專利名稱：小麥南大2419抗赤霉病擴展主效基因位點及其分子標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了小麥南大2419抗赤霉病擴展主效基因位點及其分子標記，屬于分子遺傳學領域，專用于小麥赤霉病抗病品種的選育與種質資源的利用。
二、技術背景小麥是我國的重要糧食作物。由赤霉菌引起的小麥赤霉病，不僅造成小麥嚴重減產，降低籽粒品質，而且該病菌產生的毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇還影響人、畜健康，給小麥生產造成了極大損失。在我國，有超過四分之一的小麥產區(qū)遭受赤霉病的危害，且每隔3~5年就有一次大流行，僅2002年赤霉病發(fā)生面積即達3000萬畝次。因此，研究防治小麥赤霉病也就成了當前小麥生產上的一個迫切任務。培育抗病品種是防治小麥赤霉病危害的最安全、有效而且節(jié)約成本的措施之一。但傳統(tǒng)育種方法費時費力，而且由于赤霉病表型鑒定非常困難，使小麥抗赤霉病育種進程異常緩慢。通過定位鑒定抗病主效基因位點來輔助育種可以有效解決這一問題。
遺傳研究表明，小麥赤霉病主要受少數(shù)幾個主效基因位點控制，不同的抗性材料其抗病主效基因位點在染色體上的位置不一致，而且分為抗侵染和抗擴展兩種類型。但通過不同抗病主效基因位點的聚合或者引入新的抗源可以選育出抗性很好的品種。
目前在赤霉病抗性遺傳基礎的研究及抗病育種的利用上多集中在蘇麥3號及其衍生系。南大2419是意大利小麥品種Mentana的選系，具有較好的豐產性，農藝性狀優(yōu)良，是我國小麥育種的骨干親本之一。而且Mentana與蘇三的親本“Funo”有著共同的祖先，所以南大2419中可能存在與蘇三相似的赤霉病抗性機制。
右端引物序列 CGATAACCACTCATCCACACC擴增片段172bp，該主效基因位點位于小麥南大2419的6D染色體，利用Data desk v.5.0軟件測得與赤霉病抗性不相關的概率P值為0.0089，對赤霉病抗性的貢獻率6.1％；上述小麥南大2419抗赤霉病擴展主效基因位點，是通過以下方法獲得標記定位的(1)小麥品種望水白(♀)與南大2419(♂)進行雜交得到雜種F1，F(xiàn)1自交產生F2，然后采用單粒傳方法(SSD)獲得F6代的重組自交系；(2)用SDS法提取重組自交系群體各株系的DNA，采用簡單重復序列標記SSR對兩親本進行多態(tài)性篩選，PCR在PE9600擴增儀上進行，擴增產物在8％(g/ml)聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析，親本間有多態(tài)的引物在重組自交系群體中進行分析，PCR擴增程序同上，獲取群體基因型資料；(3)根據連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構建小麥的遺傳圖譜，所用軟件為Mapmaker 2.0，最小LOD值設為3，獲得連鎖圖譜；(4)揚花期對重組自交系每個家系進行赤霉病抗性鑒定，主要指標為病小穗數(shù)和病節(jié)長度(5)利用Data desk v.5.0軟件對各個分子標記的群體基因型資料與其對應每個家系的赤霉病抗性鑒定的病小穗數(shù)及病節(jié)長度進行連鎖分析，單向方差分析測得與赤霉病抗性不相關的概率P值，P＜0.05的分子標記即表明與一個主效基因位點連鎖在南大2419中發(fā)現(xiàn)P＝0.0004的標記Xgwm107和P＝0.0089的標記Xgwm469與抗擴展主效基因位點緊密連鎖，即獲得小麥南大2419抗擴展主效基因位點QFhs.nau-4b和QFhs.nau-6d1的標記定位。有益效果 本發(fā)明所提供的小麥南大2419抗赤霉病擴展主效基因位點及其分子標記，具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明在國際上首次獲得定位了小麥品種南大2419中的2個抗赤霉病擴展的主效基因位點，共同可解釋39.6％的赤霉病抗性。小麥基因組巨大，是水稻基因組大小的40倍，對小麥抗赤霉病主效基因位點的精確定位工作居于同領域前列；(2)主效基因位點位置明確，鑒定方便。通過檢測與這些抗擴展主效基因位點連鎖的分子標記，即可以預測小麥植株的赤霉病抗性，用于小麥品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有赤霉病抗性，進而快速篩選抗病品種或品系用于小麥育種。主效基因位點的檢測方便快速，不受環(huán)境影響；(3)輔助育種選擇目標明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有抗病基因的親本與栽培品種進行一系列雜交，而且要對赤霉病抗性進行單株選擇。對小麥赤霉病進行表型鑒定要等到揚花期，受到較大的環(huán)境影響，表型鑒定的結果可靠性低。因此抗病育種不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測抗赤霉病主效基因位點，可以在苗期就鑒定出高抗赤霉病的單株，淘汰其它植株，不僅節(jié)約生產成本而且大大提高抗赤霉病小麥的選擇效率。
具體實施例方式
本發(fā)明的詳細說明如下
研究表明，小麥赤霉病抗性主要受少數(shù)主效基因位點控制。美國Anderson實驗室發(fā)現(xiàn)四個主效基因位點與蘇麥3號/Stoa群體的赤霉病抗性呈顯著相關，分別位于2AL、3BS、4BS和6BS上(Anderson，1998；Waldron，1999；Anderson，2000，2001)。美國Bai等人獲得與RAPD標記相關的兩個赤霉病抗性位點，2002年Zhou綜合運用SSR、AFLP和非整倍體技術將該主效基因位點定位在缺失系3BS-8未端上一個長度約為8cM的染色體區(qū)域。日本Ban推測蘇麥3的抗性主效基因位點可能位于5AL上。奧地利的Buerstmayr(2000，2001)發(fā)現(xiàn)有三個基因組區(qū)域與赤霉病抗擴展性顯著相關，并定位于3BS、5A、1B上。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，小麥品種南大2419的4B和6D染色體中存在2個抗擴展主效基因位點，這些主效基因位點可用來指導抗赤霉病品種的選育工作，用與之連鎖的分子標記對抗病品種進行篩選，使不同抗病主效基因位點快速聚合在同一個植株中，從而大大提高育種效率。材料與方法(一)南大2419重組自交系的構建與表型鑒定(1)對我國江蘇地方品種望水白(♀)與意大利小麥品種Mentana的選系南大2419(♂)進行雜交獲得F1，F(xiàn)1自交產生F2，136個F2單株任選一粒種植，采用單粒傳的方法繁殖到F6代，獲得重組自交系，包括136個家系；(2)重組自交系種植在南京農業(yè)大學校內試驗田、溫室內以及江蘇省農科院。揚花期對每個家系進行赤霉病抗性鑒定。采用單花滴注法，即選取麥穗中部剛開花的小穗，滴注含F(xiàn)4、F15、F17、F34幾種強致病赤霉菌孢子的混合菌液20微升，然后彌霧保濕3天。接種21天后，測量病小穗數(shù)以及病節(jié)長度等病情指標。(二)重組自交系群體的分子標記分析(1)用SDS法提取重組自交系群體各株系DNA；(2)首先用976對SSR引物對望水白和南大2419親本的DNA多態(tài)性進行初步分析。PCR反應體積為25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl21.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶(5單位/微升)0.2微升，模板DNA 20納克，加水至25微升。SSR反應體系為DNA 94℃預變性3min后，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸展2min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。在PE 9600擴增儀上進行PCR擴增，擴增產物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉雙丙烯酰胺)上進行電泳分離，然后在紫外透射儀上照相，記錄結果，親本間有多態(tài)的引物在重組自交系群體中進行分析，獲取群體基因型資料；(3)根據連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構建小麥的遺傳圖譜，所用軟件為Mapmaker 2.0，最小LOD值設為3，獲得連鎖圖譜；(4)利用Data desk v.5.0軟件對各個分子標記的群體基因型資料和與其對應每個家系的赤霉病抗性鑒定的病小穗數(shù)和病節(jié)長度進行連鎖分析，定位主效基因位點。(三)結果與分析分子標記篩選結果表明，有383對SSR引物在雙親間有差異。利用Datadesk v.5.0軟件對各個分子標記的群體基因型資料與其對應每個家系的赤霉病抗性鑒定的病小穗數(shù)及病節(jié)長度進行連鎖分析，單向方差分析測得與赤霉病抗性不相關的概率P值和位點對赤霉病抗性的貢獻率R2(表2)，P＜0.05的分子標記即與一個主效基因位點連鎖。所得分子標記在群體中的基因型按親本望水白和南大2419的基因型分類，如果基因型與南大2419相同的株系表型為抗，則該標記定位的抗病主效基因位點來自南大2419在南大2419中發(fā)現(xiàn)P＝0.0004的標記Xgwm107和P＝0.0089的標記Xgwm469與抗擴展主效基因位點緊密連鎖，即獲得小麥南大2419抗擴展主效基因位點QFhs.nau-4b和QFhs.nau-6d1的標記定位。
通過鑒定上述主效基因位點來預測小麥植株抗性，預計可迅速提高我國小麥抗病品種的育種進程。
表1.標記引物的序列及擴增片段大小片段大小標記 左端引物序列 右端引物序列(bp)Xgwm107 ATTAATACCTGAGGGAGGTGCGGTCTCAGGAGCAAGAACAC 188Xawm469 CAACTCAGTGCTCACACAACGCGATAACCACTCATCCACACC172表2.南大2419抗擴展主效基因位點的單向方差分析病小穗數(shù)主效基因位點 標記P R2(％)QFhs.nau-4b Xgwm107 0.0004 17.9QFhs.nau-6d1 Xgwm469 0.0089 6.1P表示與赤霉病抗性不相關的概率，P＜0.05表該標記與赤霉病抗性緊密連鎖R2位點對赤霉病抗性的貢獻率，值越大表明與赤霉病抗性越相關
權利要求
1.小麥南大2419抗赤霉病擴展主效基因位點，其特征在于主效基因位點QFhs.nau-4b，由標記Xgwm107定位，左端引物序列 ATTAATACCTGAGGGAGGTGC右端引物序列 GGTCTCAGGAGCAAGAACAC擴增片段188bp，該主效基因位點位于小麥南大2419的4B染色體，利用Data desk v.5.0軟件測得與赤霉病抗性不相關的概率P值為0.0004，對赤霉病抗性的貢獻率17.9％；主效基因位點QFhs.nau-6d1，由標記Xgwm469定位，左端引物序列 CAACTCAGTGCTCACACAACG右端引物序列 CGATAACCACTCATCCACACC擴增片段172bp，該主效基因位點位于小麥南大2419的6D染色體，利用Data desk v.5.0軟件測得與赤霉病抗性不相關的概率P值為0.0089，對赤霉病抗性的貢獻率6.1％。
2.根據權利要求1所述的小麥南大2419抗赤霉病擴展主效基因位點，其特征在于這些主效基因位點是通過以下方法獲得標記定位的(1)小麥品種望水白(♀)與南大2419(♂)進行雜交得到雜種F1，F(xiàn)1自交產生F2，然后采用單粒傳方法(SSD)獲得F6代的重組自交系；(2)用SDS法提取重組自交系群體各株系的DNA，采用簡單重復序列標記SSR對兩親本進行多態(tài)性篩選，PCR在PE9600擴增儀上進行，擴增產物在8％(g/ml)聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離分析，根據分子標記篩選結果，篩選出親本間有多態(tài)的引物，親本間有多態(tài)的引物在重組自交系群體中進行分析，PCR擴增程序同上，獲取群體基因型資料；(3)根據連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構建小麥的遺傳圖譜，所用軟件為Mapmaker 2.0，最小LOD值設為3，獲得連鎖圖譜；(4)揚花期接種赤霉病病原菌，對重組自交系每個家系進行赤霉病抗性鑒定，獲得重組自交系每個家系的病小穗數(shù)和病節(jié)長度；(5)利用Data desk v.5.0軟件對各個分子標記的群體基因型資料與其對應每個家系的赤霉病抗性鑒定的病小穗數(shù)及病節(jié)長度進行連鎖分析，單向方差分析測得與赤霉病抗性不相關的概率P值，P＜0.05的分子標記即與一個主效基因位點連鎖，抗赤霉病擴展主效基因位點的位置由分子標記的染色體位置確定在南大2419中發(fā)現(xiàn)P＝0.0004的標記Xgwm107和P＝0.0089的標記Xgwm469與抗擴展主效基因位點緊密連鎖，即獲得小麥南大2419抗擴展主效基因位點QFhs.nau-4b和QFhs.nau-6d1的標記定位。
3.權利要求1或2所述小麥南大2419抗赤霉病擴展主效基因位點的分子標記，其特征在于，南大2419中位于4B、6D染色體上的抗赤霉病擴展主效基因位點QFhs.nau-4b和QFhs.nau-6d1的分子標記分別為Xgwm107和Xgwm469。
全文摘要
本發(fā)明提供了小麥南大2419抗赤霉病擴展主效基因位點及其分子標記，屬于分子遺傳學領域。對小麥品種望水白(♀)與南大2419(♂)雜交獲得的重組自交系的各家系的基因型和各家系的病小穗數(shù)和病節(jié)長度進行遺傳連鎖分析，獲得南大2419抗赤霉病擴展主效基因位點QFhS.nau－4b和QFhs.nau－6d1。通過檢測南大2419及其衍生品種(系)中是否含有該主效基因位點，可預測其赤霉病抗性水平，大大提高抗赤霉病小麥的選擇效率。
文檔編號C07H21/04GK1462807SQ0313196
公開日2003年12月24日 申請日期2003年6月23日 優(yōu)先權日2003年6月23日
發(fā)明者馬正強, 林峰, 孔忠新 申請人:南京農業(yè)大學