫接種的轉(zhuǎn)染色體(trans-chromosomic)小鼠(KMmice)(WO02/43478,WO02/092812和Ishida,等，IBC，s11thAntibodyEngineeringMeeting.Abstract(2000))產(chǎn)生例證性的本發(fā)明的人抗-人OX40抗體。鑒定了特異性標記活化的人T細胞而非靜息的T細胞的例證性的抗體。例證性的抗體可檢測地染色了人OX40穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系(EL4-OX40和CHO-OX40),但不染色非轉(zhuǎn)化的親本細胞系，表明該抗體特異性結(jié)合人0X40。例證性的抗體還結(jié)合獼猴OX40和短尾猴0X40，但并不可檢測地結(jié)合鼠0X40。本發(fā)明的抗體可具有k和人輕鏈序列，或如天然存在的抗體一樣是全長序列，或是它們的混合物(即k和X鏈序列的融合體)、以及它們的子序列/片段。天然存在的抗體分子含有兩條k或兩條X輕鏈。本發(fā)明的OX40抗體還包括，例如特異性結(jié)合由稱為112F32(ATCC編號PTA-7217,2005年11月17日保藏的)、112V8(ATCC編號PTA-7219,2005年11月17日保藏的)、112Y131(ATCC編號PTA-7218，2005年11月17日保藏的)、112Y55(ATCC編號PTA-7220,2005年11月17日保藏的)或112Z5(ATCC編號PTA-7216,2005年11月17日保藏的)的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體所結(jié)合的氨基酸序列的抗體。本發(fā)明的OX40抗體進一步包括，例如特異性結(jié)合由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體所結(jié)合的OX40胞外域的抗體。本發(fā)明的OX40抗體額外地包括，例如具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性的抗體。上述OX40抗體通常顯示部分或完全封閉、降低或抑制112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5抗體與OX40結(jié)合?？墒褂镁?fàn)幗Y(jié)合測定法鑒定特異性結(jié)合由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體所結(jié)合的氨基酸序列的OX40抗體，以及具有112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5抗體結(jié)合特異性的抗體?？苫谂c112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5抗體竟?fàn)幗Y(jié)合OX40的能力選擇抗體?？赏ㄟ^包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)在內(nèi)的本領(lǐng)域中已知的多種測定法測定抗體與112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5抗體竟?fàn)幗Y(jié)合OX40的能力，或抑制、降低、減少、阻止或封閉112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5抗體與OX40的結(jié)合的能力。在具體的方面中，如在ELISA測定法中所測定的，本發(fā)明的抗體抑制或阻止由稱為112F32、112V8、U2Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體與OX40結(jié)合。在更進一步的方面中，如在ELISA測定法中所測定的，本發(fā)明的抗體抑制至少50%的由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體與OX40結(jié)合。本發(fā)明的OX40抗體還包括特異性結(jié)合OX40且不阻止或封閉小鼠抗-人OX40抗體L106(BectonDickinson,目錄號340420)與OX40結(jié)合的抗體。進一步包括的是特異性結(jié)合OX40且不抑制、降低或減少抗體L106與OX40結(jié)合的OX40抗體?？贵wL106描述于例如美國專利號6,277,962,WO95/12673和Schlossman等，編幾eukocvteTypingV:WhiteCellDifferentiationAntigens,Oxford:OxfordUniversityPress(1995)pp1157-60)中。本發(fā)明的OX40抗體包括與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體相比，具有更大或更小的對OX40親和力的特異性結(jié)合OX40的抗體。例如，提供了具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的約l-10，000倍(如2-5、5-10、10-100、100-1000或1000-10,000倍更大或更小的親和力，或位于上述數(shù)值之內(nèi)或包含上述數(shù)值的任何數(shù)值或范圍)范圍內(nèi)的OX40結(jié)合親和力的抗體。因此，本發(fā)明的OX40抗體還包括與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體相比，具有更大或更小的OX40結(jié)合親和力的抗體。在具體的實施方案中，本發(fā)明的OX40抗體具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的在約KD10—6M-約KDl(T13M范圍內(nèi)，或位于上述數(shù)值之內(nèi)或包含上述數(shù)值的任何數(shù)值或范圍的OX40結(jié)合親和力?？赏ㄟ^締合速率(Ka)和離解速率(Kd)測定結(jié)合親和力。平衡親和常數(shù)KD是Ka/Kd的比率。可使用表面等離振子共振法(SPR)測定締合速率(Ka)和離解速率(Kd)(Rich和Myszka,O/m(9;z".說o^c/z"o/11:54(2000);Englebienne,爿""/"/.123:1599(1998))。已知用于實時才企測以及監(jiān)測結(jié)合速率的裝置和方法并可從商業(yè)渠道獲得(BiaCore2000,BiacoreAB,Upsala，Sweden;和Malmqvist,Aoc/ze肌Soc.7Va肌27:335(1999))。KD值可定義為飽和一半(50%)的OX40上結(jié)合位點所需要的OX40抗體濃度。本發(fā)明的OX40抗體包括能結(jié)合存在于體內(nèi)一種或多種細胞上，原代細胞分離物、傳代細胞、培養(yǎng)細胞和無限增殖化細胞中的OX40的抗體。能表達OX40的具體的非限制性細胞類型包括活化的和其他T細胞(如活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞)以及非T細胞。非T細胞的例子包括自然殺傷(NK)細胞、粒細胞(嗜中性白細胞)、單核細胞和B細胞。例如，通過用OX40編碼核酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細胞，可將不天然表達OX40的細胞制備為表達OX40的細胞。能結(jié)合OX40的OX40抗體可結(jié)合一種或多種表達或產(chǎn)生OX40的轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)化的細胞。本發(fā)明的抗體包括結(jié)合OX40并在體內(nèi)或體外(如在個體中)調(diào)節(jié)OX40功能或活性的抗體。如本文所使用的，當(dāng)涉及OX40活性或功能使用術(shù)語"調(diào)節(jié)"及其語法變化時，意指OX40活性或功能被可檢測地影響、改變或變化了。因此，調(diào)節(jié)OX40活性或功能的OX40抗體是一種可檢測地影響、改變或變化一種或多種OX40活性或功能的抗體，所述OX40活性或功能可包括例如OX40與OX40配體的結(jié)合、OX40介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)或OX40介導(dǎo)的或OX40可調(diào)節(jié)的細胞應(yīng)答，或如本文中所列的或其他已知或可知的另外的OX40活性或功能?？杀徽{(diào)節(jié)的多種非限制性的OX40活性和功能包括例如OX40介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)或OX40介導(dǎo)的或OX40可調(diào)節(jié)的細胞應(yīng)答、細胞增殖或擴增(如、淋巴細胞例如活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞)、細胞生存或凋亡(如淋巴細胞例如活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞)，細胞因子(如Thl、Th2和非Thl/Th2細胞因子)和干擾素表達或產(chǎn)生，抗凋亡蛋白或凋亡前體蛋白表達或產(chǎn)生，以及治療、預(yù)防或改善病癥、疾病、它們的生理狀態(tài)、病理和癥狀。特異性細胞因子調(diào)節(jié)包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL陽5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-14、IL-16、IL-17、IL-23、IL-26、TNF-a、干擾素y和GM-CSF(在體內(nèi)或體外)。特異性抗凋亡蛋白或凋亡前體蛋白表達包括但不限于Bcl-xL、Bcl-2、Bad和Bim。其他非限制性的可被調(diào)節(jié)的OX40活性和功能包括例如NF-kB激活、26PKB(Akt)活性維持以及存活蛋白的增量調(diào)節(jié)(Ambrosini等，Nat.Med.3:917(1997)和Song等，Immunitv22:621(2005》。因此，如本文所示的例證性的抗體包括調(diào)節(jié)一種或多種OX40調(diào)節(jié)的信號傳導(dǎo)或OX40調(diào)節(jié)的或誘導(dǎo)的細胞應(yīng)答、細胞增殖(如活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞)、細胞生存或凋亡(如活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞)，細胞因子(如Thl、Th2和其他非Thl/Th2細胞因子，如IL-17、IL-23和IL-26)和干擾素表達或產(chǎn)生如Thl、Th2、非Thl/Th2、IL-1、IL-2、IL畫4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-IO、IL-14、IL畫16、IL-17、IL-23、IL-26、TNF-a、干擾素y和GM-CSF(在體內(nèi)或體外)，抗凋亡蛋白或凋亡前體蛋白表達(如Bcl-xL、Bcl-2、Bad或Bim),和治療、預(yù)防或改善病癥、疾病、它們的病理和癥狀的抗體。在具體的方面中，本發(fā)明的抗體調(diào)節(jié)T細胞增殖或生存，調(diào)節(jié)活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞的數(shù)量，或耗竭活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞。在另外的具體方面中，本發(fā)明的抗體減少或耗竭特異于自身抗原(如髓磷脂堿蛋白(MBP)、髓磷脂少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)、含蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、膠原、滑膜關(guān)節(jié)組織抗原、胰島素、谷氨酸脫羧酶、腸抗原、甲狀腺抗原、組蛋白、肌肉抗原或皮膚抗原的自身反應(yīng)性T細胞的數(shù)量。涉及OX40抗體使用的術(shù)語"拮抗"及其語法變化意指OX40抗體減少、減弱、抑制、推延、阻止或封閉OX40與OX40配體結(jié)合，或減少、減弱、抑制、推延、阻止或封閉OX40活性或功能。涉及OX40抗體使用的術(shù)語"激動"及其語法變化意指OX40抗體刺激、增加、增強、促進或誘導(dǎo)OX40與OX40配體結(jié)合，或刺激、增加、增強、促進或誘導(dǎo)通過OX40所誘導(dǎo)的活性或功能。因此，本發(fā)明的OX40抗體包4舌拮抗抗體和激動抗體。例如，本發(fā)明的OX40拮抗抗體在體外或體內(nèi)封閉、減少、減弱、抑制或阻止一種或多種OX40活性或功能。在具體的實施方案中，提供了能封閉、減少、減弱、抑制或阻止OX40配體(OX40L)與可溶形式的OX40(CD134)或在活化T細胞表面上表達的OX40結(jié)合的OX40抗體。在另外的實施方案中，在溶解效應(yīng)細胞(如自然殺傷細胞、巨噬細胞或嗜中性白細胞)存在下，OX40抗體誘導(dǎo)EL4-人OX40表達細胞或活化的人T細胞溶解。在具體的方面中，取決于研究中的背景水平，在10(xg/ml抗體下誘導(dǎo)的特異性細胞溶解百分率(％)為約15-75%、25-65%或30-60%,并可高達100%。此外，溫育例證性的OX40抗體和與來自同種異體供體PBMC共培養(yǎng)的人外周血單核細胞(PBMC)能通過抑制同種異體反應(yīng)性的CD4和/或CD8T細胞從而減少細胞增殖。本發(fā)明的OX40抗體包括修飾形式，如取代(如氨基酸取代)、添加或缺失(如子序列或片段)，其可稱為"變體"。上述修飾的抗體形式和變體保留了參照OX40抗體如稱為112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5的OX40抗體的至少部分的功能或活性，如與OX40結(jié)合、或調(diào)節(jié)OX40的活性或功能(如OX40信號傳導(dǎo))。因此，修飾的OX40抗體例如可保留至少部分的OX40結(jié)合或調(diào)節(jié)一種或多種OX40功能或活性(如信號傳導(dǎo)、細胞應(yīng)答等)的能力。如本文所使用的，術(shù)語"修飾"及其語法變化意指組合物背離了參照組合物。與參照的未修飾蛋白、核酸或其他組合物相比，修飾的蛋白、核酸和其他組合物可具有更大或更小的活性或不同的功能。在具體的方面中，本發(fā)明修飾的抗體保留一種或多種調(diào)節(jié)T細胞增殖或生存，調(diào)節(jié)活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞的數(shù)量，或耗竭活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞的能力。在更進一步的具體方面中，本發(fā)明修飾的抗體保留一種或多種減少或耗竭特異于自身抗原的自身反應(yīng)性T細胞或特異于自身抗原(如髓磷脂堿蛋白(MBP)、髓磷脂少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)、含蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、膠原、滑膜關(guān)節(jié)組織抗原、胰島素、谷氨酸脫羧酶、腸抗原、曱狀腺抗原、組蛋白、肌肉抗原或皮膚抗原的B細胞產(chǎn)生抗體的數(shù)量的能力。在多個實施方案中,如SEQIDNOs:7-10和SEQIDNOs:44-49所示的抗體成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列在恒定區(qū)、互補決定區(qū)(CDR)或構(gòu)架區(qū)(FR)之內(nèi)或之外具有一個或多個氨基酸取代。在具體的方面中，氨基酸取代是在恒定區(qū)、互補決定區(qū)(CDR)或構(gòu)架區(qū)(FR)之內(nèi)或之外的保守取代。在另外的多個實施方案中，本發(fā)明的抗體與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的重鏈或輕鏈序列(SEQIDNOs:7-10或SEQIDNOs:44-49)具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性，或任何位于上述百分值之內(nèi)或包含上述百分值的數(shù)值或范圍。取代的殘基的典型數(shù)目包括1-3、3-5、5-10個氨基酸殘基，或任何位于上述值之內(nèi)或包含上述值的數(shù)值或范圍，或更多的氨基酸殘基。這樣的包括氨基酸取代的抗體可為核酸所編碼。因此，還提供了編碼包括氨基酸取代的抗體的核酸序列。術(shù)語"同一性"或"同一的"意指兩個或更多個參照實體是相同的。因此，當(dāng)兩條蛋白序列(如OX40抗體)是同一時，它們至少在參照區(qū)域或部分中具有相同的氨基酸序列。"同一性區(qū)域"指相同的兩個或更多個參照實體的一部分。因此，當(dāng)兩條蛋白序列在一個或多個序列區(qū)域范圍內(nèi)是同一時，它們在該區(qū)域內(nèi)享有同一性。"實質(zhì)的同一性，，意指分子是在結(jié)構(gòu)上或功能上保守的，使得其具有或預(yù)計具有一種或多種參照分子功能或活性的至少部分的功能或活性、或其享有性。因此，具有實質(zhì)的同一性的多肽(如OX40抗體)具有或預(yù)計具有參照多肽(如OX40抗體)的至少部分的活性或功能。例如，在一個具體的實施方案中，保留未修飾的OX40抗體的至少部分的活性或功能的具有一個或多個修飾(如氨基酸取代、缺失或添加)的OX40抗體祐匸認為具有與參照OX40抗體的實質(zhì)的同一性。由于結(jié)構(gòu)上和功能上相關(guān)的蛋白之間的差異，保留功能或活性所需要的序列同一性的值取決于該蛋白、區(qū)域和該區(qū)域的功能或活性。盡管對于蛋白而言，少至30%的氨基酸序列同一性能保留給定的活性或功能，但通常需要與參照序列更多的同一性如50%、60%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%的同一性?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的計算機程序和數(shù)學(xué)算法確定兩條序列之間的同一性程度。上述計算序列同一性(同源性)百分數(shù)的算法通常能解決在整個比對范圍內(nèi)的序列缺口和錯配。例如，BLAST(如BLAST2.0)搜索算法(參見如Altschul等，丄Mo/.215:403(1990)，公眾可通過NCBI獲得)具有如下的例證性搜索參數(shù)錯配-2;缺口打開5;缺口延伸2。對于多肽序列比對，BLASTP算法通常與評分矩陣如PAM100、PAM250、BLOSUM62或BLOSUM50結(jié)合使用。FASTA(如FASTA2和FASTA3)和SSEARCH序列比對程序也用于定量同一性的程度(Pearson等，A^/.^c"^t/&485:2444(1988);Pearson,Me&oAA/o/Ao/.132:185(2000);和Smith等，丄M/.腸/.147:195(1981))。還已開發(fā)了利用基于德洛內(nèi)(Delaunay)拓樸映射的用于定量蛋白結(jié)構(gòu)相似性的程序(Bostick等，說oc/zemS/o//7j^AmComm朋.304:320(2003》。"保守取代，，是一個氨基酸為生物學(xué)上、化學(xué)上或結(jié)構(gòu)上相似的殘基所取代。生物學(xué)上相似的意指該取代不破壞生物活性如OX40結(jié)合活性。結(jié)構(gòu)上相似的意指氨基酸具有相似長度的側(cè)鏈，如丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸，或具有相似大小的側(cè)鏈?；瘜W(xué)相似性意指殘基具有相同的荷電或都是親水或疏水的。具體的例子包括用一種疏水殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一種，或用一種極性殘基取代另一種，如用精氨酸取代賴氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺，用絲氨酸取代蘇氨酸等等。修飾的抗體還包括用一個或多個D-氨基酸取代L-氨基酸(及其混合物)，結(jié)構(gòu)和功能類似物，例如，具有合成或非天然的氨基酸或氨基酸類似物及衍生形式的肽模擬物。修飾包括環(huán)狀結(jié)構(gòu)如在分子的氨基和羧基末端之間的端對端的酰胺鍵或分子內(nèi)和分子間二硫鍵。氨基酸修飾的額外的具體的非限制性例子包括OX40子序列和片段。例證性的OX40子序列和片段包含本發(fā)明的例證性的OX40抗體與之結(jié)合的OX40序列的一部分。例證性的OX40子序列和片段還包括免疫原性部分，例如包括本發(fā)明的例證性的OX40抗體所結(jié)合的序列的OX40的一部分。根據(jù)本發(fā)明，提供了OX40抗體和編碼保留未修飾的或參照的OX40抗體的至少部分的功能或活性的OX40抗體子序列或片段的核酸。如本文所使用的，術(shù)語"子序列"或"片段"意指全長分子的一部分。與全長OX40相比，編碼OX40抗體的OX40抗體的子序列至少少一個氨基酸(如一個或多個內(nèi)部氨基酸或氨基或羧基末端的末端氨基酸缺失)。與全長OX40抗體相比，OX40抗體的子序列至少少一個氨基酸。與全長對照核酸序列相比，核酸子序列至少少一個核苷酸。因此，子序列可具有任何直至全長天然OX40的長度。本發(fā)明的OX40抗體子序列和片段包括如SEQIDNOs:7-10和SEQEDNOs:44-49所示的成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列。本發(fā)明的OX40抗體子序列和片段還包括Fab、Fab'和F(ab')2、Fv、Fd、單鏈Fv(scFv)、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)、Vl和Vh結(jié)枸域片段。OX40抗體子序列和片段可具有與全長抗體一樣的結(jié)合親和力，與全長抗體一樣的結(jié)合特異性，或與全長抗體一樣的一種或多種活性或功能，如OX40拮抗或激動抗體的功能或活性。當(dāng)涉及抗體時，術(shù)語"功能性子序列"和"功能性片段"意指保留至少一部分的與全長參照抗體一樣的一種或多種功能或活性如OX40抗體的功能或活性的抗體部分。例如，與OX40或OX40的片段結(jié)合的抗體子序列或片段被認為是功能性子序列?？山M合抗體子序列和片段。例如，可通過接頭序列連4妻VL或VH子序列，從而形成Vl-Vh嵌合體?？赏ㄟ^接頭序列連接單鏈Fvs(scFv)子序列的組合，從而形成scFv-scFv嵌合體。OX40抗體子序列和片段，包括單鏈抗體或單獨的可變區(qū)或可變區(qū)與其他OX40抗體子序列的全部或一部分的組合?？赏ㄟ^蛋白水解抗體制備抗體子序列和片段，例如，通過胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗體。通過胃蛋白酶酶切割產(chǎn)生的抗體子序列和片段提供了稱為F(ab')2的5S片段。使用硫醇還原劑可進一步切割該片段以產(chǎn)生3.5SFab'單價片段?？蛇x地，使用胃蛋白酶切割直接產(chǎn)生了兩條單價的Fab'片段和Fc片段(參見如美國專利號4,036,945和4,331，647;以及Edelman等，A/eAoA1:422(1967》。其他切割抗體的方法如分離重鏈以形成單價輕鏈-重鏈片段，進一步切割片段，或還可使用其他酶或化學(xué)方法?？赏ㄟ^遺傳方法產(chǎn)生蛋白和抗體及其子序列和片段。技術(shù)包括在宿主細胞如Cos細胞或大腸桿菌中表達所有或部分的編碼蛋白或抗體的基因。重組宿主細胞合成了全長序列或子序列，例如scFv(參見如Whitlow等,在Methods:ACompaniontoMethodsinEnzvmology2:97(1991)中，Bird等，242:423(1988);和美國專利號4,946,778)?？扇缑绹鴮＠?,946,778和5,258,498;Huston等，齒W《五"^mo/203:46(1991);Shu等，/Voc.A^".爿cadSc.90:7995(1993);以及Skerra等，240:1038(1988)中所述的產(chǎn)生單鏈Fvs和抗體。修飾的形式包括衍生的序列，例如氨基酸中游離氨基形成胺鹽酸化物、對曱苯磺酰基、千氧羰基；游離的羧基形成鹽、曱酯或乙酯；有理的羥基形成O-?；騉-烷基衍生物，以及天然存在的氨基酸衍生物，例如對于脯氨酸的4-羥基脯氨酸、對于賴氨酸的5-羥基賴氨酸、對于絲氨酸的高絲氨酸、對于賴氨酸的鳥氨酸等?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法來產(chǎn)生修飾(如基于PCR的位點定向、缺失和插入誘變，化學(xué)修飾和誘變，交聯(lián)等)。蛋白(如抗體)、核酸和其他組合物的修飾形式包括添加和插入。例如，添加可以是任何類型的分子與蛋白(如抗體)、核酸或其他組合物的共價或非共價連接。添加和插入通常賦予不同的功能或活性。添加和插入包括融合(嵌合)多肽或核酸序列，其是一種具有一個或多個與參照的天然(野生型)序列共價連接且不通常存在于該序列中的分子的序列。具體的例子是用于產(chǎn)生多功能蛋白(如多特異性抗體)的另一種蛋白(如抗體)的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體還包括具有與其共價連接以賦予截然不同或互補的功能或活性的一個或多個額外的結(jié)構(gòu)域的嵌合體和融合體?？贵w包括在自然界中非天然存在的其中兩條或多條氨基酸序列連接在一起的嵌合體或融合體。根據(jù)本發(fā)明，提供了OX40抗體和編碼包括異源結(jié)構(gòu)域的OX40抗體的核酸。異源結(jié)構(gòu)域可以是氨基酸添加或插入，但不限于氨基酸殘基。因此，異源結(jié)構(gòu)域可由多種不同類型的小的或大的功能部分的任何一種組成。上述部分包括核酸、肽、碳水化合物、脂類或小的有機化合物如藥物、金屬(金、銀)等。異源結(jié)構(gòu)域的具體的非限制例子包括例如標簽、可檢測的標記和細胞毒素劑。標簽和可4企測的標記的具體例子包括T7-、His-、myc-、HA-和FLAG-標簽；酶(辣根過氧化物酶、脲酶、過氧化氬酶、堿性磷酸酶、卩-半乳糖苷酶、氯霉素轉(zhuǎn)移酶)；酶底物；配體(如生物素)；受體(抗生物素蛋白)；放射性核素(如C14、S35、P32、P33、H3、1125和1131);高電子密度試劑；能量傳遞分子；順磁標記；熒光團(熒光素、若丹明、藻紅蛋白)；發(fā)色團；化學(xué)發(fā)光劑(咪唑、熒光素酶)和生物發(fā)光劑。細胞毒素劑的具體例子包括白喉毒素、霍亂毒素和蓖麻毒素。接頭序列可插入蛋白(如抗體)、核酸或其他組分之間，該添加或插入(如異源結(jié)構(gòu)域)使得這兩個實體至少部分保持各自的功能或活性。接頭序列克具有一種或多種特性，包括柔性結(jié)構(gòu)、不能形成有序的二級結(jié)構(gòu)或疏水或荷電特性，其能促進或影響任何一個結(jié)構(gòu)域。典型地見于柔性蛋白區(qū)中氨基酸包括甘氨酸、天冬酰胺和絲氨酸。其他接近中性的氨基酸如蘇氨酸和丙氨酸也可用于接頭序列中。接頭序列的長度可以改變(參見如美國專利號6,087,329)。接頭進一步包括化學(xué)交聯(lián)劑和綴合劑，例如磺基琥珀酰亞胺衍生物(磺基-SMCC、磺基-SMPB)、二琥珀酰亞胺基辛二酸酯(DSS)、二琥珀酰亞胺基戊二酸酯(DSG)和二琥珀酰亞胺基酒石酸酯(DST)。更多的添加的例子包括糖基化、脂肪酸、脂類、乙酰化、磷酸化、酰胺化、甲酰化、遍在蛋白化和通過保護或封端基團以及諸多化學(xué)修飾中任何一種的衍生化。其他轉(zhuǎn)變和可能性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，并被認為處于本發(fā)明的范圍內(nèi)?？墒褂弥亟MDNA技術(shù)通過細胞表達或體外翻譯制備上述修飾的序列。還可使用本領(lǐng)域已知方法通過化學(xué)合成產(chǎn)生多肽和核酸序列，例如自動化肽合成裝置(參見如AppliedBiosystems,FosterCity,CA)?？赏ㄟ^多種標準的蛋白純化或重組表達技術(shù)的任何一種產(chǎn)生適于產(chǎn)生抗體的OX40蛋白。例如，可通過標準的肽合成技術(shù)如固相合成產(chǎn)生OX40序列。蛋白的一部分可含有諸如T7標簽或多組氨酸序列的氨基酸序列以利于純化表達或合成的蛋白。蛋白可在細胞中被表達并純化。蛋白可通過重組方法作為更大的蛋白(如融合或嵌合蛋白)的一部分^皮表達。產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，OX40或其免疫原性片段，任選地綴合有載體如匙孔血藍蛋白(KLH)或卵白蛋白(如BSA)或與佐劑如弗氏完全或不完全佐劑混合，并用于免疫接種動物。使用雜交瘤技術(shù)，可分離來自應(yīng)答OX40的經(jīng)免疫動物的脾細胞并與骨髓瘤細胞融合?？筛鶕?jù)與OX40或其免疫原性片段的反應(yīng)性篩選通過雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體?？擅庖呓臃N的動物包括靈長類動物、小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、?；螂嗍??？赏ㄟ^靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑進行初次免疫接種和任何可選的后繼免疫接種。此外，為增強免疫應(yīng)答，可將抗原與另一種蛋白如卵白蛋白或匙孔血藍蛋白(KLH)、甲狀腺球蛋白和破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)，或與佐劑如弗氏完全或不完全佐劑混合。可通過腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)或皮下途徑進行初次免疫接種和任何可選的后繼33免疫接種。可用相同或不同濃度的OX40制品進行后繼免疫接種，間隔可以是定期或不定期的。動物包括那些經(jīng)遺傳修飾以包括人基因座位，可用于產(chǎn)生人抗體的動物。具有一個或多個人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物描述于例如美國專利號5,939,598、WO02/43478和WO02/092812中。使用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)，可分離來自抗原高應(yīng)答個體的免疫接種小鼠的脾細胞并與骨髓瘤細胞融。可獲得與OX40結(jié)合的單克隆抗體。描述了用于產(chǎn)生人多克隆抗體和人單克隆抗體的其他方法(參見如Kuroiwa等，Ato.Ao&c/mo/.20:889(2002);WO98/24893;WO92/01047;WO96/34096;WO96/33735;美國專利號5，413,923;5,625,126;5,633,425;5,569,825;5,661,016;5,545,806;5,814,318;5,885,793;5,916,771和5,939,598)。當(dāng)涉及抗體使用術(shù)語"人，，時，意指該抗體的氨基酸序列完全是人的，即人重鏈和人輕鏈可變區(qū)和人恒定區(qū)。因此，所有的氨基酸都是人的或存在于人抗體中。通過用人抗體中存在的氨基酸殘基取代非人氨基酸殘基，可將非人抗體制備位全人抗體。本領(lǐng)域已知存在于人抗體中氨基酸殘基、CDR區(qū)作圖和人抗體共有殘基(參見如Kabat,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.第4版,USDepartmentofHealthandHumanServices.PublicHealthService(1987》Chothia和Lesk(1987))?；谡{(diào)查22種已知的人VHIII序列的人VH亞組III的共有序列以及基于調(diào)查30種已知的人KI序列的人V^K-鏈亞組I的共有序列描述于PadlanA^/./mmw"o/.31:169(1994)以及PadlanA/o/./wmw"o/.28:489(1991)中。因此，人抗體包括其中一個或多個氨基酸殘基已被一個或多個存在于任何其他人抗體中的氨基酸取代的抗體。OX40抗體包括可使用本領(lǐng)域已知技術(shù)產(chǎn)生的人源化抗體，所述技術(shù)包括例如CDR-嫁接(EP239，400;W091/09967;美國專利號5,225,539;5,530,101和5,585,089)、鑲嵌或重建(EP592,106;EP519,596;Padlan，Mo/ecw/"r/附附wwo/.28:489(1991);Studnicka等，尸rofe/w五"g/"een"g7:805(1994);Roguska.等，/Voc.Ato7Jcad91:969(1994))和鏈改組(美國專利號5,565,332)。之前人共有序列(Padlan,M>/./歸譜/.31:169(1994);和Padlan，她/./畫,/.28:489(1991》已被用于產(chǎn)生人源化抗體(Carter等，尸nc.Ato/.爿cadS"89:4285(1992);和Presta等，J./畫,/.151:2623(1993))。當(dāng)涉及抗體使用術(shù)語"人源化的"時，意指抗體的氨基酸序列具有在受體人免疫球蛋白分子中特異性結(jié)合期望抗原的一個或多個互補決定區(qū)(CDRs)的非人氨基酸殘基(如小鼠、大鼠、山羊、兔等)，以及Fv構(gòu)架區(qū)(FR)中的一個或多個人氨基酸殘基，所述人氨基酸殘基是側(cè)接CDR的氨基酸殘基。除受體人免疫球蛋白分子和構(gòu)架區(qū)氨基酸殘基可以是除任何人殘基之外的任何靈長類動物的氨基酸殘基(如類人猿、長臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、獼猴)之外，稱為"靈長類化的"抗體處于"人源化的，，抗體的含義中。免疫球蛋白的人FR殘基可為相應(yīng)的非人殘基所取代。因此，例如CDR或人構(gòu)架區(qū)中的殘基可為來自供體抗體的非人CDR或構(gòu)架區(qū)的相應(yīng)殘基所取代以改變，通常是改善抗原親和力或特異性。人源化抗體可包括既不見于人抗體也不見于供體CDR或構(gòu)架序列的殘基。例如，并不見于人抗體或供體非人抗體的特定位置的FR取代可預(yù)計能改善在該位置人抗體的結(jié)合親和力或特異性。基于分子模建的抗體構(gòu)架和CDR取代是本領(lǐng)域眾所周知的，如通過模建CDR和構(gòu)架殘基的相互作用以鑒定對于抗原結(jié)合起重要作用的構(gòu)架殘基以及進行序列比較以鑒定在特定位置稀有的構(gòu)架殘基(參見如美國專利號5,585,089和Riechmann等.A^wre332:323(1988))。OX40抗體包4舌嵌合抗體。如本文中所4吏用的，當(dāng)涉及抗體使用術(shù)語"嵌合"及其語法變化時，意指抗體的氨基酸序列含有一個或多個來源于、獲得或分離自、或基于兩種或更多種不同物種的部分。例如，抗體的一部分可以來自人(如恒定區(qū))以及抗體的另一部分可以來自非人(如鼠重鏈或鼠輕鏈可變區(qū))。因此，嵌合抗體的一個例子是一種其中抗體的不同部分為不同物種來源的抗體。不同于人源化或靈長類用于產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的(如Morrison,S"e臟229:1202(1985);Oi等，腸rec—廳4:214(1986);Gillies等，丄/mmw"o/.A/e//zoA125:191(1989);以及美國專利號5,807,715;4,816,567和4,816,397)。例如在Munro,A^fwe312:597(1984);Neuberger等，312:604(1984);Sharon等，A^we309:364(1984);Morrison等，Ato7.爿c"dS"V&481:6851(1984);Bouhanne等，iV"fwe312:643(1984);Capon等，A^wre337:525(1989);和Traunecker等，339:68(1989)中描述了其中來自一種物種抗體的可變區(qū)被另一種物種的可變區(qū)所取代的嵌合抗體。還可使用雜交瘤技術(shù)、重組技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)或它們的組合產(chǎn)生OX40抗體(參見美國專利號4,902,614,4,543,439和4,411,993;還參見MonclonalAntibodies.Hvbridomas:ANewDimensioninBiologicalAnalyses.PlenumPress,Kennett,McKearn和Bechtol(編),1980,以及Harlow等，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版,1988)?；?、非變:生凝膠純化、HPLC或RP-HPLC、大小4;且、在蛋白A、柱上純化、或這些技術(shù)的任何組合?？墒褂肊LISA測定法測定OX40抗體同種型，例如可使用鼠Ig-吸附的抗-人Ig鑒定人Ig?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的多種標準的蛋白純化或重組表達技術(shù)中的任何一種來產(chǎn)生適于產(chǎn)生抗體的OX40。適于產(chǎn)生免疫應(yīng)答的OX40的形式包括OX40子序列如免疫原性片段。另外的OX40的形式包括OX40表達細胞、含有OX40的制品或細胞提取物或級分、部分純化的OX40。根據(jù)本發(fā)明，提供了表達OX40抗體、其子序列和片l更以及編碼本發(fā)明的OX40抗體、子序列和片段的核酸的分離或純化的細胞。在一個實施方案中，分離的細胞表達具有稱為112F32、112V8、112Y131、U2Y55或U2Z5的抗體的可變區(qū)氨基酸序列的抗體。在另一個實施方案中，分離的細胞表達具有與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體相同的結(jié)合特異性的抗體。在一個更進一步的施方案中，分離的抗體表達與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體竟?fàn)幗Y(jié)合OX40的抗體。在一個另外的實施方案中，分離的細胞表達與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體相比，具有更大或更小的對OX40結(jié)合親和力的抗體。在具體的方面中，對OX40的結(jié)合親和力在由稱為112F32、112V8、U2Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的約1-5000倍范圍內(nèi)。在另外的具體方面中，對OX40的結(jié)合親和力在由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細月包系所產(chǎn)生的抗體的約KD10-6M-約KD10-13M范圍內(nèi)。本發(fā)明的表達OX40抗體、其子序列和片段，以及編碼OX40抗體、其子序列和片段的核酸的分離或純化的細胞的具體的非限制性例子包括脾細胞、雜交瘤細胞和CHO細胞。分離或純化的細胞可以是來自原代細胞分離物(如脾細胞)、次級細胞或傳代細胞分離物、或已建立的或無限增殖化的細胞培養(yǎng)物(雜交瘤或CHO細胞)的多個細胞或一群細胞。根據(jù)本發(fā)明，進一步提供了產(chǎn)生特異性結(jié)合OX40的抗體的方法。在一個實施方案中，一種用于產(chǎn)生OX40抗體的方法包括給予能表達人免疫球蛋白的動物(如轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)基因牛)任選地綴合有人Fc重組蛋白的人0X40、子序列或片段(如OX40胞外域)，篩選表達人OX40抗體的動物，以及選擇產(chǎn)生人OX40抗體的動物，從所選擇的動物中分離抗體。在一方面中，該方法確定人OX40抗體是否具有OX40拮抗或激動活性。根據(jù)本發(fā)明，額外提供的是產(chǎn)生抑制或阻止OX40結(jié)合OX40配體(OX40L)的人OX40抗體的方法。在一個實施方案中，一種用于產(chǎn)生人OX40抗體的方法包括給予能表達人免疫球蛋白的動物(如轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)基因牛)任選地綴合有人Fc重組蛋白的0X40、子序列或片段(如OX40胞外域)，篩選表達人OX40抗體的動物，選擇產(chǎn)生人OX40抗體的動物，以及A人所選擇的產(chǎn)生人OX40抗體的動物中分離抗體。配體(OX40L)。根據(jù)本發(fā)明，提供了表達OX40抗體的非人轉(zhuǎn)基因動物，所述OX40抗體具有一種或多種下列特征a)相同于由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體；b)結(jié)合由稱為112F32、U2V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體所針對的OX40胞外域氨基酸序列中的表位；c)具有在由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的約1-5000倍范圍內(nèi)的OX40結(jié)合親和力；d)具有在由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的約KD10—6M-約KD10"2M范圍內(nèi)的OX40結(jié)合親和力；e)具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性；或f)與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細;9包系所產(chǎn)生的抗體竟?fàn)幗Y(jié)合0X40。根據(jù)本發(fā)明，還提供了編碼OX40抗體、其子序列和片段的分離或純化的核酸。在多個實施方案中，核酸序列編碼如SEQIDNOs:7-10和SEQIDNOs:44-49所示的成熟的重4連或輕鏈可變區(qū)序列的序列，或其子序列。在另外的實施方案中，核酸序列包含SEQIDNOs:3-6和SEQIDNOs:38-43及其子序列的任一。在另外的實施方案中，核酸序列包含SEQIDNOs:3-6和SEQIDNOs:38-43及其子序列任一的簡并序列。核酸可以具有不同的長度。編碼本發(fā)明的OX40抗體或其子序列的核酸的長度通常為約100-600個核苷酸、或在上述長度之內(nèi)或包含上述長度的任何數(shù)值或范圍，100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、或約550-600個核普酸、或在上述長度之內(nèi)或包含上述長度的任何數(shù)值或范圍。與編碼本發(fā)明的OX40抗體或其子序列的核酸特異性雜交的核酸的長度通常為約10-20、20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-600個核苷酸，或在上述長度之內(nèi)或包含上述長度的任何數(shù)值或范圍。術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"指通過磷酸酯鍵連接的至少兩個或更多個核糖核酸或脫氧核糖核酸堿基對(核苷酸)或等價物。核酸包括多核苷酸和多核苷。核酸包括單鏈、雙鏈或三鏈、環(huán)形或線性分子。例證性的核酸包括但不限于RNA、DNA、cDNA、基因組核酸、天然存在或非天然存在的核酸，如合成的核酸。短的核酸和多核普酸(如10-20個、20-30個、30-50個、50-100個核苦酸)通常稱為"寡核苷酸"或單鏈或雙鏈DNA的"探針，，。提供了編碼具有如SEQIDNOs:7-10和SEQIDNOs:44-49任一所示的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列經(jīng)一個或多個氨基酸殘基取代、添加或缺失的氨基酸序列的核酸。在一個實施方案中，經(jīng)取代、添加或缺失的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列具有針對OX40胞外域表位的結(jié)合親和力。在另一個實施方案中，經(jīng)取代、添加或缺失的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的活性，例如調(diào)節(jié)OX40的功能或活性。本發(fā)明提供了與編碼由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的OX40抗體的全部或子序列的核酸雜交的核酸，其至少80-90%互補或同源于編碼由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細^9包系所產(chǎn)生的抗體的全部或子序列或片段的核酸序列。在一個實施方案中，該核酸序列具有約10-20、20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-600個核苷酸的長度，或在上述長度之內(nèi)或包含上述長度的任何數(shù)值或范圍。在具體的方面中，核酸序列與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列或其部分(如CDR、FR等)雜交。術(shù)語"雜交"及其語法變化指在核酸序列之間的結(jié)合。雜交序列通常與編碼參照(如OX40抗體)序列的氨基酸序列的核酸會具有大于約50%的同源性。在雜交序列之間的雜交區(qū)通常為至少約12-15個核苷酸、15-20個核苦酸、20-30個核菩酸、30-50個核普酸、50-100個核普酸、100-200個、300-400個核苷酸或更多，或在上述長度之內(nèi)或包含上述長度的任何數(shù)值或范圍。核酸序列進一步包括核苦酸和核苷取代、添加和缺失，以及衍生形式和融合/嵌合序列(如編碼與異源結(jié)構(gòu)域融合的OX40抗體)。例如，由于遺傳密碼的簡并性，核酸包括對于編碼由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55和112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的核酸簡并的序列和子序列。其他的例子是與編碼由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體、其子序列和片段的序列互補的核酸?？墒褂枚喾N標準的克隆和化學(xué)合成技術(shù)產(chǎn)生核酸。技術(shù)包括但不限于核酸擴增，如利用能退火至抗體編碼序列的引物(如簡并引物混合物)，采用基因組DNA或cDNA耙的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。還可通過化學(xué)合成(如固相亞磷酰胺合成)或由基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生核酸。然后，可在體外翻譯所產(chǎn)生的序列，或?qū)⑺a(chǎn)生的序列克隆入質(zhì)粒中并增殖，接著在細月包中(如宿主細胞例如酵母或細菌、真核細胞例如動物或哺乳動物細胞或在植物中)表達。根據(jù)本發(fā)明，進一步提供了包括載體的本發(fā)明的核酸序列。在一個實施方案中，載體包括編碼OX40抗體、其子序列或片段的核酸序列。在具體的實施方案中，載體包括編碼由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55和112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體，其子序列或片段任一的核酸序列。載體是通過插入或摻入核酸能被操作的媒介物。載體包括質(zhì)粒、病毒、原核(細菌)和真核(植物、真菌、哺乳動物)載體。載體可用于體外或體內(nèi)表達核酸。這樣的載體被稱為"表達載體"，可用于導(dǎo)入核酸，包括編碼OX40抗體、其子序列和片段的核酸，并在體外(如在溶液中或在固相中)、細胞中或個體體內(nèi)表達所編碼的蛋白。載體還可用于核酸操作。對于遺傳操作而言，可使用"克隆載體"，并在體外(如在溶液中或在固相中)、細胞中或個體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄或翻譯所插入的核酸。載體通常含有用于在細胞中進行體外或體內(nèi)增殖的復(fù)制起點。適當(dāng)時，包括存在于載體中的表達控制元件在內(nèi)的控制元件可包含于載體中以利于轉(zhuǎn)錄和翻譯。載體可包括選擇標記。"選擇標記"是一種容許對含有該基因細胞進行選擇的基因。"正選擇，，指在暴露于正選擇條件下選擇含有選擇標記的細胞的過程。藥物抗性是含有該標記的正選沖奪標記細胞在含有藥物的培養(yǎng)基中將生存而缺少該標記的細胞將死亡的一個例子。選擇標記包括藥物抗性基因如恥o,其賦予對G418的抗性；/zygr，其賦予對潮霉素的抗性；和其賦予對噪呤霉素的抗性。其他正選擇標記基因包括容許鑒定或篩選含有該標記的細胞的基因。這些基因包括編碼熒光蛋白(GFP和GFP-樣發(fā)色團、熒光素酶)的基因、lacZ基因、堿性磷酸酶基因和表面標志如CD8等。"負選擇"指在暴露于適有單純皰滲病毒胸苷激酶(//5卜^:)基因的細胞(^^^61等，Cellll:223(1977))對藥物更昔洛韋(GANC)敏感。同樣地，g/^基因使細胞對6-硫代黃嘌呤敏感。病毒載體包括基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的那些載體(用于感染分裂和不分裂的細胞的慢病毒)、泡沫病毒(美國專利號5,624,820，5,693,508,5,665,577,6,013,516和5,674,703;WO92/05266和W092/14829)、腺病毒(美國專利號5,700,470,5,731,172和5,928,944)、腺伴隨病毒(AAV)(美國專利號5,604,090)、單純皰疹病毒載體(美國專利號5,501,979)、基于巨細胞病毒(CMV)的載體(美國專利號5,561,063)、呼腸孤病毒、輪狀病毒基因組、猿猴病毒40(SV40)或乳頭狀瘤病毒(Cone等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6349(1984);EukarvoticViralVectors,ColdSpringHarborLaboratory,Gluzman編，1982;Sarver等，Mol.Cell.Biol.1:486(1981);美國專利號5,719,054)。腺病毒能有效地感染緩慢復(fù)制的細胞和/或終末分化細胞并可用于靶向緩慢復(fù)制的細胞和/或終末分化細胞。其他用于表達的病毒載體包括細小病毒、諾瓦克病毒、冠狀病毒、副粘病毒和桿狀病毒、披膜病毒(如辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒)以及水泡性口膜炎病毒(VSV)。當(dāng)核酸與表達控制元件可操作連接時，包含該核酸的載體可4皮表達。術(shù)語"可操作連接，，指在所提及的元件之間一種容許它們能以它們所預(yù)期的方式進行操作的物理或功能上的關(guān)系。因此，核酸"可操作連接"表達控制元件意指該控制元件調(diào)節(jié)核酸轉(zhuǎn)錄以及適當(dāng)時調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物的翻譯。"表達控制元件"或"表達控制序列"是影響可操作連接的核酸表達的多核苷酸。啟動子和增強子是表達控制元件和序列的具體的非限制性例子。"啟動子"是一種能啟動下游(3'方向)核酸序列轉(zhuǎn)錄的順式作用DNA調(diào)節(jié)區(qū)。啟動子序列包括促進轉(zhuǎn)錄啟動的核苷酸。增強子也調(diào)節(jié)核酸表達，但能在遠離其可操作連接的核酸的轉(zhuǎn)錄起始位點處起作用。無論位于核酸的5'或3'末端，還是在核酸內(nèi)部(如內(nèi)含子或編碼序列)，增強子都能起作用。額外的表達控制元件包括前導(dǎo)序列和融合配偶體序列，用于創(chuàng)建多基因的內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(IRES)元件，或用于內(nèi)含子、維持正確基因讀框以使mRNA進行符合讀框的翻譯的多順反子、信使、剪接信號，提供給目標轉(zhuǎn)錄物適當(dāng)?shù)亩嘞佘账岬亩嘞佘账峄盘柡徒K止密碼子。表達控制元件包括其中可操作連接的核酸的轉(zhuǎn)錄發(fā)生無需信號或刺激物的"組成型"元件。賦予表達響應(yīng)于增加或減少可操作連接的核酸表達的信號或刺激物的表達控制元件是"可調(diào)節(jié)的，，。增加響應(yīng)于信號或刺激物的可操作連接的核酸表達的可調(diào)節(jié)的元件稱為"誘導(dǎo)型元件"。減少響應(yīng)于信號或刺激物的可操作連接的核酸表達阻遏型元件"(即該信號減少表達；當(dāng)除去信號或不存在信號時，表達增加)。對于細菌表達，組成型啟動子包括T7,以及誘導(dǎo)型啟動子如噬菌體X的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合啟動子)。在昆蟲細胞系統(tǒng)中，可使用組成型或誘導(dǎo)型啟動子(如蛻皮激素)。在酵母中，組成型啟動子包括例如ADH或LEU2,以及i秀導(dǎo)型啟動子如GAL(參見如Ausubel等,在CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.2,Ch.13,纟扁專專，GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience，1988中；Grant等，在MethodsinEnz觀ologv.153:516-544(1987),編輯.Wu&Grossman,1987,Acad.Press,N.Y.中；Glover,DNACloning.Vol.II,Ch.3,IRLPress,Wash.,D.C.,1986;Bitter,在MethodsinE畫mologv,152:673-684(1987)，編輯.Berger&Kimmel,Acad.Press,N.Y.中；和Strathern等,TheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomvces編輯.ColdSpringHarborPress,Vols.I和II(1982))。對于哺乳動物表達，可使用病毒或其他來源的組成型啟動子。例如CMV、SV40或病毒長末端重復(fù)(LTRs)等等，或使用來源于哺乳動物細胞基因組(如金屬硫蛋白IIA啟動子；熱休克啟動子、類固醇/曱狀腺激素/視黃酸應(yīng)答元件)或乳動物病毒(如腺病毒晚期啟動子；小鼠乳腺瘤病毒LTR)的誘導(dǎo)型啟動子。表達控制元件包括在特定組織或細胞類型中具有活性的元件，稱為"組織特異性表達控制元件"。在特定細胞或組織類型中組織特異性表達控制元件通常是更具活性，這是因為與其他細胞或組織類型相比，它們?yōu)樵谔囟毎蚪M織類型中的轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白或其他具有活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物所識別。上述表達控制元件的具體的非限制性例子是啟動子如己糖激酶II、COX-2、曱胎蛋白、癌胚抗原、DE3/MUC1、前列腺特異性抗原、C-erB2/neu、依賴于葡萄糖的促胰島素多肽(GIP)、端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶和低氧反應(yīng)性啟動子。根據(jù)本發(fā)明，提供了用本發(fā)明的OX40核酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。宿主細胞包括但不限于原核和真核細胞如細菌、真菌(酵母)、植物、昆蟲和動物(如哺乳動物，包括靈長類動物和人)細胞。轉(zhuǎn)化細胞的非限制性例子包括用重組噬菌體核酸、質(zhì)粒核酸或粘粒核酸表達載體轉(zhuǎn)化的細菌；用重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；用重組病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)感染的或用重組質(zhì)粒表達載體(如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞；用重組病毒表達載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞；以及用重組病毒表達載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的動物細胞或工程化以穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)化的動物細胞。表達OX40抗體及其子序列和片段的哺乳動物宿主細胞的非限制性例子包括CHO細胞。宿主細胞可以是來自原代細胞分離物、次級細胞或傳代細胞分離物、或已建立的或無限增殖化的細胞培養(yǎng)物的多個細胞或一群細胞。當(dāng)涉及細胞(如宿主細胞)或生物體使用術(shù)語"轉(zhuǎn)化的"或"轉(zhuǎn)染的"時，意指在將異源分子如蛋白或核酸(如轉(zhuǎn)基因)整合入細胞后細胞中的遺傳改變。因此，"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn)化的"細胞是一種異源分子業(yè)已經(jīng)由操縱如通過重組DNA技術(shù)導(dǎo)入其中或其后代中的細胞。核酸或蛋白可在細胞及其后代中穩(wěn)定地或瞬時地轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化(表達)。細胞可被增殖并表達所導(dǎo)入的蛋白或轉(zhuǎn)錄核酸。由于在復(fù)制過程中可能發(fā)生突變，因此轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細胞的后代可以不同于親本細胞。典型地，細胞轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化使用了載體。載體可包含于病毒顆?；蛐∨葜胁⑷芜x地通過結(jié)合靶細胞配體或受體的在顆?；蛐∨荼砻嫔纤牡鞍讖亩邢蛱囟毎愋?。因此，病毒顆?；蛐∨葑陨砘虿《颈砻嫔系牡鞍卓墒拱屑毎苡糜隗w外、離體或體內(nèi)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。因此，包括了在體外、體內(nèi)和離體遞送至細胞、組織或器官中的病毒和非病毒載體工具。還可通過本領(lǐng)域已知的方法如滲透壓休克(如磷酸4丐)、電穿孔、顯微注射、細胞融合等將核酸導(dǎo)入耙細胞(如宿主細胞)中。還可使用其他技術(shù)完成核酸和多肽的體外、離體和體內(nèi)導(dǎo)入。例如，使用聚合物如聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚烯吡酮、乙烯乙酸乙烯酯、曱基纖維素、羧甲基纖維素、硫酸精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚交酯/乙交酯共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。例如分別或在膠體體系中通過利用羥曱基纖維素或明膠-微膠嚢，或聚(曱基丙烯酸曱S旨)微膠嚢，可將核酸包埋在通過凝聚技術(shù)或界面聚合制備的微膠嚢中。膠體分散體系包括大分子絡(luò)合物、納米膠嚢、微球、珠子和基于脂質(zhì)的體系，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。用于將多種組合物導(dǎo)入細胞中的脂質(zhì)體是本領(lǐng)域已知的，并包括例如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(lipofectin)和DOTAP(如美國專利號4,844,904,5,000,959,4,863,740和4,975,282;以及GIBCO-BRL,Ga池ersburg,Md)。還已知用于基因治療的基于的兩親陽離子脂質(zhì)的哌嗪(參見如美國專利號5,861,397)。陽離子脂質(zhì)體系也是已知的(參見如美國專利號5,459,127)。聚合物、微膠嚢和膠體分散體系如脂質(zhì)體在此一并稱為"嚢泡(vesicles)"。本發(fā)明的OX40抗體在包括臨床和診斷方法的處理、治療和診斷應(yīng)用中是有用的。例如，在急性或慢性移植物抗宿主病(GVHD)的小鼠模型中，當(dāng)人PBMC轉(zhuǎn)移到受輻射的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中時，當(dāng)人抗-人OX40拮抗抗體在疾病發(fā)作前或發(fā)作后給予時減少了人T細胞數(shù)量和疾病病理。因此，本發(fā)明的OX40抗體能減輕、減少或預(yù)防急性或慢性異種移植物宿主疾病模型中的移植物抗宿主病(GVHD)癥狀；并使急性或慢性異種移植物宿主疾病模型(如免疫缺陷型(SCID)小鼠)中的移植物抗宿主病緩解或消退。本發(fā)明的抗體還能通過自然殺傷細胞誘導(dǎo)OX40表達細胞的溶解。盡管并不希望受任何理論約束，但OX40表達細胞的溶解可能是由于抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。因此，本發(fā)明的OX40抗體在能服從或可順利地應(yīng)答于通過調(diào)節(jié)OX40活性或功能的病癥和疾病的處理或治療中是有用的。因而，OX40拮抗抗體可用于治療能服從或可能順利地應(yīng)答于減少、減弱、抑制、阻止或阻斷OX40活性或功能的病癥、疾病、它們的生理狀態(tài)、病理和癥狀，而OX40激動抗體則可用于治療能"良/人或可能順利地應(yīng)答于刺激、增加、增強、促進或誘導(dǎo)OX40活性或功能的病癥、疾病、它們的生理狀態(tài)、病理和癥狀。根據(jù)本發(fā)明，提供了治療與不合需要的或異常的免疫應(yīng)答相關(guān)的病癥、疾病、癥4象、病理和不利癥狀或異常的方法。如本文所〗吏用的，"不合需要的免疫應(yīng)答"或"異常的免疫應(yīng)答"指任何大于或小于所需要的或生理學(xué)上正常的免疫應(yīng)答、活性或功能。不合需要的免疫應(yīng)答、功能或活性可以是正常的應(yīng)答、功能或活性。因此，正常的免疫應(yīng)答只要它們是不合需要的，即使不被認為是異常的，都包括在這些術(shù)語的含義中。不合需要的免疫應(yīng)答、功能或活性也可以是異常的應(yīng)答、功能或活性。異常的(反常的)免疫應(yīng)答、功能或活性背離了正常的免疫應(yīng)答、功能或活性。不合需要的和異常的免疫應(yīng)答可以是慢性或急性的體液應(yīng)答、細胞介導(dǎo)的應(yīng)答或它們的組合。不合需要的和異常的免疫應(yīng)答的一個例子是高應(yīng)答性的免疫應(yīng)答，如在自身免疫性病癥或疾病(如自身免疫性)情況下的免疫應(yīng)答。不合需要的和異常的免疫應(yīng)答的另一個例子是其中導(dǎo)致任何組織或器官中急性或慢性炎癥的免疫應(yīng)答。不合需要的和異常的免疫應(yīng)答的又一個例子是其中導(dǎo)致細胞、組織或器官破壞的免疫應(yīng)答，如移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫性病癥或疾病或炎癥。不合需要的和異常的免疫應(yīng)答的還一個例子是低應(yīng)答性的免疫應(yīng)答，如對抗原的應(yīng)答低于所需要的，如出現(xiàn)耐受性。因此，不合需要的和異常的免疫應(yīng)答包括取決于病癥或疾病的特征在于生理狀態(tài)、病理和不利癥狀或異常的慢性和急性免疫病癥和疾病。本發(fā)明適用的免疫病癥和疾病的具體的非限制性例子包括移植物抗宿主病(GVHD)、移植排斥、自身免疫性疾病和炎癥。根據(jù)本發(fā)明，提供了至少部分基于OX40抗體調(diào)節(jié)OX40活性或功能的能力的體內(nèi)處理和治療方法。在具體的治療方法的實施方案中，能服從于或可響應(yīng)于用本發(fā)明的OX40抗體處理或治療的病癥、疾病、生理狀態(tài)、病理和癥狀包括例如'f曼性或急性免疫性疾病或病癥。在更多的治療方法的實施方案中，能服從于用本發(fā)明的OX40抗體處理或治療的病癥、疾病、生理狀態(tài)、病理和癥狀包i舌例如炎癥、移檔L排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫性病癥或疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病(如胰島素依賴型糖尿病、IDDM、I型糖尿病)、克羅恩氏病(CD)、炎性腸病(IBD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、乳糜瀉、銀屑病、全身性紅斑狼瘡(SLE)、增生性狼瘡性腎炎、肉芽腫性肌病、多發(fā)性肌炎和不合需要的或異常的OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了其中OX40抗體、子序列或片段用于減輕、減少、抑制、預(yù)防和阻斷慢性或急性免疫性疾病或病癥、炎癥、移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)或自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病(如胰島素依賴型糖尿病、IDDM、I型糖尿病)、克羅恩氏病(CD)、炎性腸病(IBD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、乳糜瀉、銀屑病、全身性紅斑狼瘡(SLE)、增生性狼瘡性腎炎、肉芽胂性肌病、多發(fā)性肌45炎或不合需要的或異常的OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答，治療和減輕、減少、抑制、預(yù)防和阻斷氣道高反應(yīng)性/超敏反應(yīng)(如哮喘、變應(yīng)性哮喘)以及其他組織和器官中的肺部炎癥的方法。根據(jù)本發(fā)明可治療的移植物抗宿主病癥狀的具體的非限制性的例子是體重減輕、脫發(fā)、皮滲、血尿、腹水和肝、腸道、肺、皮膚中炎性細胞浸潤和死亡。OX40抗體還可用于減輕、減少、抑制、預(yù)防和阻斷出現(xiàn)在肺、關(guān)節(jié)、肌肉、皮膚、中樞或末梢神經(jīng)系統(tǒng)或腸中的炎癥。OX40抗體能額外地用于減輕、減少、抑制、預(yù)防和阻斷因個體對傳染物(如細菌、病毒或寄生性傳染物)的反應(yīng)所引起的炎癥。能用OX40抗體處理或治療的額外的病癥包括例如骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、腦脊髓炎、重癥肌無力、自身免疫性甲狀腺炎，特應(yīng)性皮炎、濕滲性皮炎、銀屑病、斯耶格倫氏綜合征、口瘡性潰瘍、虹膜炎、結(jié)膜炎、角膜結(jié)膜炎、皮膚紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、直腸炎、麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑、自身免疫性葡萄膜炎、變應(yīng)性腦脊髓炎、急性壞死性出血性腦病、特發(fā)性兩側(cè)進行性感覺神經(jīng)性失聰、再生障礙性貧血，真性紅細胞性貧血，特發(fā)性血小板減少癥(ITP),多軟骨炎、韋格納氏肉芽腫病、慢性活動性肝炎，斯-約二氏綜合征、特發(fā)性口炎性腹瀉(idiopathicsprue)、扁平莒癬，才各雷夫斯氏病，肉樣瘤病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、后葡萄膜炎、間質(zhì)性肺纖維化、橋本甲狀腺炎、自身免疫性多腺體綜合征、免疫介導(dǎo)的不育癥、自身免疫性阿狄森氏病、尋常天皰瘡、落葉性天皰瘡、皰疹樣皮炎、自身免疫性脫發(fā)、白癜風(fēng)、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、惡性貧血、格-巴二氏綜合征、硬漢綜合征、急性風(fēng)濕熱、交感性眼炎、古德帕斯徹氏綜合征、系統(tǒng)性壞死性血管炎、抗磷脂綜合征、哮喘(如過敏性哮喘)和變態(tài)反應(yīng)。如本文所使用的，術(shù)語"移植"、"移植術(shù)"及其語法變化意指將來自身體一部分的細胞、組織或器官嫁接、植入或移植到另一部分，或?qū)碜砸粋€個體或動物的細胞、組織或器官嫁接、植入或移植到另一個體或動物。因此，所移植的細胞、組織或器官可以是同種異體移植物或異種移植物。例證性的移植細胞包括骨髓干細胞、造血干細胞、外周血干細胞和臍帶血干細胞、同種異體或非同種異體細胞以及神經(jīng)細胞。例證性的移植組織包括皮膚、血管、眼睛和骨髓。例證性的移植器官包括腎、心、肺、胰和肝。該術(shù)語還包括遺傳修飾的細胞、組織和器官，如通過離體基因治療而遺傳修飾的細胞、組織和器官，其中被轉(zhuǎn)化的細胞、組織和器官獲得自或來源于之后從不同的個體(如人或動物)接受移植物的個體(如人或動物)。節(jié)OX40而能月良/人于口用OX40抗體治療，而又能調(diào)節(jié)二種或多^t淋巴細胞(如活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞)的細胞增殖、生存、死亡或活性等的炎癥反應(yīng)。方法(如治療)可引起炎癥發(fā)生、頻率、嚴重性、進展或持續(xù)時間的減少。例證性的炎癥癥狀包括腫脹、疼痛、皮瘆、頭痛、發(fā)熱、惡心、骨關(guān)節(jié)僵直或組織或細胞損傷的一種或多種。炎癥可直接或間接導(dǎo)致對多種細胞、組織或器官或?qū)我患毎愋?、組織類型或器官的細胞、組織或器官損害?？娠@示出損害的例證性的組織和器官包括表皮或粘膜組織、消化道、腸、胰腺、胸腺、肝、腎、脾、皮膚或骨骼關(guān)節(jié)(如膝、踝、髖、肩、腕、指、趾或肘關(guān)節(jié))。根據(jù)本發(fā)明的治療可引起組織損害的緩解、抑制或阻止其進展或惡化，或?qū)е率軗p的器官或組織如皮膚、粘膜(mucosum)、肝的再生。如本文所使用的，術(shù)語"治療"及其語法變化意指對個體個體或患者所進行的其中期望在患者中獲得生理效應(yīng)或結(jié)果的治療方案、用藥法、處理或治療法。因此，本發(fā)明的方法尤其包括在給定個體的病癥、疾病、生理狀態(tài)、病理或癥狀中提供可測量的改善或有益效果的處理和治療方法。可測量的改善或有益結(jié)果是病癥、疾病、生理狀態(tài)、病理或癥狀中任何客觀或主觀的、短暫的、臨時的或長期的改善，或減少與病癥、疾病、生理狀態(tài)、病理或癥^象相關(guān)的或由病癥、疾病、生理狀態(tài)、病理或癥像所引起的不利癥狀發(fā)生、嚴重性、持續(xù)時間或頻率。本發(fā)明的方法無需即刻見效，可以有一些延遲，但隨時間的過去，在給定的個體中會出現(xiàn)最終的改善或有益效果、穩(wěn)定作用或改進作用。例如，當(dāng)增量或部分降j氐或減少一種或多種與病癥、疾病、病理或癥像相關(guān)的病理、不利癥狀或并發(fā)癥嚴重性、持續(xù)時間或頻率，或抑制、減少、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)一種或多種病癥、疾病、生理狀態(tài)、病理或癥狀(如慢性或急性免疫性疾病或病癥、GVHD、移植排斥、炎癥或自身免疫性疾病)的生理學(xué)、病理學(xué)、生物化學(xué)或細胞表現(xiàn)或特征時，就達到了根據(jù)本發(fā)明的治療方法的令人滿意的臨床終末點。因此，治療益處或改善可以不需要治愈，或消除大多數(shù)或全部的與病癥、疾病、生理狀態(tài)、病理或癥狀(如慢性或急性免疫性疾病或病癥、GVHD、移或并發(fā)癥:、:因:，治"益處或改善無i產(chǎn)生任何或全部的與病癥:、疾病、生理狀態(tài)、或病理(如慢性或急性免疫性疾病或病癥、GVHD、移或并發(fā)癥:完i治愈,二如部分減^、降低或抑制，'或穩(wěn)定或減緩與病癥、疾病、生理狀態(tài)或病理(如t曼性或急性免疫性疾病或病癥、不利癥狀或并發(fā)癥的進^或惡化，'即使只持續(xù)幾^天、幾周或幾個月，或即使一種或多種與疾病、病癥、病理或癥像(如慢性或急性免疫性疾病或病癥、GVHD、移植排斥、炎癥或自身免疫性疾病)相關(guān)或由之所引起的病理、不利癥狀或并發(fā)癥仍然保留，也是令人滿意的臨床結(jié)果。在多個具體的實施方案中，治療方法包括緩解或改善一種或多種與慢性或急性免疫病癥或疾病相關(guān)的不利(身體)癥狀或后果。在多個另外的具體實施方案中，治療方法包括減輕、減少或預(yù)防一種或多種與移植物抗宿主病相關(guān)的不利癥狀或身體后果(如體重減輕、脫發(fā)、皮滲、血尿、腹水、肝、腸道、肺中炎性細胞浸潤和死亡)的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性，或?qū)е乱浦参锟顾拗鞑〉木徑饣蛳?，或?qū)е骂A(yù)防移植物抗宿主病。在多個更進一步的具體實施方案中，治療方法包括減輕、減少或預(yù)防一種或多種與移植物或移植排斥相關(guān)的不利癥狀或身體后果(如針對移植體或移植物的免疫應(yīng)答，或移植體或移植物細胞破壞)的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性，或?qū)е乱浦参锘蛞浦才懦獾木徑饣蛳耍驅(qū)е骂A(yù)防移植物或移植排斥。在多個更進一步具體的實施方案中，治療方法包括減輕、減少或預(yù)防一種或多種與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病(如胰島素依賴性糖尿病、IDDM、I型糖尿病)、克羅恩氏病(CD)、炎性腸病(IBD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、乳糜瀉、銀屑病、全身性紅斑狼瘡(SLE)、增生性狼瘡性腎炎、肉芽腫性肌病、多發(fā)性肌炎或不合需要的或異常的OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答相關(guān)的不利癥狀或身體后果的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性。在更進一步的多個具體實施方案中，治療方法包括減少自身反應(yīng)性細胞或產(chǎn)生抗自身蛋白抗體的細胞的數(shù)量或增殖，抑制或阻止自身反應(yīng)性細胞或產(chǎn)生抗自身蛋白抗體的細胞的數(shù)量、增殖或生存的增加。就免疫病癥或疾病而言，可測量的改善或有益效果包括朝著被認為是成功的治療結(jié)果的生理學(xué)正常的基線水平調(diào)節(jié)淋巴細胞(如活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞)的數(shù)量、增殖或活性。對于免疫病癥或疾病而言，可測量的改善或有益效果的一個額外的例子是由該免疫病癥或疾病所引起的或與之相關(guān)的組織病理學(xué)改變的改善。例如，進一步阻止或緩解骨骼關(guān)節(jié)浸潤或組織破壞，或胰腺、胸腺、腎、肝、脾、表皮(皮膚)或粘膜組織、消化道或腸浸潤或組織破壞。根據(jù)本發(fā)明，提供了封閉、抑制、阻止、減少或減弱OX40配體(OX40L)在體外或體內(nèi)與活化T細胞或OX40結(jié)合的方法。在一個實施方案中，一種方法包括將活化T細胞與能有效地抑制或阻止OX40配體與活化T細胞結(jié)合的OX40抗體接觸。在另一個實施方案中，一種方法包括將OX40與能有效地抑制或阻止OX40配體與OX40結(jié)合的OX40抗體接觸。在具體的方面中，任選地用OX40藥物組合物對需要封閉、減少、減弱、抑制或阻止OX40配體(OX40L)與活化T細胞結(jié)合的個體執(zhí)行一種方法。根據(jù)本發(fā)明，提供了在體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)OX40-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)的方法。在一個實施方案中，一種方法包括給予需要調(diào)節(jié)OX40-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)的個體能有效調(diào)節(jié)OX40-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)的OX40抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了在體外或體內(nèi)減少活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量的方法。在一個實施方案中，一種方法包括給予需要減少活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量的個體足以減少活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量的量的OX40抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了治療由活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞所引起的疾病或病癥的方法。在一個實施方案中，一種方法包括給予個體足以減輕、減少或預(yù)防由活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞所引起的疾病或病癥進展或耗竭活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞的量的OX40抗體。在具體的方面中，疾病或病癥包括移才直物抗宿主病、炎癥或自身免疫性疾病。才艮據(jù)本發(fā)明，提供了減少個體血液、脾、淋巴結(jié)、腸、肝、肺或皮膚中活化T細胞數(shù)量的方法。在一個實施方案中，一種方法包括給予個體足以減少血液、脾、淋巴結(jié)、腸、肝、肺或皮膚中活化T細胞數(shù)量的量的OX40抗體。在一個方面中，一種減少血液、脾、淋巴結(jié)、腸、肝、肺或皮膚中活化T細胞數(shù)量的方法是在急性或慢性異種移植物宿主疾病^^型中進行的。本發(fā)明的組合物和方法可與任何其他提供所需效果的處理或治療相組合。具體來說，特征在于具有補充或協(xié)同效應(yīng)的處理和治療是可采用的。例證性的處理和治療包括免疫抑制劑或藥物?？稍诒景l(fā)明的任何其他方法如治療或處理之前、基本上同時進行上述免疫抑制處理和治療。因此，本發(fā)明提供了其中本發(fā)明的方法與任何治療方案、處理方案或組合物如本文中所列的或本領(lǐng)域已知的免疫抑制治療方案、試劑或藥物組合使用的聯(lián)合方法。在一個實施方案中，一種方法包括給予OX40抗體、其子序列或片段以及免疫抑制處理、試劑或藥物。該免疫抑制處理、試劑或藥物可在給予個體OX40抗體、其子序列或片段之前、基本上同時或之后給予。如本文所使用的，當(dāng)涉及處理、治療、試劑或藥物使用術(shù)語"免疫抑制"或其語法變化時，意指該處理、治療、試劑或藥物提供了對體液或細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的減弱、減少、抑制或阻止。上述治療可一般或全身性地抑制免疫應(yīng)答，或抑制特定區(qū)域或位置中的免疫應(yīng)答。免疫抑制試劑和藥物的具體非限制性的類別包括烷化劑、抗代謝物、植物提取物、植物生物堿，亞硝脲、激素(類固醇如糖皮質(zhì)激素)、核苷和核苦酸類似物。免疫抑制藥物的具體例子包括環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、環(huán)孢霉素A、他克莫司(FK506)、雷帕霉素、曱氨喋呤、FTY720、cox-2抑制劑和白細胞介素(如IL-12)。多克隆和單克隆抗體是免疫抑制處理或治療的具體例子。免疫抑制抗體包括例如英夫利昔單抗(Remicade⑧)、Rituxan、Atgam、和Thymoglobuline、Xenapax、Simulect、Humira、Raptiva、Tysabri以及Orthoclone(OKT3)。本發(fā)明的方法尤其還包括導(dǎo)致減少對另一種處理方案或治療方案、處理或治療法的需要或利用的方法。例如，對于炎癥、GVHD或50自身免疫性疾病而言，如果在給定的個體中本發(fā)明的一種方法具有治療益處，則導(dǎo)致較不常用免疫抑制處理或治療或減少免疫抑制處理或治療的劑量或除去免疫抑制處理或治療。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了減少對免疫抑制處理或治療需要或利用的方法。在一個實施方案中，一種方法包括給予正在經(jīng)歷或已經(jīng)歷免疫抑制治療的個體OX40抗體、其片段或子序列。在一方面中，一種方法包括以能有效地減少炎癥、GVHD或自身免疫性疾病的免疫抑制處理或治療的劑量、頻率或持續(xù)時間或消除對該處理或治療需要的量給予OX40抗體、其片段或子序列。該方法可在免疫抑制處理或治療給予之前、基本上同時或之后進行。在其中期望獲得治療益處或改善的處理或治療法中的劑量或"有效量"或"足夠量，，包括，例如任何客觀或主觀的緩解或改善一種、幾種或所有的與目標疾病、病癥、病理或不利癥狀或并發(fā)癥相關(guān)或由之引起的病理、不利癥狀或并發(fā)癥至可測量的或可^r測的程度的量。阻止、抑制或4,延目標疾病、病癥、病理或不利癥狀或并發(fā)癥的進展或惡化也是令人滿意的結(jié)果。足夠量或有效量意指在特定的個體而非一組個體或一般人群中足夠或有效的量。因此。"有效量，，或"足夠量"應(yīng)當(dāng)足以提供治療益處給所給定的個體?？梢缘珶o需在單次給藥中，以及可以但無需單獨或與另外的處理、治療或治療方案聯(lián)合給予以提供足夠量或有效量。例如，量可如個體的需要，所治療的病癥、疾病或癥像的狀況或治療的副作用所指示的按比例增加。此外，如果以單次或多劑量給予而無第二處理、治療或治療方案，則足夠量或有效量無需足夠或有效，這是因為在所給定的個體中可包括額外的多于上述劑量的劑量、量或持續(xù)時間或額外的處理、治療或治療方案以致有效或足夠。—見為有效或足夠的量還包括導(dǎo)致減少使用另外的處理、治療方法或方案的量。例證性的非限制性的量(劑量)為約0.1mg/kg-約100mg/kg,以及任何位于上述范圍之內(nèi)的數(shù)值或范圍或值。可給予更多或更少的量(劑量)，例如0.01-500mg/kg,以及任何位于上述范圍之內(nèi)的數(shù)值或范圍或值。另外的例證性的非限制性的量(劑量)為約0.5-50mg/kg、1.0-25mg/kg、1.0-10mg/kg,以及任何位于上述范圍之內(nèi)的數(shù)值或范圍或值。本發(fā)明的方法可通過任何給藥或遞送方式，或通過任何途徑、全身性、區(qū)域或局部給藥或遞送實施。例證性的給藥和遞送途徑包括靜脈內(nèi)、子宮內(nèi)、真皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、胸膜內(nèi)、經(jīng)皮(局部)、轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)、顱內(nèi)、脊柱內(nèi)、眼內(nèi)、直腸、經(jīng)口(飲食)和粘膜途徑?？擅刻?、每周、每月或每年實施本發(fā)明的方法一次或多次(如1-10次、1-5次或1-3次)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道什么時候適合于推遲或中斷給藥。非限制性的劑量日程表是每周l-7次，持續(xù)l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多周，以及任何位于上述范圍之內(nèi)的數(shù)值或范圍或值。當(dāng)然，與任何處理或治療所常見的一樣，不同的個體對于處理會顯示不同的響應(yīng)，某些個體可能不響應(yīng)或?qū)μ囟ǖ奶幚矸桨浮⒎椒ɑ虺绦蝽憫?yīng)不充分。因此，有效量或足夠量將至少部分取決于所治療的疾病、病癥、病理(如炎癥、GVHD、移植排斥或自身免疫性疾病，以及如果其是晚期、后期或早期的話)、期望的療效以及個體個體(如在個體中的生物利用度、性別、年齡等)，個體對該處理或治療的響應(yīng)將部分基于遺傳和外遺傳變異性(如藥物基因組學(xué))。此外，由于所有治療的個體或患者可能都不響應(yīng)于特定的處理或治療方法、草案、方案、程序或藥物，因此在每個或所有的個體或患者或如此治療的給定的人群中該處理或治療法無需達到特定的可測量的改善或有益效果、臨床終末點或所需的結(jié)果。因此，給定的個體或患者或人群對本發(fā)明的處理或治療方法可能無法響應(yīng)、響應(yīng)不充分或可能顯示不合需要的響應(yīng)如副作用。在本文中術(shù)語"個體"和"患者"可交換使用，并指動物，典型地是哺乳動物如人、非人靈長類動物(大猩猩、黑猩猩、猩猩、獼猴、長臂猿)、家畜(狗和貓)、農(nóng)場和大牧場動物(馬、牛、山羊、綿羊、豬)、實驗室和實驗動物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。個體包括用于體內(nèi)療效研究疾病模型動物(如小鼠、大鼠和非人靈長類動物)(如GVHD動物模型)。人個體包括兒童，例如新生兒、嬰兒、剛學(xué)步的小孩和青少年，1-5歲、5-10歲和10-18歲兒童，18-60歲成人，以及老年人如60-65歲、65-70歲和70-100歲老年人。個體包括需要治療的哺乳動物(如人)，更確切地i兌，他們具有服從于或可響應(yīng)于用OX40抗體、子序列或片l殳處理或治療的疾病、病癥、其病理或癥狀。個體包括那些具有或處于具有慢性或急性免疫病癥或疾病、炎癥、GVHD、移植排斥、炎癥、自身免疫性疾病或OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的危險中的個體。個體還包括那些為慢性或急性免疫病癥或疾病、GVHD、移植排斥、炎癥、自身免疫性疾病或OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的一種或多種的候選人或已對之進行治療的個體。因此，作為細胞、組織或器官移植或嫁接如腎、心、肺、皮膚、眼睛、血管、肝或姨移植或骨骨i、造血干細胞、外周血干細胞或臍帶血干細胞、同種異體或非同種異體細胞、神經(jīng)細胞的候選人或已接受該移植或嫁接的個體是使用OX40抗體進行治療的候選人。個體進一步包括那些由于實驗室或臨床診斷使有理由需要這樣的處理的需要免疫抑制處理或治療的個體、正在經(jīng)歷免疫抑制處理或治療(如由于移植)的個體和已經(jīng)歷免疫抑制處理或治療的個體，以及處于再發(fā)或復(fù)發(fā)危險中的個體。處于危險中的個體包括那些具有慢性或急性免疫性疾病或病癥、炎癥、GVHD、移植排斥、炎癥、自身免疫性疾病或OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答家族史、遺傳傾向性或之前患有上述疾病的個體?？衫煤Y選如自身反應(yīng)性T細胞或抗自身蛋白抗體來鑒定上述處于危險中的個體。例如，表達類風(fēng)濕因子的個體處于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的危險中。表達針對MBP、MOG或PLP的抗體的個體處于多發(fā)性硬化的危險中。因此，為了抑制或降低發(fā)展為或遭受再發(fā)或復(fù)發(fā)為慢性或急性免疫性疾病或病癥、炎癥、GVHD、移^i排斥、炎癥、自身免疫性疾病或OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的可能性，可對處于危險中的個體進行處理。上述處理的結(jié)果可減少發(fā)展為慢性或急性免疫性疾病或病癥、炎癥、GVHD、移植排斥、炎癥、自身免疫性疾病或OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的危險。本發(fā)明的抗體、核酸和其他組合物及方法可包括于或4吏用藥物配方。這樣的藥物配方能用于體內(nèi)局部、區(qū)域或全身性或離體治療個體或給藥或遞送至個體。藥物配方包括"藥學(xué)上可接受的"和"生理學(xué)上可接受的"載體、稀釋劑或賦形劑。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"和"生理學(xué)上可接受的"包括與藥物施用相容的溶劑(水溶劑或非水溶劑)、溶液、乳劑、分散介質(zhì)、包衣、等滲和吸收促進或延遲劑。這樣的配方可包含于液體；乳劑、混懸劑、糖漿劑或酏劑中，或包含于固體劑型；片劑(包衣或未包衣的片劑、直接釋放、延遲釋放、連續(xù)釋放或脈沖式釋放的片劑)、膠嚢劑(硬膠嚢劑或軟膠嚢劑、直接釋放、延遲釋放、連續(xù)釋放或脈沖式釋放的膠嚢劑)、粉劑、顆粒劑、晶體或微珠中。補充的化合物(如防腐劑、抗細菌劑、抗病毒劑和抗真菌劑)還可摻入配方中?？芍苽溥m合于特定的局部、區(qū)域或全身性給藥或遞送途徑的藥物配方。因此，藥物配方包括適于通過特定途徑給藥的載體、稀釋劑或賦形劑。對于本發(fā)明的組合物，給藥途徑的具體的非限制性例子是腸胃外如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、胸膜內(nèi)、經(jīng)皮(局部)、轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)、顱內(nèi)、脊柱內(nèi)、目艮內(nèi)、直腸、經(jīng)口(飲食)、粘膜給藥，以及任何其他適于處理方法或給藥方案的配方。用于腸胃外施用的溶液或混懸劑可包括無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、固定油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑如苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞^T。酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)節(jié)張度的試劑如氯化鈉或葡萄糖?？捎盟峄驂A如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。用于注射的藥物配方包括無菌水溶液(水溶的)或分散劑以及用于臨時制備無菌可注射的溶液或分散劑的無菌粉劑。對于靜脈內(nèi)給藥，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorEL(BASF,Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇)以及適合的它們的混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？衫缤ㄟ^使用諸如卵磷脂的被覆層、通過保持就分散而言所要求的顆粒大小以及通過使用表面活性劑從而維持流動性。抗細菌劑和抗真菌劑包括例如對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸和硫柳汞。等滲劑例如糖類、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，氯化鈉可包括在組合物中。所包括的延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁或明力交可延長可注射組合物的吸收。可通過將需要量的活性組合物摻入具有一種上述成分或上述成分組合的適合的溶劑中制備無菌可注射的配方。一般來說，通過將活性組合物摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和任何其他成分的無菌載體中制備分散劑。就用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑而言，制備方法包括，其由之前所制備的溶液生產(chǎn)出了活性成分外加任何額外的所需成分的粉劑。對于轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)或經(jīng)皮給藥，在配方中使用適合于要被透過的屏障的滲透劑。上述滲透劑是本領(lǐng)域已知的，包括例如，對于轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)給藥，為去垢劑、膽汁鹽類和梭鏈孢酸衍生物。可通過使用鼻腔噴霧、吸入裝置(如吸氣器)或栓劑實現(xiàn)轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)給藥。對于經(jīng)皮給藥，活性化合物可配制為軟膏劑、油膏劑、凝膠劑、霜劑或貼劑。可用免于從體內(nèi)快速排除的載體制備藥物配方，例如控制釋放配方或時間延遲材料如單硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。還可^f吏用加工產(chǎn)品如植入物和微嚢密封的遞送體系遞送配方以達到局部、區(qū)域或全身性遞送或控制或持續(xù)釋放?？蒦f吏用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙二醇二乙酸酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯類和聚乳酸。用于制備上述配方的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。材料還可通過商業(yè)渠道獲得自AlzaCorporation(PaloAlto,CA)。脂質(zhì)體混懸劑(包括使用抗體或病毒外殼蛋白靶向細胞或組織的脂質(zhì)體)也可用作藥學(xué)上可接受的載體?？筛鶕?jù)已知的方法如在美國專利號4,522,811中所描述的方法制備這些載體。其他適于給藥的藥物配方是本領(lǐng)域已知的(參見如Gennaro(編),Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.第20版,Lippincott,Williams&Wilkins(2000》Ansel等,PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems.第7版,LippincottWilliams&WilkinsPublishers(1999);Kibbe(編)，HandbookofPharmaceuticalExcipientsAmericanPharmaceuticalAssociation,第3版.(2000)和Remington'sPharmaceuticalPrinciplesofSolidDosageForms,TechnonicPublishingCo.,Inc.，Lancaster,Pa.，(1993》。包括OX40抗體、核酸、處理、治療、試劑、藥物和藥物配方在內(nèi)的根據(jù)本發(fā)明所使用的組合物可包裝為易于給藥和統(tǒng)一劑量的劑量單位形式。如本文所使用的，"劑量單位形式，，指適合于單位劑量處理的物理上分離的單位；每單位含有被計算能產(chǎn)生所需處理或治療(如有益)效果的量的與載體、賦形劑、稀釋劑或媒介物結(jié)合的組合物。單位劑量形式取決于多種因素包括但無需受限于所使用的特定組合物、所要達到的效果以及待治療的個體的藥效動力學(xué)和藥物基因組學(xué)。本發(fā)明進一步提供了試劑盒，包括包裝于適合的包裝材料中的OX40抗體、核酸、藥劑、藥物和藥物配方，任選地包括用于使用試劑盒組分的說明書如用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的說明書。在一個實施方案中，試劑盒包括OX40抗體、子序列或片段以及用于檢測OX40的說明書。在另一個實施方案中，試劑盒包括OX40抗體、子序列或片段以及用于用OX40抗體、子序列或片段治療需要該治療的個體(如具有能改善的或可響應(yīng)于處理或治療的疾病、病癥、病理或狀況的個體)的i兌明書。在一方面中，該說明書用于慢性或急性免疫性疾病或病癥、炎癥、GVHD、移植排斥、炎癥、自身免疫性疾病或OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的治療。在更進一步的方面中，試劑盒包括免疫抑制處理、治療或藥劑。術(shù)語"包裝材料"指包覆試劑盒組分的物理結(jié)構(gòu)。包裝材料可保持組分無菌，并可由常用于這樣目的的材料(如紙、瓦楞紙板、玻璃、塑料、金屬箔、安瓿等)制成。標簽或包裝嵌入物可包括適當(dāng)?shù)臅嬲f明書，如本發(fā)明的診斷或治療方法。因此，該說明書可包括用于實施本文中所述的本發(fā)明任一方法的說明書。因此，在多個實施方案中，試劑盒包括標簽或包裝插入物包括用于在溶液中、體外、體內(nèi)或離體實施本發(fā)明方法的說明書。在一個方面中，該說明書包括在本發(fā)明的處理或治療方法中局部、區(qū)域或全身性給予或遞送OX40抗體、子序列或片段至個體中。說明書可額外地包括令人滿意的臨床終末點或任何可能出現(xiàn)的不利癥狀或并發(fā)癥的指示。說明書可進一步包括貯藏信息、失效期或管理機構(gòu)如美國食品和藥物管理局對于在人個體中使用所要求的任何信息。說明書可印在"印刷品"上，如印在試劑盒中的紙或紙板上，印在貼在試劑盒或包裝材料的標簽上、或印在貼在含有試劑盒組分的管形瓶或試管的標簽上。說明書可包含聲頻或視頻媒介并可額外地包括在計算機可讀介質(zhì)如磁盤(軟盤或硬盤)、光學(xué)CD如CD-或DVD-ROM/RAM、磁帶、電存儲介質(zhì)如RAM和ROM以及這些的混合物如磁性/光學(xué)存儲介質(zhì)上。本發(fā)明的試劑盒可額外地包含緩沖劑、防腐劑或穩(wěn)定劑。該試劑盒還可包含用于活性測定的對照組分，如對照樣品或標準。該試劑盒的每一組分可包裝在單獨的容器中或以混合物的形式存在，所有的各種容器可以單一包裝或多重包裝。根據(jù)本發(fā)明，進一步提供了無細胞(如在溶液中、在固相中)和基于細胞(如體外或體內(nèi))的篩選、檢測和鑒定OX40的方法?？稍谌芤褐?、在體外使用生物材料或樣品，以及在體內(nèi)例如使用來自動物的細胞(如淋巴細胞)樣品進行該方法。在一個實施方案中，一種方法包括在容許抗體與OX40結(jié)合的條件下，將生物材料或樣品與結(jié)合OX40的抗體接觸；并測定抗體與OX40的結(jié)合?？贵w與OX40的結(jié)合檢測出OX40的存在。在一個方面中，OX40存在于細胞或組織上。在另一個方面中，生物材料或樣品獲得自哺乳動物個體。當(dāng)涉及組分如蛋白(如OX40抗體)、材料、樣品或處理使用術(shù)語"接觸"時，意指組分(如OX40抗體)和其他參照實體之間直接或間接的相互作用。直接的相互作用的一個具體例子是結(jié)合。間接的相互作用的一個具體例子是其中組分作用于中間產(chǎn)物分子，該中間產(chǎn)物分子又依次作用于參照實體。因此，例如將細胞(如淋巴細胞)與OX40抗體接觸包括使抗體與細胞結(jié)合(如通過與OX40結(jié)合)，或使抗體作用于中間產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物又依次作用于細;9包。術(shù)語"測定"和"測量"及其語法變化在本文中可交換地使用并指定性或定量測定，或同時定性及定量測定。當(dāng)涉及結(jié)合使用該術(shù)語時，任何評估結(jié)合的相對量、親和力或特異性的方法皆被考慮，包括本文中所列的和本領(lǐng)域已知的多種方法。例如，可通過ELISA測定法測定或測量OX40抗體與OX40的結(jié)合。除非另有規(guī)定，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管在本發(fā)明的實施或測試中可使用類似于或等價于本文中所描述的那些的方法和材料，但合適的方法和材料是本文中所描述的。所有本文引用的出版物、專利、Genbank登錄號以及其他參考文獻以其全文并入作為參考。如有沖突，以包括定義在內(nèi)的本說明書為準。除非上下文另有清楚指示，如本文所使用的單數(shù)形式"一種"、"和"和"該"包括復(fù)數(shù)對象。因此，例如就"一種抗體"而言，包括多種抗體，以及就"一種處理或治療"而言，可包括多種、連續(xù)的或同時發(fā)生的處理或治療等等。除非上下文另有清楚指示，如本文所使用的任何數(shù)值或數(shù)值范圍包括處于這樣的范圍之中或包含這樣的范圍的全部整數(shù)和處于范圍之中或包含范圍的值或整數(shù)的分數(shù)。因此，例如就90-100%的范圍而言，包括91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%等，以及91.1%、91.2%、91.3%、91.4%、91.5%等，92.1%、92.2%、92.3%、92.4%、92.5%等。在另一個例子中，就l-5，000倍的范圍而言，包括l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍等，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5倍等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5倍等。本發(fā)明被一般地披露于使用肯定的語言來描述諸多實施方案的本文中。本發(fā)明還明確地包括其中具體的主題如物質(zhì)或材料、方法步驟和條件、實驗方案、程序、測定法或分析被完全或部分排除的實施方案。因此，雖然在本發(fā)明沒有包括的方面本發(fā)明一般不表達在本文中，但沒有確切地包括于本發(fā)明中的方面仍然被披露了。業(yè)已描述了多個本發(fā)明的實施方案。盡管如此，4艮清楚可以進行多種修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，下列實施例旨在舉例說明而不限制權(quán)利要求中所描述的本發(fā)明的范圍。實施例該實施例描述了多種原料和方法?？乖苽?使用Tri試劑(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA),由用植物血球凝集素(PHA，Remel,Lenexa,KS)活化兩天的人外周血單核細胞分離RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴增編碼人OX40胞外域的序列。對擴增產(chǎn)物測序并確認與所布的人OX40序列(W095/12673,SEQNO:1)相同。將產(chǎn)物按讀框亞克隆入pfastbac國hFc桿狀病毒供體質(zhì)粒中。該載體產(chǎn)生自pfastbac質(zhì)粒(InvitrogenCorp.)和人IgGl("hlgGl")的Fc部分。從pV11392.fc載體上切下WgGl序列。產(chǎn)生編碼人OX40:hlgGl融合蛋白(hOX40:hFc)的重組桿狀病毒。用hOX40:hFc重組桿狀病毒感染粉紋夜蛾(7Wc/2o//wwam)High-FiveBTl陽TN畫5bl畫4("Tn5")昆蟲細胞(InvitrogenCorp.)用于蛋白產(chǎn)生。擴增58全長OX40序列并克隆入pCDNA3.1載體(InvitrogenCorp.)中用于在真核細胞中進行表達。用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)2000(InvitrogenCorp.)轉(zhuǎn)染EL-4(ATCCTIB-39)和CH0-K1(ATCCCCL-61)細胞并用潮霉素B(FisherScientific,Pittsburgh,PA)或遺傳霉素(InvitrogenCorp.)分別選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。通過戊二醛偶聯(lián)將hOX40:hFc與卵白蛋白綴合。在1ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中混合1mg的hOX40:hFc和0.5mg的卵白蛋白(Pierce,Rockford，EL)。緩慢添加50pl的P/oEM級戊二醛(Sigma,St.Louis,MO)并輕輕搖動5分鐘混合溶液。在室溫下3小時后，添加50pi的1M乙醇胺(pH7)并溫育溶液2小時，之后在NAP10柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)上用磷酸鹽緩沖鹽水進行緩沖液交換。由起始密碼子(ATG)經(jīng)人OX40胞外域至人Fc序列(下劃線的)末端的人OX40:人IgGl融合蛋白的核苷酸序列SEQIDNO:1ATGTGCGTGGGGGCTCGGCGGCTGGGCCGCGGGCCGTGTGCGCCTCTCJCTCCTCCTGGGC.60TGCAAGCCCTGGACCAACTGCACCTTGGCTGGGAAGCACACCCTGCAGCCGGCCAC!CAAT480900柳10201080"40CCTCCCGTGCTCGACTCCGACGGCTCCTTCTTqCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG..函AGC人GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTiXTCATOCTCCGTGATGCAT。AG。CTCTGCACAAC1260CACT織CGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAT1320與人IgGl的Fc部分(下劃線的)融合的人OX40-胞外域的氨基酸序列SEQIDNO:2MCVGARRLGRGPCAALLUXJU3LSTVTGLHCVGDTYPSND'RCCHECRPGNGMVSRCSRSQ60NTVCRPCGPOFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYK120PGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLA'CiKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQ180GPPARP1TVOFTEAWPKTSOGPSRSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS240RTPRVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVI,TVLHODWL300NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYP360STOAV隨SNGOPENNYOTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHN420HYTOKSLSLSPGK.433小鼠:含有編碼人免疫球蛋白區(qū)域的人染色體片段的人轉(zhuǎn)染色體KMmice(WO02/43478,WO02/092812,Ishida,等，IBC，s11thAntibodyEngineeringMeeting.Abstract(2000);Kataoka，S.IBC，s13thAntibodyEngineeringMeeting.Abstract(2002))獲得自KirinBreweryCo.,Ltd.,Japan,并安置在LaJolla變態(tài)反應(yīng)和免疫學(xué)研究所(LaJollaInstituteforAllergyandImmunology)的動物實-瞼室內(nèi)。產(chǎn)生人抗體的技術(shù)綜述描述于Lonberg(Lonberg,等，IntRevImmunol13(1):65-93(1995))中。不表達內(nèi)源性免疫球蛋白的帶有一種或多種人免疫球蛋白基因(k或人)的轉(zhuǎn)基因動物描述于例如美國專利號5,939,598中。描述了用于產(chǎn)生人抗體和人單克隆抗體的其他方法(參見如WO98/24893;WO92/01047;WO96/34096;WO96/33735;美國專利號5,413，923;5,625,126;5,633,425;5,569,825;5,661,016;5,545,806;5,814,318;5,885,793;5,916,771和5,939,598)。攜帶人免疫球蛋白基因的牛一TC母牛的開發(fā)描述于(Kuroiwa,等，NatBiotechnol2(K9):889-94(2002);Kuroiwa,等，NatGenet36(7V.775-80(2004))中。免疫接種:將hOX40:hFc重組蛋白與等體積的完全弗氏佐劑(CFA,Sigma)混合并制備乳劑。用10-25|xg蛋白向腹膜內(nèi)免疫接種小鼠，并用在不完全弗氏佐劑(IFA,Sigma)中乳化的5-10蛋白向腹膜內(nèi)加強免疫，間隔2周進行2-4次加強免疫。最后在融合前5天向腹腔內(nèi)注射不含有佐劑的5-10可溶性hOX40:hFc。另一組小鼠用通過在PBS中于80。C溫育IO分鐘熱變性，然后以1:1與RIBI佐劑(Sigma)混合的hOX40:hFc免疫接種。對小鼠免疫接種描述如上。第三組小鼠用綴合有卯白蛋白的hOX40:hFc免疫接種。用30pg的hOX40:hFc-OVA單獨接種或用處于RIBI中的10|Lig和20)ng的hOX40:hFc的混合物分別接種小鼠。前者接受處于RIBI中的30|ighOX40:hFc-OVA的加強免疫，之后以2周間隔接受處于RIBI中的10貼的hOX40:hFc。在5周后，進行處于PBS中的20昭hOX40:hFc-OVA的最終加強免疫。后者組的兩次加強免疫以2周間隔由處于RIBI中的5|LighOX40:hFc-OVA+10lughOX40:hFc組成，最后的加強免疫為處于PBS中的10hOX40:hFc。所有的注射都是在腹膜內(nèi)進行的。最后一組小鼠用已用PHA(l^g/ml)和重組人白細胞介素2(IL2,10ng/ml，BDPharmingen,SanDiego，CA)刺激2天的CD4+人T細胞免疫接種。在注射前，細胞接受25Gy的銫源輻射并在RIBI佐劑中1:1稀釋。雜交瘤產(chǎn)生:選擇在它們的血清中具有最高的抗-OX40IgG特異性抗體效價的小鼠用于產(chǎn)生單克隆抗體。收集脾臟并使用50%聚乙二醇(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)將單細胞懸液以3:1的比例與骨髓瘤細胞系(SP2/0-Ag14)(ATCC,Rockville，MD)融合。將融合物以最佳密度鋪在96孔平底平板中并于10%CO2，37。C保溫箱中，在完全DMEM-10培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(FBS,InvitrogenCorp.))、1%非必需氨基酸、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ing/ml硫酸鏈霉素(所有的都來自BioWhittaker，Walkersville,MD)、HAT補充物(Sigma)和10%雜交瘤克隆因子(HCF，Biovaris,SanDiego,CA)中培養(yǎng)。通過ELISA對來自四個融合物的大約4000孔篩選含有人k的OX40特異性抗體。通過流式細胞^企測分析確認人抗-人OX40IgG抗體。增殖陽性孔并對其進行3-4輪有限稀釋克隆以獲得單克隆抗體?？贵w和蛋白純化:對于抗體純化，在2升滾瓶中以350毫升-1升/瓶或在具有補充有超低IgG胎牛血清(TnvitrogenCorp.)的雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(InvitrogenCorp.)的1升Integra系統(tǒng)(INTEGRABioscience,Inc.Ijamsville,MD)中培養(yǎng)雜交瘤。通過用1升的Tn5細月包感染4天產(chǎn)生人OX40:hFc重組蛋白。使用重組蛋白A-SepharoseFastFlow凝膠(AmershamBiosciences)從培養(yǎng)基中純化人單克隆抗體和OX40:hFc。首先用Ultmsette切向流系統(tǒng)(PallCorp.，EastHills，NY)濃縮滾瓶中所產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基。接著用0.22jLim真空過濾裝置(Millipore,Bedford,MA)過濾條件培養(yǎng)基并加載到對于培養(yǎng)基中人抗體的量而言是適當(dāng)尺寸的蛋白A-SepharoseFastFlow牙主(AmershamBiosciences)上。用20斗主體積的PBS充分地洗滌柱子，然后用0.1MGIy-HCl,pH3.6,0.15MNaCl洗脫抗體，接著用1MTris-HCl,pH8.0中和抗體。通過SDS-PAGE分析級分，匯集陽性級分并用離心濃縮機(Vivaspin,50,000MWCO:Sartorius,Gettingen,Germany)濃縮。SephadexG-25脫鹽柱(NAP,AmershamBiosciences)用于對PBS,pH7.4的緩沖液交換。最后，使用具有0.22孔徑的注射器式濾器對抗體進行過濾消毒，并通過Lowry法測定抗體濃度。使用鱟阿米巴樣細胞溶解物("LAL")測定法(AssociatesofCapeCod,Falmouth,MA)測定熱原含量。該測定法的枱r測極限為0.06EU/mg。如果該測試是陰性的，則樣品被認為是無內(nèi)毒素的。人IgG定量ELISA:為測定存在于上清液和純化的貯存物中人抗體的量，使用了下列實驗方案。將處于碳酸鹽緩沖液中的山羊抗-人Fcy特異性抗體(JacksonImmunoresearchLaboratories,WestGrove，PA)以0.5lng/孔包被96孔平板(Nunc，Denmark)上，在37°C下溫育l小時。然后用Superblock(Pierce,Rockford,IL)封閉平板30分鐘，接著添加樣品到平板中。使用總?cè)薎gG(Sigma)或純化的人IgGl或IgG4(KirinBreweryCo.,Ltd)產(chǎn)生標準曲線。在37。C下溫育平板1小時，在PBS/l%BSA/0.1%Tween20(Sigma)t洗滌，并用綴合有辣根過氧化物酶(HRP,JacksonImmunoresearch)的山羊抗-人Fey特異性抗體^r測結(jié)合的抗體，在3"C下溫育1小時。添加TMB底物(Sigma),溫育10分鐘，并用H2S04(LabChemInc.,Pittsburgh,PA)停止反應(yīng)。在酶標儀上測定450nm處的光密度(OD)。OX40特異性抗體檢測ELISA:通過ELISA測定抗體效價、特異性以及雜交瘤產(chǎn)量。簡單地說，用處于碳酸鹽緩沖液(pH9.4)中的50jil的hOX40:hFc以5pg/ml包被96孔平底平板，在4°C下溫育過夜或在37。C下溫育1小時。在用PBS/0.l%Tween20洗滌兩次后，用PBS/1%BSA/0.1%Tween20封閉平板，在37°C下溫育1小時。在封閉緩沖液中稀釋血清、上清液體或純化的抗體，添加到孔中，然后在37。C下溫育平板1小時。用PBS/0.1%Tween20洗滌平板4次，添加l:2000稀釋的過氧化物酶綴合的綿羊抗-人k檢測抗體(TheBindingSite,Birmigham,UK)。在37°C下溫育1小時后，洗滌平寺反并添加TMB(Sigma)底物，在室溫下溫育10-30分鐘。用H2S04(LabChem)停止反應(yīng)，并通過酶標儀測定450nm處的光密度。流式細胞術(shù):通過使用人OX40穩(wěn)定的CHO-K1轉(zhuǎn)染子或三天PHA+IL2活化的人PBMC的流式細胞檢測分析測定抗體效價、特異性和相對結(jié)合親和力。在染色緩沖液PBS+2%FBS+0.1%NaN3+10mMEDTA中洗滌細胞一次，然后重懸于50inl體積的血清、上清液或純化的抗體中。在水上細胞與抗體溫育20分鐘，在染色緩沖液中洗滌兩次，然后重懸于抗-人IgG-藻紅蛋白標記的第二抗體中。使用了兩種不同的#元體(1)山羊#元-人IgG(SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,AL)或(2)小鼠抗-人IgG(BDPharmingen,SanDiego，CA)。在水上溫育20分鐘后，洗滌細胞一次并1%多聚甲醛用固定IO分鐘。在最后一次洗滌后，將細胞重懸于染色緩沖液中并使用FACScan或FACSCalibur流式細月包4義(BectonDickinsonBiosciences,PaloAlto,CA)獲取樣品,使用Cellquest(BectonDickinsonBiosciences)或FlowJo(TreeStar,Inc.,SanCarlos,CA)軟件分析數(shù)據(jù)。還用小鼠抗-人OX40抗體L106(BectonDickinson)染色活化T細胞，該抗體直接綴合有藻紅蛋白或用抗-小鼠IgG-PE(SouthernBiotechnologyAssociates.)才企測其結(jié)合。OX40L封閉測定法:為測定抗-人OX40抗體是否能封閉OX40L與可溶性O(shè)X40的結(jié)合，使用了ELISA和流式細胞術(shù)實驗方案。在ELISA中，用處于^^友酸鹽ll沖液(pH9.4)中的重組的可溶性hOX40:hFc以2pg/ml包被96孑LNunc平底平板，在37。C下溫育1小時。用PBS/0.l%Tween20洗滌平板，并添加Superblock(Pierce)到孔中以封閉非特異性結(jié)合。在PBS/Tween中將測試抗體稀釋到1pg/ml并添加到平板中。在37。C下溫育1小時后，添加FLAG標記的重組的可溶性人OX40L(AlexisBiochemicals,SanDiego,CA)到?jīng)]有洗去抗-OX40抗體的適當(dāng)?shù)目字?。?小時溫育后，洗滌平板并添加抗-FLAG-過氧化物酶綴合的抗體(Sigma)到孔中，在37。C下溫育1小時。添加TMB底物，10分鐘后用H2S04停止反應(yīng)，使用酶標儀閱讀450nm處的結(jié)果。在流式細胞計數(shù)測定中，純化人CD4+T細胞并用PHA+IL2活化2天。洗滌細胞并重懸于染色緩沖液中，然后在水上與0.005-50貼/ml增加量的人抗-人OX40抗體溫育20分鐘。接著，添加可溶性的重組OX40L-FLAG到細胞中。洗滌細胞并與綴合PE的抗-FLAG(Sigma)溫育。在另一次洗滌后，用1%多聚甲醛固定細胞并在FACScan或FACScalibur上進行分析。在下列公式中使用OD或陽性百分數(shù)測定抑制百分數(shù)0/o抑制400-((樣品/最大結(jié)合)x100)?？?OX40抗體交叉封閉測定法:為了測定抗體是否結(jié)合相同的人OX40"表位，，，使用了ELISA實驗方案。用處于碳酸鹽緩沖液中的人抗-人OX40抗體以2pg/ml包被Nunc96孔平底ELISA平板，在37。C下Biosciences,Tokyo,Japan)或ACT35(BDPharmingen)與2pg/ml重組人OX40:mFc融合蛋白(AlexisCorporation,SanDiego,CA)在室溫下預(yù)溫育30分鐘。添加抗體-OX40:mFc蛋白的組合到平板中并在37°C下溫育1小時。在3次洗滌后，用過氧化物酶綴合的綿羊抗-小鼠Ig(AmershamBiosdences)檢測結(jié)合的OX40:mFc。如上所述完成ELISA。在下列公式中使用每個樣品的OD測定抑制百分數(shù)％抑制=100-((樣品/最大結(jié)合)><100)。為確定這些人抗-人OX40抗體是否封閉小鼠抗-人OX40抗體，進行了該ELISA的變型。除小鼠抗-人OX40抗體包被在平板上以及112V8、112F32、112Y131和112Z5與人OX40:hFc蛋白預(yù)溫育之外，該方法與上述方法相同。用綿羊抗-人IgG-辣根過氧化物酶第二抗體(AmershamBisociences)檢測OX40蛋白與包被的抗體的結(jié)合。流式細胞計數(shù)測定也用于確定抗體是否彼此交叉封閉。如下所述由外周血單核細胞中純化人CD4T細胞，并用1pg/ml植物血球凝集素(Remel,Lenexa，KS)和10ng/ml重組人白細胞介素2(BDPharmingen)活化2-3天。洗滌細胞并在補充有2%胎牛血清和0.1。/。疊氮化鈉的PBS中用10jug/ml的測試抗體標記，在冰上溫育30分鐘。無需洗滌，添加10|Lig/ml的相同抗體的生物素化形式到孔中，并在水上再溫育細胞30分鐘。接著，通過添加緩沖液洗滌細胞并在4°C下以1200RPM離心3分鐘。通過與抗生物素蛋白鏈菌素-藻紅蛋白(SA-PE,BDPharmingen)溫育20分鐘，繼之以如所述的另一次洗滌來檢測生物素化的抗體的結(jié)合。在1%多聚曱醛中固定細胞10分鐘。在最后一次洗滌后，將細胞重懸于染色緩沖液中，并使用FACSCalibur流式細胞儀(BectonDickinsonBiosciences,PaloAlto,CA)獲取才羊品。4吏用Cellquest(BectonDickinsonBiosciences)或FlowJo(TreeStar,Inc.,SanCarlos,CA)軟件分析數(shù)據(jù)。所測試的抗體包括112F32、112V8、112Y55、112Y131、112Z5、抗-DNP(人IgGl陰性對照)、小鼠抗-人OX40抗體、克隆L106、克隆315和克隆ACT35。使用下列公式確定抑制百分數(shù)lOO-(測試抗體的幾何平均值/最大的幾何平均值)x100。對抗體測試自身以及彼此結(jié)合的抑制。由全血純化人PBMC:通過ScrippsGreen醫(yī)院(LaJolla，CA)正常的供血者程序，從18-50歲健康供體收集全血。添加肝素以防止血液凝結(jié)。沒有具體標明人種、種族性或性別。在PBS中稀釋血液，然后用Ficoll-PlaquePlus(AmershamBiosciences)鋪在下面。從血清中分離單核細胞并通過沒有制動的1800RPM離心沉淀。收集含有PBMC的界面并用PBS洗滌兩次。純化CD4+T細胞:使用來自MiltenyiBiotec.(Auburn,CA)的陰性分離試劑盒純化人CD4+T細胞。于PBS/0.5%BSA/2mMEDTA中用特異于CD8、CDllb、CD16、CD19、CD36和CD56的半抗原綴合的抗體混合物標記PBMC,在4。C下溫育15分鐘。在洗滌兩次后，將細胞重懸于抗-半抗原磁珠(MACS珠子)中，并在4°C下溫育細胞15分鐘。接著洗滌細胞并施加到已預(yù)洗滌并嵌入;茲體的LS/VS+柱上。用緩沖液洗滌柱子3次。"未接觸的，，CD4+細胞包含在穿過柱子的緩沖液流中。通過流式細胞檢測分析確定純度，使用了特異于人CD3和人CD4的抗體，兩者都直接綴合有熒光染料(BDPharmingen)?？蛇x地，用CD4微珠(MiltenyiBiotec.)選擇的CD4+細胞是陽性的。該操作類似于上述操作，不同之處在于通過除去柱子中的磁體并用活塞加壓輸送5ml緩沖液通過柱子，洗脫附著于柱子上的細胞?；旌系牧馨图毎磻?yīng)測定法:純化來自兩位供體的PBMC,并將來自每位供體的1x105細胞添加到存在或不存在人抗-人OX40抗體或陰性對照人IgG4(抗-人血清白蛋白，KirinBreweryCo.,Ltd.)的96孔U底平板中(Ukyo,等，Immunology109(2):226(2003))。取決于該研究，由0.005-100pg/ml測試抗體。測試多個供體對。所使用的培養(yǎng)基為補充有10%人AB血清(MPBiomedical,Irvine,CA)、青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺和2-琉基乙醇的RPMI-1640。在第6天，添加lpCi氮化胸腺嘧啶pHTdR)到每個孔中，進行最后的18小時培養(yǎng)。溶解細胞并轉(zhuǎn)移到玻璃濾墊上，使用閃爍計數(shù)器(Wallac,Turku,Finland)計數(shù)。66急性移植物抗宿主病體內(nèi);^莫型:用20pg大鼠抗-小鼠IL2受體卩鏈抗體(TM卩l(xiāng),Tanaka,等，JExpMed178(3):1103-7(1993))注射5-10周齡的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)雄性小鼠以耗竭內(nèi)源性自然殺傷細胞。第二天，使用銫源讓小鼠接受2.5Gy輻射。4小時后，通過腹膜內(nèi)注射讓小鼠接受處于PBS中的總共10個的人PBMC,接著馬上靜脈注射處于100plPBS中的2、20、100或200pg的人抗-人OX40或陰性對照hTgGl(抗-二硝基酚(抗-DNP),KirinBreweryCo.Ltd.)抗體?？蛇x地，抗體處理延遲至第3-6天以測試抗-OX40抗體的治療潛能。每3-4天對小鼠稱重，每周接受抗-IL2R卩抗體一次。在第12天，處死小鼠并評估宏觀病理學(xué)。切下脾用于流式細胞^^測分析，肝和腸用于組織學(xué)分析，并收集血清用于人細胞因子和抗體分析(Watanabe,等，Clin.Immunol.120:247(2006))。慢性移植物抗宿主病體內(nèi)模型:慢性GVHD的模型由急性異種GVHD才莫型(Watanabe,等，Clin.Immunol.120:247(2006))改造而來。通過轉(zhuǎn)移正選擇的人CD4T細胞到使用與上述方法相同的方法制備的SCID小鼠中誘發(fā)疾病。通過在第O天腹膜內(nèi)注射讓小鼠接受106個正選擇的CD4T細胞，在第0天開始每周靜脈注射一次2、20或100^g的抗-OX40或?qū)φ湛贵w。到第30天疾病明顯，并在第48天評估小鼠。切下脾和淋巴結(jié)用于流式細胞檢測分析，皮膚和肺用于組織學(xué)分析，以及血清用于人細胞因子分析。人細胞因子分析:根據(jù)廠商說明書(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA),使用多路傳輸技術(shù)測定小鼠血清中一組8種人細胞因子。純化人自然殺傷細胞:使用來自MiltenyiBiotec.(Auburn,CA)的陰性分離試劑盒純化人自然殺傷("NK")細胞。于PBS/0.5%BSA/2mMEDTA中用特異于T細胞、B細胞、千細胞、樹突細胞、單核細胞、粒細胞和紅系細胞的生物素綴合的抗體混合物標記PBMC,在4。C下溫育15分鐘。接著添加抗生物素磁珠("MACS珠子，，)。細胞在4。C下溫育15分鐘，然后洗滌并施加到已預(yù)洗滌并嵌入磁體的LS/VS+柱上。用緩沖液洗滌柱子3次。"未接觸的"CD56+NK細胞包含在穿過柱子的緩沖液流中。通過流式細胞檢測分析確定純度，使用了特異于人CD56和人CD3的抗體，兩者都直接綴合有熒光染料(BDPharmingen)?？贵w依賴性細胞毒作用測定法(ADCC):由人PBMC純化NK細胞并與處于補充有10。/o人AB血清(MPBiomedical,Irvine,CA)、青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺和2-巰基乙醇的RPMI-1640中的20ng/ml重組人白細胞介素2(BDPharmingen)培養(yǎng)48小時。在Cytotox96非放射性細胞毒性測定(PromegaCorp.,Madison,WI)中將這些細胞用作效應(yīng)細胞。靶細胞是親本或人OX40轉(zhuǎn)染的EL-4細胞。在圓底96孔組織培養(yǎng)平板中，于冰上將5000個革巴細胞與0.005-10pg/ml的抗-人OX40抗體或?qū)φ湛贵w溫育30分鐘。添加20倍數(shù)量的效應(yīng)NK細胞到孔中，最終體積為100并在37。C下與5。/。C02溫育4小時前以200xg離心平板3分鐘。以250xg離心平板5分鐘并將50pl的上清液轉(zhuǎn)移到ELISA平板中。添加50pi體積的測定緩沖液到平板中。在室溫下溫育30分鐘后，添加50pl的停止溶液到孔中并測定490nm處的吸光度。所必需的對照包括單獨的靶細胞(天然的)、在溫育的最后45分鐘用溶解緩沖液處理的單獨的耙細胞(最大值)、單獨的效應(yīng)細胞、僅含有培養(yǎng)基(添加(體積校正)及不添加溶解緩沖液)的孔。在從所有孔中扣除培養(yǎng)基背景以及從靶細胞最大值中扣除體積校正值后，使用下列公式確定特異性溶解百分數(shù)細胞毒性百分數(shù)-((實驗值-天然的效應(yīng)細胞值-天然的耙細胞值)/(把細胞最大值-天然的靶細胞值))x100。分離人抗-OX40抗體基因:通過離心收集產(chǎn)生112V8抗體(IgG4)的培養(yǎng)的雜交瘤細胞(112V8(ATCC編號PTA-7219,2005年11月17日保藏的))。根據(jù)廠商說明書，使用Rneasy試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)從這些細胞中純化總RNA。SMARTRACEcDNA擴增試劑盒(ClontechCo.,Ltd.,PaloAlto,CA)用于從雜交瘤細胞總RNA克隆編碼免疫球蛋白基因可變區(qū)的cDNA。簡言之，通過逆轉(zhuǎn)錄酶由2pg的RNA制備第一鏈cDNA。該cDNA用作模板用于聚合酶鏈反應(yīng)("PCR")來擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的一部分(分別為"HV"和"LV")。所擴增的序列還含有前導(dǎo)序列。反應(yīng)如下2.5UPfuUltraDNA聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA);0.23'引物(用于重鏈IgGlp,用于輕鏈hk5,表1);1X通用引物混合物A,用于5'末端(包括在SMARTRACE試劑盒中的UMP引物混合物A);200jliMdNTP混合物；1mMMgCl2;PfuUltra緩沖液(終濃度為1x);和cDNA模板。熱循環(huán)程序為94°Cx30秒、72°Cx3分鐘的5個循環(huán)。94°Cx30秒、70。Cx30秒、72°Cx3分4中的5個循環(huán)。94。Cx30秒、68°Cx30秒、72°Cx3分鐘的25個循環(huán)，之后在72°C下延伸7分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳收集并通過QIAquick凝膠提取試劑盒(QiagenCo.,Ltd.,Germany)純化擴增的DNA片段。使用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(InvitrogenCorp.)將純化的HV和LV的DNA片段整合入pCR4Blunt-TOPO載體中，并將每個構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，然后進行克隆。使用特異性引物(M13F、M13R,表l)分析構(gòu)建質(zhì)粒中每個插入物(HV和LV)的核苦酸序列?；讷@得自HV和LV的序列，設(shè)計寡核普酸引物用于擴增VH(V8H38、V8H39)和VL(V8L42、V8L43)(表1)。將112V8VH和VL克隆入IgGl表達載體中。筒言之，設(shè)計含有5'-Sal1和3'-Nhel限制性內(nèi)切酶識別位點的寡核普酸引物用于通過PCR擴增HV的可變區(qū)。使用pTopoV8VHminiprepDNA作為才莫板、V8H38和V8H39作為引物(表l)以及PfuUltraDNA聚合酶進行PCR。在用Nhel和Sail消化PCR產(chǎn)物后，將410bp片段亞克隆入用Nhel和Sail預(yù)消化的IgGl表達載體(IDECPharmaceuticals,SanDiego,CA，N5KG1-ValLark(一種N5KG1的改良載體，美國專利號6,001,358))(8.9kbDNA片段)中。通過限制性內(nèi)切酶酶切消化分析HV的可變區(qū)的存在。作為第二步，如下將LV插入N5KG1-ValLark-VH載體中通過兩種DNA限制性內(nèi)切酶BglII和BsiWI消化DNA載體。分離9.1-kbDNA片段。類似于重鏈構(gòu)建體，設(shè)計用于PCRLV的一組引物以包含針對5'Bgll和3'BsiWi的識別位點。這些引物V8L42和V8L43用于從pTopoV8VLminiprep質(zhì)粒DNA擴增VL。用Bglll和BsiWI消化PCR產(chǎn)物，并通過瓊脂糖凝膠電泳和凝膠純化分離。用T4DNA連接酶將該含有V8VL的片段與已制備的9.1kb載體連接，并用于轉(zhuǎn)化T叩IO細胞(InvitrogenCorp.)。選擇陽性的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體。純化表達載體pGlK112V8，并通過限制性分析確認存在112V8LV和112V8HV區(qū)。分離112Y55(ATCC編號PTA-7220,2005年11月17日保藏的)、112Y131(ATCC編號PTA-7218,2005年11月17日保藏的)和112Z5(ATCC編號PTA-7216,2005年11月17日保藏的)HV和LV可變區(qū)，并使用相同的實驗方案進行測序。用于擴增特異性HV和LV的引物列于表1中?？贵w亞類部分決定了第二種效應(yīng)子作用，如補體激活或Fc受體(FcR)結(jié)合以及抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)(Huber,等，Nature229(5284):419-20(1971);Brunhouse,等，MolImmunol16(11):907-17(1979))。在鑒定最佳類型的用于特定應(yīng)用的抗體中，可考慮抗體的效應(yīng)子作用。例如，WgGl抗體具有相對長的半衰期，在固定補體中是非常有效的，并且它們能結(jié)合FcRI和FcRII。與此相反，人lgG4抗體具有較短的半衰期，無法固定補體且對FcR具有較低的親和力。在lgG4的Fc區(qū)中用脯氨酸取代第228位絲氨酸(S228P)減少了使用hlgG4所觀察到的異質(zhì)性并增力口了血清半衰期(Kabat,等，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest第5版(1991).;Angal,等,MolImmunol30(1):105-8(1993))。用谷氨酸取代第235位亮氨酸(L235E)的另一突變消除了殘留的FcR結(jié)合和補體結(jié)合活性(Alegre,等，JImmunol148(11):3461-8(1992))。所得到的具有這兩種突變的抗體稱為IgG4PE。hlgG4氨基酸的編號方式來源于Kabat(Kabat,等，S叫職cesofproteinsofimmunologicalinterest第5版(1991))。通過用Nhel和BglII消化pGlK112V8以釋放含有112V8VH和112V8VL的片段，從而產(chǎn)生表達重組112V8IgG4PE的載體。將該載體與使用相同的酶切割的IgG4PE表達載體(pN5KG4PE-Lark,IDECPharmaceuticals,美國專利號6,001,358)連接。通過限制性內(nèi)切酶酶切消化確認所得到的質(zhì)粒pG4PEK112V8。以相同的方法，將來自112F32雜交瘤(ATCC編號PTA-7217,保藏日期2005年11月17日)的RNA用于生成產(chǎn)生重組112F32G1和112F32G4抗體的載體，在RACE反應(yīng)中分別用于擴增重鏈和輕鏈基因的3'引物是HH-2和HK-2。使用H725'和M2H3'進行112F32HV的擴增。112F32LV擴增引物是F32K5'和K52D3'(表1)。IgG4表達載體pN5KG4獲得自IDECPharmaceuticals(美國專利號6,001,358.)。通過限制性內(nèi)切酶酶切消化和測序確認所得到的載體pKLGl/F32K3H和pKLG4/F32K3H。112F32HV的cDNA的核苷酸序列(從起始密碼子(ATG)到可變區(qū)末端)SEQIDNO:3A丁GGAGTGGGGGCCGTGCTGG。TTTTCCTTGTTGTTATTiTAGAAGGT。TCCAGTGTGGG60GTGCAGCTOGTGGAGTCT。CJGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC20180240300360420112F32LV的cDNA的核苷酸序列(從起始密碼子(ATG)到可變區(qū)末端)SEQIDNO:4ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTC丁GTTTCCCAGGTGCCGTCACCATTACTTGTCGGGCGAGTCAGGATA竹AGCAGCTGGTTAGCCTGG"iA;TCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAOTCCCTOA士CTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTC.CCATCAAGGTTCAGCGGCAG丁GGATtTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCdTGAAGATTTTOCAACTTATTACTOCCAAC^GTATAATAOTTAC;CCCCTCACCTTC一G.GCCAAGGOA-GA^GACTOGAGATTAAACGA.60120.賜2403003—3卯112V8HV的cDNA的核苷酸序列(從起始密碼子(ATG)到可變區(qū)末端)SEQIDNO:57112V8LV的cDNA的核苷酸序列(從起始密碼子(ATG)到可變區(qū)末端)SEQIDNO:6ATOGAAACCCCAGCGCAGCT丁CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGA丁ACCACCGGA60GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCT^CAGGGGAAAGAGCCACC120GACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG300CqTGAACATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGC/y3TATGATAG(TCGCTCACTTTCGCJCCiGA360GGG入Ct入AGGTGGAGATCAAACGAACT387112F32HV的cDNA的氨基酸序列(前導(dǎo)序列(粗體)和可變區(qū))SEQIDNO:7MEWGPCWVFLVVILEGVQCGVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSM'NWVRQAP60GKGLEWVSY1SSSSSTIYYADSVKGRFTKRDNAKNSLYLQMNSLRDEpTAVYYCARGVY120HNGWSFFDYWGQGTLLTVSS140112F32kLV的cDNA的氨基酸序列(前導(dǎo)序列(粗體)和可變區(qū))SEQIDNO:8MDMRVLAQLLGIXLLCFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGNRVTITCRASQD1SSWLAWYQQ60KPEKAPKSLIY個ASSLQSGVPS鵬GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTF120GQGTRLEIKR130112V8HV的cDNA的氨基酸序列(前導(dǎo)序列(粗體)和可變區(qū))SEQIDNO:9MDTLCSTLLLLTIPSWVLSQTLKESGPTLVKPKQTLTLl"CTFSGFSLSTSGMGVGWIRQ60PPGKALEWLAVrYWDDHQLYSPSLKSRLTITKDTSKNQWLTMTNMDPVD丁ATYYCAHRR120GAFQHWGQGTLVTVSSASTKG141112V8LV的cDNA的氨基酸序列(前導(dǎo)序列(粗體)和可變區(qū))smmN"inMETPAQLLFLIXLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQK60PGQAPRLUYGASSRATGEPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDSSLTFGG120GTKVEIKRT129<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>112Y55HV的cDNA的核苷酸序列(從起始密碼子(ATG)到可變區(qū)末端)SEQIDNO:38ATGGACACACTTTGCTCCACGCTCCTGCTGCTGACCATCCCTTCATGGGT亡TTGTCCCAG60ATCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGCTGTCC20TGCACCTTCTCTGGGTTCTCACTCAGCACTAGTGGAGTGGGTGTGGGCTGGATCCGTCAGlgJ3360qGGGCTTTTGATATC丁GGGGCCAAGGGACAA丁GGTCACCGTCTCTTCA408112Y55LV的cDNA的核普酸序列(從起始密碼子(ATG)到可變區(qū)末端)SEQIDNO:39ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA60GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGACCCATC120180CCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATTTAGCAGGGCCACT。GCATCCCA240300360GGGACCAAGGTGGAAATCAAA381112Y131HV的cDNA的核苷酸序歹ll(從起始密碼子(ATG)到可變區(qū)末端)SEQIDNO:40ATGGACACACTTTGCTCCACGCTCCTGbTGCTGACCATCCCTTCATGGGTCTTGTCCCAG60ATCACCTTGAAGGAGTCTGCJTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAOACCCTCACGCTGACC;120TGCACCTTCTCTGGATTCTCACTCAGCACTAGTGGAGTGGGTGTGGGCTGGATCCOTCAG，的CCCCCAGGAAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACTCATTTATTGGGATGATCAt"AGCCCCTAC240300360GGGGCTTTTGATATCTGGGGCCAAtiGGACAATGGTCACCOTCTCTTCA408112Y131LV的cDNA的核苷酸序列(從起始密碼子(ATG)到可變區(qū)末端)SEQIDNO:41ATCGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA60GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGA'GCCACC120180GGCCIAGGCTCCCAGGCTgCTCATCTATGATGCATCCAACAGOGCCACTGGCATCCCAGCC240AGGTTCAGTGGCAGTGGGCCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAtMGCCT300GAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGqGTAGCAACTGGCATCCGACGTTCGGCCAACJGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATC381112Z5LV的cDNA的核苷酸序列(從起始密碼子(ATG)到可變區(qū)末端)SEQIDNO:4260GTGCTGGAATTCGCCCTTCTAATACGACTCACTATAGGCiCAAGCAGTGGTATCAACGCAG1.20180240300GGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAA(GCCAAGAACTCtlCTOTATCTGCAAATGAACAGT360CTGAGAGTTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGTAAAAOATATTAGTGGCJGGTACAGC420TTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA462112Z5LV的cDNA的核苦酸序列(從起始密碼子(ATG)到可變區(qū)末端)SEQIDNO:4360TCCAGCCACCCTGTCTTTGTCtCCAGGGGAAAGAGCCACC120300GAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGC。TAGCAACTGGCCGATCACClTCGt5CCAA.366GGGACACGACTGGAGATTAAA381112Y55HV的cDNA的氨基酸序歹'J(前導(dǎo)序歹Q(粗體)和可變區(qū))SEQIDNO:44MDTLCSTLLLLTIPSWVLSQITLKESGPTLVKPTQTLTLSCTFSGFSLSTSGVGVGW諷Q60PPGKALEWLALIHWDDAERYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDLVDTATYYCAHTR120GAFDIWGQGTMVTVSS136112Y55LV的cDNA的氨基酸序歹寸(前導(dǎo)序歹寸(粗體)和可變區(qū))SEGIDNO:45M鍅TPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERAITLSCRASQSVSSSFLAWYQQK60PGQAPRLL1YGAFSRATGIPDRFSJ3SGSGTDFTLT1SRLEPEDPAVYYCQQYDSSRTFGQ120GTKVEIK127112Y131HV的cDNA的氨基酸序列(前導(dǎo)序列(粗體)和可變區(qū))SEGIDNO:46MDTXCSTLLLLTIPSWVLSQ1TLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGW1RQ60PPGKALEWLAL1YWDDHSPYSPSLKSRLT1TKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTA.TYYCARTR120GAFDI^VGQGTMVTVSS136112Y131LV的cDNA的氨基酸序列(前導(dǎo)序歹寸(粗體)和可變區(qū))SEQIDNO:47MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQGVSSYLAWYQQKP60GQAPRLLIYOASNRATGIPARFSGSGPGTDPTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWHPTF。Q120GTKVEIK1.27112Z5HV的cDNA的氨基酸序歹'J(前導(dǎo)序歹'J(粗體)和可變區(qū))SEQIDNO:48MTMITPSLVP.SSDPLVTAASVLEFALLIRLTIGQAVVSTQSTGGGLVQPGRSLRLSCAAS60.GFTLDDYGMHWVRQAPGKGLEWVSG1SWNS.DSIGYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNS120LRVEDTALYYCVKDISGWYSPDYWGQGTLVTVSS154112Z5LV的cDNA的氨基酸序歹寸(前導(dǎo)序歹'J(粗體)和可變區(qū))SEQIDNO:49MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKP60GQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLT1SS^EPEDFAVYYCQQRSNWP1TFGQ!20GTRLEIK127由CHO細胞產(chǎn)生重組人抗-OX40抗體:為了產(chǎn)生重組抗體，將含有抗-OX40抗體的單個抗體載體電穿孔入宿主細胞一中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞，ATCC弁CRL-9096)的dhfr-缺陷型細胞林中，并從轉(zhuǎn)染細胞的上清液中分離重組抗體。簡言之，通過DNA限制酶Nrul線性化10(ig純化的DNA表達載體，并使用BioRad電穿孔儀(0.8kV,25uF)將DNA轉(zhuǎn)染入3x106個CHO細胞中。將轉(zhuǎn)染細胞接種在96孔培養(yǎng)平板中，在補充有青霉素/鏈霉(BioWhitaker)、HT(Sigma)和遺傳霉素(InvitrogenCo卬.)的含有谷氨酰胺的EX-CELL325PFCHO無血清培養(yǎng)基(JRHBioscience,Lenexa,KS)中選擇含有該DNA載體的CHO細胞。在選擇出幾株穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞系后，通過ELISA鑒定高的人IgG產(chǎn)生細胞系，并用于產(chǎn)生重組抗體。^滋辨2該實施例描述了針對人OX40的人單克隆抗體的多個特征。用處于CFA/BFA中的可溶性的重組hOX40:hFc、處于RIBI中的hOX40:hFC+hOX40:hFc-ova綴合物、處于RIBI中的熱變性的hOX40:hFc或處于RIBI中的經(jīng)輻射的、活化的人T細胞免疫接種KMmiceTM。一些小鼠產(chǎn)生在人IgGOX40特異性效價范圍內(nèi)的抗-人OX40特異性抗體。將來自最高應(yīng)答者的脾細胞與骨髓瘤細胞融合以生成產(chǎn)生人抗-人OX40的雜交瘤。通過ELISA和流式細胞術(shù)測定抗-OX40抗體的產(chǎn)生，分別使用了重組的可溶性hOX40:hFc和CHO-OX40轉(zhuǎn)染子。通過有限稀釋克隆陽性雜交瘤以產(chǎn)生單克隆雜交瘤(表2)。表2:用于產(chǎn)生抗體的抗原抗體抗原<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>對一些抗體進一步鑒定對人OX40的相對結(jié)合親和力、體外封閉人OX40配體結(jié)合的能力、彼此交叉封閉的能力、體外阻斷增殖的能力、體內(nèi)阻斷炎癥的能力以及介導(dǎo)ADCC的能力(表3)。112F32、112V8、112Y131、112Y55和112Z5全都特異性結(jié)合活化的人T細胞，但不特異性結(jié)合靜息的人T細胞(圖1)。用不同濃度這些人抗-人OX40抗體的結(jié)合是可飽和的。通過滴定標記的活化人T細胞需要的抗體量測定每種抗體的最大結(jié)合(圖2)。獲得相對結(jié)合親和力的變化范圍(KD和BMAX,表3)。還測定了純化的小鼠抗-人OX40抗體L106的結(jié)合，與L106相比，112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5全都具有對活化T細胞更高的BMAX?！?02401表3:人抗-人OX40單克隆抗體的特性<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>*:m;在50jig/ml下不抑制A:+:在體外抑制增殖或在體內(nèi)抑制疾病，未定量#:NT;未測試@:使用10pg/ml不相關(guān)抗體的溶解百分數(shù)為14%通過ELISA分析OX40抗體以確定是否彼此竟?fàn)幗Y(jié)合可溶性O(shè)X40。將單種人抗體包一皮在96孔平板的孔中。將hOX40:mFc與可溶性抗-OX40抗體(封閉抗體)預(yù)溫育，然后添加到包被的孔中。用抗-小鼠IgG-HRP檢測hOX40:mFc與包被的抗體的結(jié)合。使用下列公式確定抑制百分數(shù)(100-(OD樣品/OD最大結(jié)合樣品))*100(圖3A)。此外，將小鼠抗體包被在96孔平板的孔中(L106、315、ACT35湖小鼠IgG),并讓hOX40:hFc與封閉抗體預(yù)溫育。用綿羊抗-人IgG-HRP檢測hOX40.'hFc的結(jié)合(圖3B)。對于這些人抗-人OX40抗體，已鑒定了三組"表位，，。U2V8、112Y55和112Y131都彼此交叉封閉，而112F32和112Z5則各自具有獨特的結(jié)合位點。112V8、112Y131和112Y55部分降低112Z5的結(jié)合，但反過來卻不這樣，112Z5僅封閉其自身。這暗示與112V8、112Y55和112Y131相比，112Z5識別不同的表位，結(jié)合的任何降低可能是由于空間位阻之故。這些人抗-OX40抗體并不封閉L106、315或ACT35結(jié)合OX40(圖3A和3B),而L106封閉其自身和ACT35,與不結(jié)合040的對照抗體(實線)相比，其4又降低10%的112V8和112Y131結(jié)合。這表明在此所述的抗體識別不同于L106的表位?？寺?15降低112V8和112Y131結(jié)合，^a由于后兩種抗體并不封閉315結(jié)合，因此它們必定結(jié)合不同的表位。還使用流式細胞計數(shù)測定來評估抗體封閉結(jié)合活化人T細胞表面表達的OX40的能力。用封閉抗體染色活化T細胞，然后添加生物素化的抗-OX40抗體。此外，用小鼠抗-人OX40抗體標記活化的人T細胞以封閉OX40結(jié)合。用SA-PE檢測生物素化的抗-OX40抗體與這些細胞的結(jié)合。通過流式細胞儀分析細胞。使用相同的公式，將陽性SA-PE染色的幾何平均值用于計算抑制百分數(shù)，即(1OO-(OD樣品/OD最大結(jié)合樣品))*100。將這些數(shù)據(jù)(圖4A和4B)與ELISA分析相關(guān)聯(lián)。人抗-人OX40抗體識別3個表位，112F32識別第1個，112Z5識別第2個，112V8和112Y131識別第3個。照ELISA數(shù)據(jù)的情況看，112Z5僅封閉其自身，但其結(jié)合為112V8和112Y131所降低。對于112V8和112Y131的L106封閉同樣如此。如果L106首先結(jié)合細胞，則112V8和112Y131仍能有效結(jié)合人0X40。無i侖如何，112V8和112Y131抑制了L106的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)一并考慮暗示抗體在空間上阻礙了L106的結(jié)合，但不識別相同的表位。112F32和U2Z5并不封閉L106的結(jié)合。ACT35并不抑制112F32、112V8、112Y131或112Z5的結(jié)合，但克隆315降低50%的112V8和112Y131的結(jié)合。對活細胞的抗體結(jié)合和檢測可包括內(nèi)在化表面分子，使得單種抗體的結(jié)合水平可由于OX40的表面表達整體上降低而被降低，但不封閉抗體的結(jié)合。與較低親和力抗體相比，更高親和力抗體可導(dǎo)致更多的內(nèi)在化。這就可以解釋在ELISA和流式細胞計數(shù)數(shù)據(jù)之間的差異以及取決于用于封閉的抗體而導(dǎo)致的結(jié)果差異。使用ELISA實驗方案測試112F32、112V8、112Y131、112Y55和112Z5封閉可溶性hOX40L結(jié)合包被的hOX40:hFc融合蛋白的能力(圖5A,表3)。用hOX40:hFc包^皮平板，并在封閉非特異性位點后，讓抗-OX40抗體進行結(jié)合。不洗滌就添加OX40L-FLAG到孔中。用抗-FLAG-HRP第二抗體檢測結(jié)合的配體。使用下列公式確定抑制百分數(shù)(100-(OD樣品/OD最大OX40L結(jié)合))*100。112V8、112Y55和112Y131阻止了85%的可溶性O(shè)X40L與hOX40:hFc的結(jié)合。112F32阻止了大約70%的可溶性hOX40L與hOX40:hFc的結(jié)合，以及112Z5封閉了67%的最大結(jié)合。這些數(shù)據(jù)暗示這些人抗-人OX40抗體與涉及配體結(jié)合的OX40的一部分結(jié)合。當(dāng)基于流式細胞計數(shù)的測定被用于監(jiān)測封閉可溶性O(shè)X40L與表達OX40的活化的人T細胞結(jié)合時，獲得了稍有不同的結(jié)果(圖5B)。先用抗-OX40抗體再用可溶性flag標記的-人OX40L標記活化的人T細胞。用抗-FLAG-PE抗體檢測OX40L的結(jié)合。使用相同的公式確定抑制百分數(shù)，即(100-(樣品/最大結(jié)合))*100。在該研究中，112F32不能阻止OX40L結(jié)合，112Z5的封閉降低了，而其他抗體112V8、112Y55和112Y131則持續(xù)不斷地具有類似的封閉能力。結(jié)果差異可取決于112F32和112Z5對OX40的親和力。還可取決于與可溶性O(shè)X40:mFc融合蛋白的二聚化相反的細胞表面上OX40蛋白的三聚化?？蛇x地，在活化T細胞表面上表達的OX40可與阻止112F32或降低112Z5結(jié)合OX40、但不封閉OX40L結(jié)合OX40的4-lBB(Ma,等，Blood106(6):2002-10(2005))或類似于BTLA的抑制分子(Cheung,等，ProcNatlAcadSdUSA102(37):13218-23(2005);Compaan，等，JBiolChem280(47):39533-6(2005);Croft，TrendsImmunol26(6):292-4(2005);Gonzalez,等，ProcNatlAcadSciUSA102(4):1116-21(2005);Sedy,等，NatImmunol6(U:90-8(2005))形成復(fù)合物。最后三種可能性可指向單種抗體的特異性表位結(jié)合。L106(—種小鼠抗-人OX40抗體)所識別的表位也依賴于OX40配體和OX40的確定，如L106封閉了95%的OX40L與重組OX40蛋白的結(jié)合，但—僅封閉60%的活化T細胞結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明在OX40上有多個表位，某些表位完全干擾了與OX40L的結(jié)合，而其他表位僅部分封閉該相互作用。這些抗體與不同表位的結(jié)合可能或不可能具有獨特的功能結(jié)果。通過任何一種不需要支配OX40信號傳導(dǎo)的方法對配體結(jié)合的封閉將為給定的抗體所削弱。為確定人抗-人OX40抗體是否能阻止經(jīng)由OX40的信號傳導(dǎo)，由同種異體供體使用總PBMC建立雙向混合的淋巴細胞培養(yǎng)物。在不同劑量的抗-OX40抗體或?qū)φ湛贵w存在或不存7天，重復(fù)三次。將1x105個細胞/供體添加到每個孔中。在培養(yǎng)的最后18小時用1pCi/孔SHtdR使平板受脈沖作用。收獲細胞并在閃爍計數(shù)器上計數(shù)。在對照或抗-OX40抗體存在或不存在下測定增殖(圖6)。112V8(圖6A)、112Y55和112Z5(圖6B)以及112Y55、112Y131和112F32(圖6C)全都能以劑量依賴性方式減少由同種異體細胞誘導(dǎo)的增殖的量，而陰性對照hlgG4、抗-人血清白蛋白則對增殖沒有影響(圖6A)。進行多次研究，應(yīng)答量值、CPM摻入的最大值取決于用于每次測定的供體PBMC的組合。在混合的淋巴細胞培養(yǎng)物中，CD4和CD8T細胞應(yīng)答于同種異體抗原。由于人抗-人OX40抗體而減少的增殖響應(yīng)可能歸因于對CD4和CD8T細胞的直接抑制。豸滋辨3該實施例描述了用人OX40的線性肽進行人抗-人OX40抗體的表位作圖。選擇人OX40胞外域中的三種肽(表4)用于開始進行為112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5所識別的表位作圖。表4:人OX40肽<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>肽以10jxg/ml包被96孑LMaxisorpELISA平板(Nunc)，在4。C下溫育過夜。用PBS/0.1%Tween20洗滌平板，然后在室溫下用酪蛋白緩沖液(Pierce)封閉3小時。添加10|ig/ml的在處于PBS/0.1%Tween20中的10%酪蛋白中稀釋的候選抗體。如對OX40特異性抗體檢測ELISA所述的，進行其余的ELISA。沒有一種人抗-人OX40抗體能可檢測地與這些人OX40肽反應(yīng)，而來自用這些肽免疫接種的小鼠的血清結(jié)合了適當(dāng)?shù)碾?。這些結(jié)果表明在所使用的檢測條件下，112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5不能可檢測地結(jié)合這些來自人OX40胞外序列的短的線性表位。如果這些序列包括在更長的肽序列中，則這些數(shù)據(jù)并不排除這些序列來自于為人抗-人OX40抗體所識別的序列。,滋辨4該實施例描述了人抗-人OX40單克隆抗體的體內(nèi)功能分析。將急性異種移植物抗宿主病(XGVHD)模型用于測試112V8G1人抗-人OX40抗體的體內(nèi)治療潛能(Watanabe,等，ClinImmunol120:247-259(2006))。在該沖莫型中，將人外周血單核細胞轉(zhuǎn)移到嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中。在轉(zhuǎn)移到小鼠之前，用抗-IL2R卩鏈抗體處理小鼠以耗竭內(nèi)源性鼠自然殺傷細胞，然后對它們進行亞致死量的輻射以使人細胞遷移到腸道中。人T細胞增殖并誘導(dǎo)移植物抗宿主樣病，導(dǎo)致體重減輕、血尿、腹水、肝和腸道中炎性細胞浸潤以及最終的死亡。與純化的T細胞轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)類似的癥狀一樣，該疾病主要由人T細胞所介導(dǎo)的。SCID小鼠按如上所述進行處理，外加在第0天給予112V8G1或人IgGl同種型對照(抗-DNP)重組抗體以測試OX40封閉的預(yù)防性潛能。在第0天，通過靜脈注射讓小鼠接受100、20或2的112V8G1抗體或100嗎抗-DNP。每3-4天測定體重一次。在第12天，殺死小鼠并分析疾病癥狀，收集脾進行流式細胞檢測分析。對第12天所觀察到的宏觀病理學(xué)評分如下，腹瀉(0-l)、腸和腹膜腔中出血以及腹膜炎(各自為0-5),具有更高的分數(shù)表明疾病更嚴重。所有疾病癥狀，與接受112V8G1的小鼠相比具有更高的病理學(xué)評分。所有測試劑量的112V8G都緩解或預(yù)防了這些癥狀(圖7A)。脾的分析結(jié)果與該觀察結(jié)果一致。通過流式細胞儀分析脾的單細胞懸液中人T細胞的存在。人T細胞存在于用對照抗體處理的小鼠脾中，^旦與對照動物中T細胞的數(shù)量相比，在112V8G1處理的動物中人T細胞的數(shù)量明顯更低(圖7B)。此外，使用多路傳輸技術(shù)測定血清中的炎性人細胞因子(干擾素i、胂瘤壞死因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)。與對照相比，在112V8G1處理的動物中炎性人細胞因子減少。最具戲劇性的影響是針對干擾素y水平的(圖7C)。已使在同種異體骨髓移植患者的外周血中OX40+T細胞的出現(xiàn)與慢性GVHD發(fā)病相關(guān)(Gadisseur,等，BoneMarrowTransplant23(10):1013-7(1999);Kotani，等，Blood98(10):3162-4(2001);Sanchez,等，BrJHaematol126(5):697-703(2004》。為了在慢性GVHD的治療中評估OX40封閉的有效性，建立慢性異種GVHD的動物模型系統(tǒng)。該模型類似于急性異種GVHD模型，不同之處在于將106個純化的CD4+細胞而非PBMC注射入SCID小鼠中。輻射劑量也降低到2.12Gy以減少腸損傷的程度。該疾病最初的跡象是脫發(fā)和體重減輕，之后是死亡，其部分歸因于在肺中T細胞浸潤。在約第30天疾病癥狀變得明顯。5只一組的小鼠分別用100、20或2的112V8G1重組抗體每周處理一次，持續(xù)5周，或用100pg的抗-DNPhlgGl對照抗體每周處理一次，持續(xù)5周。在第7周分析生存下來的小鼠。通過脫發(fā)、出血和腹膜炎(各自為0-5)和腹瀉(0-l)的程度確定宏觀病理學(xué)評分。最初觀察到的病理是脫發(fā)，與對照處理的小鼠相比所有這三種劑量的112V8G1都緩解了該疾病癥狀(圖8A)。該觀察結(jié)果與轉(zhuǎn)移CD4T細胞后第48天U2V8G1處理的小鼠脾中人T細胞的減少相一致(圖8B)。在該^t型中，人T細胞遷移到淋巴結(jié)中，其在對照動物中容易檢測到，但在抗-OX40處理的動物中則人T細胞明顯減少或沒有發(fā)現(xiàn)(圖8C)。注意，在用20或100iLig的112V8G1處理的動物中沒有發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)。此外，不同于急性模型，在對照處理的小鼠脾和淋巴結(jié)中可容易地檢測到OX40陽性細胞，而在112V8G1處理的動物中OX40+細胞的數(shù)量則減少(圖8B和8C)。在接受人CD4T細胞的小鼠血清中檢測到炎性細胞因子，與用對照人IgGl相比，在用112V8G1抗-人OX40處理的小鼠中被檢測到的細胞因子的量減少。在該疾病模型中產(chǎn)生的細胞因子包括但不限于白細胞介素2、白細胞介素4、白細胞介素6、白細胞介素8、白細胞介素10、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、干擾素Y和腫瘤壞死因子a。通過用112V8G1處理，除白細J包介素6之外的所有細胞因子都明顯地減少了，證實了通過耗竭和/或封閉的OX40信號傳導(dǎo)抑制的抗炎活性。利用預(yù)防性用藥法在急性XGVHD模型中研究112V8G4PE。該抗體不具有耗竭活性，這是因為其無法固定補體或結(jié)合Fc受體，因此疾病預(yù)防應(yīng)當(dāng)依賴于阻斷OX40信號傳導(dǎo)或下行性調(diào)節(jié)0X40。在第0天，向每組5只小鼠單次注射200、20或2pg的112V8G4PE。在第0、3或6天，讓對照處理的小鼠接受200]Lig抗-DNP人IgG4抗體。在第12天分析小鼠的宏觀病理學(xué)和脾中人T細胞的數(shù)量(圖9A和9B，表5)。在第12天，按0-3分對腹瀉、腹膜出血或血性腹水以及腸出血的宏觀病理學(xué)評分，O分代表沒有觀察到病理，3分代表嚴重的疾病。200和20pg的112V8G4PE阻止了明顯病理的發(fā)展，而2iug劑量并不足以預(yù)防疾病。在第12天宏觀病理學(xué)的量與脾中人T細胞的數(shù)量相關(guān)。與對照處理的動物相比，200或20jLig的112V8G4PE顯著減少了人T細胞在脾中的蓄積，而2pg劑量則無效。在112V8G4PE(圖9A和9B)和112V8G1(圖7)滴定中所〗t見察到的差異可歸因于112V8G4PE抗體的耗竭活性缺乏。遲至第3或6天給予112V8G4PE以測試阻斷OX40信號傳導(dǎo)的治療效能。在轉(zhuǎn)移人PBMC后第3或6天用200pg的112V8G4PE或?qū)φ杖薎gG4抗體處理小鼠。在第14天評估宏觀病理學(xué)。與對照抗體處理的動物中觀察到疾病程度相比，當(dāng)在第3或6天給予112V8G4PE抗-人OX40抗體時，OX40信號傳導(dǎo)的阻斷改善了疾病(圖9C)。與對照處理的小鼠相比，抗-OX40處理的小鼠脾中人T細胞的數(shù)量也明顯減少。如果在第6天給予，112V8G1也緩解了疾病。這些數(shù)據(jù)證實了作為治療方法用于緩解疾病病理的通過OX40特異性抗體封閉OX40的有效性。89異種移植物抗宿主病模型中，與對照處理的動物相比，112V8(—種人抗-人OX40抗體)顯著地緩解了疾病病理，減少了炎性細胞因子的產(chǎn)生以及脾和淋巴結(jié)中人T細胞的數(shù)量。這些數(shù)據(jù)證實了直接靶向OX40陽性細胞是適合于預(yù)防(預(yù)防性)和改善(治療)T細胞介導(dǎo)的疾病的療法。在使用112F32、112Y55、112Y131和112Z5的一種或兩種模型中獲得了類似的結(jié)果(表3)。在急性GVHD模型中，CD4和CD8人T細胞都是疾病所需要的。CD4T細胞對于誘導(dǎo)是必需的，而CD8T細胞則介導(dǎo)大多數(shù)的發(fā)病機理。通過給予一種所述的人抗-人OX40抗體對疾病的預(yù)防和改善可能是由于直接拮抗了CD4和CD8T細胞，或可能是由于通過減少CD4幫助功能從而直接封閉了具有對CD8T細胞間接影響的CD4T細胞。此外，OX40抗體可促進一些調(diào)節(jié)T細胞產(chǎn)生或增加其數(shù)量。盡管不希望受任何理論約束，有可能這些機制的一種或全部可介導(dǎo)疾病改善。盡管不希望受任何理論約束，這些抗-人OX40抗體可能的作用機制是通過自然殺傷細胞或嗜中性效應(yīng)細胞誘導(dǎo)抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。該過程依賴于效應(yīng)細胞表達的Fc受體與結(jié)合活化T細胞上表達的OX40的抗-OX40抗體結(jié)合的能力。免疫球蛋白結(jié)合Fc受體的能力取決于抗體亞類以及Fc受體類型。人IgGl抗體結(jié)合自然殺傷細胞和嗜中性白細胞上的Fc受體，而人IgG4抗體并不結(jié)合(Huber，等，Nature229(5284):419-20(1971);Brunhouse，等，MolImmunol16(11):907-17(1979))。測試人抗畫人OX40抗體112F32(IgGl)、112V8(IgGl和IgG4PE)、112Y55(IgGl)、112Y131(IgG4)和112Z5(IgGl)通過人自然殺傷細胞介導(dǎo)OX40表達粑細胞的ADCC的能力。在與人抗-人OX40抗體以及以20個效應(yīng)細胞1個耙細胞的比例的人自然殺傷細胞溫育4小時后，將非放射性細胞毒性測定用于測定耙細胞特異性溶解百分數(shù)(圖10)。用0.001-10pg/ml抗-OX40或陰性對照抗體標記EL4-人OX40粑細胞，然后與人自然殺傷細胞溫育。通過在非放射性細胞毒性測定中乳糖脫氫酶的釋放測定靶細胞的溶解。如該方法中所述的測定特異性溶解百分數(shù)。人IgGl抗-人OX40抗體以劑量依賴性方式誘導(dǎo)了EL4-人OX40耙細胞的ADCC。人IgG4抗-OX40抗體和對照人IgGl抗體無法誘導(dǎo)耙細胞的特異性溶解。ADCC活性水平與相對結(jié)合親和力和表位組相關(guān)，如與組A(112F32)和C(112Z5)中的抗體相比，那些在表位組B中的抗體(112V8和112Y55)具有更高的ADCC活性抗體。在此描述的分析結(jié)果鑒定了具有結(jié)合親和力變化范圍的抗體、三種不同的表位并證實了它們在阻斷OX40配體結(jié)合和預(yù)防或改善T細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的有效性。這些人抗-人OX40抗體(112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5)減少增殖、減i爰疾病進展以及減少炎性細胞因子產(chǎn)生的能力證實了直接封閉OX40作為一種用于治療T細胞介導(dǎo)的炎性或自身免疫性疾病，包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、銀屑病、克羅恩氏病、移植物抗宿主病和移植排斥的方法的潛力。對于減少增殖或改善疾病，抗-OX40抗體的碑毛竭活性是不需要的，這樣能減少由于T細胞耗竭所致的潛在不利影響。文獻目錄Akiba，H.,Y-Miyahira,etal.(2000)-"CriticalcontributionofOX40ligand'toThelpercelltype2differentiationinexperimentalleishmaniasis."JExpMed191(2):375-80.—AI-Shamkhani,A.,S.MaJett,etal,(1997),"AffinityandkineticsoftheinteractionbetweensolubletrimericOX40ligand,amemberofthetumornecrosisfactorsuperfamily,anditsreceptorOX40onactivatedTcells."JBiolChem272(8):5275-82.〖00271]Aegre，M.L.,A.M.Collins,etaL(1992)."Effectofasingleaminoacidmutationontheactivatingandimniunosuppressivepropertiesofa"humanized"OKT3monoclonalantibodv."JImmunol148(11):3461-8.Angal;S.,D.J.King,etal.(1993)."Asingleapiinoacid.substitutionpolishestheheterogeneityofchjmericmouse/human(IgG4)antibody."MolImmunol30(1):105-8.Bachmann,.M,F.,M.Barner'etaL(1999)."CD2setsquantitativethresholdsinTcellactivation."JEkpMedl卯f10):1383-92.Bansal-Pakala，P.，A.G.Jember,et.a].(2001)."Signalingthrough.OX40(CD134)breaksperipheralT-celltolerance."NatMed7f8、:907-12.Baum,P.R.，R.B.Gayle;3rd，etal.(1994)."Molecularcharacterizationofmurine^andhuipanOX4t)/OX40ligandsystems:identificationofahumanOX40ligandastheHTLV-1-regulatedproteingp34."EmboJ13(17):3992-4001.Baum，P.R.,R.B.Gayle，3rd,etal.(1994)."IdentificationofOX40ig^ndandpreliminarycharacterizationofitsactivitiesonOX40receptor."CircShock44(1):30-4.Brugnoni,A.Bettinardi,etal.(1998)."CD134/OX40expressionbysynovialfluidCD4+Tlymphocytesinchronicsynovitis."BrJRheumatol37(5):584-5.,Brunhouse,R.andJ.J.Cebra(1"9),"IsotypesofIgG:comparisonoftheprimarystructuresofthreepairsofisotypeswhichdifferintheirabilitytoactivatecompJement:"MolImmunol16(11):907-17.00281〗Calderhead>D.M.，J.E.Buhl咖nn,etal.(1993)."CloningofmouseOx40:aTcellactivationmarkerthatmaymediateT-Bcellinteractions."iImmunol151(10):5261-71.02(37):13218-23.Compaan,D.M"LC.Gonzalez,etal.(2005〉."Attenuating,lymphocyteactivity:Thecrystalstructureofthebtla-hvemcomplex."JBioJChem.Croft，M.(2003)."CostimulationofTc6sbyOX40.4-lBB，andCD27."CytokineGrowthFactorRev14(3-4):265-73..TZ寸ISS:(61)09sshJ3簡o".，ch3jo山n，jo叫sojuroiBUBpireXipfU33oun山山〖jo山tuuospusdspXpoq卩UBjo]d。aiI9-￡St>:(t)OIfoun國i叫"'sh3:j丄+|CD3gp3ds-u〖f3Xu1u！《ip，3oi!iBqiiMU3gup叩wjoaiqudB3ibuS!s/CtcnBiiuu!is-o:)iu'柳dbs鄰!八cudjo由mj0i7-XOaq丄,，乂86)''bia,J3iyj。.f[''V.f[66Z00]__'uo!i!pa'iSal3〗UfiB3!3Qi6umu山j(luò)osup〗ojdjossaijsnbss.(661)'B'3'1琴>[[86Z00]:(8)68poo舊".uo!卿舊u！IP:3!ura5(呵xeiru)SBAojuo!saqpe打3》ss^pstus:jus，dBjaraj|n3i33~丄ifnpEuiojjsia。ojuraati31qsaijuoj^ssardsra0WiO"'(￡66"^'!J叫.丄"V'wnuq.['96Z00]:。)￡81P噴axg;Xi:p3j!purajsXst^dS/otXOiretunq3q丄,，.(9661)'口設(shè)'口。h:丄"v'BJtuui[s6z00]_7^-/_￡乙1:(8)861-1"丄u！0^x0"J3IOJP3!j!j3v"'(C00Z).IBp.D"H.1'sAaiqduintl[mzoo]'0Z-6117:(柳S)6Ztwtu"M,,"!sjoviscpj，30uou1ireui叫joiCi!wjTMdssseoqns￡>Sl,，'(IWI)"W'sB^n-o<f'(j'S"H'J叫nH[e6Z00f"-u!aj(wduc^stijoSi-pire:S！0VXOubW!叢ioujnq'u!3ioj3uo!snjo舌I:uop3BJ柳！pire3！10欣00儀0aifl3叩;aRre.;iXqoa!au！p'ubcuwrtwuojiba!K)bi33丄jouo〖iBinS;>a，，'(6661)p,pEuocpw-v'S"W'1'su〖3S!h'S€_ni:9oun山uijia3^[nuuv"'X1〖unu1tu！p3iB!p。ui-n30a！frSICOP加OiKID，，'(8661)〖P八Bia.vpuB,sI'fB崎Q[I6Z00]iiwiodb:pu^S!1o，-xo,,'(8661)"P'gJ叫u!3叢'av"I'"!i加urejo.0￡_￡K)￡:(9)S91ioim山uq;f":u'o!suedxBuopiQldaoai/tiojBituupsooO，XO叫丄".(000S)p'J3q山3f.v"I(b!i§buib4￡)'_..tS-9II:欣OlVsnPSPB3VBBM30Jd,.uojB!p9tuXjqugsn早S9draqpub.joibiiushbsjjC3oqdui/C工piro狂s:raquraui/CliubjjojdaosjdN丄pue82dO3屮u33/w:jquo!兩a:ju！joid3加o。v"'(S00Z)'b13,]3i(oq:'w'，，'z3IB2uod[88z00]_^_'厶-nOT:(OT)K-〖33|丄Rvredu〖9SB9s!pisoq-snsJ3A-yBJ*3inojoXdejsw01ssuodsai;1033uautK)003ip;19js，八3Apt55paidousbi}(0tXO)，EtCtC)u33!，ubuojjb/vjpbH33丄，0uo!ssa1dx3，，.(6661).fB，3'BUJBjBjro.jf"j'v'jnass〖pBD[厶szoo]n_K)89:(n)厶9lI"ounujLUip加lustudoi3A9pXxoui3ui/uo!:iEZ!〖〖qouiso丄(+)KLD。o:p油-ii33!:jUB.s,3irequ30tXOjoitraui3gB^U3,,.(〖002)''lB13'v.H*.3.d's的八3'1t"Z6Z:(9)9'Ziounuiuiispuw丄"'V1JL8-W3八H:SJ。id3。ar細〖q〖iju〖-03.p'ue/ticnEimn!]s墨o。usawsq^eissoj。3u!aoas3qx>，'(S00乙).W'W。j;D〖S8加0]雖S8/S8憲法能改<formula>formulaseeoriginaldocumentpage94</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage95</formula>Watanabe,.T.,J.Masuyama,etal.(2006)."CD52isanovelcostimulatorynioleculeforinductionofCD4+regulatoryTcells."ClinImmunol120:247-259.WeatheriU,A.R.,J.R.Maxwell,etal.(2001)."OX40ligationenhancescellcycleturnoverofAg-activatedCD.4TceJIsinvivo."CellImmunol209(1):63-75.Weinberg,A.D.(2002)."OX40:targetedimmunotherapy—implicationsfortemperingautoimmunityandenhancingvaccines."TrendsImmunol23(2):102-9.WO95/12673WO95/2125權(quán)利要求1.一種特異性結(jié)合OX40胞外域氨基酸序列中的表位的分離或純化的抗體，其中抗體包括人、人源化或嵌合抗體，并且其中抗體具有OX40拮抗活性。2.權(quán)利要求1的抗體，其中OX40拮抗活性減少或增加了細胞因子或干擾素的產(chǎn)生，活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞的生存或增殖，抗凋亡蛋白或凋亡前體蛋白的表達。3.權(quán)利要求2的抗體，其中細胞因子選自IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL畫9、IL畫IO、IL隱14、IL-16、IL-17、IL畫23、IL-26、TNF隱ou干擾素y和GM-CSF。4.權(quán)利要求2的抗體，其中抗凋亡蛋白或凋亡前體蛋白選自Bcl-xL、Bcl-2、Bad和Bim。5.權(quán)利要求1的抗體，其中OX40胞外域氨基酸序列中的表位在下列序列之內(nèi)MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTGKH丁LQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARP訂yQPTEAWPRTSQGPS(seqedno:50).6.—種特異性結(jié)合OX40胞外域氨基酸序列中的表位的分離或純化的抗體，其中抗體包含結(jié)合由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體結(jié)合的氨基酸序列的人、人源化或嵌合抗體。7.—種具有由稱為112F32、112V8、112Y13K112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的約1-5000倍范圍內(nèi)的OX40結(jié)合親和力的分離或純化的抗體。8.權(quán)利要求7的抗體，其中與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體相比，該抗體具有更大或更小的OX40結(jié)合親和力。9.權(quán)利要求1、6、7或8任一項的抗體，其中抗體具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細l包系所產(chǎn)生的抗體的約KD10-6MJ々KD10—13M范圍內(nèi)的OX40結(jié)合親和力。10.權(quán)利要求1、6、7或8任一項的抗體，其中抗體具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性；或與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體竟?fàn)幣cOX40結(jié)合。11.權(quán)利要求1的抗體，其中抗體結(jié)合與112V8、112Y55和Y131所結(jié)合的表位相同的表位，并抑制或阻止85%或更多的OX40與OX40配體(OX40L)結(jié)合。12.權(quán)利要求1的抗體，其中抗體由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細月包系所產(chǎn)生。13.權(quán)利要求1、6、7或8任一項的抗體，其中如在ELISA測定法中所測定的，抗體抑制或阻止由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體與OX40結(jié)合。14.權(quán)利要求1、6、7或8任一項的抗體，其中如在ELISA測定法中所測定的，抗體抑制至少50%的由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體與OX40結(jié)合。15.權(quán)利要求l、6、7或8任一項的抗體，其中抗體特異性結(jié)合非T細胞上表達的OX40,任選地其中所述非T細胞選自用OX40轉(zhuǎn)染的自然殺傷細胞、粒細胞、單核細胞、B細胞或非T細胞系，任選地其中所述用OX40轉(zhuǎn)染的非T細胞系選自CHO細胞、L929細胞和HELA細胞。16.權(quán)利要求1的抗體，其中抗體包含如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列，或如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列的子序列。17.權(quán)利要求16的抗體，其中子序列選自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、單鏈Fvs(scFv)、二硫鍵連接的Fvs(sdFv)和VL或VH。18.權(quán)利要求16的抗體，其中如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44_49所示的抗體成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列在恒定區(qū)、互補決定區(qū)(CDR)或構(gòu)架區(qū)(FR)之內(nèi)或之外具有一個或多個氨基酸取代。19.權(quán)利要求18的抗體，其中氨基酸取代是在恒定區(qū)、互補決定區(qū)(CDR)或構(gòu)架區(qū)(FR)之內(nèi)或之外的保守氨基酸取代。20.權(quán)利要求18的抗體，其中氨基酸取代包含1-3個、3-5個、5-10個或更多個氨基酸殘基的氨基酸取代。21.權(quán)利要求1、6、7或8任一項的抗體，其中抗體保留由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的可4企測活性。22.權(quán)利要求21的抗體，其中活性包括調(diào)節(jié)T細胞增殖或生存、活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞的數(shù)量或耗竭活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T纟田月包。23.權(quán)利要求21的抗體，其中活性包括抑制OX40信號傳導(dǎo)。24.權(quán)利要求21的抗體，其中活性包括減少或耗竭特異性針對自身抗原的自身反應(yīng)性T細胞的數(shù)量，任選地其中自身抗原選自髓磷脂堿蛋白、髓磷脂少突膠質(zhì)細胞糖蛋白、含蛋白脂質(zhì)蛋白、膠原、滑膜關(guān)節(jié)組織抗原、胰島素、谷氨酸脫羧酶、腸抗原、甲狀腺抗原、組蛋白、肌肉抗原和皮膚抗原。25.—種特異性結(jié)合OX40胞外域氨基酸序列中的表位的分離或純化的抗體，其中抗體與如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列的序列具有80%-85%、85%-90%、90%-95%、96%、97%、98%、99%或更多的同一性。26.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體特異性結(jié)合活化的人T細胞，而非靜息的T細胞。27.權(quán)利要求1的抗體，其中如在ELISA測定法中所測定的，抗體并不抑制或阻止抗體L106與OX40結(jié)合。28.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體抑制或阻止OX40配體與OX40結(jié)合。29.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體抑制或阻止OX40配體與活化T細胞結(jié)合。30.權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體調(diào)節(jié)OX40-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)或調(diào)節(jié)OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答。31.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體抑制或阻止OX40-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)。32.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體抑制或阻止OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答。33.權(quán)利要求32的抗體，其中OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答包括淋巴細胞增殖、細胞因子表達、淋巴細胞生存、NF-kB活化、PKB(Akt)活性的維持或存活蛋白的增量調(diào)節(jié)。34.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體通過自然殺傷細胞、巨噬細胞或嗜中性白細胞介導(dǎo)，誘導(dǎo)EL4-人OX40表達細胞或活化的人T細胞的溶解，其中在10^g/ml抗體下誘導(dǎo)的特異性細胞溶解百分數(shù)(％)為約15-75%、25-65%、或30-60%或50-100%。35.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體減輕、減少或預(yù)防急性或慢性異種移植物宿主疾病^t型中移植物抗宿主病的癥狀，或其中抗體使急性或慢性異種移植物宿主疾病模型中的移植物抗宿主病緩解或消退。36.權(quán)利要求35的抗體，其中異種移植物宿主疾病模型包括在給予抗-IL2R卩鏈抗體和亞致死劑量的輻射后接受人外周血單核細胞(PBMC)的免疫缺陷型(SCID)小鼠。37.權(quán)利要求35的抗體，其中移植物抗宿主病的癥狀選自體重減輕，脫發(fā)，皮滲，血尿，腹水和肝、腸道、肺、皮膚中炎性細胞浸潤以及死亡。38.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體減輕、減少或預(yù)防肺、皮膚或腸中的炎癥。39.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體減輕、減少或預(yù)防自身免疫性疾病的癥狀。40.權(quán)利要求39的抗體，其中自身免疫性疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病、克羅恩氏病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉、銀屑病、增生性狼瘡性腎炎、肉芽腫性肌病和多發(fā)性肌炎。41.權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體，其中OX40是人0X40。42.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中OX40包含序列MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTV丁GLHCVGDTYPSNDRCCHEO^PGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSi3RKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNq:TLAGKHTLQPRAVAAELGLGLVU3ULGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAH-TLAKI(SEQ遼)NO:49).43.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體是單克隆或多克隆抗體。44.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD同種型。45.權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體，其中抗體進一步包含異源結(jié)構(gòu)域。46.—種包含權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。47.—種編碼如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的成熟的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列的序列或其子序列的分離的核酸。48.權(quán)利要求47的分離的核酸，其中序列包含SEQIDNO:3-6和SEQIDNO:38-43，或SEQIDNO:3隱6和SEQIDNO:38-43的簡并序列。49.權(quán)利要求47的分離的核酸，其進一步包含表達控制序列。50.權(quán)利要求47的分離的核酸，其進一步包含載體。51.權(quán)利要求47的分離的核酸，其進一步包含宿主細胞。52.—種編碼具有如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列經(jīng)一個或多個氨基酸殘基取代、添加或缺失的氨基酸序列的核酸，其中氨基酸序列具有針對OX40胞外域表位的結(jié)合親和力。53.—種編碼具有如SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:44-49所示的重鏈或輕鏈可變區(qū)序列經(jīng)一個或多個氨基酸殘基取代、添加或缺失的氨基酸序列的核酸，其中氨基酸序列具有由稱為U2F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的活性。54.—種包含由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體和有關(guān)用于將抗體給予需要用該抗體治療的個體的說明書的試劑盒。55.—種表達具有與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體一樣的結(jié)合特異性的抗體的分離的細月包。56.—種用于治療需要治療的個體中慢性或急性免疫性疾病或病癥或慢性或急性免疫性疾病或病癥的癥狀的方法，所述方法包括給予個體能有效治療個體中慢性或急性免疫性疾病或病癥或慢性或急性免疫性疾病或病癥的癥狀的權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體或權(quán)利要求46的藥物組合物。57.權(quán)利要求56的方法，其中個體是慢性或急性免疫性疾病或病癥的候選人或已進行慢性或急性免疫性疾病或病癥治療。58.權(quán)利要求56的方法，其中治療導(dǎo)致緩解或改善一種或多種與慢性或急性免疫性疾病或病癥相關(guān)的不利癥狀或身體后果。59.—種治療移植物抗宿主病的方法，所述方法包括給予需要治療的個體能有效治療移植物抗宿主病的權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體或權(quán)利要求47的藥物組合物。60.權(quán)利要求59的方法，其中個體是移植物抗宿主病的候選人或已進行移植物抗宿主病治療。61.權(quán)利要求59的方法，其中治療減輕、減少或預(yù)防一種或多種與移植物抗宿主病相關(guān)的不利癥狀或身體后果的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性，或其中該治療引起移植物抗宿主病的緩解或消退，或其中該治療造成預(yù)防移#_物抗宿主病。62.權(quán)利要求61的方法，其中移植物抗宿主病的癥狀選自體重減輕，脫發(fā)，皮滲，血尿，腹水，肝、腸道、肺中炎性細胞浸潤和死亡。63.權(quán)利要求59的方法，其中移植物包括骨髓、造血干細胞、外周血干細胞或臍帶血干細胞。64.—種治療移植排斥的方法，所述方法包括給予需要治療的個體能有效治療移植排斥的權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體或權(quán)利要求46的藥物組合物。65.權(quán)利要求64的方法，其中個體是移植排斥的候選人或已進行移植排斥治療。66.權(quán)利要求64的方法，其中治療減輕、減少或預(yù)防一種或多種與移植排斥相關(guān)的不利癥狀或身體后果的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性，或其中該治療引起移植排斥的緩解或消退，或其中該治療造成預(yù)防移植排斥。67.權(quán)利要求66的方法，其中移植排斥的癥狀包括針對移植物或移才直細力包的免疫應(yīng)答或組織^皮壞。68.權(quán)利要求64的方法，其中移植物包括腎、心、肺、皮膚、肝或胰。69.—種減輕、減少或預(yù)防炎癥的方法，所述方法包括給予需要治療的個體能有效減輕、減少或預(yù)防炎癥的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性的權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體或權(quán)利要求46的藥物組合物。70.權(quán)利要求69的方法，其中炎癥存在于肺、關(guān)節(jié)、肌肉、皮膚、中樞或末梢神經(jīng)系統(tǒng)或腸中。71.權(quán)利要求69的方法，其中個體是炎癥的候選人或已進行炎癥治療。72.權(quán)利要求69的方法，其中治療導(dǎo)致減輕一種或多種與炎癥相關(guān)的不利癥狀或身體后果的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性。73.—種治療自身免疫性疾病的方法，所述方法包括給予需要治療的個體能有效減輕、減少或預(yù)防自身免疫性疾病癥狀的發(fā)作、頻率、持續(xù)時間或嚴重性的權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體或權(quán)利要求46的藥物組合物。74.權(quán)利要求73的方法，其中自身免疫性疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病、克羅恩氏病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉、銀屑病、增生性狼瘡性腎炎、肉芽腫性肌病和多發(fā)性肌炎。75.權(quán)利要求73的方法，其中個體是自身免疫性疾病的候選人或已進行自身免疫性疾病治療。76.權(quán)利要求73的方法，其中治療導(dǎo)致減輕、減少或預(yù)防一種或續(xù)時間或嚴重性。77.—種抑制或阻止OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的方法，所述方法包4舌給予需要抑制或阻止OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的個體能有效抑制或阻止OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體或權(quán)利要求46的藥物組合物。78.權(quán)利要求77的方法，其中細胞應(yīng)答包括淋巴細胞增殖、細胞因子表達或淋巴細胞生存。79.權(quán)利要求77的方法，其中個體是OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的候選人或已進行OX40-介導(dǎo)的細胞應(yīng)答治療。80.—種抑制或封閉OX40配體與活化T細胞結(jié)合的方法，所述方法包括給予需要封閉、抑制或阻止OX40配體與活化T細胞結(jié)合的個體能有效抑制或阻止OX40配體與活化T細胞結(jié)合的權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體或權(quán)利要求46的藥物組合物。81.—種抑制或封閉OX40配體與OX40結(jié)合的方法，所述方法包括給予需要封閉、抑制或阻止OX40配體與OX40結(jié)合的個體能有^:抑制或阻止OX40配體與OX40結(jié)合的權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體或權(quán)利要求46的藥物組合物。82.—種調(diào)節(jié)OX40-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)的方法，所述方法包括給予需要調(diào)節(jié)OX40-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)的個體能有效調(diào)節(jié)OX40-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)的權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體或權(quán)利要求46的藥物組合物。83.—種減少活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量的方法，所述方法包括給予需要減少活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量的個體足以減少活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量的量的權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體。84.—種治療由活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞所引起的疾病或病癥的方法，所述方法包括給予個體足以減輕、減少或預(yù)防由活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞所引起的疾病或病癥的進展，或庫毛竭活化、效應(yīng)、記憶或調(diào)節(jié)T細胞的量的權(quán)利要求1、6、7、8或25任一項的抗體。85.權(quán)利要求84的方法，其中疾病或病癥包括移植物抗宿主病、炎癥或自身免疫性疾病。86.權(quán)利要求56-85任一項的方法，其中個體為哺乳動物。87.權(quán)利要求56-85任一項的方法，其中哺乳動物為人。88.權(quán)利要求56-85任一項的方法，其中抗體局部、區(qū)域或全身性給予個體。89.—種在異種移植物宿主疾病沖莫型中減少血液、脾、淋巴結(jié)、肝、肺或皮膚中活化T細胞數(shù)量的方法，所述方法包括給予異種移植物宿主疾病模型足以減少血液、脾、淋巴結(jié)、肝、肺或皮膚中活化T細胞數(shù)量的量的權(quán)利要求l、6、7、8或25任一項的抗體。90.—種產(chǎn)生具有OX40拮抗活性的人OX40抗體的方法，所迷方法包括a)給予能表達人免疫球蛋白的動物綴合有人Fc重組蛋白的人OX40胞外域或活化的人T細胞；b)篩選表達人OX40抗體的動物；c)選4^產(chǎn)生人OX40抗體的動物；d)從所選擇的動物中分離抗體；和e)確定人OX40抗體是否具有OX40拮抗活性。91.一種產(chǎn)生抑制或阻止OX40與OX40配體(OX40L)結(jié)合的人OX40抗體的方法，所述方法包括a)給予能表達人免疫球蛋白的動物綴合有人Fc重組蛋白的人OX40胞外域或活化的人T細胞；b)篩選表達人OX40抗體的動物；c)選擇產(chǎn)生人OX40抗體的動物；d)從所選擇的動物中分離抗體；和e)確定人OX40抗體是否抑制或阻止OX40與OX40配體(OX40L)結(jié)合。92.權(quán)利要求90或91任一項的方法，其中能表達人免疫球蛋白的動物包括轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)基因牛。93.—種表達下列抗體的非人轉(zhuǎn)基因動物a)與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體相同的抗體；b)結(jié)合由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體所結(jié)合的OX40胞外域氨基酸序列中的表位的抗體；c)具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的約1-5000倍范圍內(nèi)的OX40結(jié)合親和力的抗體；d)具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的約KD10-614-約KD1(T12M范圍內(nèi)的OX40結(jié)合親和力的抗體；e)具有由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性的抗體；或f)與由稱為112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗體竟?fàn)幣cOX40結(jié)合的抗體。全文摘要本發(fā)明提供了特異性結(jié)合OX40(CD134)的抗體，稱為OX40抗體、抗-OX40或抗-OX40抗體。本發(fā)明特異性結(jié)合OX40的抗體包括哺乳動物(人、靈長類動物等)、人源化或嵌合的抗-OX40抗體。本發(fā)明特異性結(jié)合OX40的抗體和抗體子序列(片段)包括用于多種方法包括治療、篩選和檢測方法的純化和分離的抗體，及其藥物配方。文檔編號C12N5/20GK101331150SQ200680044085公開日2008年12月24日申請日期2006年11月27日優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日發(fā)明者M·克羅特,R·索洛夫努根特,加藤慎一郎,吉田均申請人:麒麟醫(yī)藥株式會社;拉霍拉敏感及免疫學(xué)研究所