專利名稱：基因表達(dá)抑制劑的制作方法
相關(guān)申請本申請要求2002年5月7日提交的臨時申請?zhí)枮?0/377,964的優(yōu)先權(quán)權(quán)益。
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明涉及藥物和生物醫(yī)學(xué)研究。更具體地說，本發(fā)明涉及在真核細(xì)胞里產(chǎn)生在本申請中統(tǒng)稱為siRNA的小發(fā)夾RNAs(shRNAs)或干涉RNAs(siRNAs)的表達(dá)系統(tǒng)，以及用于在真核細(xì)胞里表達(dá)siRNAs的方法。本發(fā)明還涉及所述表達(dá)系統(tǒng)作為藥物產(chǎn)品的應(yīng)用。
現(xiàn)有技術(shù)RNA干涉(RNAi)是由與沉默基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的動植物體中序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)過程。它是一種進(jìn)化保守現(xiàn)象，并且是一種多步驟過程，其涉及通過未完全了解機制的反應(yīng)在體內(nèi)產(chǎn)生活性siRNAs。RNAi已被用作反向遺傳工具，在諸如植物、線蟲(Caenorhabditis elegants)和果蠅(Drosophila)等多種模式生物體中研究基因功能，在這些生物體里大的dsRNAs能有效地引起基因特異沉默。
在哺乳動物細(xì)胞里，30個或更長堿基對的dsRNAs會激活抗病毒反應(yīng)，導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄本的非特異性降解和寄主細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯的總體中止。因此，長的dsRNA不是用于沉默哺乳動物細(xì)胞中特異基因的常用方法。近來，化學(xué)合成或用DNA模板和RNA聚合酶的生物學(xué)方法產(chǎn)生的不同siRNAs已被用于在人工培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞里下調(diào)靶基因的表達(dá)。在用過的方法中，人們總希望，使用包含轉(zhuǎn)錄啟動子和siRNAs的模板的DNA構(gòu)建體，在體內(nèi)和體外產(chǎn)生siRNAs。盡管在這種DNA構(gòu)建體中可適用多種不同啟動子，但所用啟動子的類型仍保持局限于諸如U6啟動子和H1啟動子的III型RNA聚合酶III(Pol III)啟動子，以及諸如T7啟動子的需要病毒RNA聚合酶的啟動子。本發(fā)明提供了產(chǎn)生基因表達(dá)抑制劑的方法和設(shè)計，所述基因表達(dá)抑制劑能大大拓寬siRNAs的潛在應(yīng)用。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及產(chǎn)生用于在哺乳動物細(xì)胞中siRNAs表達(dá)的基因表達(dá)抑制劑的方法。這種抑制劑包含RNA聚合酶III(Pol III)轉(zhuǎn)錄啟動子元件、用于在寄主細(xì)胞里轉(zhuǎn)錄的siRNAs的模板序列、及終止子序列。
所述啟動子是任何天然的或工程化的轉(zhuǎn)錄啟動子。作為這種啟動子的例子(不意味著局限于此)，在一個實施方案中，所述啟動子是I型Pol III啟動子，而在另一個實施方案中，所述啟動子是I型Pol III啟動子元件和III型Pol III啟動子元件的組合。在其它實施方案中使用了其它類型的啟動子。
siRNA的靶區(qū)域是在真核生物或病毒基因組中任何序列的轉(zhuǎn)錄本上的任意位置。所述終止子是任何天然的或工程化的序列，其通過Pol III或其它類型的RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄。
這種基因表達(dá)抑制劑以任何路線、程序或方法，例如(但并不局限于)體內(nèi)、體外、離體、電穿孔、轉(zhuǎn)染或病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，被運送進(jìn)入真核細(xì)胞，包括(但并不局限于)哺乳動物、昆蟲、蠕蟲和植物。


圖1表示在哺乳動物細(xì)胞中用脊椎動物的I型Pol III啟動子產(chǎn)生siRNA的實施方案。具體地說，圖1表示在哺乳動物細(xì)胞中用脊椎動物的I型Pol III啟動子(5S rRNA基因啟動子及其它)產(chǎn)生siRNA的方法。“Abox”、“C box”、“D box”和“IE”是Pol III啟動子元件，“+1”是轉(zhuǎn)錄的起始位點，“Tn”是Pol III啟動子轉(zhuǎn)錄本的終止位點，并且箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。siRNA模板由有義、間隔區(qū)、反義和終止子序列組成，并且在表達(dá)時產(chǎn)生發(fā)夾dsRNA?！坝辛x”是一段17-23核苷酸(nt)的有義序列，其與靶基因的序列相同，并且是發(fā)夾dsRNA中莖的一條鏈的模板?！伴g隔區(qū)”是一段4-15核苷酸的序列，并且是發(fā)夾dsRNA中莖鏈的環(huán)的模板?！敖K止子”是5個胸腺嘧啶脫氧核苷(5Ts)的轉(zhuǎn)錄終止信號。
圖2表示在哺乳動物細(xì)胞中用脊椎動物的III型Pol III啟動子(U6基因啟動子、H1 RNA基因啟動子、Y1基因啟動子、Y3基因啟動子、RNA酶P基因啟動子及其它)產(chǎn)生siRNA的實施方案。DSE是Pol III啟動子的遠(yuǎn)端序列元件(distal sequence element)；PSE是Pol III啟動子的近端序列元件(proximal sequence element)；TATA是一個啟動子元件；+1是轉(zhuǎn)錄的起始位點；箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向；siRNA模板是一段43-66核苷酸(nt)的工程化的插入物，其是用于相對于靶基因產(chǎn)生一發(fā)夾dsRNA的模板；有義是來自靶基因的一段17-23核苷酸的有義序列，是發(fā)夾中莖的一條鏈的模板；間隔區(qū)是一段4-15核苷酸的序列，是發(fā)夾的環(huán)的模板；反義是一段17-23核苷酸的反義序列，是發(fā)夾中莖的另一條鏈的模板；終止子是5個胸腺嘧啶脫氧核苷(5Ts)的轉(zhuǎn)錄終止信號。
圖3表示在哺乳動物細(xì)胞中用工程化的包含I型和III型啟動子中的元件的Pol III啟動子產(chǎn)生siRNA的實施方案?！癉SE”是III型Pol III啟動子的遠(yuǎn)端序列元件(distal sequence element)?！癙SE”是III型Pol III啟動子的近端序列元件(proximal sequence element)；“TATA”是一個III型Pol III啟動子元件?！癆 box”、“C box”、和“IE”是I型Pol III啟動子元件?！?1”是轉(zhuǎn)錄的起始位點?！癟n”是III型Pol III啟動子轉(zhuǎn)錄本的終止位點。箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。siRNA模板由有義、間隔區(qū)、反義和終止子序列組成，并且在表達(dá)時產(chǎn)生發(fā)夾dsRNA?！坝辛x”是一段17-23核苷酸的有義序列，其與靶基因序列相同，并且是發(fā)夾dsRNA中莖的一條鏈的模板。間隔區(qū)是一段4-15核苷酸的序列，并且是發(fā)夾dsRNA的環(huán)的模板；“反義”是一段17-23核苷酸反義序列，并且是發(fā)夾dsRNA中莖的另一條鏈的模板。終止子是5個胸腺嘧啶脫氧核苷(5Ts)的轉(zhuǎn)錄終止信號。
圖4表示在哺乳動物細(xì)胞中用脊椎動物的兩個I型Pol III啟動子產(chǎn)生siRNA的實施方案，所述兩個I型Pol III啟動子分別啟動有義siRNA和反義siRNA轉(zhuǎn)錄?！癆 box”、“C box”、“D box”和“IE”是Pol III啟動子元件?！?1”是轉(zhuǎn)錄的起始位點。“Tn”是Pol III啟動子轉(zhuǎn)錄本的終止位點。箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。“有義siRNA模板”是一段22-28核苷酸的工程化的插入序列，其是用于相對于靶基因產(chǎn)生一個有義單鏈RNA(ssRNA)的模板，并且由有義和終止子序列組成?！胺戳xsiRNA模板”是一段22-28核苷酸的工程化的插入序列，其是用于相對于靶基因產(chǎn)生一個反義ssRNA的模板，并且由反義和終止子序列組成?！坝辛x”是一段17-23核苷酸的有義序列，其與靶基因序列相同，并且是發(fā)夾dsRNA中莖的一條鏈的模板。“間隔區(qū)”是一段4-15核苷酸的序列，并且是發(fā)夾dsRNA的環(huán)的模板?！胺戳x”是一段17-23核苷酸反義序列，并且是發(fā)夾dsRNA中莖的另一條鏈的模板?！敖K止子”是5個胸腺嘧啶脫氧核苷(5Ts)的轉(zhuǎn)錄終止信號。
圖5表示在哺乳動物細(xì)胞中用工程化的T7聚合酶和T7啟動子產(chǎn)生siRNA的實施方案?！皢幼印笔且粋€組成型的或依賴環(huán)境的啟動子，例如可誘導(dǎo)啟動子或細(xì)胞類型特異的啟動子；“T7聚合酶基因”是一段編碼T7聚合酶的序列。T7啟動子是一種T7啟動子。“+1”是轉(zhuǎn)錄的起始位點。箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。siRNA模板由有義、間隔區(qū)、反義和終止子序列組成，并且在表達(dá)時產(chǎn)生發(fā)夾dsRNA。“有義”是一段17-23核苷酸的有義序列，其與靶基因序列相同，并且是發(fā)夾dsRNA中莖的一條鏈的模板?！伴g隔區(qū)”是一段4-15核苷酸的序列，并且是發(fā)夾dsRNA的環(huán)的模板。“反義”是一段17-23核苷酸的反義序列，并且是發(fā)夾dsRNA中莖的另一條鏈的模板?！敖K止子”是T7聚合酶的工程化的終止子。
圖6表示在哺乳動物細(xì)胞中用單個的多轉(zhuǎn)錄單元構(gòu)建體產(chǎn)生多個siRNA的實施方案?！皢卧笔且粋€包含脊椎動物的I型Pol III啟動子和siRNA模板的轉(zhuǎn)錄單元?！癆 box”、“C box”、“D box”和“IE”是Pol III啟動子元件?！?1”是轉(zhuǎn)錄的起始位點?！癟n”是Pol III啟動子轉(zhuǎn)錄本的終止位點。箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。siRNA模板的結(jié)構(gòu)由有義、間隔區(qū)、反義和終止子序列組成，并且是一段設(shè)計的插入序列，其是用于相對于靶基因產(chǎn)生一個發(fā)夾dsRNA的模板?！坝辛x”是一段17-23核苷酸的有義序列，其與靶基因序列相同，并且是發(fā)夾dsRNA中莖的一條鏈的模板?！伴g隔區(qū)”是一段4-15核苷酸的序列，并且是發(fā)夾dsRNA的環(huán)的模板?！胺戳x”是一段17-23核苷酸的反義序列，并且是發(fā)夾dsRNA中莖的另一條鏈的模板?！敖K止子”是5個胸腺嘧啶脫氧核苷(5Ts)的轉(zhuǎn)錄終止信號。多個siRNA可以靶向一個基因的單個區(qū)域、一個基因的不同區(qū)域、或多個基因中每一個基因的一個區(qū)域。
本發(fā)明的詳細(xì)描述提供以下的詳細(xì)說明是為了幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)用本發(fā)明。不能視作對本發(fā)明的限制。
本發(fā)明旨在通過制造和使用DNA構(gòu)建體，選擇性地抑制哺乳動物中靶基因的表達(dá)，所述構(gòu)建體包含RNA聚合酶III(Pol III)轉(zhuǎn)錄啟動子元件、將在寄主細(xì)胞里轉(zhuǎn)錄的siRNAs的模板序列、和終止子序列。
啟動子是任何天然的或工程化的轉(zhuǎn)錄啟動子。在一個實施方案中，啟動子是I型Pol III啟動子。I型啟動子的必要元件，如“A box”、“C box”、“D box”和“IE”都包含在DNA構(gòu)建體中。在這個實施方案中，siRNA模板置于“D box”和“A box”之間。在另一個實施方案中，啟動子是I型Pol III啟動子元件和III型Pol III啟動子元件的組合。在這個實施方案中，兩種啟動子的必要元件，如I型啟動子的“A box”、“C box”、和“IE”，以及III型啟動子的“DSE”、“PSE”和“TATA”都包含在DNA構(gòu)建體中，其中“DSE”、“PSE”和“TATA”位于“+1”位點的上游區(qū)域，“A box”、“C box”、和“IE”位于“+1”位點的下游區(qū)域。任何在哺乳動物細(xì)胞中起作用的啟動子都適用于本發(fā)明。對現(xiàn)有啟動子做的修飾，如增加可誘導(dǎo)或增強元件也適用于本發(fā)明。
siRNA的靶區(qū)域是哺乳動物或病毒基因組的任何序列的轉(zhuǎn)錄本的任何位置。在一些實施方案中，編碼具有“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的RNA分子的siRNA的模板包含靶基因的有義和反義序列。在其他實施方案中，有義序列的模板和反義序列的模板由不同啟動子啟動。
終止子是任何天然的或工程化的序列，通過Pol III或其它類型的RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄，例如(并不局限于)，DNA分子中一段4個或更多胸腺嘧啶脫氧核苷殘基。
任何包含啟動子、RNA的模板和終止子的轉(zhuǎn)錄單元都適用于與另一個單元或多個單元一起構(gòu)建到作為抑制劑的DNA分子里。在一個實施方案中，表示了多轉(zhuǎn)錄單元的構(gòu)建體。多于一種的基因表達(dá)抑制劑(DNA分子)適用于一起被導(dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞中。在同一個哺乳動物細(xì)胞里由這些多轉(zhuǎn)錄單元或共-導(dǎo)入方法產(chǎn)生的siRNAs使得抑制劑能靶向于一個靶RNA分子的一個特定區(qū)域、一個靶RNA分子的多個區(qū)域、或多于一個的RNA分子的多個區(qū)域。
上述這種DNA構(gòu)建體可以被構(gòu)建作為任何合適的克隆載體或表達(dá)載體的一部分。然后抑制劑可以任何路線、程序或方法，例如體內(nèi)、體外、離體、注射、電穿孔法、轉(zhuǎn)染或病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，被運送進(jìn)細(xì)胞、組織或生物體。
實施例實施例1人類5S rDNA調(diào)節(jié)序列的克隆用于下面提供的實驗設(shè)計的啟動子是人類5S rRNA基因。該序列在數(shù)據(jù)庫里提供Genebank登錄號X12811。5S rRNA啟動子包含下游的Abox和C box和上游的D box。在圖1中，在5S rRNA的起始位點和A box之間的49個核苷酸的序列要被干涉RNA序列替換。用2個步驟產(chǎn)生包含上游和下游box的盒(cassette)。A box和C box的克隆可以由化學(xué)合成得到。上游的D box由PCR得到。
重組的5S rRNA的D box的克隆是通過PCR得到，其中使用了正向引物(AACggatccaaaacgctgcctccgcga)和反向引物(TAGACGCTGCAGGAGGCGCCTGGCT)，然后其被亞克隆到pBS2SK載體的BamHI和PstI位點。A/C box可以被作為頂鏈(top strand)(AGAAGACGAagctaagcagggtcgggcctggttagtacttggatgggagaccgcctgggaataccgggtgctgtaggctttttg)和底鏈(bottom strand)(TCGACAAAAAGCCTACAGCACCCGGTATTCCCAGGCGGTCTCCCATCCAAGTACTAACCAGGCCCGACCCTGCTTAGCTTCGTCTTCT)合成，然后被退火、亞克隆到克隆的D box下游的EcoRV和SalI位點。退火的DNA片斷工程化為帶有BbsI位點。
實施例2RNAi序列的插入和克隆RNAi盒(cassette)以兩條鏈合成，并克隆到PstI位點和BbsI位點之間。RNAi盒(cassette)設(shè)計如下5’GC(N19)TTTCGG(61N)TTTTT3’3’ACGTCG(61N)AAAGCC(N19)AAAAATCGA5’N19是從靶基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域挑選出的19核苷酸的靶DNA序列。61N是N19的反向互補鏈。轉(zhuǎn)錄從N19靶序列的第一個堿基開始，終止于polyT。
實施例3靶向于乳腺癌的ErbB2/Her2ErbB2/Her2基因在約30％的人類乳腺癌里擴增，導(dǎo)致癌細(xì)胞的快速生長和轉(zhuǎn)移。Herceptin是Genentech公司生產(chǎn)的一種能阻遏ErbB2作用的抗體，與只進(jìn)行化療的病人相比，只有Herceptin當(dāng)與化療聯(lián)用給藥時能使ErbB2陽性的乳腺癌病人減緩轉(zhuǎn)移乳腺疾病的發(fā)展，提高總存活率。通過本發(fā)明研發(fā)的產(chǎn)生靶向于ErbB2的siRNA的方法，能夠提供一種可供選擇的治療方法。
實施例4靶向于慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)和其他癌癥的BCR-AbI酪氨酸激酶BCR-AbI是一種在CML中經(jīng)常產(chǎn)生的融合基因產(chǎn)物。Novartis公司研制的ST1571又稱Gleevec，新近被批準(zhǔn)為靶向于CML中的BCR-AbI的抗癌藥物。通過本發(fā)明研發(fā)的產(chǎn)生針對融合基因BCR-AbI的siRNAs的方法，不干涉BCR或AbI基因的正常表達(dá)，從而應(yīng)有以基因治療方法治療CML的很大潛力。
實施例5靶向于B型肝炎病毒(HBV)應(yīng)用本發(fā)明靶向于HBV基因組的不同位點，能夠提供一種強效的基因治療方法以治療B型肝炎病人。
實施例6靶向于I型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)應(yīng)用本發(fā)明靶向于HIV基因組的不同位點，能夠提供一個強效的基因治療方法以治療HIV感染病人。一個能同時靶向于多個位點，例如env、gag、pol、Vif、nef、vpr、vpu和tat的多單元抑制劑，可適用于解決HIV基因組變異引起的抗性。
權(quán)利要求
1.一種重組DNA構(gòu)建體，包含至少一個轉(zhuǎn)錄單元，該轉(zhuǎn)錄單元含有轉(zhuǎn)錄啟動子、制造RNA分子的模板序列和轉(zhuǎn)錄終止子。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中天然的I型Pol III啟動子是轉(zhuǎn)錄的起始機制。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中工程化的I型Pol III啟動子是轉(zhuǎn)錄的起始機制。
4.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中包含I型Pol III啟動子的一個或多個必要元件的天然啟動子是轉(zhuǎn)錄的起始機制。
5.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中包含I型Pol III啟動子的一個或多個必要元件的工程化啟動子是轉(zhuǎn)錄的起始機制。
6.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中能通過任何哺乳動物或病毒的RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄的天然啟動子是轉(zhuǎn)錄的起始機制。
7.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中能通過任何哺乳動物或病毒的RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄的工程化啟動子是轉(zhuǎn)錄的起始機制。
8.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述模板包括，能產(chǎn)生全長或部分RNA分子的序列，所產(chǎn)生的RNA分子能通過RNA介導(dǎo)的下調(diào)作用下調(diào)靶基因的表達(dá)，包括但不局限于RNAi。
9.權(quán)利要求8的構(gòu)建體，其中所述靶基因是選自哺乳動物和病毒基因組的基因。
10.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄單元與多于一個的其它這種單元一起構(gòu)建到同一個DNA分子里，以靶向于一個或多個基因的相同或不同的區(qū)域。
11.包含如權(quán)利要求1所述構(gòu)建體的克隆或表達(dá)載體。
12.包含權(quán)利要求1的構(gòu)建體的分子、細(xì)胞、組織、器官、生物體或其它任何工程化的材料。
13.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述模板包含能產(chǎn)生全長或部分RNA分子的序列，所產(chǎn)生的RNA分子能結(jié)合其靶(例如DNA、RNA、蛋白質(zhì)或任何其它形式的分子)并調(diào)節(jié)這些靶的功能。
14.一種制造用于真核細(xì)胞的基因抑制劑的方法，這種方法包括使用重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含至少一個轉(zhuǎn)錄單元，所述轉(zhuǎn)錄單元包含轉(zhuǎn)錄啟動子、用于制造RNA分子的模板序列和轉(zhuǎn)錄終止子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過使用一種重組DNA構(gòu)建體制造用于真核細(xì)胞的基因抑制劑的方法，這種重組DNA構(gòu)建體包含至少一個轉(zhuǎn)錄單元，該轉(zhuǎn)錄單元包括轉(zhuǎn)錄啟動子、用于制造RNA分子的模板序列、和轉(zhuǎn)錄終止子。RNA介導(dǎo)的基因抑制的機制包括，但并不局限于，RNA干涉(RNAi)。也揭示了該抑制劑作為生物醫(yī)學(xué)研究的工具和醫(yī)藥產(chǎn)品的應(yīng)用。
文檔編號C07H21/04GK1780920SQ03826448
公開日2006年5月31日 申請日期2003年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月12日
發(fā)明者校迎憲, 馮新華 申請人:波多瑪克制藥有限公司