專利名稱：蛋白質(zhì)的電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的快速且高靈敏度的電泳方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)一般是根據(jù)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)法進行大小分離和檢測。將其用于毛細(xì)管電泳即為SDS-CGE(毛細(xì)管凝膠電泳)，作為將其進一步應(yīng)用于微芯片型電泳的方法，可以例舉通過使用Protein 200試劑盒的Agilent 2100 Bioanalyzer(AgilentTechnologies公司生產(chǎn))進行的分析。蛋白質(zhì)在天然狀態(tài)下帶有各種電荷，認(rèn)為帶正電荷的蛋白質(zhì)在正電場下不發(fā)生移動。因此，按照上述現(xiàn)有方法，通常必須進行蛋白質(zhì)的熱變性處理作為預(yù)處理，使全部被測蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。熱變性處理通常通過下述方法實現(xiàn)將蛋白質(zhì)置于表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液和2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇等還原劑中，在95～100℃下加熱數(shù)分鐘。2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇用來切斷S-S鍵，且SDS用來使所有蛋白質(zhì)的電荷都變?yōu)樨?fù)電荷。
因此，即使通過微芯片型電泳能夠使分析步驟快速化，也不能縮短SDS-PAGE法和SDS-CGE法等現(xiàn)有方法中該預(yù)處理步驟的時間，存在操作煩鎖的缺點。因此，期望有更快速的蛋白質(zhì)電泳方法。而且，在解析生物樣品的場合，必須對試樣中非常微量的蛋白質(zhì)進行解析，所以希望有靈敏度更高的電泳方法。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的在于提供一種不必進行熱變性的預(yù)處理步驟，就能夠在天然狀態(tài)下對蛋白質(zhì)進行快速解析，而且具有更高靈敏度的電泳方法。
亦即，本發(fā)明的要點是涉及[1]一種電泳方法，其特征在于，不進行熱變性處理，就將蛋白質(zhì)供于大小分離的電泳；[2]上述[1]所述的電泳方法，其特征在于，將溶解于水的蛋白質(zhì)供于電泳； 上述[1]或[2]所述的電泳方法，其特征在于，將2個或2個以上的分子量標(biāo)記與蛋白質(zhì)一起供于電泳，至少該標(biāo)記之一與標(biāo)準(zhǔn)濃度相比為低濃度；[4]上述[1]～[3]中任意一項所述的電冰方法，其特征在于，將2個或2個以上的分子量標(biāo)記與蛋白質(zhì)一起供于電泳，該標(biāo)記之一的濃度為被測蛋白質(zhì)濃度的1/10～10倍；[5]上述[1]～[4]中任意一項所述的電冰方法，其特征在于，電泳的方式選自毛細(xì)管電泳法、微芯片型電泳法和納米通道型電泳法。
附圖的簡要說明

圖1表示在微芯片型電泳中對電泳條件進行研究的結(jié)果。
圖2表示在微芯片型電泳中對電泳條件進行研究的結(jié)果。
圖3表示在微芯片型電泳中對電泳條件進行研究的結(jié)果。
圖4表示在微芯片型電泳中對電泳條件進行研究的結(jié)果。
圖5表示在微芯片型電泳中對電泳條件進行研究的結(jié)果。
圖6表示在微芯片型電泳中對電泳條件進行研究的結(jié)果。
圖7表示在微芯片型電泳中對電泳條件進行研究的結(jié)果。
發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明的蛋白質(zhì)電泳方法的一個重要特征在于，不進行熱變性處理即可將蛋白質(zhì)供于以大小分離為目的的電泳。本發(fā)明的電泳方法因其不進行熱變性處理，具有可以縮短電泳的分析時間，簡化操作的優(yōu)點。
在本說明書中，蛋白質(zhì)是指多個氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物，這意味著天然來源物、合成物和短鏈的肽都包括在內(nèi)。
作為本發(fā)明的電泳方法中能夠解析的蛋白質(zhì)，沒有特別的限定，可以對天然來源物、合成物和含有氨基酸以外的構(gòu)成成分的核蛋白、糖蛋白、脂蛋白質(zhì)等進行解析，但特別適用于水溶性蛋白質(zhì)。關(guān)于能夠測定的分子大小，通過適當(dāng)設(shè)定標(biāo)記，所有大小的蛋白質(zhì)都可以進行解析，但特別適合解析6kDa～210kDa的蛋白質(zhì)。另外，膜結(jié)合的蛋白質(zhì)優(yōu)選在溶解后用于本發(fā)明的電泳方法中。該溶解處理可以通過鹽溶液或EDTA等螯合劑的處理、超聲波等的機械處理、或者用表面活性劑的處理等實現(xiàn)。
作為本發(fā)明的電泳方法所使用的分離用載體，沒有特別的限定，可以例舉通常的毛細(xì)管凝膠電泳或微芯片型凝膠電泳等中蛋白質(zhì)的分子大小分離用的聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺凝膠、羥丙基纖維素、羥甲基丙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、β-環(huán)糊精、α-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精等分離用載體，此外，也可以適用WO 02/097421記載的含有β-1，3葡聚糖結(jié)構(gòu)的cardran、昆布糖和海藻提取物等。作為分離用載體的添加劑，可以例舉十二烷基硫酸鈉(SDS)、Triton X-100、ε-氨基己酸、3-[(3-膽酰胺(colamide)丙基)-二甲氨基]-1-丙烷、CHAPS、6～8M尿素、四甲基乙二胺(TEMED)、溴化己基三甲基銨(HTAB)、溴化十二烷基三甲基銨(DTAB)等。
作為電泳用緩沖液，可以例舉Tris-甘氨酸緩沖液、Tris-硼酸緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、Tris-Tricine緩沖液、Tris-磷酸二氫鈉酸緩沖液等，以及一般作為蛋白質(zhì)的電泳用緩沖液所使用的緩沖液，市售的蛋白質(zhì)電泳用試劑盒中提供的緩沖液等也可以使用。上述電泳用緩沖液能夠以一般作為蛋白質(zhì)電泳用緩沖液使用的濃度使用。
電泳用緩沖液也可以含有上述分離用載體。通過將分離用載體加入電泳用緩沖液中，可使操作變得簡便，從而能夠以更快的速度進行解析。
從合適的滲透電流和適合于蛋白質(zhì)的電泳的觀點考慮，電泳用緩沖液的pH優(yōu)選為2.0～9.0，更優(yōu)選為6.8～8.6。
作為制備試樣用的溶液，可以使用水、SDS溶液、或者在SDS-Tris硼酸溶液等中添加了2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇的溶液。從提高峰強度、提高峰分離度、提高檢測限、提高測定精度的觀點出發(fā)，特別優(yōu)選水。
作為水，可以使用超純水、去離子水、MilliQ水等在蛋白質(zhì)電泳中通常使用的水，特別優(yōu)選MilliQ水。
另外，水作為制備試樣用的溶液使用時，從增強峰強度、提高檢測限的觀點考慮，優(yōu)選用水使蛋白質(zhì)溶解。
從測定精度的觀點考慮，作為試樣溶液中蛋白質(zhì)的濃度，優(yōu)選為0.05～2000ng/μl，更優(yōu)選為0.1～2000ng/μl，特別優(yōu)選為0.5～200ng/μl。
作為能夠使用本發(fā)明的電泳方法的優(yōu)選方式，可以例舉毛細(xì)管電泳、微芯片型電泳、和納米通道型電泳。
毛細(xì)管電泳通常是在內(nèi)徑為100μm以下的毛細(xì)管內(nèi)充填電泳用緩沖液，將試樣導(dǎo)入一端后，在兩端施加高電壓，使被測蛋白質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)展開。作為毛細(xì)管，通常使用火成(fumed)二氧化硅毛細(xì)管，可以使用其內(nèi)壁無涂層的毛細(xì)管，也可以使用內(nèi)壁有涂層的毛細(xì)管(50％苯甲基聚硅氧烷、聚乙二醇、聚胺等)。另外，也可以使用用PEO(聚環(huán)氧乙烷)對無涂層的毛細(xì)管進行處理后的毛細(xì)管。
采用毛細(xì)管電泳的方式，本發(fā)明的電泳方法具體通過包括下述步驟的方法進行，不對含有蛋白質(zhì)的試樣進行熱變性，將試樣注入毛細(xì)管內(nèi)，使蛋白質(zhì)移動至能夠進行蛋白質(zhì)分離的泳動電場下的步驟；以及利用泳動電場使蛋白質(zhì)電泳的步驟。
將試樣注入毛細(xì)管內(nèi)，使蛋白質(zhì)移動至能夠進行蛋白質(zhì)分離的泳動電場下的步驟，更具體地說，是通過電壓法、加壓法、落差法進行，可以根據(jù)裝置的種類、毛細(xì)管的粗細(xì)(內(nèi)徑)和長度等適當(dāng)決定電壓或施加的壓力的大小以及供壓的時間。而且，也可以應(yīng)用WO02/097421記載的方法。
對于在毛細(xì)管電泳中使用的毛細(xì)管，內(nèi)徑、外徑、全長、有效長度都沒有特別的限定，可以使用通常使用的尺寸的毛細(xì)管。關(guān)于有效長度，從能夠快速解析的觀點考慮，可以使用有效長度短的毛細(xì)管。其中，所謂毛細(xì)管的有效長度，是指從試樣注入口至檢測部分的距離。
從獲得良好的分離能力、縮短移動時間的觀點出發(fā)，毛細(xì)管電泳中的泳動電場優(yōu)選為20V/cm～10kV/cm，更優(yōu)選為50V/cm～5kV/cm，特別優(yōu)選100V/cm～1kV/cm。
在微芯片型電泳中，使用的微芯片具備加樣通道和與該加樣通道交叉的分離用通道，而且在該加樣通道的一端配置了試樣儲存器，在該加樣通道的另一端配置了出口。
采用微芯片型電泳的方式，本發(fā)明的電泳方法具體通過包括下述步驟的方法進行，不對含有蛋白質(zhì)的試樣進行熱變性，將試樣供給試樣儲存器的步驟；將該試料儲存器中的試料導(dǎo)入分離用通道中的步驟；以及在分離用通道中使試樣電泳的步驟。
將試樣供給試樣儲存器的步驟，更具體地說，是通過在加樣通道一端的試樣儲存器和另一端的出口施加電壓而實現(xiàn)。電壓的強度根據(jù)裝置不同而異，用SV1100(日立電子公司生產(chǎn))的場合，施加50～800V的電壓，通常施加300V的電壓。利用該方法將試樣供給加樣通道和分離用通道的交叉部位。另一方面，也可以適用WO 02/097421記載的方法。
將試料儲存器中的試料導(dǎo)入分離用通道的步驟，更具體地說，是同時實現(xiàn)以下兩個步驟在加樣通道一端的試樣儲存器和另一端的出口施加擠壓電壓，剩余的試樣從試樣儲存器和另一端的出口側(cè)排出的步驟；以及在分離用通道的出口側(cè)及其相反一側(cè)施加分離電壓的步驟。電壓的強度可以根據(jù)裝置適當(dāng)選擇，用SV1100(日立電子公司生產(chǎn))的場合，前者在130V左右，后者在700～900V下完成。另一方面，也可適用WO02/097421記載的方法。
作為微芯片的材質(zhì)，可以例舉石英玻璃、硼硅酸玻璃、鈉玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、二甲基硅氧烷等。其中，從吸附試樣少，芯片加工容易的觀點考慮，希望使用玻璃、或聚甲基丙烯酸甲酯。此外，也可以與毛細(xì)管同樣使用進行了內(nèi)壁加工處理的微芯片。
在微芯片型電泳中，微芯片的大小，例如可以是長10～120mm、寬10～120mm、厚500～5000μm。
微芯片中的加樣通道和分離用通道的形狀均無特殊的限定。另外，也可以使用在一片芯片上設(shè)置3～96條上述通道，可同時進行多通道解析的芯片。多通道的排列方式有平行、放射線狀、圓形等，對其形狀沒有特別的限定。
上述通道的寬可根據(jù)微芯片的大小、使用目的等適當(dāng)設(shè)定。具體而言，從獲得足夠的解析靈敏度的觀點考慮，希望通道的寬度為0.1μm以上，優(yōu)選10μm以上；從獲得足夠的解析精度的觀點考慮，希望通道的寬度為100μm以下，優(yōu)選50μm以下。此外，上述通道的深度可以根據(jù)微芯片的大小、使用目的等適當(dāng)設(shè)定。具體而言，從獲得足夠的解析靈敏度的觀點考慮，希望為0.1μm以上，優(yōu)選10μm以上；從獲得足夠的解析精度的觀點考慮，希望為100μm以下，優(yōu)選50μm以下。而且，上述分離用通道的長度可以根據(jù)微芯片的大小、解析對象化合物適當(dāng)選擇，但希望有較長的有效長度。有效長度是指從通道交叉部位到高分子化合物的檢測點(配置在分離用通道上)的距離。從獲得足夠的分離能力的觀點考慮，希望為0.1mm以上，優(yōu)選10mm以上；從快速分離的觀點考慮，希望為100mm以下，優(yōu)選50mm以下。
另外，上述儲存器的大小可以根據(jù)試樣的容量適當(dāng)設(shè)定。具體而言，從試樣導(dǎo)入的操作和電極的粗細(xì)的觀點考慮，希望直徑為0.05mm以上，優(yōu)選3mm以下。
從得到良好的分離能力、縮短移動時間的觀點考慮，微芯片型電泳的泳動電場希望為20V/cm～50kV/cm，優(yōu)選50V/cm～20kV/cm，更優(yōu)選為100V/cm～10kV/cm。
所謂納米通道型電泳，是指采用形成了通道寬度為納米尺寸，即1nm～1μm，優(yōu)選10～500nm，更優(yōu)選50～100nm的流路的芯片所進行的電泳。其中包括上述記載的納米尺寸的結(jié)構(gòu)體形成了微米尺寸的通道的結(jié)構(gòu)。納米尺寸的結(jié)構(gòu)體的形狀沒有特別的限定，例如可以使用四邊形、圓形、三角形等的結(jié)構(gòu)體，結(jié)構(gòu)體的設(shè)置間隔也沒有特別的限定。使用由這些結(jié)構(gòu)體形成的納米通道芯片。與毛細(xì)管電泳的情況相同，納米通道型電泳也包括能夠同時進行多通道解析的芯片。
納米通道型電泳的通道可以設(shè)計成具有尺寸為納米這一特征的，通道的形狀彎曲成帶有曲率的形狀，如蛇行狀、鋸齒狀或它們的組合等各種形狀。據(jù)此可以在微小的尺寸內(nèi)形成多個通道。另外，據(jù)此可以一次處理多個樣品，從而有可能實現(xiàn)高生產(chǎn)率。另外，納米尺寸的結(jié)構(gòu)體形成微米尺寸的通道的場合，具有可自由地改變其形狀，其設(shè)置間隔也可自由改變的優(yōu)點。可以同時進行多道通的測定。
納米通道型電泳和微芯片型電泳一樣，也包括配置了加樣通道、與該加樣通道交叉的分離用通道、在該加樣通道的一端設(shè)置的試樣儲存器、在該加樣通道的另一端設(shè)置的出口的結(jié)構(gòu)，但形狀沒有特別的限定。
作為納米通道型電泳中所用的納米通道的材質(zhì)，可以使用與微芯片相同的材質(zhì)。例如，石英玻璃、硼硅酸玻璃、鈉玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、二甲基硅氧烷等。
納米通道型電泳中納米通道芯片的大小適用與微芯片相同的大小。例如，長為10～120mm、寬為10～120mm、厚度為500～5000μm。納米通道芯片的通道深度、通道的長度、儲存器的大小等參照微芯片。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的電泳方法中，可將分子量標(biāo)記與蛋白質(zhì)試樣一起供于電泳。作為分子量標(biāo)記，可以使用Agilent TechnologiesNo.5065-4430的分子大小6kDa、分子大小210kDa的Myosin、HMW、LMW標(biāo)記試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech公司)等蛋白質(zhì)電泳中通常使用的市售的分子量標(biāo)記，或者使用含有市售的分子量和濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)試樣的蛋白質(zhì)或含有由生物試樣精制和/或定量的蛋白質(zhì)的分子量標(biāo)記。也可以將這些分子量標(biāo)記組合使用。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的電泳方法中，作為分子量標(biāo)記，也可以使用相對于被測蛋白質(zhì)在可以測定的范圍內(nèi)處于低分子量側(cè)和高分子量側(cè)的2種分子量標(biāo)記。據(jù)此可以更好地調(diào)整移動時間并進行定量。本說明書中，低分子量側(cè)的分子量標(biāo)記稱為“下標(biāo)記(Lower marker)”，高分子量側(cè)的分子量標(biāo)記稱為“上標(biāo)記(Upper marker)”。
作為下標(biāo)記，例如分子大小為6kDa的Agilent TechnologiesNo.5065-4430。作為上標(biāo)記，例如分子大小為210kDa的Myosin。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)電泳方法中，還可以將其他分子量標(biāo)記與下標(biāo)記和上標(biāo)記組合使用。
作為分子量標(biāo)記的用量，可采用蛋白質(zhì)電泳中一般使用的量。生產(chǎn)者或一般實驗方案根據(jù)裝置的種類、該裝置的檢測限、檢測靈敏度、測定精度等推薦的試樣溶液中的分子量標(biāo)記的濃度，在本說明書中作為蛋白質(zhì)電泳中通常使用的濃度，稱為“標(biāo)準(zhǔn)濃度”。例如，對Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies公司生產(chǎn))來說，從被測濃度、檢測靈敏度、測定精度的觀點考慮，特別優(yōu)選在試樣溶液中為74ng/ml左右，該濃度為標(biāo)準(zhǔn)濃度。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)電泳方法中，使用2種以上分子量標(biāo)記的場合，通過使用至少1個濃度比標(biāo)準(zhǔn)濃度低的分子量標(biāo)記，優(yōu)選為標(biāo)準(zhǔn)濃度的1/30～1/2，更優(yōu)選為1/15～1/3，特別優(yōu)選為1/10～2/7，可以提高分析對象蛋白質(zhì)的檢測靈敏度。這是因為通過擴大低濃度范圍的刻度，檢測靈敏度超過檢測精度的原因。而且，使用稀釋標(biāo)記，可以稀釋原有標(biāo)記溶液中的離子。另一方面，由于泳動中的離子強度越低靈敏度越高，最終可以使靈敏度提高。
上述方案中，也可以使用低于標(biāo)準(zhǔn)濃度的下標(biāo)記和/或上標(biāo)記。在使用低于標(biāo)準(zhǔn)濃度的下標(biāo)記的場合，優(yōu)選使用的濃度為標(biāo)準(zhǔn)濃度的1/30～1/2，更優(yōu)選為1/15～1/3，特別優(yōu)選為1/10～2/7；另一方面，使用低于標(biāo)準(zhǔn)濃度的上標(biāo)記的場合，優(yōu)選使用的濃度為標(biāo)準(zhǔn)濃度的1/20～2/3，更優(yōu)選為1/15～1/3，特別優(yōu)選為1/10～2/7，這樣，可以提高分析對象蛋白質(zhì)的檢測靈敏度。另外，也可以使用濃度都低于標(biāo)準(zhǔn)濃度的下標(biāo)記和/或上標(biāo)記，并進一步組合使用其他標(biāo)記。
另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)電泳方法中，使用2種以上標(biāo)記的場合，使其中之一的濃度與測定試樣中被測蛋白質(zhì)的濃度實質(zhì)上相同或近似，可以提高被測蛋白質(zhì)的檢測靈敏度。其原因是通過將分子量標(biāo)記的濃度設(shè)定為與被測蛋白質(zhì)實質(zhì)上相同或近似的濃度，并在標(biāo)記的刻度附近進行測定，能夠以高的精度進行測定。所謂與被測蛋白質(zhì)的濃度實質(zhì)上相同或近似的濃度，具體而言，優(yōu)選為測定試樣中被測蛋白質(zhì)濃度的1/10～10倍，更優(yōu)選為1/5～5倍，特別優(yōu)選為1/2～2倍。
上述方案中，也可以將下標(biāo)記或上標(biāo)記進一步組合使用。另外，也可以使用濃度與被測蛋白質(zhì)的濃度相同或近似的下標(biāo)記或上標(biāo)記。另外，也能夠以與被測蛋白質(zhì)相同或近似的濃度使用下標(biāo)記或上標(biāo)記，進一步與其他分子量標(biāo)記組合使用。
作為供于電泳的蛋白質(zhì)的檢測方法，例如通過UV波長光的吸收、熒光、激光、燈、LED等進行的檢測、電化學(xué)檢測、化學(xué)發(fā)光檢測等。具體而言，在蛋白質(zhì)或肽的場合，可以通過測定200nm處的吸收；使SYPRO Orange與蛋白質(zhì)或肽反應(yīng)，在460～550nmm激發(fā)，在550～650nm處測定熒光；或者使蛋白質(zhì)與熒光標(biāo)記(Agilent TechnologiesNo.5065-4430)反應(yīng)，在630～650nm激發(fā)，在670～700nm處測定熒光；以及電化學(xué)測定、化學(xué)發(fā)光測定等，對蛋白質(zhì)或肽進行檢測。
毛細(xì)管電泳中，例如，可以在毛細(xì)管的出口設(shè)置能夠發(fā)射UV波長光的裝置和該UV波長光的檢測器，或者也可以設(shè)置能夠發(fā)射熒光波長的裝置和能夠檢測該熒光波長的檢測器。
微芯片型電泳中，例如，可以在分離用通道上設(shè)置的檢測點設(shè)置UV波長光的檢測器，或者也可以設(shè)置能夠發(fā)射熒光波長的裝置和能夠檢測該熒光波長的檢測器。另外，可以同時檢測多通道。
納米通道型電泳中，可以適用與微芯片型電泳的場合同樣的檢測器、檢測方法。而且，納米通道型電泳中，同時檢測多通道時，與微芯片型電泳的場合相比，可以同時檢測更多的樣品。
檢測時，對蛋白質(zhì)、肽、氨基酸等進行鑒定的場合，可以通過UV吸收、分子量標(biāo)記、與標(biāo)準(zhǔn)樣品的移動時間的比較、質(zhì)譜解析等進行。
以下，結(jié)合實施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實施例的任何限定。
在實施例中，蛋白質(zhì)的電泳全部用Agilent Technologies公司的微芯片型電泳裝置Agilent 2100 Bioanalyzer和該公司的Protein 200試劑盒進行?，F(xiàn)有方法采用Agilent Technologies推薦的實驗方案進行。具體包括下述1～7的步驟。
1、在3μl的上標(biāo)記中，加入90μl的變性處理用緩沖液和3μl的100mM二硫蘇糖醇，渦流混合5秒鐘。
2、取下標(biāo)記15μl的原液，與1.0ml的milliQ水混合。
3、取3μl梯形(ladder)液以及另外2μl上述1、制備的變性處理用緩沖液的混合物和4μl被測蛋白質(zhì)樣品，渦流混合后，在1000×g下離心5秒鐘。
4、將上述3的樣品在100℃下加熱5分鐘。
5、加熱結(jié)束后放冷1～2分鐘。
6、在加熱和放冷處理后的梯形液和被測蛋白質(zhì)液中，分別加入84μl上述2、制備的下標(biāo)記液并混合。
7、取上述6的制備物各6μl作為被測樣品進行電泳。
另外，為了將本發(fā)明的蛋白質(zhì)電泳方法與現(xiàn)有方法相比較，在上述Agilent Technologies推薦的實驗方案基礎(chǔ)上，補充各實施例中所記載的變更點進行蛋白質(zhì)的電泳。
作為下標(biāo)記，使用分子大小為6kDa的Agilent TechnologiesNo.5065-4430，作為上標(biāo)記，使用分子大小為210kDa的肌球蛋白。
另外，所謂梯形液，是用于確定分子大小的分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別含有74ng/ml的以下物質(zhì)溶菌酶(14.3kDa)、β-乳球蛋白(18.4kDa)、碳酸酐酶(29.0kDa)、脫輔白蛋白(43.0kDa)、血清白蛋白(68.0kDa)、磷酸化酶B(97.4kDa)、肌球蛋白(210kDa)。
實施例1圖1的A～D是現(xiàn)有方法中，進行了蛋白質(zhì)的預(yù)處理(熱變性處理)后，進行微芯片型電泳時的電泳圖譜；圖1的E～M是不進行熱變性處理的場合。使用1μg/μl的牛血清白蛋白(BSA)(SIGMA)作為蛋白質(zhì)。
移動時間20s左右的2個峰來源于下標(biāo)記，40s附近的1個峰來源于上標(biāo)記。BSA的峰在25s～30s。
現(xiàn)有方法按照常規(guī)方法(Agilent Technologies推薦的方法)得到的結(jié)果如圖1A所示。與此相對，圖1B是熱變性處理時未添加二硫蘇糖醇的結(jié)果。另外，圖1C是熱變性處理時，用無SDS的去離子水(ICN Biomedicals，Inc.公司生產(chǎn))代替樣品緩沖液(AgilentTechnologies試劑盒內(nèi)的緩沖液，認(rèn)為是含有SDS的緩沖液)的結(jié)果，圖1D是使用去離子水，不添加二硫蘇糖醇的體系。
其結(jié)果可以確認(rèn)，由于使用去離子水而降低了強度。與此相對，在不進行熱變性處理的場合，添加規(guī)定的樣品緩沖液和二硫蘇糖醇，強度比圖1提高(圖1E)。但這不是由二硫蘇糖醇引起的(圖1F)。
另一方面，不經(jīng)過熱變性處理，用去離子水代替樣品緩沖液，使蛋白質(zhì)溶解，添加二硫蘇糖醇，表現(xiàn)出強度急劇增加(1圖G)。在無二硫蘇糖醇的情況下，其結(jié)果也一樣(1圖H)。使用2倍濃度的上標(biāo)記的場合，其結(jié)果也完全相同(圖1L)。此外，不進行熱變性處理，使用去離子水的體系的強度再現(xiàn)性良好(圖1M)。
根據(jù)這些結(jié)果，不進行熱變性處理，蛋白質(zhì)不用緩沖液溶解，而是用水溶解的場合，光譜的強度可以提高8～10倍。
實施例2圖2是在進行熱變性處理(現(xiàn)有方法)和不進行熱變性處理(實施例1E記載)的情況下，比較光譜強度的濃度變化的結(jié)果。圖2A～J是進行熱變性處理的結(jié)果；圖2K～S是不進行熱變性處理，使用實施例1記載的水，無二硫蘇糖醇的結(jié)果。被測蛋白質(zhì)BSA的濃度為，圖2A、K5μg/μl，B、L2μg/μl，C、M1μg/μl，D、N0.5μg/μl，E0.2μg/μl，F(xiàn)、O0.1μg/μl，G、P0.05μg/μl，H、Q0.02μg/μl，I、R0.01μg/μl，J、S0.005μg/μl。
根據(jù)這些結(jié)果，確認(rèn)在現(xiàn)有方法(進行反應(yīng))的體系中，檢測限為0.05μg/μl，與此相對，本發(fā)明的方法(不進行反應(yīng))為0.005μg/μl，靈敏度提高10倍。
實施例3
圖3是針對實施例2的光譜強度的濃度變化，對進行熱變性處理(現(xiàn)有方法)的再現(xiàn)性研究的結(jié)果。被測蛋白質(zhì)BSA的濃度為，圖3A～A5μg/μl，B～B2μg/μl，C～C1μg/μl，D～D0.5μg/μl，E～E0.2μg/μl，F(xiàn)～F0.1μg/μl，G～G0.05μg/μl，H～H0.02μg/μl，I～I0.01μg/μl，J～J0.005μg/μl。
由這些結(jié)果可知，現(xiàn)有方法(進行反應(yīng))的體系的再現(xiàn)性高，檢測限為0.05～0.02μg/μl。
實施例4圖4是針對實施例2的光譜強度的濃度變化，對不進行熱變性處理(使用實施例1E記載的水，沒有二硫蘇糖醇)的再現(xiàn)性研究的結(jié)果。圖4A～A為BSA 5μg/μl，B～B為2μg/μl，C～C為1μg/μl，D～D為0.5μg/μl，F(xiàn)～F為0.1μg/μl，G～G為0.05μg/μl，H～H為0.02μg/μl，I、I’、I”為0.01μg/μl，J～J為0.005μg/μl。
由這些結(jié)果可知，不進行熱變性處理的體系的再現(xiàn)性高，檢測限為0.01～0.005μg/μl。
實施例5圖5表示在低濃度下的檢測。圖5A-C所用的方法是用實施例1記載的本發(fā)明方法的水，無二硫蘇糖醇，而且下標(biāo)記或上標(biāo)記任意一種標(biāo)記采用低于標(biāo)準(zhǔn)濃度的濃度。圖5ABSA濃度為0.01gμ/μl，下標(biāo)記為常規(guī)的濃度，圖5BBSA 0.005μg/μl，下標(biāo)記濃度用現(xiàn)有方法的1/2，圖5CBSA 0.001μg/μl，下標(biāo)記濃度為現(xiàn)有方法的1/2，而且上標(biāo)記濃度為現(xiàn)有方法的1/10。
圖5D-J是對下標(biāo)記為規(guī)定的1/4，再添加與被測蛋白質(zhì)濃度相同的胰島素(來源于牛胰臟，SIGMA)作為下標(biāo)記所得的結(jié)果。D0.5μg/μl，E0.05μg/μl，F(xiàn)0.01μg/μl，G0.005μg/μl，H0.001μg/μl，I0.0005μg/μl，J0.0001μg/μl。按照該方法，BSA的檢測限可達到0.0005μg/μl。
實施例6與實施例5同樣對其他蛋白質(zhì)的檢測限進行研究。圖6A-J是用現(xiàn)有方法(進行熱變性處理)的肌紅蛋白(來源于馬骨骼肌，SIGMA)。圖6B’、E’、H’、I’觀察到同樣的再現(xiàn)性。圖6K-O是用現(xiàn)有方法的胰蛋白酶(I型，來源于牛胰臟，SIGMA)。濃度分別為A、K5μg/μl，B、B’2μg/μl，C1μg/μl，D、L0.5μg/μl，E、E’0.2μg/μl，F(xiàn)0.1μg/μl，M0.05μg/μl，H、H’、N0.02μg/μl，I、I’、O0.01μg/μl，J0.005μg/μl。按照該方法，肌紅蛋白、胰蛋白酶的檢測限都為0.05～0.02μg/μl。該結(jié)果與BSA的場合一致。
實施例7針對肌紅蛋白和BSA，對進行熱變性處理的體系的現(xiàn)有方法以及采用與被測蛋白質(zhì)實質(zhì)上相同或近似量的標(biāo)記(為方便起見，在這里稱為可變濃度標(biāo)記)作為下標(biāo)記的方法進行比較。
圖7A～I是用現(xiàn)有方法(進行熱變性處理)的肌紅蛋白。圖7A’～I’進行熱變性處理，但使用可變濃度標(biāo)記。圖7J-R是用現(xiàn)有方法(進行熱變性處理)的BSA。圖7J’-R’進行熱變性處理，但使用可變濃度標(biāo)記。均使用胰島素作為可變濃度標(biāo)記?？勺儩舛葮?biāo)記的濃度分別為A、A’、J、J’2μg/μl，B、B’、K1μg/μl，C、C’、L、L’0.5μg/μl，D、D’、M、M’0.2μg/μl，E、E’、N0.1μg/μl，F(xiàn)、F’、O、O’0.05μg/μl，G、G’、P、P’0.02μg/μl，H、H’、Q、Q’0.01μg/μl，I、I’、R’0.005μg/μl。
采用現(xiàn)有方法，肌紅蛋白、BSA的檢測限為0.05μg/μl，與此相對，用可變濃度標(biāo)記的場合，檢測限可達到0.02μg/μl，但與不進行反應(yīng)的實施例6的體系相比，沒有顯著地提高。但是，由此可知，即使在進行反應(yīng)的場合也具有可變濃度標(biāo)記的效果。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，提供了一種不必進行熱變性的預(yù)處理步驟即可在天然狀態(tài)下對蛋白質(zhì)進行快速解析，而且具有更高靈敏度的電泳方法。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的電泳方法在蛋白體解析和醫(yī)療診斷方面有用。
權(quán)利要求
1.一種電泳方法，其特征在于，不對蛋白質(zhì)進行熱變性處理，就供于大小分離的電泳。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電泳方法，其特征在于，將水溶解的蛋白質(zhì)供于電泳。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的電泳方法，其特征在于，將2種或2種以上的分子量標(biāo)記與蛋白質(zhì)一起供于電泳，至少該標(biāo)記之一與標(biāo)準(zhǔn)濃度相比為低濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任意一項所述的電泳方法，其特征在于，將2種或2種以上的分子量標(biāo)記與蛋白質(zhì)一起供于電泳，該標(biāo)記之一的濃度為被測蛋白質(zhì)濃度的1/10～10倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任意一項所述的電泳方法，電泳的方式選自毛細(xì)管電泳法、微芯片型電泳法和納米通道型電泳法。
全文摘要
本發(fā)明提供一種不必進行熱變性的預(yù)處理步驟即能夠在天然狀態(tài)下對蛋白質(zhì)迅速地進行解析，而且具有更高靈敏度的電泳方法。本發(fā)明的電泳方法在蛋白體解析和醫(yī)療診斷方面有用。
文檔編號C07K1/26GK1608202SQ02826269
公開日2005年4月20日 申請日期2002年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月28日
發(fā)明者田渕真理, 馬場嘉信 申請人:獨立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機構(gòu)