專利名稱：雙核大環(huán)多胺金屬配合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種水解DNA和RNA的仿酶催化劑。
背景技術：
關于DNA和RNA的斷裂，限制性內(nèi)切酶是一種有效的水解催化劑，它能在特定位點切割DNA和RNA分子，但其識別位點僅為4-8個核苷酸，而且只能在數(shù)目有限的位點斷裂DNA和RNA。
化學合成仿酶水解催化劑是20世紀80年代開始發(fā)展起來的一類新型的核酸切割試劑，既有限制性內(nèi)切酶的高度專一性，又能在人們預先設計的任何位點斷裂DNA和RNA，而且具有制備簡單，價格便宜等優(yōu)點，但現(xiàn)有的仿酶水解催化劑——例如近年報道的金屬配合物(見(1)Novel Recognition of Thymine Base in Double-Stranded DNA byZinc(II)-Macrocyclic Tetraamine Complexes Appended with Aromatic Groups，EiichiKimura etc，J.Am.Chem.Soc.1999，121，5426-5436；(2)Hamessing thorium(IV)as a catalystRNA and phosphate diester cleavage by a thorium(IV)macrocyclic complex，CongfangWang，Seema Choudhary，Claire B.Vink，Elizabeth A.Secord and Janet R.Morrow，Chem.Commun.，2000，2509-2510；(3)Dinuclear copper(II)complexes that promotehydrolysis of GpppG，a model for the 5’-cap of mRNA，Janet R.Morrow etc，J.Chem.Soc.，Dalton Trans.，1998，Pages 2961-2963；(4)Hydrolysis of Double-Stranded and Single-StrandedRNA in Hairpin Structures by the Copper(II)Macrocycle Cu([9]aneN3)Cl2，Judith N.Burstyn，Inorg.Chem.1997，36，1715-1718)都存在這樣或那樣的缺點，要么存在水解時間長(水解時間一小時以上)，要么水解液濃度大(水解液濃度一般達mM級)等缺點。
近年來，對雙核及多核金屬配合物的研究非常活躍，其中對能同時結合兩個金屬離子的配體的研究，尤為引人注目。Ciampolim，M.等人提供了一種能同時結合兩個金屬離子的配體——雙核大環(huán)多胺化合物(見Ciampolim，M.；Fabbrizzi，L.；Perotti，A.；Poggi，A.；Seghi，B.；Zanobini，F(xiàn).，Inorg.Chem，1987，26，3527)， R＝-(CH2)n-，n＝2，3，4此種化合物的橋連基團R為柔性結構，其對DNA或RNA的催化水解活性較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種催化水解活性更好的雙核大環(huán)多胺金屬配合物，此種金屬配合物不僅能在低濃度下短時間內(nèi)有效的切割DNA和RNA，而且具有良好的選擇性。
本發(fā)明的技術方案是根據(jù)天然酶水解DNA和RNA起主導作用的因素(如活性中心結構，疏水微環(huán)境，與底物的多種非共價鍵相互作用及其協(xié)同效應)和識別原理設計分子結構，特別是選擇了剛性結構的橋連基團。所提供的雙核大環(huán)多胺金屬配合物具有如下的結構式。
上述結構式中，R為橋，M為金屬離子。
R可以是下述五種基團中的任一種基團。
R1，R2，R3，R4，R5＝烷基或HM為Zn2+或Cu2+或Cd2+或Ca2+或Ni2+金屬離子。
本發(fā)明所述的雙核大環(huán)多胺金屬配合物的制備為三個步驟第一是大環(huán)多胺的合成；第二是橋聯(lián)大環(huán)多胺的合成；第三是橋聯(lián)大環(huán)多胺與金屬離子的絡合。上述步驟均在常壓下進行，具體操作及工藝條件通過實施例予以說明。
用本發(fā)明所述的雙核大環(huán)多胺金屬配合物切割DNA或RNA的操作如下1、將瓊脂糖加入容器中，再加入TBE緩沖液(1×)，將裝有瓊脂糖和TBE緩沖液的容器放在沸水中加熱使瓊脂糖顆粒溶解，冷卻至60℃時倒入帶梳子的水平槽中，室溫下放置30-40分鐘，然后將水平槽放入電泳槽中。
2、加入電泳緩沖液，加入量以淹沒膠面約1mm深為宜，然后取出梳子，令樣品孔自然充滿緩沖液。
3、在EP管中加入雙核大環(huán)多胺金屬配合物、需切割的DNA或RNA、抗壞血酸Vc(還原劑)，雙核大環(huán)多胺金屬配合物的濃度為5μmol/L～100μmol/L，DNA或RNA的濃度為0.010-0.061μg/ml，抗壞血酸Vc(還原劑)的濃度為0.125-0.342mmol/L，控制pH＝6.00-7.50，離子強度I＝0.1左右；將EP管放入恒溫水槽內(nèi)，在37±0.5℃反應30-90分鐘后，加入略多于雙核大環(huán)多胺金屬配合物摩爾數(shù)的EDTA溶液終止反應。
4、在EP管中加入濃度為0.04mol/L的磷酸氫二鈉-鹽酸緩沖液，制成樣品溶液，混勻后用微量移液器加入凝膠樣品孔中并蓋上電泳槽，然后在4℃采用4V/cm電壓槽電泳(60V左右)，使DNA向陽極移動，觀察溴酚藍顯示的電泳情況，當樣品到達陽極終止電泳。
5、取下凝膠，在含1ug/ml溴化乙錠的電泳緩沖液中浸泡染色30分鐘，水中脫色10分鐘后，用紫外燈觀察，并用GDS成像系統(tǒng)照相則可檢測出切割DNA或RNA的結果。
本發(fā)明具有以下有益效果1、由于橋連基團R為剛性結構，因而雙核大環(huán)多胺金屬配合物對DNA和RNA具有良好的切割活性，作水解催化劑用，能在生理條件下，低濃度(雙核大環(huán)多胺金屬配合物的濃度可低至5μmol/L)、短時間(水解時間30分鐘左右)內(nèi)十分有效的切割DNA和RNA。
2、切割反應的選擇性好，無帶切口環(huán)狀DNA和RNA出現(xiàn)，并且切割方式也與限制性內(nèi)切酶相同。
3、如橋連基團R中含中有羥基，雙核大環(huán)多胺金屬配合物切割DNA和RNA活性會更好，尤其是某些橋連基團苯環(huán)上的取代基為酚羥基的對位含有排電子基團或酚羥基被甲醚化后，裂解活性將得到提高，某些橋連基團含有較多的共額度或平面結構，催化活性更高。
4、提供了多種金屬離子構成的雙核大環(huán)多胺金屬配合物，擴大了水解催化劑的范圍。
5、制備方法簡單，原材料易于獲取。


圖1是雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物催化水解DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式
實施例1本實施例制備雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物，橋R為基團c，結構式如下 R5＝H工藝步驟為1、大環(huán)多胺的合成-4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮雜十二烷的合成N2氣保護下，將146.5克(0.26mol)化合物-N，N′，N″-三(對甲基苯磺酰)-二亞乙基三胺溶于300ml無水DMF中，冰浴攪拌下，分批加入17.1克(0.57mol)氫化鈉(80％-礦物油)，攪拌反應2小時后，在80-90℃下，滴加入147.0克(0.26mol)化合物-O，O′，N-三(對甲基苯磺酰)-雙(2-羥乙基)胺的無水DMF溶液300ml，攪拌反應3小時，放置室溫，將混合物倒入1000ml冰水中，過濾收集固體。用水，乙醇洗滌，得白色固體為1，4，7，10-四(對甲基苯磺酰)-1，4，7，10-四氮雜十二烷，產(chǎn)率92.5％。m.p.＝289-290℃。
將160克上述化合物與200ml濃H2SO4混合，加熱使其溶解，然后快速升至高溫反應10-15min。自然冷卻至室溫，劇烈攪拌下，加入到1000ml無水乙醚中，過濾，將沉淀物溶于水中，用活性碳脫色，加入100ml濃HCl煮沸，靜置，過濾，得白色晶體。將此白色晶體溶于一定量水中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至強堿性，CHCl3萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥，除去溶劑，得白色固體為1，4，7，10-四氮雜十二烷，產(chǎn)率63％。m.p.＝108-110℃。
N2氣保護下，將12.8mmol的1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷溶于含有39.5mmol三乙胺的無水無醇氯仿溶液中，冰浴下，緩慢地滴加入含有36.2mmol(Boc)2O的120ml無水無醇氯仿溶液中，室溫攪拌過夜，去除溶劑，殘余物用柱分離得無色非晶形固體為4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮雜十二烷，產(chǎn)率92.7％。
2、橋聯(lián)大環(huán)多胺溴酸鹽的合成N2氣保護下，將1.0克(2.12mmol)化合物-4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷溶于50ml無水乙腈中，加入0.28克(1.06mmol)2，6-二溴甲基吡啶和0.25克(2.36mmol)無水Na2CO3，回流反應72h，過濾除去不溶物，蒸出溶劑，殘余物用水溶解，CHCl3萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥，除去溶劑。殘余物溶于無水無醇氯仿中，冰浴下，加入0.3g(0.21mmol)三乙胺和0.34克芐氧羰酰氯，室溫反應過夜，減壓蒸去溶劑，殘余物用硅膠H柱層析分離，得無色無定形固體為2，6-雙[4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基]吡啶，產(chǎn)率85％。
將1.3克(1.24mmol)上述化合物溶于20ml無水乙醇中，冰浴攪拌下，緩慢地滴加入15ml40％HBr溶液，室溫攪拌過夜。減壓蒸出溶劑，殘余物用EtOH/24％HBr重結晶，得白色晶體為2，6-雙(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基)吡啶氫溴酸鹽，產(chǎn)率80％。
3、橋聯(lián)大環(huán)多胺與金屬離子Zn(II)的絡合將0.25克(0.24mmol)的上述化合物溶于5ml的高水中，加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH強堿性，用CHCl3萃取，合并有機相，無水Na2SO4干燥，蒸去CHCl3，得淡黃色液體。N2下，將此淡黃色油狀液體溶于5ml無水乙醇中，加熱至60℃，攪拌下，緩慢地滴入含有0.26g(0.7mmol)Zn(ClO4)2.6H2O的乙醇溶液5ml，加畢，攪拌反應過夜。冷卻，過濾，固體用EtOH/H2O重結晶，得白色晶體，產(chǎn)率88.3％。m.p.＞300℃(dec)。
實施例2本實施例制備雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物，橋R為基團b，結構式如下 R2＝CH3R3＝H工藝步驟為1、大環(huán)多胺的合成與實施例1相同。
2、橋聯(lián)大環(huán)多胺溴酸鹽的合成N2氣保護下，將1.0克(2.12mmol)化合物-4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷溶于50ml無水乙腈中，加入1.06mmol 2，6-二氯甲基-4-甲基苯酚和0.25克(2.36mmol)無水Na2CO3，回流反應72h，過濾除去不溶物，蒸出溶劑，殘余物用水溶解，CHCl3萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥，除去溶劑。殘余物溶于無水無醇氯仿中，冰浴下，加入0.3g(0.21mmol)三乙胺和0.34克芐氧羰酰氯，室溫反應過夜，減壓蒸去溶劑，殘余物用硅膠H柱層析分離，得無色無定形固體為2，6-雙[4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基]-4-甲基-苯酚。產(chǎn)率83.9％。
將1.24mmol上述化合物溶于20ml無水乙醇中，冰浴攪拌下，緩慢地滴加入15ml40％HBr溶液，室溫攪拌過夜。減壓蒸出溶劑，殘余物用EtOH/24％HBr重結晶，得白色晶體為2，6-雙(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基)-4-甲基-苯酚氫溴酸鹽，產(chǎn)率78％。
3、橋聯(lián)大環(huán)多胺與金屬離子Zn(II)的絡合與實施例1相同。
實施例3本實施例制備雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物，橋R為基團b，結構式如下 R2＝Cl R3＝H工藝步驟為1、大環(huán)多胺的合成與實施例1相同。
2、橋聯(lián)大環(huán)多胺溴酸鹽的合成N2氣保護下，將1.0克(2.12mmol)化合物-4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷溶于50ml無水乙腈中，加入1.06mmol2，6-二氯甲基-4-氯苯酚和0.25克(2.36mmol)無水Na2CO3，回流反應72h，過濾除去不溶物，蒸出溶劑，殘余物用水溶解，CHCl3萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥，除去溶劑。殘余物溶于無水無醇氯仿中，冰浴下，加入0.3g(0.21mmol)三乙胺和0.34克芐氧羰酰氯，室溫反應過夜，減壓蒸去溶劑，殘余物用硅膠H柱層析分離，得無色無定形固體為2，6-雙[4，7，10-三(叔丁氧羰?；?-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基]-4-氯-苯酚。產(chǎn)率83.9％。
將1.24mmol上述化合物溶于20ml無水乙醇中，冰浴攪拌下，緩慢地滴加入15ml40％HBr溶液，室溫攪拌過夜。減壓蒸出溶劑，殘余物用EtOH/24％HBr重結晶，得白色晶體為2，6-雙(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基)-4-氯-苯酚氫溴酸鹽，產(chǎn)率78％。
3、橋聯(lián)大環(huán)多胺與金屬離子Zn(II)的絡合與實施例1相同。
實施例4本實施例制備雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物，橋R為基團b，結構式如下 R2＝Cl R3＝CH3工藝步驟為1、大環(huán)多胺的合成與實施例1相同。
2、橋聯(lián)大環(huán)多胺溴酸鹽的合成N2氣保護下，將1.0克(2.12mmol)化合物-4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷溶于50ml無水乙腈中，加入1.06mmol2，6-二氯甲基-4-氯苯甲醚和0.25克(2.36mmol)無水Na2CO3，回流反應72h，過濾除去不溶物，蒸出溶劑，殘余物用水溶解，CHCl3萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥，除去溶劑。殘余物溶于無水無醇氯仿中，冰浴下，加入0.3g(0.21mmol)三乙胺和0.34克芐氧羰酰氯，室溫反應過夜，減壓蒸去溶劑，殘余物用硅膠H柱層析分離，得無色無定形固體為2，6-雙[4，7，10-三(叔丁氧羰酰基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基]-4-氯-苯甲醚。產(chǎn)率85％。
將1.24mmol上述化合物溶于20ml無水乙醇中，冰浴攪拌下，緩慢地滴加入15ml40％HBr溶液，室溫攪拌過夜。減壓蒸出溶劑，殘余物用EtOH/24％HBr重結晶，得白色晶體為2，6-雙(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基)-4-氯-苯甲醚氫溴酸鹽，產(chǎn)率78％。
3、橋聯(lián)大環(huán)多胺與金屬離子Zn(II)的絡合與實施例1相同。
實施例5本實施例制備雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物，橋R為基團e，結構式如下 工藝步驟為1、大環(huán)多胺的合成與實施例1相同。
2、橋聯(lián)大環(huán)多胺溴酸鹽的合成N2氣保護下，將1.0克(2.12mmol)化合物-4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷溶于50ml無水乙腈中，加入1.06mmol2，9-二溴甲基菲羅啉和0.25克(2.36mmol)無水Na2CO3，回流反應72h，過濾除去不溶物，蒸出溶劑，殘余物用水溶解，CHCl3萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥，除去溶劑。殘余物溶于無水無醇氯仿中，冰浴下，加入0.3g(0.21mmol)三乙胺和0.34克芐氧羰酰氯，室溫反應過夜，減壓蒸去溶劑，殘余物用硅膠H柱層析分離，得無色無定形固體為2，9-雙[4，7，10-三(叔丁氧羰?；?-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基]-菲羅啉。產(chǎn)率63.9％。
將1.24mmol上述化合物溶于20ml無水乙醇中，冰浴攪拌下，緩慢地滴加入15ml40％HBr溶液，室溫攪拌過夜。減壓蒸出溶劑，殘余物用EtOH/24％HBr重結晶，得白色晶體為2，9-雙(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基)-菲羅啉氫溴酸鹽，產(chǎn)率50％。
3、雙核大環(huán)多胺與金屬離子Zn(II)的絡合與實施例1相同。
實施例6用實施例1～實施例5所制備的不同橋連基團的雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物與橋連基團為R＝CH2CH2CH2、R＝CH2CH(OH)CH2的雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物對質(zhì)粒DNA進行催化水解試驗。催化水解實驗采用凝膠電泳技術。
1、儀器BDY-Z型恒壓恒流電泳儀(上海博通貿(mào)易有限公司)FR-180A電泳槽(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)pHS-3TC型數(shù)顯酸度計(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠)TG 328B型電光分析天平(湘儀天平儀器廠)GDS成像系統(tǒng)Olympus公司，Grab-IT2.0 Annotating Image Campture System，帶UVP數(shù)碼相機和White/UV，F(xiàn)ransillunimator。
2、試劑硼酸、蔗糖、溴酚藍均為A.R質(zhì)粒DNA(PUC18、PBR322)華美生物技術公司；Takara公司。
抗壞血酸(Vc)，EDTA二鈉鹽，NaNO3，NaCl用高水重結晶兩次。
瓊脂糖BR，Takara寶生物工程有限公司。
溴乙錠(EB)AR，Sigma公司產(chǎn)品。
三羥甲基胺基甲烷(Tris)用無水乙醇重結晶兩次。
HEPESN-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸。
PIPES1，4-哌嗪-雙(2-乙基磺酸)。
水為滅菌高純水。
所用儀器均在0.10～0.15MPa下滅菌處理。
3、試劑的配制(1)10×TBE電泳緩沖液54gTris-base，4.65gEDTA二鈉鹽，27.5g硼酸，調(diào)節(jié)pH至8.00，加水至800mL。長期保存，用時稀釋。
(2)凝膠加樣緩沖液(6×)0.25％溴酚藍，40％蔗糖水溶液，4℃保存，長期使用。
(3)溴乙錠染色液500mL(1×)電泳緩沖液(內(nèi)含1μg/mL EB)。
4、操作步驟(1)將準確稱量的瓊脂糖加入到100mL的容器中，再加入40mLTBE緩沖液(1×)，將裝有瓊脂糖和TBE緩沖液的容器放在沸水中加熱使瓊脂糖顆粒溶解，冷卻至60℃時倒入帶梳子的水平槽中，室溫下放置30-40分鐘，然后將水平槽放入電泳槽中。
(2)加入電泳緩沖液(1×)，加入量以淹沒膠面約1mm深為宜，然后取出梳子，令樣品孔自然充滿緩沖液。
(3)在各EP管中加入相應的雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物、DNA、抗壞血酸Vc(還原劑)等，雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物的濃度為25μmol/L，DNA的濃度為0.010-0.061μg/ml，抗壞血酸Vc(還原劑)的濃度為0.125-0.342Mm，控制pH＝6.00-7.50，離子強度I＝0.1左右；將EP管放入恒溫水槽內(nèi)，在37±0.5℃反應30-90分鐘后，加入略多于雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物摩爾數(shù)的EDTA溶液終止反應。
(4)在EP管中加入濃度為0.04M的磷酸氫二鈉-鹽酸緩沖液，制成樣品溶液，混勻后用微量移液器加入凝膠樣品孔中并蓋上電泳槽，然后在4℃采用4V/cm電壓降電泳(60V左右)，使DNA向陽極移動，觀察溴酚藍顯示的電泳情況，當樣品到達陽極終止電泳。
(5)取下凝膠，在含1ug/ml溴化乙錠的電泳緩沖液中浸泡染色30分鐘、水中脫色10分鐘后，用紫外燈觀察，DNA呈顯多條帶，用GDS成像系統(tǒng)照相，所得瓊脂糖凝膠電泳圖為圖1。
圖1中，第1行圖為未使用雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物的試驗結果；第2行圖為用橋連基團R＝CH2CH2CH2的雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物對質(zhì)粒DNA進行催化水解的試驗結果；第3行圖為用橋連基團R＝CH2CH(OH)CH2的雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物對質(zhì)粒DNA進行催化水解的試驗結果；第4～8行圖為用實施例1～實施例5所制備的的雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物對質(zhì)粒DNA進行催化水解的試驗結果。
從圖1可以看出，本發(fā)明所提供的五種橋連基團R所構成的雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物(見第4～8行圖)對質(zhì)粒DNA的催化水解效果明顯優(yōu)于橋連基團R＝CH2CH2CH2、R＝CH2CH(OH)CH2所構成的雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物(見第2、3行圖)，其中，實施例4、實施例5所制備的雙核大環(huán)多胺Zn(II)配合物(見第7、8行圖)的催化水解活性更高。
實施例7本實施例制備雙核大環(huán)多胺Cu(II)配合物，橋R為基團a，結構式如下 R1＝H工藝步驟為1、大環(huán)多胺的合成與實施例1相同。
2、橋聯(lián)大環(huán)多胺溴酸鹽的合成N2氣保護下，將1.0克(2.12mmol)化合物-4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷溶于50ml無水乙腈中，加入1.06mmol2，6-二芐溴(2.36mmol)，加入0.25克無水Na2CO3，回流反應72h，過濾除去不溶物，蒸出溶劑，殘余物用水溶解，CHCl3萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥，除去溶劑。殘余物溶于無水無醇氯仿中，冰浴下，加入0.3g(0.21mmol)三乙胺和0.34克芐氧羰酰氯，室溫反應過夜，減壓蒸去溶劑，殘余物用硅膠H柱層析分離，得無色無定形固體為2，6-雙[4，7，10-三(叔丁氧羰?；?-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基]-苯。產(chǎn)率73.9％。
將1.24mmol上述化合物溶于20ml無水乙醇中，冰浴攪拌下，緩慢地滴加入15ml40％HBr溶液，室溫攪拌過夜。減壓蒸出溶劑，殘余物用EtOH/24％HBr重結晶，得白色晶體為2，6-雙(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基)-苯氫溴酸鹽，產(chǎn)率58％。
3、橋聯(lián)大環(huán)多胺與金屬離子Cu(II)的絡合將0.24mmol的上述化合物溶于5ml的高水中，加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH強堿性，用CHCl3萃取，合并有機相，無水Na2SO4干燥，蒸去CHCl3，得淡黃色液體。N2下，將此淡黃色油狀液體溶于5ml無水乙醇中，加熱至60℃，攪拌下，緩慢地滴入含有0.7mmolCu(ClO4)2.6H2O的乙醇溶液5ml，加畢，攪拌反應過夜。冷卻，過濾，固體用EtOH/H2O重結晶，得白色晶體，產(chǎn)率80％。
實施例8本實施例制備雙核大環(huán)多胺Ca(II)配合物，橋R為基團d，結構式如下 R4＝H工藝步驟為1、大環(huán)多胺的合成與實施例1相同。
2、橋聯(lián)大環(huán)多胺溴酸鹽的合成N2氣保護下，將1.0克(2.12mmol)化合物-4，7，10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷溶于50ml無水乙腈中，加入1.06mmol4，4′-二溴甲基聯(lián)二苯和0.25克(2.36mmol)無水Na2CO3，回流反應72h，過濾除去不溶物，蒸出溶劑，殘余物用水溶解，CHCl3萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥，除去溶劑。殘余物溶于無水無醇氯仿中，冰浴下，加入0.3g(0.21mmol)三乙胺和034克芐氧羰酰氯，室溫反應過夜，減壓蒸去溶劑，殘余物用硅膠H柱層析分離，得無色無定形固體為4，4’-雙(4，7，10-三(叔丁氧羰酰基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基)-聯(lián)二苯。產(chǎn)率70％。
將1.24mmol上述化合物溶于20ml無水乙醇中，冰浴攪拌下，緩慢地滴加入15ml40％HBr溶液，室溫攪拌過夜。減壓蒸出溶劑，殘余物用EtOH/24％HBr重結晶，得白色晶體為4，4’-雙(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-甲基)-聯(lián)二苯氫溴酸鹽，產(chǎn)率48％。
3、橋聯(lián)大環(huán)多胺與金屬離子Ca(II)的絡合將0.24mmol的上述化合物溶于5ml的高水中，加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH強堿性，用CHCl3萃取，合并有機相，無水Na2SO4干燥，蒸去CHCl3，得淡黃色液體。N2下，將此淡黃色油狀液體溶于5ml無水乙醇中，加熱至60℃，攪拌下，緩慢地滴入含有0.7mmolCa(ClO4)2.6H2O的乙醇溶液5ml，加畢，攪拌反應過夜。冷卻，過濾，固體用EtOH/H2O重結晶，得白色晶體，產(chǎn)率85.1％。
實施例9本實施例制備雙核大環(huán)多胺Ni(II)配合物，橋R為基團b，結構式如下 R2＝CH3R3＝H工藝步驟為1、大環(huán)多胺的合成與實施例1相同。
2、橋聯(lián)大環(huán)多胺溴酸鹽的合成與實施例2相同。
3、橋聯(lián)大環(huán)多胺與金屬離子Ni(II)的絡合將0.24mmol的上述化合物溶于5ml的高水中，加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH強堿性，用CHCl3萃取，合并有機相，無水Na2SO4干燥，蒸去CHCl3，得淡黃色液體。N2下，將此淡黃色油狀液體溶于5ml無水乙醇中，加熱至60℃，攪拌下，緩慢地滴入含有0.7mmolNi(ClO4)2.6H2O的乙醇溶液5ml，加畢，攪拌反應過夜。冷卻，過濾，固體用EtOH/H2O重結晶，得白色晶體，產(chǎn)率82％。
實施例10本實施例制備雙核大環(huán)多胺Cd(II)配合物，橋R為基團b，結構式如下 R2＝Cl R3＝CH3工藝步驟為
1、大環(huán)多胺的合成與實施例1相同。
2、橋聯(lián)大環(huán)多胺溴酸鹽的合成與實施例4相同。
3、橋聯(lián)大環(huán)多胺與金屬離子Cd(II)的絡合將0.24mmol的上述化合物溶于5ml的高水中，加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH強堿性，用CHCl3萃取，合并有機相，無水Na2SO4干燥，蒸去CHCl3，得淡黃色液體。N2下，將此淡黃色油狀液體溶于5ml無水乙醇中，加熱至60℃，攪拌下，緩慢地滴入含有0.7mmolCd(ClO4)2.6H2O的乙醇溶液5ml，加畢，攪拌反應過夜。冷卻，過濾，固體用EtOH/H2O重結晶，得白色晶體，產(chǎn)率80％。
權利要求
1.一種雙核大環(huán)多胺金屬配合物，其結構式如下 上述結構式中，R為橋，M為金屬離子，R是下述五種基團中的任一種基團。 R1，R2，R3，R4，R5＝烷基或H
2.根據(jù)權利要求1所述的雙核大環(huán)多胺金屬配合物，其特征在于M為Zn2+或Cu2+或Cd2+或Ca2+或Ni2+金屬離子。
3.權利要求1或權利要求2所述的雙核大環(huán)多胺金屬配合物作為DNA和RNA水解催化劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供的雙核大環(huán)多胺金屬配合物具有如下的結構式上述結構式中，R為橋，M為金屬離子。此種雙核大環(huán)多胺金屬配合物作水解催化劑用，能在生理條件下，低濃度(濃度可低至5μmol/L)、短時間(水解時間30分鐘左右)內(nèi)有效的切割DNA和RNA，切割反應的選擇性好，無帶切口環(huán)狀DNA和RNA出現(xiàn)，并且切割方式也與限制性內(nèi)切酶相似。
文檔編號C07F15/04GK1528763SQ200310110730
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月14日 優(yōu)先權日2003年10月14日
發(fā)明者謝如剛, 余孝其, 向清祥, 夏傳琴 申請人:四川大學