專利名稱：關(guān)節(jié)炎的治療藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到作為有效成分含有抗FGF-8抗體的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥、關(guān)節(jié)炎破壞抑制劑、軟骨保護(hù)劑、滑膜增殖抑制劑、關(guān)節(jié)炎的診斷藥以及采用該抗體的關(guān)節(jié)炎的判定方法。
背景技術(shù)：
在高齡社會中，患有關(guān)節(jié)病癥的人確實(shí)正在增加。對稱之為關(guān)節(jié)疾病的代表性的變形性關(guān)節(jié)病、或關(guān)節(jié)風(fēng)濕病的疾病進(jìn)行早期診斷和篩選、或患者的預(yù)后判定確實(shí)非常重要，該治療可以提高很多高齡人的生活質(zhì)量，但十分有效的診斷和治療方法還沒有確立。
關(guān)節(jié)軟骨是富含包被關(guān)節(jié)可動面的少數(shù)軟骨細(xì)胞和豐富的細(xì)胞外基質(zhì)的組織，沒有血管和神經(jīng)分布，主要接受來自包被關(guān)節(jié)內(nèi)面的滑膜產(chǎn)生的滑液的營養(yǎng)補(bǔ)給。另外不僅沒有血管，而且對來自富含血管網(wǎng)的周圍組織的血管的侵入表現(xiàn)出強(qiáng)的抵抗性。軟骨細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)合成、分解兩方面進(jìn)行復(fù)雜調(diào)控，對細(xì)胞外基質(zhì)的恒定性的維持起著中心作用。細(xì)胞因子、生長因子等化學(xué)因子和荷重負(fù)荷等的力學(xué)因子通過作用于軟骨細(xì)胞，改變細(xì)胞外基質(zhì)合成、分解的兩者平衡，影響細(xì)胞外基質(zhì)代謝。
變形性關(guān)節(jié)病的原因?yàn)槟挲g增長或機(jī)械的應(yīng)力，引起關(guān)節(jié)軟骨表面的崩壞以及伴隨而來的關(guān)節(jié)邊緣的新的軟骨的增殖、關(guān)節(jié)的變形、適合性的破綻，甚至發(fā)展到關(guān)節(jié)滑膜的發(fā)炎。變形性關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)的軟骨的慢行變性，以常常疼痛和功能喪失為特征的單關(guān)節(jié)病(Manek M.J.andLane N.E.，Am.Fam.Physician，61，1795-1804，2000)。
關(guān)節(jié)風(fēng)濕病是以免疫異?；蚋腥景Y為起因，炎性細(xì)胞浸潤滑膜，進(jìn)而，伴隨血管新生，滑膜纖維芽細(xì)胞的增殖亢進(jìn)，形成稱之為血管翳的炎性滑膜肉芽組織。如果形成血管翳，骨和軟骨的破壞發(fā)展，引起關(guān)節(jié)不可逆的損傷。在骨和軟骨被破壞過程中，大量存在的膠原和蛋白聚糖等各種細(xì)胞外基質(zhì)被分解。
在變形性關(guān)節(jié)病和關(guān)節(jié)風(fēng)濕病等的關(guān)節(jié)病中，滑膜炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)的破壞與關(guān)節(jié)軟骨的功能喪失有關(guān)。
變形性關(guān)節(jié)病和關(guān)節(jié)風(fēng)濕病從病因論的觀點(diǎn)看是完全不同的疾病，但在關(guān)節(jié)軟骨破壞機(jī)制上有許多共通點(diǎn)。在關(guān)節(jié)滑液以及滑膜、軟骨等的關(guān)節(jié)局部產(chǎn)生、分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶，在關(guān)節(jié)局部檢測出過量的基質(zhì)金屬蛋白酶?；|(zhì)金屬蛋白酶由于分解多種細(xì)胞外基質(zhì)，這是關(guān)節(jié)破壞的一個原因。雖然他們是由炎癥滑膜、巨噬細(xì)胞、中性白細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的，但他們的產(chǎn)生受到在相同的關(guān)節(jié)局部產(chǎn)生分泌的種種細(xì)胞因子、活性氧、一氧化氮、前列腺素、生長因子等調(diào)節(jié)。有報道說他們誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶后，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分解。
根據(jù)這些報道認(rèn)為除了變形性關(guān)節(jié)病和關(guān)節(jié)風(fēng)濕病之外，在由于自身抗體的出現(xiàn)和免疫復(fù)合體的組織沉著引起的炎性組織損傷的原因不明的疾病中，關(guān)節(jié)病高頻率出現(xiàn)的全身性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎、伴隨合并干癬病患者的滑膜增殖直至骨破壞的干癬性關(guān)節(jié)炎、確認(rèn)椎間盤的細(xì)胞外基質(zhì)的破壞的椎問盤疾病、急性結(jié)晶性滑膜炎(痛風(fēng)、假痛風(fēng))的關(guān)節(jié)病(広 和志等人編風(fēng)濕病學(xué)同人書院1989年)中，通過抑制滑膜的增殖和軟骨破壞，可以進(jìn)行治療。
以往，關(guān)節(jié)風(fēng)濕病的藥物療法主要是為了減輕關(guān)節(jié)的疼痛和炎癥，使用以種種非甾體消炎藥、氫化潑尼松等類固醇劑和氨甲蝶呤為首的抗風(fēng)濕藥(治療，78，3553-3558，南山堂，1996)。在變形性關(guān)節(jié)病中，為了消除疼痛和炎癥，給予各種非甾體消炎藥和鎮(zhèn)痛劑，關(guān)節(jié)注入劑透明質(zhì)酸制劑等。抑制軟骨破壞的透明質(zhì)酸作為軟骨保護(hù)劑使用(Creamer P.，J.Rheum.，20，1461-1464，1993，ArthritisRheum.，43，1905-1915，2000)。另外也實(shí)施理療法、骨切除術(shù)、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)等手術(shù)療法．對于全身性紅斑狼瘡，使用非甾體消炎藥和氫化潑尼松等類固醇劑，對強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎的非甾體消炎藥和抗風(fēng)濕藥柳氮磺胺吡啶，對于伴隨合并干癬病患者的滑膜增殖直至骨破壞的干癬性關(guān)節(jié)炎使用非甾體消炎藥、抗風(fēng)濕藥和類固醇的關(guān)節(jié)內(nèi)注入，對于確認(rèn)椎間盤的細(xì)胞外基質(zhì)的破壞的椎間盤疾病使用非甾體消炎藥和鎮(zhèn)痛藥，對于急性結(jié)晶性滑膜炎使用非甾體消炎藥和秋水仙素(広 和志等人編風(fēng)濕病學(xué)同文書院1989年)，這樣的藥物療法是對癥療法，充分抑制關(guān)節(jié)的破壞是困難的。
現(xiàn)在，在關(guān)節(jié)風(fēng)濕病的治療中，要預(yù)防關(guān)節(jié)破壞少的積極療法的選擇正被人們接受，在盡可能早的階段診斷為關(guān)節(jié)風(fēng)濕病，如何適當(dāng)選擇以柳氮磺胺吡啶為首的抗風(fēng)濕藥成為關(guān)鍵，但還不是充分有效的療法。
作為存在于生物體內(nèi)的各種各樣的生長因子之一的纖維芽細(xì)胞增殖因子(以下略為FGF)作為作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的乙酰肝素結(jié)合性增殖因子已為人們所知。另外，在FGF家族中存在19種以上，而FGF-2(堿性FGF)和FGF-1(酸性FGF)等人們很早就知道。FGF受體到現(xiàn)在為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7種，在細(xì)胞內(nèi)區(qū)域編碼酪氨酸激酶。
FGF-8是作為雄激素誘導(dǎo)增殖因子(AIGF)從表現(xiàn)出性激素依賴性增殖的鼠乳腺癌細(xì)胞株SC-3(Nakamura N.et al.，J.SteroidBiochem.，27，459-464，1987)的培養(yǎng)上清中分離出的因子，由于雄激素刺激，產(chǎn)生誘導(dǎo)，自分泌使SC-3細(xì)胞增殖的增殖因子(Tanaka A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，8928-8932，1992)。有報道說FGF-8促進(jìn)前列腺癌的細(xì)胞和纖維芽細(xì)胞的增殖(Tanaka A.et al.，F(xiàn)EBS Lett.，363，226-230，1995)。報道說FGF-8與FGF受體-2IIIc、FGF受體-3IIIc、FGF受體-4的3種受體結(jié)合(Ornitz D.M.etal.，J.Biol.Chem.，271，15292-15297，1996)。在FGF的作用中與多配體蛋白聚糖等膜型乙酰肝素硫酸蛋白聚糖的結(jié)合是不可缺的。與乙酰肝素硫酸的結(jié)合是為了在局部穩(wěn)定蓄積FGF所必需的。認(rèn)為在炎癥等組織改變的狀況下，通過乙酰肝素硫酸被分解，F(xiàn)GF由細(xì)胞外基質(zhì)游離出來，發(fā)揮其活性。在軟骨中含有象FGF-2那樣的強(qiáng)的血管新生因子(SatohH.et al.，J.Biol.Chem.，273，12307-12315，1998)。而對于關(guān)節(jié)炎來說，滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和侵入的炎癥細(xì)胞顯著地合成高水平的FGF-1和FGF-2(Sano H.et al.，J.Cell Biol.，110，1417-1426，1990、RemmersE.F.，Growth factors，2，179-188，1990)、風(fēng)濕病患者的關(guān)節(jié)液中的FGF-2的濃度與關(guān)節(jié)病癥有關(guān)(Manabe N.et al.，Rheumatology，38，714-720，1999)。FGF-2與變形性關(guān)節(jié)病中的骨刺形成有關(guān)(UchinoM.et al.，Clin.Orthopl.，377，119-125，2000)。這些報告表明FGF-1和FGF-2與關(guān)節(jié)炎有關(guān)。
在使用FGF-8人工破壞特定基因小鼠的報告中，認(rèn)為FGF-8出現(xiàn)在關(guān)節(jié)發(fā)生階段(Haraguchi R.et al.，Development，127，2471-2479，2000；Lewandoski M.et al.，Nat.Genet.，26，460-463，2000)，但還不了解FGF-8與關(guān)節(jié)炎的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥、關(guān)節(jié)炎破壞抑制劑、軟骨保護(hù)劑、滑膜增殖抑制劑、關(guān)節(jié)炎的診斷藥以及關(guān)節(jié)炎的判定方法。
本發(fā)明提供以下(1)～(51)。
(1)一種關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥，含有與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的抗體作為有效成分。
(2)根據(jù)上述(1)所述的醫(yī)藥，其中，與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的抗體是單克隆抗體。
(3)根據(jù)上述(2)所述的醫(yī)藥，其中，單克隆抗體是選自雜交瘤產(chǎn)生的抗體、人源化抗體以及它們的抗體片段中的抗體。
(4)根據(jù)上述(3)所述的醫(yī)藥，其中，雜交瘤是雜交瘤KM1334(FERM BP-5451)。
(5)根據(jù)上述(3)所述的醫(yī)藥，其中，人源化抗體是人型嵌合抗體或人型互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植抗體。
(6)根據(jù)上述(5)所述的醫(yī)藥，其中，人型嵌合抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的單克隆抗體的抗體重鏈可變區(qū)(VH)以及抗體輕鏈可變區(qū)(VL)、以及人抗體的抗體重鏈恒定區(qū)(CH)以及抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)構(gòu)成的人型嵌合抗體。
(7)根據(jù)上述(6)所述的醫(yī)藥，其中，人型嵌合抗體是以下(a)～(c)中任一種人型嵌合抗體(a)VH含有序列編號5所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(b)VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(c)VH含有序列編號5所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體。
(8)根據(jù)上述(7)所述的醫(yī)藥，其中，人型嵌合抗體是轉(zhuǎn)化體KM3034(FERM BP-7836)生產(chǎn)的人型嵌合抗體。
(9)根據(jù)上述(5)所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是含有與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的單克隆抗體的VH以及VL的CDR和人抗體的CH以及CL的人型CDR移植抗體。
(10)根據(jù)上述(9)所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的單克隆抗體的VH以及VL的CDR、人抗體的VH以及VL的框架區(qū)(FR)、以及人抗體的CH以及CL構(gòu)成的人型CDR移植抗體。
(11)根據(jù)上述(9)或(10)所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(12)根據(jù)上述(9)或(10)所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL含有以下氨基酸序列的人型CDR移植抗體，即序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列(c)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(13)根據(jù)上述(9)或(10)所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(14)根據(jù)上述(13)所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體
(b)VH含有序列編號18所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號44所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(15)根據(jù)上述(9)或(10)所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)轉(zhuǎn)化體KM8037(FERM BP-8084)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體(b)轉(zhuǎn)化體KM8035(FERM BP-8082)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體(c)轉(zhuǎn)化體KM8036(FERM BP-8083)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體。
(16)根據(jù)上述(3)所述的醫(yī)藥，其中，抗體片段是選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(scFv)、二聚體可變區(qū)(V區(qū))片段(diabody)、二硫化物穩(wěn)定的V區(qū)片段(dsFv)以及含有CDR的肽的抗體片段。
(17)一種關(guān)節(jié)炎的診斷藥，其中，作為有效成分含有與FGF-8特異性結(jié)合的抗體。
(18)根據(jù)上述(17)所述的診斷藥，其中，與FGF-8特異性結(jié)合的抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
(19)根據(jù)上述(18)所述的診斷藥，其中，單克隆抗體是選自雜交瘤生產(chǎn)的抗體、人源化抗體以及它們的抗體片段中的抗體。
(20)根據(jù)上述(19)所述的診斷藥，其中，雜交瘤是雜交瘤KM1334(FERM BP-5451)。
(21)根據(jù)上述(19)所述的診斷藥，其中，人源化抗體是人型嵌合抗體或人型CDR移植抗體。
(22)根據(jù)上述(21)所述的診斷藥，其中，人型嵌合抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL、以及人抗體的CH以及CL構(gòu)成的人型嵌合抗體。
(23)根據(jù)上述(22)所述的診斷藥，其中，人型嵌合抗體是以下(a)～(c)中任一種人型嵌合抗體(a)VH含有序列編號5所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(b)VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(c)VH含有序列編號5所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體。
(24)根據(jù)上述(23)所述的診斷藥，其中，人型嵌合抗體是轉(zhuǎn)化體KM3034(FERM BP-7836)生產(chǎn)的人型嵌合抗體。
(25)根據(jù)上述(21)所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是含有與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL的CDR和人抗體的CH以及CL的人型CDR移植抗體。
(26)根據(jù)上述(25)所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL的CDR、人抗體的VH以及VL的FR、以及人抗體的CH以及CL構(gòu)成的人型CDR移植抗體。
(27)根據(jù)上述(25)或(26)所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(28)根據(jù)上述(25)或(26)所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體
(b)VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(29)根據(jù)上述(25)或(26)所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(30)根據(jù)上述(29)所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示氨基酸序列并且VL含有序列編號21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VH含有序列編號18所示氨基酸序列并且VL含有序列編號44所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18所示氨基酸序列并且VL含有序列編號50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(31)根據(jù)上述(25)或(26)所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)轉(zhuǎn)化體KM8037(FERM BP-8084)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體(b)轉(zhuǎn)化體KM8035(FERM BP-8082)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體(c)轉(zhuǎn)化體KM8036(FERM BP-8083)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體。
(32)根據(jù)上述(19)所述的診斷藥，其中，抗體片段是選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(scFv)、二聚體化V區(qū)片段(diabody)、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)片段(dsFv)以及含有CDR的肽的抗體片段。
(33)一種關(guān)節(jié)炎的判定方法，其特征在于，利用與FGF-8特異性結(jié)合的抗體檢測和/或定量試樣中的FGF-8。
(34)根據(jù)上述(33)所述的判定方法，其中，與FGF-8特異性結(jié)合的抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
(35)根據(jù)上述(34)所述的判定方法，其中，單克隆抗體是選自雜交瘤生產(chǎn)的抗體、人源化抗體以及它們的抗體片段中的抗體。
(36)根據(jù)上述(35)所述的判定方法，其中，雜交瘤是雜交瘤KM1334(FERM BP-5451)。
(37)根據(jù)上述(35)所述的判定方法，其中，人源化抗體是人型嵌合抗體或人型CDR移植抗體。
(38)根據(jù)上述(37)所述的判定方法，其中，人型嵌合抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL、以及人抗體的CH以及CL構(gòu)成的人型嵌合抗體。
(39)根據(jù)上述(38)所述的判定方法，其中，人型嵌合抗體是以下(a)～(c)中任一種人型嵌合抗體(a)VH含有序列編號5所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(b)VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(c)VH含有序列編號5所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體。
(40)根據(jù)上述(39)所述的判定方法，其中，人型嵌合抗體是轉(zhuǎn)化體KM3034(FERM BP-7836)生產(chǎn)的人型嵌合抗體。
(41)根據(jù)上述(37)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是含有與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL的CDR和人抗體的CH以及CL的人型CDR移植抗體。
(42)根據(jù)上述(41)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL的CDR、人抗體的VH以及VL的FR、以及人抗體的CH以及CL構(gòu)成的人型CDR移植抗體。
(43)根據(jù)上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(44)根據(jù)上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(45)根據(jù)上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(46)根據(jù)上述(45)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VH含有序列編號18所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號44所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
(47)根據(jù)上述(41)或(42)所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)轉(zhuǎn)化體KM8037(FERM BP-8084)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體(b)轉(zhuǎn)化體KM8035(FERM BP-8082)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體(c)轉(zhuǎn)化體KM8036(FERM BP-8083)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體。
(48)根據(jù)(35)所述的判定方法，其中，抗體片段是選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(scFv)、二聚體可變區(qū)(V區(qū))片段(diabody)、二硫化物穩(wěn)定的V區(qū)片段(dsFv)以及含有CDR的肽的抗體片段。
(49)一種關(guān)節(jié)破壞抑制劑，其中，含有與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的抗體作為有效成分。
(50)一種軟骨保護(hù)劑，其中，含有與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的抗體作為有效成分。
(51)一種滑膜增殖抑制劑，其中，含有與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的抗體作為有效成分。
本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中所用的抗體，只要是與FGF-8特異性結(jié)合，并且抑制FGF-8活性的抗體(以下，也稱為“抗FGF-8中和抗體”)就可以，例如可以舉出對FGF-8具有中和活性的抗體以及該抗體的片段等。
本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中所用的抗FGF-8中和抗體，可以通過從與FGF-8特異性結(jié)合的抗體(以下也稱為“抗FGF-8抗體”)中選擇具有抑制FGF-8活性能力的抗體而獲得。作為FGF-8的活性，只要是FGF-8具有的生物活性，可以是任意的活性，具體可以舉出促進(jìn)小鼠乳腺癌細(xì)胞株SC-3(Nakamura N.et al.，J SteroidBiochem.，27，459-464，1987)、小鼠纖維胚細(xì)胞株NIH/3T3(ATCC編號CRL-1658)或人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP(ATCC編號CRL-1740)的增殖的活性；促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖的活性；促進(jìn)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的分解的活性；促進(jìn)源于軟骨細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶-3的產(chǎn)生的活性。
抗FGF-8抗體可以采用眾所周知的手段(Harlow E.and Lane D.，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)制備。
作為在本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中使用的抗FGF-8中和抗體，可以使用多克隆抗體或單克隆抗體中任一種，但最好使用單克隆抗體。
作為單克隆抗體可以舉出由雜交瘤產(chǎn)生的抗體、人源化抗體以及這些抗體的抗體片段。
在本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中使用的、通過雜交瘤產(chǎn)生的抗FGF-8中和單克隆抗體，具體的可以通過下述方法制備。
即，作為抗原制備FGF-8蛋白質(zhì)，從免疫該抗原的動物誘導(dǎo)具有抗原特異性的漿細(xì)胞，進(jìn)而使其與骨髓瘤細(xì)胞融合制備雜交瘤，或培養(yǎng)該雜交瘤或給予動物該雜交瘤細(xì)胞使該動物腹水癌化，從該培養(yǎng)液或腹水中分離純化與FGF-8特異性結(jié)合的抗體。從所得抗體中選擇抑制FGF-8活性的抗體。作為這種抗FGF-8中和單克隆抗體，可以舉出特開平9-271391中公開的屬于小鼠IgG1亞類的雜交瘤KM1334(FREMBP-5451)產(chǎn)生的單克隆抗體KM1334。
作為本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中使用的人源化抗體，可以舉出利用基因重組技術(shù)改變上述抗FGF-8中和單克隆抗體的人源化抗體。該抗體為抗原性低，并且血液中半衰期延長的抗體，作為預(yù)防藥或治療藥是優(yōu)選的。
作為本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中使用的人源化抗體，包括人型嵌合抗體以及人型互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determiningregion；以下簡稱為CDR)移植抗體。
人型嵌合抗體是指由人以外的動物的抗體的重鏈可變區(qū)(以下將可變區(qū)稱為V區(qū)，將重鏈可變區(qū)稱為VH)以及輕鏈V區(qū)(以下稱為VL)、人抗體的重鏈恒定區(qū)(以下將恒定區(qū)稱為C區(qū)，將重鏈恒定區(qū)稱為CH區(qū))以及人抗體的輕鏈C區(qū)(以下稱為CL)構(gòu)成的抗體。作為人以外的動物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔等，只要能夠制作雜交瘤，可以使用任何動物。
作為本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中使用的人型嵌合抗體，可以通過以下方法制備，即，從對由產(chǎn)生抗FGF-8中和單克隆抗體的雜交瘤獲得的編碼該抗體的H鏈以及L鏈的cDNA中，取得編碼VH以及VL的DNA，分別插入具有編碼人抗體的CH以及CL的DNA的動物細(xì)胞用表達(dá)載體中，構(gòu)建人型嵌合抗體表達(dá)載體，然后再導(dǎo)入動物細(xì)胞中，最后使其表達(dá)制備。
作為人型嵌合抗體的CH，只要是屬于免疫球蛋白(hIg)，則可以是任何CH，但是，優(yōu)選hIgG類的CH，可以使用屬于hIgG類的γ1、γ2、γ3、γ4等的亞類中的任一種。另外，作為人型嵌合抗體的CL，只要是屬于hIg就可以，可以使用κ類或λ類的CL。
作為與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的人型嵌合抗體(以下也稱為抗FGF-8中和嵌合抗體)，可以舉出由與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的單克隆抗體的VH以及VL和人抗體的CH以及CL構(gòu)成的抗FGF-8中和嵌合抗體，優(yōu)選VH含有序列編號5所示的氨基酸序列的人型嵌合抗體、VL含有序列編號6所示的氨基酸序列的人型嵌合抗體以及VH含有序列編號5所示的氨基酸序列并且VL含有序列編號6所示的氨基酸序列的人型嵌合抗體。具體可以舉出抗體的VH由序列編號5記載的氨基酸序列構(gòu)成、CH由人γ1亞類的氨基酸序列構(gòu)成、抗體的VL由序列編號6記載的氨基酸序列構(gòu)成、CL由人κ類的氨基酸序列構(gòu)成的人型嵌合抗體KM3034以及KM3334。
生產(chǎn)人型嵌合抗體KM3034的轉(zhuǎn)化體KM3034于平成13年12月26日以保藏號FERM BP-7836保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地中央第6)。
人型CDR移植抗體是指在人抗體上以人以外的動物抗體的CDR序列分別置換人以外的動物抗體的VH以及VL的CDR的抗體。
本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中使用的人型CDR移植抗體，可以通過以下方法制備，即，構(gòu)建對以人以外的動物抗FGF-8中和抗體的VH以及VL的CDR序列分別置換任意的人抗體的VH以及VL的CDR序列的V區(qū)進(jìn)行編碼的DNA，分別插入具有編碼人抗體的CH以及人抗體的CL的基因的動物細(xì)胞用表達(dá)載體中，構(gòu)建人型CDR移植抗體表達(dá)載體，然后導(dǎo)入動物細(xì)胞中，最后使其表達(dá)而制備。
作為人型CDR移植抗體的CH，只要是屬于hIg就可以，但是優(yōu)選hIgG類的CH，可以使用屬于hIgG類的γ1、γ2、γ3、γ4等的亞類中的任一種。另外，作為人型CDR移植抗體的CL，只要是屬于hIg就可以，可以使用κ類或λ類的CL。
作為與FGF-8特異性結(jié)合，并且抑制FGF-8活性的人型CDR移植抗體(以下也稱為“抗FGF-8中和CDR移植抗體”)，可以舉出含有與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的單克隆抗體的VH以及VL的CDR和人抗體的CH以及CL的CDR移植抗體、由與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的單克隆抗體的VH以及VL的CDR、人抗體的VH以及VL的框架區(qū)(以下簡稱為FR)以及人抗體的CH以及CL構(gòu)成的人型CDR移植抗體。優(yōu)選(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體，(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體，(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體，更優(yōu)選(a)VH含有序列編號18所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體，(b)VL含有序列編號19所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體，(c)VH含有序列編號18所示氨基酸序列并且VL含有序列編號19所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體。進(jìn)一步優(yōu)選(a)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上的氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列，(b)VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上的氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列，(c)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上的氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。具體地說，可以舉出(a)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體，(b)VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體，(c)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體，優(yōu)選(a)VH含有序列編號18所示氨基酸序列并且VL含有序列編號21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體，(b)VH含有序列編號18所示氨基酸序列并且VL含有序列編號44所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體，(c)VH含有序列編號18所示氨基酸序列并且VL含有序列編號50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體。作為這種人型CDR移植抗體，可以舉出VH由序列編號18記載的氨基酸序列并且CH由人γ1亞類的氨基酸序列構(gòu)成、VL由序列編號21記載的氨基酸序列并且CL由人κ類的氨基酸序列構(gòu)成的人型CDR移植抗體HVOLV6、HVOLV6/CHO；VH由序列編號18記載的氨基酸序列并且CH由人γ1亞類的氨基酸序列構(gòu)成、VL由序列編號44記載的氨基酸序列并且CL由人κ類的氨基酸序列構(gòu)成的人型CDR移植抗體HVOLV3-1/CHO；VH由序列編號18記載的氨基酸序列并且CH由人γ1亞類的氨基酸序列構(gòu)成、VL由序列編號50記載的氨基酸序列并且CL由人κ類的氨基酸序列構(gòu)成的人型CDR移植抗體HVOLV4-1/CHO。
生產(chǎn)人型CDR移植抗體HVOLV6的轉(zhuǎn)化體KM8037于平成14年6月20日以保藏號FERM BP-8084保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地中央第6)。生產(chǎn)人型CDR移植抗體HVOLV3-1的轉(zhuǎn)化體KM8036，于平成14年6月20日以保藏號FERM BP-8083保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地中央第6)。生產(chǎn)人型CDR移植抗體HVOLV4-3的轉(zhuǎn)化體KM8035，在平成14年6月20日作為FERM BP-8082保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地中央第6)。
在本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中使用的抗FGF-8中和抗體中也包括抗體片段?？贵w片段包括作為與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的抗體片段的Fab(fragment of antigen binding的簡稱)、F(ab’)2、Fab’、單鏈抗體(single chain Fv，以下簡稱為scFv)、二聚體V區(qū)片段(diabody)、二硫鍵穩(wěn)定化抗體(disulfide stabilized Fv，以下簡稱為dsFv)以及含有CDR的肽。
Fab是由H鏈的N末端側(cè)大致一半與整個L鏈構(gòu)成的、分子量約5萬的具有抗原結(jié)合活性的片段，他是通過木瓜蛋白酶對在IgG的鉸鏈區(qū)交聯(lián)兩根H鏈的兩個二硫鍵結(jié)合的上部肽部分進(jìn)行分解而得到。
F(ab’)2是分子量約10萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，在通過蛋白質(zhì)分解酶胃蛋白酶處理IgG的鉸鏈區(qū)的兩個二硫鍵結(jié)合的下部而得到的片段中(在H鏈的234號氨基酸殘基處切斷)比Fab借助鉸鏈區(qū)的二硫鍵結(jié)合的片段稍大。
Fab’是切斷上述F(ab’)2的鉸鏈間的二硫鍵的分子量約5萬的、具有抗原結(jié)合活性的片段。
ScFv是利用適當(dāng)?shù)碾慕宇^(以下稱為P)對一條VH以及一條VL進(jìn)行連接的VH-P-VL或VL-P-VH多肽。在本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中使用的ScFv所含有的VH以及VL只要是抗FGF-8中和單克隆抗體，可以是任意的VH和VL。
diabody(雙抗體)是由抗原結(jié)合特異性相同或不同的scFv形成二聚體的抗體片段，對相同的抗原具有二價的抗原結(jié)合活性或者對于不同的抗原分別具有特異的抗原結(jié)合活性。
dsFv是指通過二硫鍵使VH以及VL中的各1個氨基酸殘基被置換為半胱氨酸殘基的多肽結(jié)合的片段。置換為半胱氨酸殘基的氨基酸殘基，可以通過Reiter等提出的方法(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7 697-704，1994)，根據(jù)抗體的立體結(jié)構(gòu)預(yù)測進(jìn)行選擇。在本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中使用的dsFv所含有的VH或VL只要是抗FGF-8中和單克隆抗體，可以是任意的VH和VL。
在本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥中使用的含有CDR的肽，其構(gòu)成中含有抗FGF-8中和抗體的VH或VL的CDR的至少一個區(qū)以上。含有多個CDR的肽，可以直接制備或通過適當(dāng)?shù)碾慕宇^結(jié)合制備。
以下對本發(fā)明中使用的抗FGF-8中和抗體的具體制作方法和活性評價方法、含有該抗體的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥、抗FGF-8抗體的關(guān)節(jié)炎的診斷藥、使用抗FGF-8抗體的關(guān)節(jié)炎的判定方法進(jìn)行說明。
1.抗FGF-8中和抗體(多克隆抗體、單克隆抗體)的制作方法(1)抗原的制備作為制備抗FGF-8中和抗體所必需的抗原，可以舉出產(chǎn)生FGF-8的細(xì)胞或細(xì)胞組分、或FGF蛋白質(zhì)、該蛋白質(zhì)的部分片段、具有該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的部分序列的肽等。
FGF-8蛋白質(zhì)以及該蛋白質(zhì)的部分片段可以通過以下方式制備，即，制備將編碼FGF-8的全長或其部分片段DNA(Tanaka A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，8928-8932，1992，Tanaka A.et al.，F(xiàn)EBSLett.，363，226-230，1996)插入適當(dāng)?shù)妮d體的啟動子下游的重組載體，將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞獲得FGF-8表達(dá)細(xì)胞，然后通過在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)該FGF-8表達(dá)細(xì)胞，從而在細(xì)胞內(nèi)或培養(yǎng)上清液中直接產(chǎn)生或作為融合蛋白而產(chǎn)生。另外，具有FGF-8蛋白質(zhì)的部分序列的肽，可以利用肽合成儀制備。
編碼FGF-8的全長或其部分片段的DNA，可以通過以表達(dá)FGF-8的SC-3等的細(xì)胞制備的cDNA作為模板的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[PolymeraseChain Reaction，以下簡稱為PCR；Sambrook J.，et al.，MolecularCloning 3rdedition，Cold Spring Harbor Laboratory，2001，Ausubel F.M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，1987-2001(以下記為Current Protocols in Molecular Biology)]制備。
作為宿主，只要是能夠表達(dá)目的基因的都可以，例如細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。作為細(xì)菌可以舉出大腸桿菌(Escherichia coil)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等的大腸桿菌屬，芽孢桿菌屬的細(xì)菌。作為酵母可以舉出釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Schizosaccharomyces pombe等。作為動物細(xì)胞可以舉出人的細(xì)胞，即Namalwa細(xì)胞、猴的細(xì)胞即COS細(xì)胞、中國倉鼠細(xì)胞即CHO細(xì)胞等。作為昆蟲細(xì)胞可以舉出Sf9、Sf21(フア一ミンジエン公司生產(chǎn))、HighFive(インビトロジエン公司生產(chǎn))等。
作為導(dǎo)入編碼FGF-8的全長或其部分片段DNA的載體，可以只要是能夠重組該DNA并在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的載體，可以使用任何載體。
以細(xì)菌例如大腸桿菌(Escherichia coil)作為宿主使用時的表達(dá)載體，優(yōu)選由啟動子、核糖體結(jié)合序列、編碼FGF-8的全長或其部分片段DNA、復(fù)制終結(jié)序列、基于不同情況的啟動子控制序列構(gòu)成的載體，例如可以舉出市售的pGEX-2T(Amersham Biosciences公司生產(chǎn))、pET17b(Novagen公司生產(chǎn))等。
作為向細(xì)菌導(dǎo)入重組載體的方法，只要是在細(xì)菌中導(dǎo)入DNA的方法，可以使用任何方法，例如使用鈣離子的方法(Cohen S.N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110-2114，1972)、原生質(zhì)體法(特開昭63-248394)等方法。
在作為宿主細(xì)胞使用酵母時，作為表達(dá)載體例如可以使用YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等。
作為向酵母導(dǎo)入重組載體的方法，只要是將DNA導(dǎo)入酵母的方法可以使用任意的方法，例如電穿孔法(Becker D.M.and Guarente L.，Methods.Enzymol.，194，182-187，1991)、原生質(zhì)體法(Hinnen A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1929-1933，1978)、醋酸鋰法(Ito H.et.，J.Bacteriol.，153，163-168，1983)等。
在作為宿主細(xì)胞使用動物細(xì)胞時，作為表達(dá)載體例如可以使用pAGE107(特開平3-22979；Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3，133-140，1990)、pAGE103(Mizukami T.and Itoh S.，J.Biochem.，101，1307-1310，1987)等。
作為啟動子只要是在動物細(xì)胞中能夠表達(dá)的都可以使用，例如可以舉出巨細(xì)胞病毒(CMV)的IE(immediate early)基因的啟動子、SV40或金屬硫因的啟動子等。另外，也可以將人CMV的IE基因的增強(qiáng)子與啟動子一起使用。
作為向動物細(xì)胞導(dǎo)入重組載體的方法，只要是將DNA導(dǎo)入動物細(xì)胞的方法都可以使用，例如電穿孔法(Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3，133-140，1990)、磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂[質(zhì)]轉(zhuǎn)[染]法(FelgnerP.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413-7417，1987)等。
在作為宿主使用昆蟲細(xì)胞時，例如可以通過Current Protocols inMolecular Biology，O’Reilly et al.，Baculovirus Expression VectorsALaboratory Manual，Oxford University Press，1994等記載的方法表達(dá)蛋白質(zhì)。即，將以下敘述的重組基因?qū)胼d體與(昆蟲)桿狀病毒(Baculovirus)共同導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞，在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清液中獲得重組病毒，然后使昆蟲感染重組病毒，從而獲得蛋白質(zhì)表達(dá)昆蟲細(xì)胞。
作為基因?qū)胼d體，例如可以使用pVL1392、pVL1393(都是フア一ミンジエン社制)、pBlueBac4.5(イン ビトロジエン公司生產(chǎn))等。
作為Baculovirus，例如可以使用作為感染射干科昆蟲病毒的Autographa californica nuclear polyhedrosis virus等。
作為用于制備重組病毒的、向昆蟲細(xì)胞共同導(dǎo)入上述重組基因?qū)胼d體和上述Baculovirus的方法，例如可以使用磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂[質(zhì)]轉(zhuǎn)[染]法(Felgner P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413-7417，1987)等。
另外，也可以通過使用フア一ミンジエン公司生產(chǎn)的バキユロゴ一ルド引酵物試劑盒(starter kit)等制作重組桿狀病毒，然后使該重組病毒感染前述的Sf9、Sf21或High Five等的昆蟲細(xì)胞，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)(Bio/Technology，6，47，1988)。
作為基因的表達(dá)方法，除了只讓FGF-8蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外，也開發(fā)了分泌產(chǎn)生、融合蛋白質(zhì)表達(dá)等，可以使用任意方法。例如可以根據(jù)《分子克隆》第3版記載的方法進(jìn)行。
將通過上述方式得到的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使在培養(yǎng)物中蓄積產(chǎn)生FGF-8蛋白質(zhì)，然后從培養(yǎng)物中提取FGF-8蛋白質(zhì)，從而可以將FGF-8蛋白質(zhì)的全長或部分片段直接作為FGF-8蛋白質(zhì)或作為融合蛋白而制備。
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的方法，可以根據(jù)在宿主培養(yǎng)中通常所用的方法進(jìn)行。
作為以大腸菌或酵母等的微生物為宿主對得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，只要是含有微生物生長所需的碳源、氮源、無機(jī)鹽類并且能夠有效進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基中的任一種(分子克隆第3版)。培養(yǎng)是在通常的振蕩培養(yǎng)或深部通氣攪拌培養(yǎng)等的好氧條件下、15～40℃培養(yǎng)16～96小時。在培養(yǎng)期間將pH保持在3.0～9.0。pH的調(diào)節(jié)可以使用無機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進(jìn)行。在培養(yǎng)中根據(jù)需要也可以在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素或四環(huán)素等抗生素。
作為以動物細(xì)胞為宿主對得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用通常所用的RPMI 1640培養(yǎng)基、Eagle的MEM培養(yǎng)基或者在這些培養(yǎng)基中添加胎牛血清(以下簡稱為FBS)等的培養(yǎng)基等。通常在5％CO2存在下、35～37℃，培養(yǎng)3～7天，在培養(yǎng)中根據(jù)需要也可以在培養(yǎng)基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
作為以昆蟲細(xì)胞為宿主對得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用通常所用的TNM-FH培養(yǎng)基(フア一ミンジエン公司生產(chǎn))、SF900IISFM(インビトロジエン公司生產(chǎn))、EX-CELL400、EX-CELL405[都是JRH Biosciences公司生產(chǎn)]等。培養(yǎng)可以在25～30℃培養(yǎng)1～4天，在培養(yǎng)過程中也可以根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加慶大霉素等抗生素。
在上述的動物細(xì)胞以及昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)中，可能的話，由于很容易直接將FGF-8的全長或部分片段作為FGF-8蛋白，或進(jìn)行融合蛋白的純化，因此優(yōu)選使用不添加血清的培養(yǎng)基。
在使FGF-8的全長或者部分片段直接或作為融合蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)蓄積時，培養(yǎng)結(jié)束后，對細(xì)胞進(jìn)行離心，懸浮于水系緩沖液中后，通過超聲波法、法式?jīng)_壓法等對細(xì)胞進(jìn)行破碎，從該離心上清液中回收該蛋白質(zhì)。
另外，在細(xì)胞內(nèi)形成不溶體時，通過蛋白質(zhì)變性劑使不溶體可溶化后，在不含有蛋白質(zhì)變性劑的溶液或蛋白質(zhì)變性劑的濃度稀釋成蛋白質(zhì)不變性的程度的溶液中，進(jìn)行稀釋或透析，可以形成蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)。
在FGF-8蛋白質(zhì)的全長或部分片段、或者這些蛋白質(zhì)的融合蛋白是在細(xì)胞外分泌時，可以從培養(yǎng)上清液中回收表達(dá)蛋白。
對于分離純化，可以單獨(dú)或組合使用溶劑萃取、基于有機(jī)溶劑的分級沉淀、鹽析、透析、離心、超濾、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、疏水性色譜、親水性色譜、逆相色譜、結(jié)晶、電泳等的分離操作來進(jìn)行。
具有FGF-8的氨基酸序列的部分序列的肽，可以通過Fmoc(芴基甲基氧基羰基)法、tBoc(叔丁基氧基羰基)法等的化學(xué)合成法制備。另外，也可以使用Advanced ChemTech公司、Applied Biosystems公司、Protein Technologies公司、島津制作所等的肽合成機(jī)制備。
(2)動物的免疫與抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備以上述得到的該蛋白質(zhì)作為抗原對動物進(jìn)行免疫。作為免疫的方法，可以直接在動物的皮下、靜脈或腹腔內(nèi)給予抗原，但是優(yōu)選使抗原性高的載體蛋白質(zhì)與抗原結(jié)合而給予，或者將抗原與適當(dāng)?shù)淖魟┮黄鸾o予。
作為載體蛋白質(zhì)，可以舉出匙孔X血藍(lán)蛋白(Keyhole limpethemocyanin)、牛血清白蛋白、牛甲狀球蛋白等，作為佐劑可以舉出弗羅因德完全佐劑(Complete Freund’s Adjuvant)、氫氧化鋁凝膠與百日咳菌疫苗等。
作為免疫動物，可以舉出兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠等的非人哺乳動物。
抗原的給予，在第一次給予后，每1～2周給予3～10次?？乖慕o予量優(yōu)選每只動物50～100μg。在各給予后，在第3～7日從免疫動物的眼底靜脈叢或尾靜脈采血，對于與該血清的抗原的特異性結(jié)合性，可以通過以下所示的酶免疫測定法[酶免疫測定法第3版醫(yī)學(xué)書院1987年antibodies a laboratory manual(Chapter 14)、Goding J.W.，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press，1996(以下簡稱為單克隆抗體)]等確認(rèn)。
酶免疫測定法可以通過以下方式進(jìn)行。
將抗原蛋白或表達(dá)抗原蛋白的細(xì)胞等涂層在板上，將從免疫動物採集的血清作為第一抗體使其反應(yīng)。在第一抗體反應(yīng)后，對板進(jìn)行清洗添加第二抗體。反應(yīng)后，進(jìn)行對應(yīng)于標(biāo)記第二抗體的物質(zhì)的檢測反應(yīng)，測定抗體效價。
所謂第二抗體，是指用過氧化物酶等酶或生物素等對可以識別第一抗體的抗體進(jìn)行標(biāo)記的物質(zhì)。具體的說，若免疫動物使用小鼠，則作為第二抗體使用能夠識別小鼠免疫球蛋白的抗體。
另外，將該血清顯示充分抗體效價的非人哺乳動物作為抗體產(chǎn)生細(xì)胞的供給源。
在抗原最終給予后3～7日，根據(jù)眾所周知的方法(antibodies alaboratory manual)從免疫動物摘出抗體產(chǎn)生細(xì)胞，使抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。
多克隆抗體可以通過對該血清進(jìn)行分離純化而制備。該多克隆抗體是否具有抑制FGF-8活性的中和活性，可以通過以下1.(4)中所述的細(xì)胞增殖抑制分析法進(jìn)行檢測。
單克隆抗體可以通過使該抗體產(chǎn)生細(xì)胞與源于非人哺乳動物的骨髓瘤細(xì)胞融合制作雜交瘤，對該雜交瘤進(jìn)行培養(yǎng)或給予動物后使該細(xì)胞腹水癌化，對該培養(yǎng)液或腹水進(jìn)行分離或純化而制備。
抗體產(chǎn)生細(xì)胞是從給予抗原后的非人哺乳動物脾細(xì)胞、淋巴結(jié)、末梢血液等中採集的細(xì)胞。
(3)骨髓瘤細(xì)胞的制備作為骨髓瘤細(xì)胞可以使用從小鼠中獲得的株化細(xì)胞即8-氮雜鳥嘌呤耐性小鼠(BALB/c由來)骨髓瘤細(xì)胞株P(guān)3-X63Ag8-U1(Kohler Gand Milstein C，Eur.J.Immunol.，6511-519，1976)、SP2/0-Ag14(Shulman M.et al.，Nature，276 269-270，1998)、P3-X63-Ag8653(Kearney J.F.et al.，J.Immunol.，123 1548-1550，1979)、P3-X63-Ag8(Koler G and Milstein C，Nature，256 495-479，1975)等，只要是在體外(in vitro)能夠增殖的骨髓瘤細(xì)胞，可以是任意的骨髓瘤細(xì)胞。對于這些細(xì)胞株的培養(yǎng)以及傳代可以根據(jù)眾所周知的方法(antibodies alaboratory manual)，在細(xì)胞融合前確保2×107個以上的細(xì)胞數(shù)。
(4)細(xì)胞融合與單克隆抗體的選擇對上述得到的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行清洗后，加入聚乙二醇1000(PEG-1000)等細(xì)胞凝集性溶劑，使細(xì)胞融合，懸浮于培養(yǎng)基中。在細(xì)胞的清洗中可以使用MEM培養(yǎng)基或PBS(1.83g/L Na2HPO4、0.21g/LK2HPO4、7.65g/L NaCl，pH7.2)等。另外，作為使融合細(xì)胞懸浮的培養(yǎng)基，使用HAT培養(yǎng)基[在正常培養(yǎng)基(添加1.5mmol/L白蛋白、50μmol/L 2-巰基乙醇、10mg/mL慶大霉素以及10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基)中加入100μmol/L賀克沙霉素、15μmol/L胸腺嘧啶脫氧核苷以及0.4μmol/L氨基蝶呤的培養(yǎng)基]，以便可以選擇性地只獲得目的融合蛋白。
在培養(yǎng)后，取部分上清液，通過下述的酶免疫測定法，選擇與抗原蛋白質(zhì)反應(yīng)而與非抗原蛋白質(zhì)不反應(yīng)的樣品。然后，通過限界稀釋法進(jìn)行克隆，通過酶免疫測定法選擇穩(wěn)定并且抗體效價高的雜交瘤株作為與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤株。
酶免疫測定法通過與1.(2)中所述方法相同的方法進(jìn)行，作為第一抗體使用雜交瘤培養(yǎng)上清液或通過后述方法得到的純化抗體。
單克隆抗體與FGF-8的特異性結(jié)合也可以根據(jù)表面胞質(zhì)團(tuán)共鳴(Karlsson R et al.，J.Immunol.Methods，145，229-240，1991)來評價。
作為抗FGF-8單克隆抗體的具體例子，可以舉出特開平9-271391中記載的屬于小鼠IgG1亞類的雜交瘤KM1334(FREM BP-5451)產(chǎn)生的單克隆抗體KM1334。
通過在靶細(xì)胞中使用小鼠乳癌細(xì)胞株SC-3(Nakamura N.et al.，JSteriod Biochem.，27，495-464，1987)、小鼠纖維牙細(xì)胞株NIH/3TS(ATCC編號CRL-1658)、或者人前列腺癌細(xì)胞株LNCap(ATCC編號CRL-1740)的增殖抑制分析法來檢測由上述選擇的雜交瘤產(chǎn)生的抗FGF-8單克隆抗體是否抑制FGF-8活性。作為方法，在利用含有FGF-8(1～100ng/mL或睪丸素的培養(yǎng)基培養(yǎng)靶細(xì)胞時，以培養(yǎng)上清液或根據(jù)下述2.(5)純化的抗FGF-8單克隆抗體的最終濃度變?yōu)?.001～100μg/mL的方式進(jìn)行階段稀釋并添加在培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)24～72小時后，利用MTT[3-(4，5-二甲基-2-噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑 溴化物]溶液、セルカウンテイク試劑盒或WST-1試劑盒等測定活細(xì)胞數(shù)。與不添加抗FGF-8單克隆抗體的情況相比，在活細(xì)胞數(shù)減少與抗FGF-8單克隆抗體有濃度依賴性時，可以確認(rèn)該抗FGF-8單克隆抗體是抑制FGF-8活性的抗FGF-8中和抗體。
另外，也可以利用以Bolton-Hunter法(Bolton A.E.and Hunter W.M.，Biochem.J.，133，529-539，1973)等125I標(biāo)記的FGF-8與上述細(xì)胞株結(jié)合系統(tǒng)，測定抗FGF-8單克隆抗體向FGF-8細(xì)胞表面上的受體結(jié)合抑制活性。
上述單克隆抗體KM1334是具有抑制FGF-8活性的抗FGF-8中和抗體，優(yōu)選作為關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥。
(5)單克隆抗體的制備單克隆抗體可以通過以下方式進(jìn)行制備，即，在腹腔內(nèi)給予培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞所得的培養(yǎng)液或降植烷(Pristane，2，6，10，14-四甲基十五烷)0.5mL，飼育2周，在如此所得的8～10周齡的小鼠或裸鼠腹腔給予產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞使其腹水癌化，然后從腹水中分離純化，從而制備單克隆抗體。
作為分離、純化單克隆抗體的方法，可以舉出離心、基于40～50％飽和硫酸銨的鹽析、辛酸沉淀法、利用DEAE-葡聚糖柱、陰離子交換柱、蛋白質(zhì)A或G-柱或凝膠過濾柱等的色譜層析法等，這些方法可以單獨(dú)使用也可以組合使用。根據(jù)該方法可以回收IgG或IgM級分而獲得純化單克隆抗體。
純化的單克隆抗體的亞類的確定，可以利用單克隆抗體的類型試劑盒進(jìn)行確定。蛋白質(zhì)量可以通過勞里(Lowry)法或通過280nm的吸光度計算出。
所謂抗體的亞類是指在一類內(nèi)的不同類型，對于小鼠可以舉出IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，對于人可以舉出IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。特別是小鼠IgG3、IgG2a、人IgG1類型具有補(bǔ)體依存性細(xì)胞損傷活性以及抗體依存性細(xì)胞損傷活性，在治療應(yīng)用上是有效的。
2.抗FGF-8中和人源化抗體的制作方法(1)人源化抗體表達(dá)用載體的構(gòu)建為了從人以外的動物的抗體制作人源化抗體，要構(gòu)建必要的人源化抗體表達(dá)用載體。所謂人源化抗體表達(dá)用載體是指導(dǎo)入編碼人抗體的C區(qū)，即CH以及CL的基因的動物細(xì)胞用表達(dá)載體，可以通過在動物細(xì)胞用表達(dá)載體上分別插入編碼人抗體的CH以及CL的基因來構(gòu)建。
人抗體的C區(qū)可以是任意的人抗體的CH以及CL，例如可以舉出人抗體的γ1亞類的CH、γ4亞類的CH以及κ類的CL等。作為編碼人抗體的CH以及CL的DNA，可以使用由外顯子和內(nèi)含子構(gòu)成的染色體DNA，另外也可以使用cDNA。作為動物細(xì)胞用表達(dá)載體，只要是能夠?qū)刖幋a人抗體C區(qū)的基因并且表達(dá)的載體，可以使用任意載體。
例如可以舉出pAGE107(特開平3-22979；Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3，133-140，1990)、pAGE103(Mizukami T.and Itoh S.，J.Biochem.，101，1307-1310，1987)、pHSG274(Brady G.et al.，Gene，27，223-232，1984)、pKCR(O’Hare K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，78，1527-1531，1981)、pSG1βd2-4(Miyaji H.et al.，Cytotechnology，4，173-180，1990)等。作為動物細(xì)胞用表達(dá)載體中所用的啟動子和增強(qiáng)子，可以舉出SV40的初期啟動子和增強(qiáng)子(Mizukami T.and Itoh S.，J.Biochem.，101，1307-1310，1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR啟動子和增強(qiáng)子(Kuwana Y.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960-968，1987)、以及免疫球蛋白H鏈的啟動子(Mason J.O.et al.，Cell，41，479-487，1985)和增強(qiáng)子(Gillies S.D.et al.，Cell，33，717-728，1983)等。
人源化抗體表達(dá)用載體可以使用抗體H鏈、L鏈存在各個載體上的類型或存在同一載體上的類型(串連型)中任一類型，但是從人源化抗體表達(dá)載體的構(gòu)建的容易程度、向動物細(xì)胞導(dǎo)入的容易程度、在動物細(xì)胞內(nèi)的抗體H鏈和L鏈的表達(dá)量的平衡的觀點(diǎn)來看，串連型的人源化抗體表達(dá)用載體是優(yōu)選的(Shitara K.et al.，J Immunol.Methods，167，271-278，1994)。作為串連型的人源化抗體表達(dá)用載體可以舉出pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18(Bentley K.J.et al.，Hybridoma，17，559-567，1998)等。
構(gòu)建的人源化抗體表達(dá)用載體可以在人型嵌合抗體以及人型CDR移植抗體在動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)中使用。
(2)編碼人以外的動物的抗FGF-8中和抗體的VH以及VL的DNA的獲得編碼人以外的動物的抗FGF-8中和抗體、例如小鼠抗FGF-8中和單克隆抗體的VH以及VL的DNA可以通過以下方式獲得。
從產(chǎn)生小鼠抗FGF-8中和單克隆抗體的細(xì)胞、例如產(chǎn)生小鼠FGF-8中和抗體的雜交瘤等提取mRNA，合成cDNA。將合成的cDNA插入噬菌體或質(zhì)粒等的載體中，制作cDNA文庫。作為探針使用小鼠抗體的C區(qū)部分或V區(qū)部分，分別從該文庫中分離具有編碼VH的cDNA的重組噬菌體或重組質(zhì)粒以及具有編碼VL的cDNA的重組噬菌體或重組質(zhì)粒。
對重組噬菌體或重組質(zhì)粒上的VH以及VL的全部堿基序列進(jìn)行確定，從而由堿基序列推定VH以及VL的全部氨基酸序列。
作為人以外的動物，可以舉出小鼠、大鼠、倉鼠、兔等，只要能夠制作雜交瘤可以使用任意動物。作為從雜交瘤中制備全RNA的方法，可以舉出硫氰酸胍-三氟乙酸硒法(Okayama H.et al.，Methods Enzymol.，154，3-28，1987)，另外作為從全RNA制備mRNA的方法，可以舉出低聚(dT)固定化纖維素柱法(《分子克隆》，第3版)等。另外，作為從雜交瘤制備mRNA的試劑盒，可以舉出FastTrack mRNA分離試劑盒(インビトロジエン公司生產(chǎn))、QuickPrep mRNA分離試劑盒(Amersha Biosciences公司生產(chǎn))等。
作為cDNA的合成以及cDNA文庫的制作法可以舉出通常的方法(《分子克隆》，第3版；Current Protocols in Molecular Biology)、或者使用市售的試劑盒例如cDNA合成用SuperScript Choice System(SuperScript Choice System for cDNA Synthesis，インビトロジエン公司生產(chǎn))或ZAP-cDNA合成試劑盒(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))、TimeSaver cDNA合成試劑盒(Amersha Biosciences公司生產(chǎn))的方法等。
在cDNA文庫的制作時導(dǎo)入將從雜交瘤提取的mRNA作為鑄模合成的cDNA的載體，只要是導(dǎo)入該cDNA的載體，可以使用任意載體。例如可以使用ZAP Express(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))、pBlurescript IISK(±)(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))、λZAPII(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))、λgt10(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))、λgt11(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))、Lambda BlueMid(Clontech公司生產(chǎn))、λExcell(Amersha Biosciences公司生產(chǎn))、pcD2(Okayama H.and Berg P.，Mol.Cell.Biol.，3，280-289，1983)以及pUC18(Yanisch-Perron C.et al.，Gene，33，103-119，1985)等的噬菌體或質(zhì)粒載體。
作為導(dǎo)入通過噬菌體或質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA文庫的大腸菌，只要是導(dǎo)入該cDNA文庫并且能夠表達(dá)以及維持的大腸菌，可以任意使用。例如可以使用XL1-Blue MRF’(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))、C600(Appleyard R.K.Genetics，39，440-452，1954)、Y1088(Yong R.A.andDavis R.，Science，222，778-782，1983)、Y1090(Yong R.A.and DavisR.，Science，222，778-782，1983)、NM522(Gough J.A.and MurrayN.E.，J.Mol.Bio.，166，1-19，1983)、K802(Wood W.B.，J.Mol.Biol.，16，118-133，1966)和JM(Yanisch-Perron C.et al.，Gene，33，103-119，1985)等。
作為編碼來自cDNA文庫的人以外的動物的抗FGF-8中和抗體的VH以及VL的cDNA克隆的選擇法，可以使用從用同位素或熒光標(biāo)記的探針的菌落雜交法或噬斑雜交法(分子克隆第3版)選擇的方法。而制備引物，將由mRNA合成的cDNA或cDNA文庫作為模板，通過PCR也可以制備編碼VH以及VL的cDNA。
通過上述方法選擇的cDNA的堿基序列可以用被克隆到適當(dāng)載體的該cDNA，進(jìn)行雙脫氧反應(yīng)(Sanger F.et al.，Proc.Natl.Acad.USA74，5463-5467，1977)，通過使用ABI377(Applied Biosystem公司生產(chǎn))等DNA測序儀進(jìn)行解析決定。
(3)人以外的動物的抗FGF-8中和抗體的VH以及VL的氨基酸序列解析和CDR的氨基酸序列鑒定通過對從2.(2)獲得的、決定的cDNA的堿基序列推定該cDNA編碼的VH和VL的全氨基酸序列，與已知的抗體的VH和VL的全氨基酸序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Healthand Human Services，1991，以下記為“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”)進(jìn)行比較，可以確認(rèn)獲得的cDNA是否編碼含有分泌信號序列的抗體的VH和VL的完全氨基酸序列。有關(guān)含有分泌信號序列的抗體的VH和VL的完全氨基酸序列通過與已知的抗體的VH和VL的全氨基酸序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)進(jìn)行比較，可以推定分泌的信號序列的長度和N末端氨基酸序列，進(jìn)一步了解他們屬于的亞類。
另外，利用BLAST(Altschul S.F.et al.，J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)等同源性檢索程序?qū)θ我獾臄?shù)據(jù)庫，例如SWISS-PROT和PIR-Protein等進(jìn)行獲得的VH和VL的完全氨基酸序列的同源性檢索，可以研究序列是否是新序列。
形成抗體的抗原結(jié)合部位的VH和VL是由序列相對保守的4個FR和連接他們的序列富于變化的3個CDR(CDR1、CDR2、CDR3)構(gòu)成的(Sequences of Proteins of Immunological Interest)。而VH和VL的各個CDR的氨基酸序列可以通過與已知的抗體的V區(qū)的氨基酸序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)比較進(jìn)行鑒定。
(4)抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建在編碼2.(1)中構(gòu)建的人源化抗體表達(dá)用載體的人抗體的CH和CL的基因的上游插入編碼人以外的動物的抗FGF-8中和抗體的VH以及VL的DNA，可以構(gòu)建抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)載體。例如，以含有編碼人以外的動物的抗FGF-8中和抗體的VH以及VL的DNA的質(zhì)粒作為模板，通過使用由適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶的識別序列和編碼V區(qū)的堿基序列構(gòu)成的5’末端一側(cè)和3’末端一側(cè)的引物的PCR法對抗體的VH和VL進(jìn)行擴(kuò)增，將各個擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pBluescriptIISK(-)(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))等質(zhì)粒中，利用2.(2)所述的方法決定堿基序列，獲得具有編碼抗FGF-8中和抗體的VH以及VL的氨基酸序列的DNA序列的質(zhì)粒。從得到的質(zhì)粒分離編碼抗FGF-8中和抗體的VH以及VL的DNA，使他們可以以適當(dāng)方式表達(dá)那樣克隆到編碼2.(1)所述的人源化抗體表達(dá)用載體的人抗體的CH和CL的基因的上游，可以構(gòu)建抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)載體。
(5)編碼抗FGF-8中和CDR移植抗體的V區(qū)的DNA的構(gòu)建編碼抗FGF-8中和移植抗體的VH和VL的DNA可以象以下那樣構(gòu)建。首先，選擇移植人以外動物的抗FGF-8中和抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列的人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列。作為人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列只要是來自人抗體的序列，可以用任意序列。例如登錄在Protein Data Bank等的數(shù)據(jù)庫的人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列、人抗體的VH和VL的FR的各個亞類的共通氨基酸序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)等，為了制作具有充分活性的人型CDR移植抗體，希望選擇與人以外動物的抗FGF-8中和抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列盡可能高的同源性、最好是具有60％以上同源性的氨基酸序列。
接下來，將作為目的的人以外動物的抗FGF-8中和抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到選擇的人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列，設(shè)計抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH和VL的氨基酸序列。考慮抗體基因的堿基序列中出現(xiàn)的密碼子的使用頻率(Sequences ofProteins of Immunological Interest)將設(shè)計的氨基酸序列轉(zhuǎn)換為堿基序列，設(shè)計編碼抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH和VL的氨基酸序列的堿基序列。根據(jù)設(shè)計的堿基序列，合成由100～150堿基長構(gòu)成的數(shù)條合成DNA，用他們實(shí)施PCR法。此時，優(yōu)選根據(jù)PCR的反應(yīng)效率和可合成的DNA長度設(shè)計VH、VL 4條合成的DNA。另外通過在位于兩端的合成DNA的5’末端導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶的識別序列，可以很容易地克隆到2.(1)構(gòu)建的人源化抗體表達(dá)用載體。PCR反應(yīng)后，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pBluescript II SK(-)(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))等質(zhì)粒中，利用2.(2)所述的方法決定堿基序列，獲得具有編碼所期望的抗FGF-8中和CDR抗體的VH以及VL的氨基酸序列的堿基序列的質(zhì)粒。
(6)抗FGF-8中和CDR抗體的VH以及VL的氨基酸序列的改變?nèi)诵虲DR移植抗體只是將作為目的的人以外動物的抗體的VH和VL的CDR移植到人抗體的VH和VL的FR，其抗原結(jié)合活性與原來的人以外動物的抗體活性相比降低了(Tempest P.R.etal.，Bio/technology，9，266-271，1991)。其原因可能是在原來的人以外的動物的抗體的VH和VL中，不僅CDR，而且FR的幾個氨基酸殘基也直接或間接地與抗原結(jié)合活性有關(guān)，這些氨基酸殘基伴隨著CDR的移植，變化為與人抗體的VH和VL的FR不同的氨基酸殘基。為了解決這一問題，在人型CDR移植抗體的人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列中，對與直接參與與抗原結(jié)合的氨基酸殘基或與CDR的氨基酸殘基相互作用，維持抗體的空間結(jié)構(gòu)，間接參與與抗原結(jié)合的氨基酸殘基進(jìn)行鑒定，將他們改變?yōu)樵瓉砣艘酝獾膭游锟贵w中出現(xiàn)的氨基酸殘基，可以使低下的抗原結(jié)合活性上升(Tempest P.R.et al.，Bio/technology，9，266-271，1991)。在人型CDR移植抗體的制作中，如何有效地對那些與抗原結(jié)合活性有關(guān)的FR的氨基酸殘基進(jìn)行鑒定是最重要的方面，因此通過X射線晶體解析(Bernstein F.C.et al.，J.Mol.Biol.，112，535-542，1977)或計算機(jī)模擬(Tempest P.R.et al.，Protein Engineering，7，1501-1507，1994)等可以進(jìn)行抗體的空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和解析。這些抗體空間結(jié)構(gòu)的信息為人型CDR移植抗體的制作帶來了許多有益的信息，但可適應(yīng)所有抗體的人型CDR移植抗體的制作法還未確立，目前，就各種各樣的抗體制作數(shù)種改變體，研究與各個抗原結(jié)合活性的關(guān)系等種種試行錯誤是必要的。
人抗體的VH和VL的FR的氨基酸殘基的改變可以用改變用合成DNA作引物進(jìn)行PCR達(dá)到。有關(guān)PCR后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過2.(2)所述的方法決定其堿基序列，確認(rèn)實(shí)施目的改變后可以獲得含有導(dǎo)入目的變異的DNA的載體(以下稱之為氨基酸序列改變載體)。
只要是在窄的區(qū)域的氨基酸序列的改變，可以通過使用由20～35堿基構(gòu)成的變異導(dǎo)入引物的PCR變異導(dǎo)入法進(jìn)行。具體來說，合成由含有編碼改變后的氨基酸殘基的DNA序列的20～35堿基構(gòu)成的有意義變異引物和反義變異引物，以含有編碼應(yīng)當(dāng)改變的VH和VL的氨基酸序列的DNA的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行2階段的PCR。將最終擴(kuò)增片段亞克隆到適當(dāng)?shù)妮d體后，決定其堿基序列，獲得含有導(dǎo)入目的變異的DNA的氨基酸序列改變載體。
(7)抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體的構(gòu)建在編碼2.(1)中記載的人源化抗體表達(dá)用載體的人抗體的CH和CL的DNA的上游插入編碼2.(5)和(6)中構(gòu)建的編碼抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH以及VL的DNA，可以構(gòu)建抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體。例如，在2.(5)和(6)中構(gòu)建編碼抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH以及VL時使用的合成DNA中，在位于兩端的合成DNA的5，末端導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶的識別序列，使他們可以以適當(dāng)方式表達(dá)那樣克隆到編碼2.(1)所述的人源化抗體表達(dá)用載體的人抗體的CH和CL的DNA的上游。
(8)人源化抗體的一過性表達(dá)和活性評價為了有效地對制作的多種人源化抗體的抗原結(jié)合活性進(jìn)行評價，可以使用2.(4)所述的抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)載體，2.(7)所述的抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體，或?qū)λ麄冞M(jìn)行改變后的表達(dá)載體，進(jìn)行人源化抗體的一過性表達(dá)。作為導(dǎo)入表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，只要是可以表達(dá)人源化抗體的宿主細(xì)胞，可以使用任意細(xì)胞，從其表達(dá)量高出發(fā)，一般使用COS-7細(xì)胞(ATCC編號CRL-1651)(Warr G.W.etal.，Methods in Nucleic Acids Research，CRC Press，283，1990)。作為表達(dá)載體向COS-7細(xì)胞的導(dǎo)入法，如DEAE-葡聚糖法(Warr G.W.etal.，Methods in Nucleic Acids Research，CRC Press，283，1990)、脂(質(zhì))轉(zhuǎn)染法(Felgner P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413-7417，1987)等。
表達(dá)載體導(dǎo)入后，培養(yǎng)上清中的人源化抗體的表達(dá)量以及抗原結(jié)合活性可以通過作為第一抗體使用培養(yǎng)上清、作為第二抗體可以使用標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體的1.(2)所述的酶免疫測定法等測定。另外，通過1.(4)所述的細(xì)胞增殖抑制分析確認(rèn)是否保持抑制FGF-8活性的中和活性。
(9)人源化抗體穩(wěn)定表達(dá)以及活性評價通過將2.(4)所述的抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)載體，2.(7)所述的抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，可以獲得穩(wěn)定生產(chǎn)人源化抗體的轉(zhuǎn)化體。
作為表達(dá)載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入法，如電穿孔法(特開平2-257891；Miyaji H.et al.，Cytotechnology，3，133-140，1990)等。
作為導(dǎo)入抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)載體和抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，只要是可以使人源化抗體表達(dá)的宿主細(xì)胞，可以使用任意的細(xì)胞。例如，小鼠SP2/0--Ag14細(xì)胞(ATCC編號CRL-1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細(xì)胞(ATCC編號CRL-1580)、二氫葉酸還原酶(以下略為DHFR)基因缺損的CHO細(xì)胞的CHO/DG44細(xì)胞(Urlaub G.and Chasin L.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4216-4220，1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細(xì)胞(ATCC編號CRL-1662、以下稱之為YB/0細(xì)胞)等。
表達(dá)載體導(dǎo)入后，穩(wěn)定生產(chǎn)人源化抗體的轉(zhuǎn)化體可以通過在含有G418(G418 Sulfate；Sigma Aldrich公司生產(chǎn))等藥物的動物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)進(jìn)行選擇(Shitara K.et al.，J.Immunol.Methods，167，271-278，1994)。作為動物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基可以使用RPMI 1640培養(yǎng)基(日水制藥公司生產(chǎn))、GIT培養(yǎng)基(日本制藥公司生產(chǎn))、EX-CELL302培養(yǎng)基(JRH Bio Sciences公司生產(chǎn))、IMDM培養(yǎng)基(インビトロジエン公司生產(chǎn))、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(インビトロジエン公司生產(chǎn))、或向這些培養(yǎng)基中添加了FBS等各種添加物的培養(yǎng)基等。通過在培養(yǎng)基中對得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，可以使人源化抗體表達(dá)蓄積在培養(yǎng)上清中。培養(yǎng)上清中的人源化抗體的表達(dá)量以及抗原結(jié)合活性可以通過上述1.(4)所述的ELISA等測定。另外轉(zhuǎn)化體利用DHFR基因擴(kuò)增體系等可以使人源化抗體的產(chǎn)量上升(Shitara K.et al.，J.Immunol.Methods，167.271-278，1994)。
人源化抗體可以用蛋白A柱從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清進(jìn)行純化(Antibodies A Laboratory Manual，chapter 8；monoclone antibodies)。另外，也可以使用通常蛋白質(zhì)中使用的純化方法。例如，將凝膠過濾、離子交換色譜以及超濾等組合進(jìn)行純化。純化的人源化抗體的H鏈、L鏈或抗體分子整體的分子量可以通過聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE；Laemmli U.K.，Nature，227，680-685，1970)或Western Blotting法(Antibodies A Laboratory Manual)等測定。
純化的人源化抗體的抗原結(jié)合活性可以通過作為第一抗體使用純化的人源化抗體、作為第二抗體可以使用標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體的上述1.(2)所述的酶免疫測定法、表面胞質(zhì)團(tuán)共振(Karlsson R et al.，J.Immunol.Methods，145，229-240，1991)等測定。另外，通過1.(4)所述的細(xì)胞增殖抑制分析確認(rèn)是否保持抑制FGF-8活性的中和活性。
3.抗體片段的制作抗體片段可以通過1.和2.所述的抗FGF-8中和單克隆抗體、抗FGF-8中和人源化抗體為基礎(chǔ)的基因工程手法或蛋白質(zhì)化學(xué)手法進(jìn)行制作。作為抗體片段如Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、diabody、dsFv、含有CDR的肽等。
(1)Fab的制作Fab可以通過用蛋白水解酶番木瓜蛋白酶對抗FGF-8中和抗體進(jìn)行處理制作。番木瓜蛋白酶處理后，只要原來抗體是具有蛋白A結(jié)合性的IgG亞類，通過蛋白A柱，分離為IgG分子和Fc片段，可以回收均一的Fab(monoclonal antibodies)。不帶有蛋白A結(jié)合性的IgG亞類的抗體情形，通過離子交換層析，F(xiàn)ab可以回收在以低鹽濃度洗脫的級分中(monoclonal antibodies)。而Fab也可以用大腸桿菌通過基因工程手法進(jìn)行制作。例如將編碼2.(2)、(5)和(6)所述的抗體的V區(qū)的DNA克隆到Fab表達(dá)用載體，可以制作Fab表達(dá)載體。作為Fab表達(dá)用載體只要是Fab用的可以整合表達(dá)DNA的載體，可以使用任意載體。例如pIT106(Better M.et al.，Science，240，1041-1043，1988)等。將Fab表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌，可以使Fab生成蓄積在包涵體或外周胞質(zhì)層。由包涵體可以通過通常蛋白質(zhì)用的再折疊法變成具有活性的Fab，而表達(dá)在胞質(zhì)時，具有活性的Fab漏出到培養(yǎng)上清中。再折疊后或從培養(yǎng)上清中可以通過使用使抗原結(jié)合的柱子對均一的Fab進(jìn)行純化(BorrebeckK.，Antibody EngineeringA Practical Guide，Oxford UnivesrsityPress，1991)。
(2)F(ab’)2的制作F(ab’)2可以通過用蛋白水解酶胃蛋白酶對抗FGF-8中和抗體進(jìn)行處理制作。胃蛋白酶處理后，通過與Fab同樣的純化操作，可以回收均一的F(ab’)2(monoclonal antibodies)。另外，也可以通過用N，N’-o-亞苯基二馬來酰亞胺或二馬來酰亞胺己烷等那樣的馬來酰亞胺對3.(3)所述的Fab’進(jìn)行處理，使硫醚鍵生成的方法，以及用二硫代二(2-硝基苯甲酸)進(jìn)行處理，使二硫鍵生成的方法也可以制作(McCafferty J.etal.，Antibody EngineeringA Practical Approach，IRL Press，1996)。
(3)Fab’的制作Fab’可以通過用二硫蘇糖醇等還原劑對3.(2)所述的F(ab’)2進(jìn)行處理得到。而Fab’也可以用大腸桿菌通過基因工程手法進(jìn)行制作。例如將編碼2.(2)、(5)和(6)所述的抗體的V區(qū)的DNA克隆到Fab’表達(dá)用載體，可以制作Fab’表達(dá)載體。作為Fab’表達(dá)用載體只要是可以整合表達(dá)編碼2.(2)、(5)和(6)所述的抗體的V區(qū)的DNA的載體，可以使用任意載體。例如pAK19(Carter P.et al.，Bio/Technology，10，163-167，1992)等。將Fab’表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌，可以使Fab’生成蓄積在包涵體或外周胞質(zhì)層。由包涵體可以通過通常蛋白質(zhì)用的再折疊法變成具有活性的Fab’，而表達(dá)在胞質(zhì)層時，通過溶菌酶進(jìn)行部分消化、滲透壓沖擊、超聲等處理破碎細(xì)菌，可以從菌體外回收。再折疊后或從菌的破碎液中通過使用蛋白G柱等，可以純化均一的Fab’(McCaffertyJ.et al.，Antibody EngineeringA Practical Approach，IRL Press，1996)。
(4)svFv的制作svFv可以通過基因工程手法用噬菌體或大腸桿菌制作。例如，通過編碼由12個殘基以上的氨基酸序列構(gòu)成的多肽接頭的DNA連接編碼2.(2)、(5)和(6)所述的抗體的VH以及VL的DNA，制作編碼scFv的DNA。多肽接頭的付加要不妨礙VH、VL與抗原的結(jié)合那樣最適化是重要的，例如，可以使用Pantoliano等人報道的(Pantoliano M.W.etal.，Biochemistry，30，10117-10125，1991)或?qū)λM(jìn)行改變的多肽接頭。
將制作的DNA克隆到scFv表達(dá)用載體，可以制作scFv表達(dá)載體。作為scFv表達(dá)用載體只要是可以整合表達(dá)scFv的DNA的，可以使用任意的載體。如，pCANTAB5E(Amersham Biosciences公司生產(chǎn))、Phfa(LahM.et al.，Hum.Antibodies Hybridomas，5，48-56，1994)等。通過將scFv表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌，使輔助噬菌體感染，可以得到在噬菌體表面scFv以與噬菌體表面蛋白質(zhì)融合的形式表達(dá)的噬菌體。另外，將scFv表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌，可以使scFv生成蓄積在包涵體或外周胞質(zhì)層。由包涵體可以通過通常蛋白質(zhì)用的再折疊法變成具有活性的scFv，而表達(dá)在胞質(zhì)層時，通過溶菌酶進(jìn)行部分消化、滲透壓沖擊、超聲等處理破碎細(xì)菌，可以從菌體外回收。再折疊后或從菌的破碎液中通過使用陽離子交換柱等，可以純化均一的scFv(McCafferty J.etal.，Antibody EngineeringA Practical Approach，IRL Press，1996)。
(5)diabody的制作通過將制作上述的scFv時的多肽接頭做成3～10個殘基左右可以制作diabody。使用一種抗體的VH和VL時，可以制作2價抗體，使用兩種抗體的VH和VL時，可以制作具有2種特異性的diabody(Le Gall F.etal.，F(xiàn)EBS Lett.，453，164-168，1999，Courage C.et al.，Int.J.Cancer，77.763-768，1998)。
(6)dsFv的制作dsFv可以通過基因工程手法用大腸桿菌制作。首先，在編碼2.(2)、(5)和(6)所述的抗體的VH以及VL的DNA的適當(dāng)位置導(dǎo)入變異，制作編碼的氨基酸殘基被置換為半胱氨酸的DNA。氨基酸殘基向半胱氨酸殘基的改變可以通過使用2.(6)的PCR法的變異導(dǎo)入法進(jìn)行。將制作的各個DNA克隆到dsFv表達(dá)用載體，可以制作VH和VL的表達(dá)載體。作為dsFv表達(dá)用載體只要是可以整合表達(dá)dsFv用的DNA的載體，可以使用任意載體。例如pUL19(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7，697-704，1994)等。將VH和VL的表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌，可以使VH和VL生成蓄積在包涵體或外周胞質(zhì)層。由包涵體或外周胞質(zhì)層得到VH和VL，進(jìn)行混合，通過通常蛋白質(zhì)用的再折疊法使二硫鍵形成，可以制作具有活性的dsFv。在重折疊后，可以通過離子交換層析和凝膠過濾等進(jìn)一步進(jìn)行純化(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7，697-704，1994)。
(7)含有CDR的肽的制作含有CDR的肽可以通過Fmoc法或tBoc法等化學(xué)合成法制作。另外制作編碼含有CDR的肽的DNA，將制作的DNA克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，可以制作CDR肽表達(dá)載體。作為表達(dá)用載體只要是可以整合表達(dá)編碼含有CDR的肽的DNA的載體，可以使用任意載體。例如pLEX(インビトロジエン公司生產(chǎn))、pAX4a+[MoBiTec公司生產(chǎn)]等。將表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌，可以使含有CDR的肽生成蓄積在包涵體或外周胞質(zhì)層。由包涵體或外周胞質(zhì)層可以得到含有CDR的肽，通過離子交換色譜和凝膠過濾等進(jìn)行純化(Reiter Y.et al.，Protein Eng.，7，697-704，1994)。
(8)活性評價上述抗體片段的抗原結(jié)合活性可以使用抗體片段作為第一抗體，通過上述1.(2)所述的酶免疫測定法、表面胞質(zhì)團(tuán)共振(Karlsson R et al.，J.Immunol.Methods，145，229-240，1991)等進(jìn)行測定。另外，通過1.(4)所述的細(xì)胞增殖抑制分析確認(rèn)是否保持抑制FGF-8活性的中和活性。
4.本發(fā)明的預(yù)防藥和治療藥抗FGF-8中和抗體由于可以與滑膜和軟骨的細(xì)胞以及組織上的FGF-8結(jié)合，抑制由于FGF-8誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分解，抑制軟骨的破壞，所以成為軟骨的保護(hù)劑。另外由于該抗體具有抑制由FGF-8誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞的增殖的能力，所以成為滑膜細(xì)胞的增殖抑制劑。由于關(guān)節(jié)的破壞伴隨著軟骨的破壞和滑膜細(xì)胞的增殖，所以該抗體通過抑制滑膜細(xì)胞的增殖和軟骨的破壞而成為關(guān)節(jié)破壞的抑制劑。關(guān)節(jié)炎是伴隨著關(guān)節(jié)的破壞的疾病，該抗體由于抑制關(guān)節(jié)的破壞而成為關(guān)節(jié)炎的治療藥和預(yù)防藥。關(guān)節(jié)炎包括變形性關(guān)節(jié)病和關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、全身性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性關(guān)節(jié)炎、干癬性關(guān)節(jié)炎、椎間盤疾病、急性結(jié)晶性滑膜炎(包括痛風(fēng)、假痛風(fēng))等。
人源化抗體與人以外的動物的單克隆抗體比較，由于幾乎是來自人抗體的氨基酸序列的一部分，所以在人體內(nèi)表現(xiàn)出很高的效果，而且免疫原性低，預(yù)期其效果持續(xù)時間長，所以作為預(yù)防藥和治療藥很理想。
含有抗FGF-8中和抗體的藥，作為治療藥雖然可單獨(dú)給藥，但通常都是與藥理學(xué)上容許的一種或一種以上的載體一起混合，作為通過制劑學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中常見的任意方法制造的藥劑提供最好。
給藥途徑希望使用治療時效果最好的途徑，如可以口服給藥、或經(jīng)口腔內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、以及靜脈內(nèi)等非口服給藥，抗體或肽制劑時，最好是經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi)和靜脈內(nèi)給藥。
給藥方式，如噴霧劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖漿制劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、貼劑等。
作為適用于口服的制劑，如乳劑、糖漿、膠囊、片劑、散劑、顆粒劑等。
象乳劑和糖漿那樣的液體制品可以使用水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等糖類，聚乙二醇、丙二醇等醇類，芝麻油、橄欖油、大豆油等油類，p-羥基苯甲酸酯等防腐劑，草莓香料、薄荷香料等香料類等作為添加劑制造。
膠囊、片劑、散劑、顆粒劑等可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖醇等賦形劑，淀粉、藻酸鈉等崩解劑，硬脂酸鎂、滑石等滑潤劑，聚乙烯醇、羥丙基甲基纖維素、明膠等粘合劑，脂肪酸酯等表面活性劑，甘油等可塑劑等作為添加劑制造。
作為適用于非口服的制劑，如注射劑、栓劑、噴霧劑等。
注射劑可以用鹽溶液、葡萄糖溶液、或由兩者混合物組成的載體等制備。
栓劑可以用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體制備。
而噴霧劑可以用抗體或肽本身、或者不刺激患者口腔和氣管粘膜，而且使該抗體或肽以微細(xì)的粒子分散，使其容易吸收的載體等制備。
作為載體，具體來說，如乳糖、甘油等。根據(jù)該抗體或肽以及使用的載體的性質(zhì)，可以做成煙霧劑、干燥粉末等制劑。另外，在這些非口服制劑中，也可以添加口服制劑中作為添加劑列舉的成分。
給藥量或給藥次數(shù)因目的治療效果、給藥方法、治療期間、年齡、體重等而有所不同，通常成人為每天10μg/kg～20mg/kg。
抗FGF-8中和抗體抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分解以及抑制滑膜細(xì)胞的增殖可以使用以下(1)和(2)所示的體外的分析體系確認(rèn)。而作為關(guān)節(jié)炎的治療藥和預(yù)防藥也可以將該抗體用于以下(3)所示的關(guān)節(jié)炎病理模型鼠，通過看是否可以減輕他的關(guān)節(jié)炎癥狀進(jìn)行評價。
(1)FGF-8對軟骨破壞的抑制活性軟骨的破壞通過將使用軟骨細(xì)胞或軟骨器官的軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)的分解、從軟骨細(xì)胞或滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的破壞因子的增加作為指標(biāo)的分析，以及由于軟骨破壞的進(jìn)展引起的軟骨下骨的破壞可以分別通過以骨吸收量作為指標(biāo)的分析進(jìn)行評價。
(a)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分解在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中和抗體的情況下對初代培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過測定培養(yǎng)后殘留在培養(yǎng)板上的細(xì)胞外基質(zhì)的量對軟骨破壞作用進(jìn)行評價。細(xì)胞外基質(zhì)量是以經(jīng)番木瓜蛋白酶處理能夠游離出來的葡萄糖胺聚糖的量進(jìn)行測定。由于FGF-8誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的減少在由于抗FGF-8中和抗體的添加受到抑制時，可以認(rèn)為該抗體具有抑制軟骨破壞的作用。
軟骨破壞作用也可以按照Price等人的方法(Price J.S.etal.，Arthritis Rheum.，42，137-147，1999)在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中和抗體的情況下對初代培養(yǎng)的牛鼻中隔軟骨器官進(jìn)行培養(yǎng)，通過測定培養(yǎng)后軟骨器官中的細(xì)胞外基質(zhì)的量對軟骨破壞作用進(jìn)行評價。由于FGF-8誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的減少在通過抗FGF-8中和抗體的添加受到抑制時，可以認(rèn)為該抗體具有抑制軟骨破壞的作用。細(xì)胞外基質(zhì)的量是以通過二甲基亞甲基法(Chandrasekhar S.etal.，Anal.Biochem.161 103-108，1987)對經(jīng)番木瓜蛋白酶處理培養(yǎng)后的器官，能夠游離出來的葡萄糖胺聚糖的量進(jìn)行測定，或根據(jù)東京衛(wèi)生年報，36，277，1985，以膠原的量作為羥脯氨酸濃度的測定來測定的。
(b)與軟骨破壞有關(guān)的因子的產(chǎn)生作為與軟骨破壞有關(guān)的因子如前列腺素E2、基質(zhì)金屬蛋白激酶3、一氧化氮。在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中和抗體的情況下對兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞或兔滑膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以這些因子從該細(xì)胞的產(chǎn)生量對培養(yǎng)上清的前列腺素E2、基質(zhì)金屬蛋白激酶3、一氧化氮進(jìn)行測定。FGF-8促進(jìn)前列腺素E2、基質(zhì)金屬蛋白激酶3、一氧化氮的產(chǎn)生由于抗FGF-8中和抗體的添加受到抑制時，可以認(rèn)為該抗體具有抑制軟骨破壞的作用。
前列腺素E2可以通過前列腺素E2EIA系統(tǒng)(Amersham Biosciences公司生產(chǎn))、基質(zhì)金屬蛋白激酶3可以通過兔基質(zhì)金屬蛋白激酶3ELISA系統(tǒng)(Amersham Biosciences公司生產(chǎn))，一氧化氮可以通過使用Griess試劑的方法(Green L.C.et al.，Anal.Biiochem.126，131-138 1982)進(jìn)行測定。
(c)骨吸收骨吸收可以通過在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中和抗體的情況下對鼠頭蓋骨進(jìn)行培養(yǎng)，測定培養(yǎng)上清中的鈣濃度或羥脯氨酸濃度來測定。由于FGF-8促進(jìn)骨吸收在添加抗FGF-8中和抗體時受到抑制時，可以認(rèn)為該抗體具有抑制軟骨破壞的作用。培養(yǎng)上清中的鈣濃度可以使用鈣C-測試和光(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))進(jìn)行測定。培養(yǎng)上清中的羥脯氨酸濃度可以根據(jù)東京衛(wèi)生年報，36，277，1985的報道進(jìn)行測定。
(2)滑膜細(xì)胞的增殖抑制作用滑膜細(xì)胞的增殖可以在FGF-8存在下添加和不添加抗FGF-8中和抗體的情況下對人或兔的滑膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過測定[3H]胸腺嘧啶整合量來評價。由于FGF-8促進(jìn)的[3H]胸腺嘧啶整合量在添加抗FGF-8中和抗體時受到抑制時，可以認(rèn)為該抗體具有抑制滑膜細(xì)胞增殖的作用。
(3)用關(guān)節(jié)炎病理模型動物在體內(nèi)的評價用下述的關(guān)節(jié)炎病模型動物，可以評價FGF-8或抗FGF-8中和抗體對關(guān)節(jié)破壞的效果。將抗FGF-8中和抗體用于關(guān)節(jié)炎病理模型動物，當(dāng)該模型動物的關(guān)節(jié)炎癥狀減輕時，認(rèn)為可以用作關(guān)節(jié)炎的治療藥和預(yù)防藥。
作為表現(xiàn)出類似于關(guān)節(jié)風(fēng)濕病的病理模型動物，主要有在足關(guān)節(jié)自然發(fā)生關(guān)節(jié)炎的MRL-lpr小鼠(Hang L.et al.，J.Exp.Med.，155，1690-1701，1982、可從日本チヤ-ルス·リバ-購買到)、對免疫結(jié)核死菌后誘導(dǎo)的大鼠·佐劑關(guān)節(jié)炎模型(Pearson CM.et al.，Arth.Rheum.，5，654-658，1962；Taurog J.D.et al.，Cell.Immunol.，75，271-282，1983；Bendele A.et al.，J.Rheumatol.，26，1225-1229，1999)，將關(guān)節(jié)中許多II型膠原與佐劑一起免疫后發(fā)病的小鼠·膠原關(guān)節(jié)炎模型(Stuart J.M.etal.，Annu.Rev.Immunol.，2，199-218，1984；Kamada H.et al.，Jpn.J.Pharmacol.，70，169-175，1996)等。這些模型動物表現(xiàn)出類似于關(guān)節(jié)風(fēng)濕病的癥狀，可以廣泛地用于關(guān)節(jié)炎治療藥的評價。
使用大鼠·佐劑關(guān)節(jié)炎模型時，分別就佐劑處理足(在急性炎癥之后又發(fā)生慢性炎癥的二相性炎癥反應(yīng))和佐劑非處理足(從致敏1周左右引起慢性炎癥)隨時間對后肢足浮腫容積進(jìn)行測定。另外進(jìn)行左右后肢的軟X射線攝影，就骨破壞和關(guān)節(jié)的變形進(jìn)行評價。另外通過測定尿中的葡萄糖胺聚糖量可以對全身的軟骨破壞進(jìn)行評價，通過測定尿中的脫氧吡啶啉量和羥脯氨酸量對全身的骨破壞進(jìn)行評價。尿中的葡萄糖胺聚糖量可以用二甲基亞甲基藍(lán)法(Chandrasekhar S.etal.，Anal.Biochem.161 103-108，1987)，而尿中的脫氧吡啶啉量可以使用オステオリンクス「DPD」(住友制藥公司生產(chǎn))，尿中的羥脯氨酸量可以根據(jù)池田的方法(池田真悟等，東京衛(wèi)研年報.36，277-282，1985)進(jìn)行測定。另外可以使用アスプロ-GP(大塚制藥)對作為全身的炎癥反應(yīng)指標(biāo)的血清中的粘蛋白濃度進(jìn)行測定，按照Tracey等人的方法(Tracey W.R.，et al.，J.Pharmacol.Exp.ther.，272，1011-1015，1995)對血清中的一氧化氮濃度進(jìn)行測定。
使用小鼠·膠原關(guān)節(jié)炎模型時，對體重和關(guān)節(jié)炎記分的隨時間變化、血清中抗膠原抗體效價進(jìn)行測定。另外解剖后，進(jìn)行關(guān)節(jié)部的病理組織學(xué)研究。關(guān)節(jié)炎記分通過0至4分、全肢最高16分的記分進(jìn)行評價。記分基準(zhǔn)為0正常；1發(fā)現(xiàn)弱紅斑，2發(fā)現(xiàn)弱腫脹和紅斑，3發(fā)現(xiàn)強(qiáng)腫脹和紅斑，通過觸知發(fā)現(xiàn)溫感，4發(fā)現(xiàn)隨著手指變形引起的顯著的腫脹。
作為變形性關(guān)節(jié)病模型，更多地使用用狗、兔等大動物，通過膝半月的切除和韌帶的切離，使關(guān)節(jié)產(chǎn)生動搖，使慢性關(guān)節(jié)的變性發(fā)生的模型(以下稱之為實(shí)驗(yàn)變形性關(guān)節(jié)病模型)(伊騰隆太，用于新藥開發(fā)的動物模型利用集成，變形性關(guān)節(jié)病，R&D計劃，1985年，Guingamp C.etal.，Arthritis Rheum.，40，1670-1679，1997；van der Kraan P.M.etal.，Am.J.Pathol.，135，1001-1014，1989)。另外，通過向大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入一碘代乙酸，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)葡萄糖胺聚糖的游離，作為引起關(guān)節(jié)破壞的大鼠·一碘代乙酸誘發(fā)變形性關(guān)節(jié)病模型。
通過兔膝關(guān)節(jié)半月板部分切除形成實(shí)驗(yàn)變形性關(guān)節(jié)病模型可以通過Colombo等人的方法(Colombo C.et al.，Arthritis Rheum.，26，875-886，1983)和菊地等人的方法(菊地壽辛等人，關(guān)節(jié)外科，15，92-98，1966)制作。
大鼠·一碘代乙酸誘發(fā)變形性關(guān)節(jié)病模型基于Guingamp等人的方法(Guingamp C.et al.Arthritis Rheum.，40，1670-1679，1997)，向大鼠的膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入一碘代乙酸進(jìn)行制作。
這些變形性關(guān)節(jié)病動物模型可以通過在一定期間后摘出膝關(guān)節(jié)膝蓋骨，用番木瓜蛋白酶進(jìn)行處理，通過用二甲基亞甲基藍(lán)法(Chandrasekhar S.et al.，Anal.Biochem.161 103-108，1987)測定葡萄糖胺聚糖量，對關(guān)節(jié)破壞(細(xì)胞外基質(zhì)的分解)進(jìn)行評價。另外進(jìn)行膝關(guān)節(jié)的病理組織學(xué)的研究。
作為將抗FGF-8中和抗體用于模型動物時的劑型以及給藥途徑，可以根據(jù)對象模型動物的性質(zhì)和病情適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，可以直接地，或者與其他藥理學(xué)上容許的載體、賦形劑、稀釋劑等一起對模型動物經(jīng)口或不經(jīng)過口(腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下給藥等)給藥。
抗FGF-8中和抗體的配合量以及給藥量可以根據(jù)該制劑的給藥方法、給藥方式、使用目的、模型動物的具體癥狀、模型動物的體重等分別決定，沒有特別限定，給藥量每天大概為1μg/kg～100mg/kg，給藥間隔可以是1天1次，也可以1天分為2～4次，或4次以上的次數(shù)給藥。另外也可以通過點(diǎn)滴等連續(xù)給藥。當(dāng)給藥到關(guān)節(jié)等局部時，每一處大約可給藥1pg至100mg。
5.本發(fā)明的診斷藥FGF-8誘導(dǎo)關(guān)節(jié)中的滑膜細(xì)胞的增殖、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的破壞。上述的FGF-8抗體由于與FGF-8特異性結(jié)合，可以對FGF-8進(jìn)行檢測和定量，所以可以用作關(guān)節(jié)炎的診斷藥。作為可以診斷的關(guān)節(jié)炎，如上述4.所述的疾病。FGF-8的檢測和定量可以按照下述6.所述方法進(jìn)行。
作為本發(fā)明診斷藥使用的抗FGF-8抗體，只要是與FGF-8特異性結(jié)合的抗體都可以，可以使用多克隆抗體或單克隆抗體中的任一種，最好使用單克隆抗體。
作為單克隆抗體，如通過雜交瘤生產(chǎn)的抗體、人源化抗體和這些抗體的抗體片段。
本發(fā)明診斷藥中使用的抗FGF-8抗體可以象上述的抗FGF-8中和抗體的制造法那樣制造，但不需要抑制FGF-8的活性。也可以將抗FGF-8中和抗體作為本發(fā)明的診斷藥所用的抗FGF-8抗體來使用。作為本發(fā)明診斷藥使用的抗FGF-8抗體的具體例子如雜交瘤KM1334(FERM BP-5451)生產(chǎn)的單克隆抗體KM1334、轉(zhuǎn)化體KM3034(FERM BP-7836)生產(chǎn)的人型嵌合抗體KM3034、轉(zhuǎn)化體KM3334生產(chǎn)的人型嵌合抗體KM3334、轉(zhuǎn)化體KM8037(FERM BP-8084)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體HV0LV6、轉(zhuǎn)化體KM8034生產(chǎn)的人型CDR移植抗體HV0LV6/CHO、轉(zhuǎn)化體KM8036(FERM BP-8083)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體HV0LV3-1/CHO以及轉(zhuǎn)化體KM8035(FERM BP-8082)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體HV0LV4-3/CHO。
含有抗FGF-8抗體的診斷藥根據(jù)下述6.所述那樣的判定方法也可以含有用于進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的試劑、該反應(yīng)的檢測用試劑。作為用于進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的試劑，如緩沖劑、鹽等。作為檢測用試劑如識別抗FGF-8抗體的標(biāo)記二次抗體、在對應(yīng)于標(biāo)記的底物等通常的免疫學(xué)檢測法中使用的試劑。
6.本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的判定方法作為用本發(fā)明的判定方法判定的關(guān)節(jié)炎如上述4.所述的疾病。在這些疾病的患者的關(guān)節(jié)中，與健康人比較，認(rèn)為具有誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞的增殖、軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)的破壞的活性的FGF-8的量增加了。
作為本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎的判定方法，例如使用通過活組織等檢查從被檢查者採取的關(guān)節(jié)的滑膜和軟骨的細(xì)胞或組織切片、以及由該細(xì)胞或組織制備的細(xì)胞提取液、滑液等，象下述那樣對細(xì)胞或組織中存在的FGF-8進(jìn)行免疫學(xué)檢測和/或定量的方法。
作為使用針對FGF-8的抗體對在關(guān)節(jié)中表達(dá)的FGF-8進(jìn)行免疫學(xué)檢測和/或定量的方法，可以使用熒光抗體法、酶免疫測定法(ELISA)、放射性物質(zhì)標(biāo)記免疫抗體法(RIA)、免疫組織染色法、免疫細(xì)胞染色法、免疫印跡法、免疫沉降法、三明治(Sandwich)ELISA法(富山朔二和安東民衛(wèi)，單克隆抗體實(shí)驗(yàn)手冊，講談社科學(xué)，1987年、日本生化學(xué)會、續(xù)生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座5，免疫生化學(xué)研究法，東京化學(xué)同人，1986年)等。
熒光抗體法可以使用文獻(xiàn)(單克隆·抗體、富山朔二和安東民衛(wèi)，單克隆抗體實(shí)驗(yàn)手冊，講談社科學(xué)，1987年)等所述方法進(jìn)行。具體來說，在分離的關(guān)節(jié)的細(xì)胞和組織等中使抗FGF-8抗體反應(yīng)，再使用異硫氰酸酯熒光素(FITC)或藻紅素等熒光物質(zhì)標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體反應(yīng)后，用細(xì)胞流式細(xì)胞計進(jìn)行測定熒光色素的方法。
酶免疫測定法(ELISA)是使抗FGF-8抗體與分離的關(guān)節(jié)的細(xì)胞或組織、滑液等反應(yīng)，再使實(shí)施了過氧化物酶、堿性磷酸酶等的酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體反應(yīng)后，加入通過酶反應(yīng)發(fā)色的底物，進(jìn)行反應(yīng)，用吸光光度計測定發(fā)色色素的方法。
放射性物質(zhì)標(biāo)記免疫抗體法(RIA)是使抗FGF-8抗體與分離的關(guān)節(jié)的細(xì)胞或組織、滑液等反應(yīng)，再使實(shí)施了放射性同位素標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體反應(yīng)后，用閃爍計數(shù)器等測定放射能的方法。
免疫組織染色法、免疫細(xì)胞染色法是使抗FGF-8抗體與分離的關(guān)節(jié)的細(xì)胞或組織等反應(yīng)，再使實(shí)施了FITC等熒光物質(zhì)、過氧化物酶、堿性磷酸酶等的酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體反應(yīng)；酶標(biāo)記的情形下，加入通過酶反應(yīng)發(fā)色的底物，進(jìn)行反應(yīng)后，用顯微鏡進(jìn)行觀察的方法，可以使用文獻(xiàn)(單克隆抗體，富山朔二和安東民衛(wèi)，單克隆抗體實(shí)驗(yàn)手冊，講談社科學(xué)，1987年)等所述方法進(jìn)行。
免疫印跡是將分離的關(guān)節(jié)的細(xì)胞或組織、他們的破碎液、滑液等溶解于含有SDS的樣品用緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，使抗FGF-8抗體反應(yīng)，再使實(shí)施了過氧化物酶、堿性磷酸酶等的酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體反應(yīng)后，加入通過酶反應(yīng)發(fā)色或化學(xué)發(fā)光的底物，進(jìn)行反應(yīng)，作為帶檢測出的方法。
免疫沉降法是使分離的關(guān)節(jié)的細(xì)胞或組織的破碎液、滑液與固定于顆粒等上的抗FGF-8抗體等反應(yīng)，通過離心等將顆粒分離后，用含有SDS的樣品用緩沖液進(jìn)行處理顆粒，用閃爍計數(shù)器等檢測溶解的FGF-8的方法。
三明治ELISA是使用抗原表位各不相同的兩種抗FGF-8抗體的酶免疫測定法中的一種。將其中的一種抗體固定于培養(yǎng)板上，使分離的關(guān)節(jié)的細(xì)胞或組織、他們的破碎液、滑液反應(yīng)后，再使另一種抗FGF-8抗體與結(jié)合于培養(yǎng)板上的抗FGF-8抗體的FGF-8反應(yīng)。再使實(shí)施了過氧化物酶、堿性磷酸酶等的酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體反應(yīng)后，加入通過酶反應(yīng)發(fā)色的底物，進(jìn)行反應(yīng)，用吸光光度計測定發(fā)色色素的方法。
附圖的簡單說明

圖1是表示兔軟骨細(xì)胞的FGF-8引起細(xì)胞外基質(zhì)的分解作用的圖?？v軸表示殘留在細(xì)胞外基質(zhì)中的葡萄糖胺聚糖的量，橫軸表示FGF-8的濃度(ng/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，***表示P＜0.001(無刺激組對比、Dunnett檢測)。
圖2是表示抗FGF-8中和抗體KM1334對兔軟骨細(xì)胞的FGF-8引起細(xì)胞外基質(zhì)的分解的抑制作用的圖?？v軸表示殘留在細(xì)胞外基質(zhì)中的葡萄糖胺聚糖的量，橫軸表示KM1334的濃度(μg/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，###表示P＜0.001(無刺激組對比、Student的t-檢測)，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001(0組為對比，Dunnett檢測)。
圖3是表示由兔軟骨細(xì)胞的FGF-8促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白激酶3的產(chǎn)生和抗FGF-8中和抗體KM1334產(chǎn)生的抑制作用的圖?？v軸表示殘留在培養(yǎng)液中的基質(zhì)金屬蛋白激酶3的量(ng/孔)，橫軸表示KM1334的濃度(μg/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，##表示P＜0.01(無刺激組對比、Aspin-Welch檢測)，***表示P＜0.001(0組為對比，Dunnett檢測)。
圖4是表示兔滑膜細(xì)胞的FGF-8促進(jìn)增殖作用的圖?？v軸表示整合到兔滑膜細(xì)胞中的[3H]胸腺嘧啶的放射活性，橫軸表示FGF的濃度(ng/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，*表示P＜0.05(無刺激組對比、Steel檢測)。
圖5是表示抗FGF-8中和抗體KM1334對由兔滑膜細(xì)胞的FGF-8引起的增殖促進(jìn)的抑制作用的圖?？v軸表示整合到兔滑膜細(xì)胞中的[3H]胸腺嘧啶的放射活性，橫軸表示KM1334的濃度(μg/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，###表示P＜0.001(無刺激組對比、Student的t-檢測)，***表示P＜0.001(0組為對比，Dunnett檢測)。
圖6是表示由人滑膜細(xì)胞的FGF-8引起的增殖促進(jìn)作用的圖。縱軸表示整合到人滑膜細(xì)胞中的[3H]胸腺嘧啶的放射活性，橫軸表示FGF-8的濃度(ng/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，***表示P＜0.001(無刺激組對比，Dunnett檢測)。
圖7是表示抗FGF-8中和抗體KM1334對由人滑膜細(xì)胞的FGF-8引起的增殖促進(jìn)的抑制作用的圖?？v軸表示整合到兔滑膜細(xì)胞中的[3H]胸腺嘧啶的放射活性，橫軸表示KM1334的濃度(μg/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，###表示P＜0.001(無刺激組對比、Aspin-Welch檢測)，*表示P＜0.05(0組為對比，Steel檢測)。
圖8是表示由于FGF-8注入引起的關(guān)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)分解的圖。縱軸表示關(guān)節(jié)洗凈液中的葡萄糖胺聚糖濃度(μg/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，**表示P＜0.01(生理鹽水注入組對比，Student的t-檢測)。
圖9是表示由于FGF-8注入引起的關(guān)節(jié)的膝蓋骨破壞的圖。縱軸表示膝蓋骨重量(mg)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，*表示P＜0.05(生理鹽水注入組對比，Student的t-檢測)。
圖10是表示抗FGF-8中和抗體KM1334對膠原關(guān)節(jié)炎病小鼠的關(guān)節(jié)炎記分的隨時間變化的抑制作用的圖?？v軸表示關(guān)節(jié)炎記分，橫軸表示從膠原初次致敏開始的經(jīng)過天數(shù)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，*表示P＜0.05(給予生理鹽水組對比，Wilcoxon順位和檢測)，#表示P＜0.05(給予溶劑組對比，Wilcoxon順位和檢測)。
圖11是表示抗FGF-8中和抗體KM1334對佐劑關(guān)節(jié)炎病大鼠的佐劑非處置足的足容積量增加的抑制作用的圖。縱軸表示足容積(mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，###表示P＜0.001(未處置組對比、Aspin-Welch檢測)，**表示P＜0.01(生理鹽水注入組對比，Student的t-檢測)。
圖12是表示雙氯芬酸鈉、甲氨蝶呤、以及氫化潑尼松對佐劑關(guān)節(jié)炎病大鼠的佐劑非處置足的足容積量增加的抑制作用的圖?？v軸表示足容積(mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，###表示P＜0.001(未處置組對比、Aspin-Welch檢測)，***表示P＜0.001(給予溶劑組對比，Student的t檢測)， 表示P＜0.01， 表示P＜0.001(給予溶劑組對比，Aspin-Welch檢測)。
圖13是表示抗FGF-8中和抗體KM1334對佐劑關(guān)節(jié)炎病大鼠尿中的葡萄糖胺聚糖量上升的抑制作用的圖?？v軸表示葡萄糖胺聚糖濃度/肌酸酐濃度比(μg/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，###表示P＜0.001(未處置組對比、Aspin-Welch檢測)，**表示P＜0.01(生理鹽水注入組對比，Student的t-檢測)。
圖14是表示雙氯芬酸鈉、甲氨蝶呤、以及氫化潑尼松對佐劑關(guān)節(jié)炎病大鼠尿中的葡萄糖胺聚糖量上升的抑制作用的圖?？v軸表示葡萄糖胺聚糖濃度/肌酸酐濃度比(μg/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，##表示P＜0.01(未處置組對比、Aspin-Welch檢測)，*表示P＜0.05(生理鹽水注入組對比，Student的t-檢測)。
圖15是表示抗FGF-8中和抗體KM1334對佐劑關(guān)節(jié)炎病大鼠尿中的脫氧吡啶啉(deoxypyridinoline)上升的抑制作用的圖?？v軸表示脫氧吡啶啉濃度/肌酸酐濃度比(nmol/mmol)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，###表示P＜0.001(未處置組對比、Aspin-Welch檢測)，*表示P＜0.05(生理鹽水注入組對比，Student的t-檢測)。
圖16是表示雙氯芬酸鈉、甲氨蝶呤、以及氫化潑尼松對佐劑關(guān)節(jié)炎病大鼠尿中的脫氧吡啶啉量上升的抑制作用的圖?？v軸表示脫氧吡啶啉濃度/肌酸酐濃度比(nmol/mmol)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，###表示P＜0.001(未處置組對比、Student的t-檢測)，**表示P＜0.01(溶劑注入組對比，Student的t-檢測)。
圖17是表示抗FGF-8中和抗體KM1334對佐劑關(guān)節(jié)炎病大鼠尿中的羥脯氨酸上升的抑制作用的圖?？v軸表示羥脯氨酸濃度/肌酸酐濃度比(μg/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，###表示P＜0.001(未處置組對比、Student的t-檢測)，**表示P＜0.01(溶劑給予組對比，Student的t-檢測)。
圖18是表示抗FGF-8中和抗體KM1334對一碘代乙酸誘發(fā)變形性關(guān)節(jié)病模型大鼠中的關(guān)節(jié)軟骨破壞的抑制作用的圖?？v軸表示關(guān)節(jié)洗凈液中的葡萄糖胺聚糖濃度(μg/mL)。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，##表示P＜0.01(假手術(shù)組對比、Aspin-Welch檢測)，*表示P＜0.05(生理鹽水注入組對比，Student的t-檢測)。
圖19是表示質(zhì)粒pKM1334CH-H5的構(gòu)建步驟的圖。
圖20是表示質(zhì)粒pKM1334CH-L4的構(gòu)建步驟的圖。
圖21是表示質(zhì)粒pKANTEX1334的構(gòu)建步驟的圖。
圖22是表示抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334、抗FGF-8中和抗體KM3034和KM3334對小鼠乳腺癌細(xì)胞株SC-3細(xì)胞的FGF-8依賴增殖的中和活性的圖。橫軸表示抗體濃度(μg/mL)，縱軸表示將只添加了FGF-8時的增殖作為100％時的相對增殖(％)?！馂镵M1334、□為KM3034、△為KM3334、×為陰性對照的KM2760的活性。
圖23是表示質(zhì)粒pKM1334HVO的構(gòu)建步驟的圖。
圖24是表示質(zhì)粒pKANTEX1334HVOLVO的構(gòu)建步驟的圖。
圖25是表示通過ELISA測定抗FGF-8中和嵌合抗體KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLVO、HVOLV6、HV6LV6對FGF-8的結(jié)合活性的結(jié)果的圖。橫軸表示抗體濃度(μg/mL)，縱軸表示結(jié)合活性(OD415)。△為KM3334、○為HVOLVO、□為HVOLV6、×為HV6LV6的活性。
圖26是表示通過BIAcore 2000測定抗FGF-8中和嵌合抗體KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLVO、HVOLV6、HV6LV6對FGF-8的結(jié)合活性的結(jié)果的圖。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示共振信號(RU)。
圖27是表示質(zhì)粒pKM1334LV3-1的構(gòu)建步驟的圖。
圖28是表示質(zhì)粒pKM1334LV4-2的構(gòu)建步驟的圖。
圖29是表示質(zhì)粒pKM1334LV3-2的構(gòu)建步驟的圖。
圖30是表示通過BIAcore 2000測定抗FGF-8中和嵌合抗體KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLVO/CHO、HVOLV6/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV4-2/CHO、HVOLV3-1/CHO、HVOLV3-2/CHO、HVOLV2-1/CHO、HVOLV2-2/CHO對FGF-8的結(jié)合活性的結(jié)果的圖。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示共振信號(RU)。
圖31是表示抗FGF-8中和嵌合抗體KM3034、抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLV6/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV3-1/CHO、HVOLV2-1/CHO對小鼠乳腺癌細(xì)胞株SC-3細(xì)胞的FGF-8依賴增殖的中和活性的圖。橫軸表示抗體濃度(μg/mL)，縱軸表示將只添加了FGF-8時的增殖作為100％時的相對增殖(％)?！馂镵M3034、●為HVOLV6/CHO、◇為HVOLV4-1/CHO、△為HVOLV3-1/CHO、□為HVOLV2-1/CHO、×為陰性對照的KM2760的活性。
圖32是表示質(zhì)粒pKM1334LV3-3的構(gòu)建步驟的圖。
圖33是表示通過BIAcore 2000測定抗FGF-8中和嵌合抗體KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLV6/CHO、HVOLV3-1/CHO、HVOLV4-3/CHO、HVOLV3-3/CHO對FGF-8的結(jié)合活性的結(jié)果的圖。橫軸表示時間(秒)，縱軸表示共振信號(RU)。
圖34是表示抗FGF-8中和嵌合抗體KM3334、抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLV6/CHO、HVOLV3-1/CHO、HVOLV4-3/CHO、HVOLV3-3/CHO對小鼠乳腺癌細(xì)胞株SC-3細(xì)胞的FGF-8的結(jié)合活性的結(jié)果的圖。橫軸表示抗體濃度(μg/mL)，縱軸表示將只添加了FGF-8時的增殖作為100％時的相對增殖(％)。○為KM3034、●為HVOLV6/CHO、△為HVOLV3-1/CHO、▲為HVOLV4-3/CHO、■為HVOLV3-3/CHO、×為陰性對照的KM2760的活性。
具體實(shí)施例方式
以下給出本發(fā)明的實(shí)施例和參考例。
實(shí)施例1兔軟骨細(xì)胞的FGF-8引起的細(xì)胞外基質(zhì)的分解和抗體引起的抑制兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是按照田村等人的方法(Tamura T.etal.，Eur.J.Pharmacol.，419，269-274，2001)從3周齡的雌性新西蘭白兔的兩膝和肩分離培養(yǎng)的。即摘出兩膝關(guān)節(jié)和兩肩關(guān)節(jié)，採取骨端軟骨。用磷酸緩沖生理鹽水洗凈后，將軟骨切碎，通過在含有0.4％肌動蛋白酶(アクチナ-ゼ)E的添加10vol％FBS的DMEM(以下將含有FBS的DMEM記為FBS/DMEM)中，37℃下處理1小時，再在含有0.025w/v％的膠原酶P的添加10vol％FBS的DMEM中，37℃下處理5～6小時，將軟骨細(xì)胞從軟骨組織中分離出來、採取。將採取的軟骨細(xì)胞懸浮于10vol％FBS/DMEM，調(diào)整到100,000個/mL。將含有該軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)液接種到24孔板的各個孔中，每孔1mL，然后在5％CO2-95％空氣氣相下于37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。在軟骨細(xì)胞達(dá)到鋪滿程度后，將培養(yǎng)液置換成0.5vol％FBS/DMEM，培養(yǎng)24小時。除去培養(yǎng)液，添加1mL的0.5vol％FBS/DMEM(無刺激組)，或含有FGF-8[1、10或100ng/mL；Peprotech公司生產(chǎn)]的0.5vol％FBS/DMEM后培養(yǎng)48小時。在研究抗FGF-8中和抗體的作用時，添加1mL含有FGF-8(100ng/mL)的0.5vol％FBS/DMEM(0組)，或含有FGF-8(100ng/mL)和抗FGF-8中和抗體KM1334(1、3或10μg/mL)的0.5vol％FBS/DMEM后培養(yǎng)48小時。除去培養(yǎng)液，通過二甲基亞甲基法(DMMB)(Chandrasekhar S.etal.，Anal.Biochem.161103-108，1987)對殘留在板上的細(xì)胞外基質(zhì)的葡萄糖胺聚糖量進(jìn)行測定。即，向加入5mmol/L L-半胱氨酸鹽酸鹽-水和物后活化的保存用番木瓜蛋白酶緩沖液(0.1mol/L乙酸鈉、50mmol//LEDTA、pH5.8)加入終濃度為20μg/mL的番木瓜蛋白酶(Sigma Aldrich公司生產(chǎn))，將該液添加到培養(yǎng)上述軟骨細(xì)胞的板的各個孔中，每孔1mL，于60℃下消化過夜。向75μL的該消化液添加25μL鹽酸胍緩沖液(2.88mol/L鹽酸胍、50mmol/L乙酸鈉、pH6.8)和200μL DMMB溶液，測定530/590nm的吸光度。由作為標(biāo)準(zhǔn)使用的硫酸軟骨素(來自鯨的軟骨，生化學(xué)工業(yè)公司生產(chǎn))的吸光度算出各個樣品的葡萄糖胺聚糖的濃度。實(shí)驗(yàn)在各個條件下都進(jìn)行了3例，求平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖1和圖2給出了算出的結(jié)果。FGF-8在100ng/mL濃度下可以使細(xì)胞外基質(zhì)中的葡萄糖胺聚糖殘存量顯著地降低(圖1)。
這表明FGF-8具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分解的作用。另外，抗FGF-8中和抗體KM1334在3μg/mL以上的抗體濃度下對FGF-8促進(jìn)軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)的分解顯著地抑制(圖2)。因此通過給予抗FGF-8中和抗體可以抑制關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞外基質(zhì)的分解。
實(shí)施例2 FGF-8促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白激酶3的產(chǎn)生和抗體引起的抑制兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是按照實(shí)施例1所述方法分離培養(yǎng)的。在軟骨細(xì)胞達(dá)到鋪滿程度后，將培養(yǎng)液置換成0.5vol％FBS/DMEM，培養(yǎng)24小時。除去培養(yǎng)液，添加1mL的0.5vol％FBS/DMEM(無刺激組)，含有FGF-8(100ng/mL)的0.5vol％FBS/DMEM(0組)、或含有FGF-8(100ng/mL)和抗FGF-8中和抗體KM1334(1、3或10μg/mL)的0.5vol％FBS/DMEM后培養(yǎng)48小時。48小時后，回收培養(yǎng)液，用兔細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白激酶3 ELISA系統(tǒng)(Amersham·Biosciences公司生產(chǎn))測定培養(yǎng)液中的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白激酶3濃度。實(shí)驗(yàn)在各個條件下都進(jìn)行了3例，求平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖3給出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。FGF-8在100ng/mL濃度下可以使來自軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白激酶3量顯著地增加(無刺激組對0組、P＝0.0079)。這表明FGF-8通過來自軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白激酶3的產(chǎn)生誘導(dǎo)具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分解的作用。另外，抗FGF-8中和抗體KM1334在1μg/mL以上的抗體濃度下對FGF-8促進(jìn)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白激酶3的產(chǎn)生顯著地抑制(圖2)?？笷GF-8中和抗體KM1334的1、3或10μg/mL的抑制率分別為72、74、100％。因此通過給予抗FGF-8中和抗體可以抑制來自軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白激酶3的產(chǎn)生，抑制關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞外基質(zhì)的分解。
實(shí)施例3 FGF-8促進(jìn)兔滑膜細(xì)胞的增殖和抗體產(chǎn)生的抑制兔關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞是按照Hamilton等人的方法(Hamilton J.andSlywka J.，J.Immunol.126，851-855，1981)採集。將分離的滑膜細(xì)胞懸浮于含有10vol％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(以下將含有FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基記為FBS/RPMI 1640培養(yǎng)基)，每10,000個接種到96孔的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時后，除去各個孔的培養(yǎng)液，添加200μL的0.2vol％FBS/RPMI 1640(無刺激組)，或含有FGF-8(1、10或100ng/mL)的0.2vol％FBS/RPMI 1640。當(dāng)研究抗FGF-8中和抗體的作用時，向各個孔添加200μL含有FGF-8(100ng/mL)的0.2vol％FBS/RPMI 1640(0組)，或含有FGF-8(100ng/mL)和抗FGF-8中和抗體KM1334(0.1、0.3、1、3或10μg/mL)的0.2vol％FBS/RPMI 1640。培養(yǎng)48小時后，每孔添加9.25kBq的[3H]胸腺嘧啶。再培養(yǎng)24小時，用液相閃爍計數(shù)器(1205β板，Perkin Elmer Life scence日本)測定整合到細(xì)胞內(nèi)的[3H]胸腺嘧啶的放射性活性。實(shí)驗(yàn)在各個條件下都進(jìn)行了6例，求平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖4和圖5給出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。FGF-8在100ng/mL濃度下可以有意義地促進(jìn)[3H]胸腺嘧啶向兔滑膜細(xì)胞的整合(圖4)。這表明FGF-8具有促進(jìn)兔滑膜細(xì)胞增殖的作用。另外，抗FGF-8中和抗體KM1334在3μg/mL以上的抗體濃度下對依賴FGF-8的[3H]胸腺嘧啶整合的促進(jìn)顯著地抑制(圖5)。因此通過給予抗FGF-8中和抗體可以抑制關(guān)節(jié)炎的滑膜的增殖。
實(shí)施例4 FGF-8促進(jìn)人滑膜細(xì)胞的增殖和抗體產(chǎn)生的抑制使用關(guān)節(jié)風(fēng)濕病患者的人滑膜細(xì)胞(由東洋紡購入)，進(jìn)行與實(shí)施例3同樣的實(shí)驗(yàn)。FGF-8的濃度為10、100或500ng/mL，與抗FGF-8中和抗體KM1334共存的FGF-8濃度調(diào)整到500ng/mL。實(shí)驗(yàn)在各個條件下都進(jìn)行了6例，求平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖6和圖7給出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。FGF-8在500ng/mL濃度下可以顯著地促進(jìn)[3H]胸腺嘧啶向人滑膜細(xì)胞的整合(圖6)。這表明FGF-8具有促進(jìn)人滑膜細(xì)胞增殖的作用。另外，抗FGF-8中和抗體KM1334在1μg/mL以上的抗體濃度下對依賴FGF-8的[3H]胸腺嘧啶整合的促進(jìn)顯著地抑制(第7圖)。因此通過給予抗FGF-8中和抗體可以抑制關(guān)節(jié)炎的滑膜的增殖。
實(shí)施例5使用抗FGF-8抗體的滑膜染色從人關(guān)節(jié)風(fēng)濕病患者摘出滑膜，按照文獻(xiàn)的方法(Tanaka A.etal，Cancer Res.58，2053-2056，1998)，制作石蠟切片，用抗FGF-8抗體KM1334進(jìn)行組織免疫染色。結(jié)果4例人關(guān)節(jié)風(fēng)濕病中有3例的滑膜細(xì)胞中FGF-8呈陽性。因此，可以確認(rèn)FGF-8存在于人滑膜中。另外通過使用抗FGF-8抗體檢測人關(guān)節(jié)風(fēng)濕病的滑膜細(xì)胞，可以判定人關(guān)節(jié)風(fēng)濕病。
實(shí)施例6由關(guān)節(jié)內(nèi)注入FGF-8而誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎用FGF-8，象以下那樣誘發(fā)Sprague-Dawley系大鼠(雄性、7周齡、日本チヤ-ルス·リバ-公司)關(guān)節(jié)炎樣病癥。使用生理鹽水(大塚制藥工廠公司生產(chǎn))終濃度為1mg/mL那樣地制備的50μL FGF-8注入到大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)。另外，建立向膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入50μL生理鹽水的對照組。一組3只。注入FGF-8或生理鹽水3天后，按照Yamada等人的方法(Yamada A.et al.，Inflamm.Res.，49，144-146，2000)，用含有0.38％w/v檸檬酸鈉的生理鹽水30μL洗膝關(guān)節(jié)包內(nèi)，回收洗凈液。該操作重復(fù)進(jìn)行10次，回收300μL的關(guān)節(jié)洗凈液。按照實(shí)施例1所述的DMMB法測定關(guān)節(jié)洗凈液中的葡萄糖胺聚糖的量。另外，將膝關(guān)節(jié)的膝蓋骨取出，按照實(shí)施例1所述的方法用番木瓜蛋白酶消化軟骨部分，測定硬骨的重量。
圖8和圖9給出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8表示關(guān)節(jié)洗凈液中的葡萄糖胺聚糖的濃度。由于注入FGF-8，關(guān)節(jié)洗凈液中的葡萄糖胺聚糖的濃度比注入生理鹽水組上升1.9倍(P＝0.0034)。這表明由于FGF-8的注入，關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)分解亢進(jìn)。圖9表示番木瓜蛋白酶消化后的膝蓋骨重量。由于FGF-8的注入，膝蓋骨的重量下降到注入生理鹽水組的40％(P＝0.0454)。這表明由于FGF-8的注入，膝蓋骨的破壞亢進(jìn)。因此，F(xiàn)GF-8在生物體內(nèi)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)破壞，引起關(guān)節(jié)炎那樣的癥狀。
實(shí)施例7用小鼠·膠原關(guān)節(jié)炎模型的評價小鼠·膠原關(guān)節(jié)炎模型用DBA/1J系小鼠(雄性、7周齡、日本チヤ-ルス·リバ-公司)，按照鎌田等人的方法(Kamada H.etal.，Jpn.J.Pharmacol.，70，169-175，1996)象以下那樣制作。
將來自牛軟骨的II型膠原溶液(膠原技術(shù)研修公司生產(chǎn))在冰冷下與付氏完全佐劑(ヤトロン公司生產(chǎn))混合，使其形成乳劑，將II型膠原的終濃度調(diào)整到1.5mg/mL，然后將調(diào)整后的乳劑100μL注射到鼠的尾根部皮內(nèi)，進(jìn)行致敏，再于21天后，按照同樣操作進(jìn)行追加免疫。一組10只。對于給予KM1334組，用生理鹽水(大塚制藥工廠公司生產(chǎn))將抗FGF-8抗體KM1334溶解，使終濃度為2mg/mL，于從上述小鼠·膠原關(guān)節(jié)炎模型的初次致敏開始后的第21、25、28、32、35和39天，1天1次地向各個個體腹腔內(nèi)給藥200μL。另外對于給予生理鹽水對照組，代替抗FGF-8抗體KM1334溶液，只向腹腔內(nèi)注入生理鹽水。而作為陽性對照，對于給予雙氯芬酸組，將非甾體抗炎藥雙氯芬酸鈉(Sigma Aldrich公司生產(chǎn))溶解于0.5w/v％甲基纖維素溶液中，終濃度為0.3mg/mL，于從上述小鼠·膠原關(guān)節(jié)炎模型的初次致敏開始后的第21、25、28、32、35和39天，1天1次地按照每100g體重1mL經(jīng)口給藥。另外預(yù)設(shè)未處置組，不進(jìn)行膠原致敏和給藥。膠原關(guān)節(jié)炎中的全肢浮腫的隨時間變化用一肢0到4分、全肢合計最高16分的記分評價。記分基準(zhǔn)為0正常；1發(fā)現(xiàn)弱紅斑，2發(fā)現(xiàn)弱腫脹和紅斑，3發(fā)現(xiàn)強(qiáng)腫脹和紅斑，通過觸知發(fā)現(xiàn)溫感，4發(fā)現(xiàn)隨著手指變形引起顯著的腫脹。
圖10給出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在給予抗FGF-8抗體KM1334組，在第42天確認(rèn)34％(P＝0.0204)的顯著的關(guān)節(jié)炎記分的抑制，其抑制程度與陽性對照的給予雙氯芬酸組同等程度(圖10)。這表明通過給予抗FGF-8中和抗體，可以抑制關(guān)節(jié)炎。
實(shí)施例8用大鼠·佐劑關(guān)節(jié)炎模型的評價大鼠·佐劑關(guān)節(jié)炎模型用Lewis系大鼠(雌性、8周齡、日本チヤ-ルス·リバ-公司)，按照Pearson等人的方法(Pearson CM.etal.，Arth.Rheum.，5，654-658，1962)象以下那樣制作。
將Mycobacterium butyricum(デイフコ公司生產(chǎn))懸浮于液體石蠟(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))，終濃度為6mg/mL，高壓滅菌，然后將滅菌后的溶液100μL注射到大鼠的右側(cè)足蹠部皮內(nèi)，進(jìn)行致敏。一組8～10只。對于給予KM1334組，用生理鹽水將抗FGF-8抗體KM1334溶解，使終濃度為2mg/mL，于從上述大鼠·佐劑關(guān)節(jié)炎模型的致敏日以及致敏開始后的第3、7、10、14和17天，1天1次地向各個個體腹腔內(nèi)給藥0.5mLμL。另外對于給予生理鹽水組，代替抗FGF-8抗體KM1334溶液只向腹腔內(nèi)注入生理鹽水。而作為陽性對照，對于給予雙氯芬酸組，將消炎藥雙氯芬酸鈉溶解于0.5w/v％甲基纖維素溶液中，終濃度為0.3mg/mL，于從佐劑致敏日開始后的第4、從7開始的11天、從14開始的第18天，1天1次地按照每100g體重1mL經(jīng)口給藥。對于給予甲氨蝶呤組，將作為代謝拮抗藥的注射用甲氨蝶呤R50mg(日本ワイスレダリ-公司生產(chǎn))懸浮于0.5w/v％甲基纖維素溶液中，終濃度為0.01mg/mL，象與雙氯芬酸組同樣那樣給藥。對于氫化潑尼松給予組，將作為甾體類藥氫化潑尼松(Sigma-Aldrich公司生產(chǎn))懸浮于0.5w/v％甲基纖維素溶液中，終濃度為0.3mg/mL，象雙氯芬酸組那樣給藥。另外作為溶劑給予組，同樣經(jīng)口只給予0.5w/v％甲基纖維素溶液。另外預(yù)設(shè)未處置組，進(jìn)行Mycobacterium butyricum致敏和給藥。佐劑處置足和非處置足的容積用大鼠后肢足浮腫測定裝置(TK-101、ユニコム公司生產(chǎn))隨時間進(jìn)行測定。
圖11和圖12給出了致敏后第21天的測定結(jié)果。在抗FGF-8中和抗體KM1334給予組，于佐劑非處置足可以看到69％(P＝0.0010)的顯著的足容積增加的抑制(圖11)。在雙氯芬酸給予組可以看到45％(P＜0.0001)，在甲氨蝶呤給予組可以看到90％(P＜0.0001)，在氫化潑尼松給予組可以看到51％(P＝0.0029)的顯著的足容積增加的抑制(圖12)。即，抗FGF-8中和抗體KM1334表現(xiàn)出比雙氯芬酸或氫化潑尼松高的浮腫抑制作用。
用致敏開始后第20天至第21天24小時蓄尿，測定尿中的葡萄糖胺聚糖、脫氧吡啶啉、羥脯氨酸以及肌酸酐。尿中的葡萄糖胺聚糖量按照實(shí)施例1所述的DMMB法進(jìn)行測定。尿中羥脯氨酸量按池田等人方法(池田真悟等，東京衛(wèi)研年報.36，277-282，1985)進(jìn)行測定。即，向0.8mL尿中添加0.8mL氨基酸分析用鹽酸(關(guān)東化學(xué)公司生產(chǎn))，于110℃下水解15小時。向水解的樣品0.5mL添加2mL的1.2mol/L的氫氧化鈉溶液，進(jìn)行中和。向0.5mL中和處理的樣品中添加1mL異丙醇，添加1mLOxidant溶液后充分?jǐn)嚢?，于室溫下靜置5分鐘。Oxidant溶液是將醋酸鈉3水和物5.7g、檸檬酸三鈉2水和物3.75g、檸檬酸一水和物0.602g溶解于約50mL蒸餾水中，加38.5mL異丙醇，再加蒸餾水，成為100mL的醋酸檸檬酸緩沖液，使用時將該緩沖液與用蒸餾水配制的7w/v％氯胺T溶液(對甲苯磺氯酰胺鈉三水和物，和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))按照4∶1比例充分混合后的溶液。然后添加1mL Ehrlich試劑，充分?jǐn)嚢?，于恒溫器中?0℃，加熱20分鐘。Ehrlich試劑是將17.6g的p-二甲基氨基苯醛(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))溶解于20.9mL的過氯酸(關(guān)東化學(xué)公司生產(chǎn))，加異丙醇做成100mL的溶液。加溫后，用流水冷卻，測定562nm的吸光度。用L-羥脯氨酸(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))的吸光度做成的檢量線，算出各個樣品的羥脯氨酸濃度。尿中的脫氧吡啶啉量用オステオリンクス「DPD」(住友制藥公司生產(chǎn))測定。尿中的肌酸酐量用肌酸酐測試和光(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))檢測。由于要對個體間的尿濃度的差進(jìn)行修正，對于每個個體算出葡萄糖胺聚糖濃度/肌酸酐濃度、脫氧吡啶啉濃度/肌酸酐濃度、或羥脯氨酸濃度/肌酸酐濃度的比，作為各自的指標(biāo)。
圖13到圖17給出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。尿中的葡萄糖胺聚糖量在生理鹽水給予組上升到未處置組的2.2倍(P＜0.0001)(圖13)。這表明隨著關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，軟骨破壞亢進(jìn)。在給予抗FGF-8中和抗體KM1334組，對于尿中的葡萄糖胺聚糖量的上升，可以看到73％(P＝0.0064)的顯著的抑制(圖13)。在給予甲氨蝶呤組，可以看到對尿中的葡萄糖胺聚糖量的上升的79％(P＝0.0465)的顯著的抑制。雖然不顯著，但在雙氯芬酸給予組可以看到40％，在氫化潑尼松給予組可以看到18％的尿中的葡萄糖胺聚糖量的降低(圖14)，即，抗FGF-8中和抗體KM1334顯示出與甲氨蝶呤同等程度的軟骨破壞抑制作用。
尿中的脫氧吡啶啉量在生理鹽水給予組上升到未處置組的1.8倍(P＜0.0001)(圖15)。這表明隨著關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，軟骨破壞亢進(jìn)。在給予抗FGF-8中和抗體KM1334組，對于尿中的脫氧吡啶啉量的上升，可以看到41％(P＝0.0185)的顯著的抑制。在雙氯芬酸給予組可以看到88％(P＝0.0016)的顯著的尿中的脫氧吡啶啉量上升的抑制。雖然不顯著，但在給予甲氨蝶呤組，可以看到34％，在氫化潑尼松給予組可以看到38％的脫氧吡啶啉量的降低(圖16)。即，抗FGF-8中和抗體KM1334顯示出超過甲氨蝶呤和氫化潑尼松的骨破壞抑制作用。
尿中的羥脯氨酸量在生理鹽水給予組上升到未處置組的1.8倍(P＝0.0002)(圖17)。這表明隨著關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，骨破壞亢進(jìn)。在給予抗FGF-8中和抗體KM1334組，對于尿中的羥脯氨酸量的上升，雖然不顯著，但可以看到48％的降低。
在致敏后第21天，在脛骨骨干部切斷佐劑非處置足，採集，用10vol％磷酸緩沖液福爾馬林溶液固定。然后，用軟X射線發(fā)生裝置SOFRONSRO-M50(ソフロン公司生產(chǎn))，于29kV、4mA、2分鐘的條件下拍攝軟X射線照片。用實(shí)體顯微鏡觀察照片，對骨破壞打分。打分是通過觀察有無踵骨(一邊作為1個部位，合計5個部位)的骨糜爛，有糜爛為1分，沒有為0分，一肢最高為5分來進(jìn)行。
第1表和第2表給出了打分結(jié)果。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，*表示P＜0.05、**表示P＜0.01，***表示P＜0.001(溶劑給予組對比，Wilcoxon順位和檢測)。
第1表給予組 骨破壞打分 (抑制率)未處置組0.0±0.0-生理鹽水4.4±0.3-KM1334 3.2±0.5 27％第2表給予組骨破壞打分(抑制率)未處置組 0.0±0.0 -溶劑 4.6±0.3 -雙氯芬酸 3.1±0.6*33％甲氨蝶呤 0.9±0.4***80％氫化潑尼松 1.8±0.7**61％在給予抗FGF-8中和抗體KM1334組，雖然不顯著，但可看到骨破壞打分的27％降低(第1表)。在雙氯芬酸給予組可以看到33％(P＝0.0362)、在給予甲氨蝶呤組，可以看到80％(P＝0.0006)，在氫化潑尼松給予組可以看到61％(P＝0.0032)骨破壞打分降低(第2表)。即，抗FGF-8中和抗體KM1334顯示出與雙氯芬酸同等程度的骨破壞打分降低。
制作福爾馬林固定的佐劑非處置足的石蠟切片。進(jìn)行蘇木精/伊紅染色，對從脛骨到中足骨的骨、關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍區(qū)域進(jìn)行組織病理學(xué)評價。對于向關(guān)節(jié)周圍組織或關(guān)節(jié)腔的血漿漏出通過一肢0到4分的打分進(jìn)行評價。打分的基準(zhǔn)為0沒有變化，1發(fā)現(xiàn)極輕度的變化，2發(fā)現(xiàn)輕度變化，3發(fā)現(xiàn)中等程度變化，4發(fā)現(xiàn)重度變化。
第3表給出了結(jié)果。值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，*表示P＜0.05、**表示P＜0.01(生理鹽水給予組對比，Wilcoxon順位和檢測)。
第3表給予組病理打分向關(guān)節(jié)周圍(抑制率) 向關(guān)節(jié)腔的(抑制率)的血液漏出 血細(xì)胞和血漿漏出未處置 0.0±0.0- 0.0±0.0生理鹽水 3.4±0.2- 2.7±0.2KM1334 2.0±0.4**41％1.6±0.3*41％
在給予抗FGF-8中和抗體KM1334組，可以看到血漿向關(guān)節(jié)周圍組織的漏出降低41％(P＝0.0022)、血細(xì)胞和血漿向關(guān)節(jié)腔的漏出降低41％(P＝0.0156)(第3表)。因此通過給予抗FGF-8中和抗體，可以抑制關(guān)節(jié)炎中的浮腫形成，和軟骨以及骨破壞。
實(shí)施例9用小鼠·一碘代乙酸誘發(fā)變形性關(guān)節(jié)炎模型的評價小鼠·佐劑關(guān)節(jié)炎模型用Sprague-Dawley系大鼠(雄性、7周齡、日本チヤ-ルス·リバ-公司)，按照Guingamp等人的方法(GuingampC.et al.，Arthritic Rheum.，40，1670-1679，1997)象以下那樣制作。
用生理鹽水配制終濃度為10mg/mL的一碘代乙酸(Sigma Aldrich公司生產(chǎn))，將25μL配制的一碘代乙酸注入大鼠的右膝關(guān)節(jié)內(nèi)。一組10只。對于KM1334給予組，用生理鹽水(大塚制藥工廠公司生產(chǎn))溶解抗FGF-8中和抗體，使終濃度為4mg/mL，在注入一碘代乙酸時，每100g體重向腹腔內(nèi)一次注入0.5mL。而對于生理鹽水組，取代抗體溶液，只向腹腔內(nèi)注入生理鹽水。另設(shè)置假手術(shù)組，將生理鹽水注入膝關(guān)節(jié)內(nèi)，不給藥。一碘代乙酸注入3日后，按照實(shí)施例6所述的方法，回收關(guān)節(jié)洗凈液。用實(shí)施例1所述的DMMB法測定關(guān)節(jié)洗凈液中的葡萄糖胺聚糖量。
圖18給出了測定結(jié)果。由于一碘代乙酸的注入，關(guān)節(jié)洗凈液中的葡萄糖胺聚糖濃度上升到假手術(shù)組的1.6倍(P＝0.0014)。這表明由于一碘代乙酸注入，關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)分解亢進(jìn)。對于由于一碘代乙酸注入使得關(guān)節(jié)洗凈液中的葡萄糖胺聚糖濃度上升，在抗FGF-8中和抗體給予組，可以看到42％(P＝0.0188)的有意義的抑制。因此，通過給予抗FGF-8中和抗體，可以抑制關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)軟骨的破壞。
參考例1抗FGF-8中和嵌合抗體的生產(chǎn)1.編碼小鼠的抗FGF-8中和抗體的V區(qū)的cDNA的分離和解析(1)從生產(chǎn)小鼠的抗FGF-8中和抗體的雜交瘤細(xì)胞制備mRNA使用mRNA制備試劑盒フアストトラツクmRNA分離試劑盒(インビトロジエン公司生產(chǎn))，按照附帶的使用說明書從生產(chǎn)小鼠的抗FGF-8中和抗體的雜交瘤KM1334(FERM BP-5451、特開平9-271391)的1×107細(xì)胞制備約8μg的mRNA。
(2)抗FGF-8中和鼠抗體的H鏈和L鏈cDNA文庫的制作使用タイムセ-バ-cDNA合成試劑盒(Amersha Biosciences公司生產(chǎn))，按照附帶的使用說明書由上述(1)中獲得的KM1334的mRNA 5μg合成兩端含有EcoRI-NotI接頭的cDNA。然后，使用λZAPII克隆試劑盒(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))，制作cDNA文庫。首先，將cDNA全量溶解于20μL的滅菌水后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，分別回收大約0.1μg的對應(yīng)于IgG類抗體的H鏈的約1.5kb的cDNA片段和對應(yīng)于κ類的L鏈的約1.0kb的cDNA片段。然后，按照附帶的使用說明書將約1.5kb的cDNA片段0.1μg以及約1.0kb的cDNA片段0.1μg和用限制性內(nèi)切酶RcoRI消化后經(jīng)小牛小腸由來的堿性磷酸酶對末端進(jìn)行脫磷酸化的λAPII載體1μg連接起來。
使用Gigapack II Packaging Extracts Gold(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))，按照附帶的使用說明書，將連接后的各個反應(yīng)液中的4μL包裝到λ噬菌體中，使適量的噬菌體感染大腸桿菌菌株XL1-Blue(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))，作為KM1334的H鏈cDNA文庫和L鏈cDNA文庫分別獲得約8.1×104個和5.5×104個的噬菌體克隆。接下來，按照常規(guī)方法(《分子克隆》，第3版)，將各個噬菌體固定于尼龍膜上。
(3)抗FGF-8中和小鼠抗體的H鏈和L鏈cDNA的克隆使用ECL直接核酸標(biāo)記檢測系統(tǒng)(ECL Direct Nucleic AcidLabelling and Detection Systems，Amershm Biosciences公司生產(chǎn))，按照附帶的使用說明書，以含有小鼠抗體的C區(qū)的cDNA[H鏈含有鼠Cγ1cDNA的DNA片段(French D.L.et al.，J/Immunol.，146，2010-2016，1991)，L鏈含有鼠CκcDNA的DNA片段(Hieter P.A.etal.，Cell，22，197-207，1980)]作為探針檢測上述(2)制作的KM1334的H鏈cDNA文庫和L鏈cDNA文庫的尼龍膜，獲得H鏈、L鏈各10個與探針密切結(jié)合的噬菌體克隆。接下來，按照λZAPII克隆試劑盒(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))的使用說明書，通過體內(nèi)切除(in vivo excision)將各個噬菌體克隆轉(zhuǎn)換為質(zhì)粒。使用Big Dye Terminator Kit Ver.2(0)和DNA測序儀決定上述得到的各個質(zhì)粒中含有的cDNA的堿基序列。結(jié)果，得到了含有存在推定cDNA的5’末端起始密碼子為ATG序列存在的全長的功能的H鏈cDNA的質(zhì)粒pKM1334H7-1和含有L鏈cDNA的質(zhì)粒pKM1334L7-1。
(4)抗FGF-8中和小鼠抗體的V區(qū)的氨基酸序列解析序列1表示質(zhì)粒pKM1334H7-1含有的VH的全堿基序列、序列2表示推定的全氨基酸序列、序列3表示質(zhì)粒pKM1334L7-1含有的VL的全堿基序列、序列4表示推定的全氨基酸序列。由與已知的小鼠抗體的序列資料(Sequence of Proteins of Immunological interest)的比較和與通過使用蛋白質(zhì)測序儀PPSQ-10(島津制作所制造)進(jìn)行自動Edman降解對純化的抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的H鏈和L鏈的N末端氨基酸序列解析的結(jié)果比較，分離的各個cDNA是編碼含有分泌信號序列的抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的全長cDNA，就H鏈來說，序列2表示的氨基酸序列的1至19，就L鏈來說，序列4表示的氨基酸序列的1至19是分泌信號序列。序列5和6分別表示除去分泌信號序列的VH和VL的氨基酸序列。
接下來，就抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的VH和VL的氨基酸序列是否為新的序列進(jìn)行研究。作為序列解析系統(tǒng)使用GCG數(shù)據(jù)庫[版本9.1、Genetics Computer Group公司制作]，通過BLAST(Altschul S.F.etal.，J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)對已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列數(shù)據(jù)[PIR-Protein(Release 56.0)]進(jìn)行檢索。結(jié)果，沒有看到與H鏈、L鏈完全一致的序列，確認(rèn)抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的VH和VL的氨基酸序列是新的氨基酸序列。
另外，通過與已知的抗體的氨基酸序列比較，對抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的VH和VL的氨基酸序列進(jìn)行了鑒定。序列7、8和9分別表示抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，序列10、11和12分別表示VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
2.抗FGF-8中和嵌合抗體用動物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)(1)含有編碼抗FGF-8中和嵌合抗體的VH的DNA的質(zhì)粒pKM1334CH-H5的構(gòu)建以參考例1的1.(3)得到的50ng的質(zhì)粒pKM1334H7-1為模板，以分別含有序列13、14所述的堿基序列的合成DNA[GENSET公司生產(chǎn)]作為引物，使他們的終濃度為0.3μmol/L，按照KOD Plus聚合酶(東洋紡織公司生產(chǎn))附帶的使用說明書，總量為50μL，首先在94℃加熱2分鐘后，于94℃15秒鐘、57℃30秒鐘、68℃1分鐘的條件下進(jìn)行30次循環(huán)的PCR。對該反應(yīng)液進(jìn)行純化后，溶解于滅菌水，用10單位的限制性內(nèi)切酶EcoRI(寶酒造公司生產(chǎn))，于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約0.3μg的約0.48kb的EcoRI片段(5’末端一側(cè)為EcoRI、3’末端一側(cè)為平末端)。
然后，使10單位的限制性內(nèi)切酶EcoRI和10單位的限制性內(nèi)切酶EcoRV(寶酒造公司生產(chǎn))于37℃下與3μg的質(zhì)粒pBluescript SK(-)反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約2μg的約2.95kb的EcoRI-EcoRV片段。
然后，將上述得到的編碼VH的DNA的EcoRI片段0.1μg和來自質(zhì)粒pBluescript SK(-)的EcoRI-EcoRV片段0.1μg加到總量10μl的滅菌水中，用Ligation High(東洋紡織公司生產(chǎn))進(jìn)行連接。用這樣得到的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue株，得到圖19給出的含有編碼抗FGF-8中和嵌合抗體的VH的DNA的質(zhì)粒pKM1334CH-H5。
(2)編碼抗FGF-8中和嵌合抗體的LH的DNA的質(zhì)粒的構(gòu)建以參考例1的1.(3)得到的50ng的質(zhì)粒pKM1334L7-1為模板，以分別含有序列15、16所述的堿基序列的合成DNA(ジエンセツト公司生產(chǎn))作為引物，使他們的終濃度為0.3μmol/L，按照KOD Plus聚合酶附帶的使用說明書，總量為50μL，首先在94℃加熱2分鐘后，于94℃15秒鐘、57℃30秒鐘、68℃1分鐘的條件下進(jìn)行30次循環(huán)的PCR。對該反應(yīng)液進(jìn)行純化后，溶解于滅菌水，用10單位的限制性內(nèi)切酶EcoRI于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約0.3μg的約0.45kb的EcoRI片段(5’末端一側(cè)為EcoRI、3’末端一側(cè)為平末端)。
然后，將上述得到的編碼VL的DNA的EcoRI片段0.1μg和來自質(zhì)粒pBluescript SK(-)的EcoRI-EcoRV片段0.1μg加到總量10μl的滅菌水中，用Ligation High進(jìn)行連接。用這樣得到重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue株，得到圖20給出的含有編碼抗FGF-8中和嵌合抗體的VL的DNA的質(zhì)粒pKM1334CH-L4。
(3)抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX1334的構(gòu)建用WO97/10354所述的人源化抗體表達(dá)用載體pKANTEX93和參考例1的2.(1)和(2)得到的質(zhì)粒pKM1334CH-H5和pKM1334CH-L4，象下述那樣構(gòu)建抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX1334。
向參考例1的2.(1)得到的3μg的質(zhì)粒pKM1334CH-H5中添加10單元的限制性內(nèi)切酶NotI[New England Biolabs公司生產(chǎn)]和10單元的限制性內(nèi)切酶ApaI(寶酒造公司生產(chǎn))，于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約0.2μg的約0.48kb的NotI-ApaI片段。
然后向3μg的人源化抗體表達(dá)用載體pKANTEX93中添加10單元的限制性內(nèi)切酶ApaI(寶酒造公司生產(chǎn))和10單元的限制性內(nèi)切酶NotI，于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約2μg的約12.8kb的ApaI-NotI片段。
接下來，將上述得到的來自質(zhì)粒pKM1334CH-H5的NotI-ApaI片段0.1μg和來自質(zhì)粒pKANTEX93的ApaI-NotI片段0.1μg加到總量10μl的滅菌水中，用Ligation High進(jìn)行連接。用這樣得到的重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue株，得到圖21所示的質(zhì)粒pKANTEX1334H。
向參考例1的2.(2)得到的3μg的質(zhì)粒pKM1334CH-L4中添加10單元的限制性內(nèi)切酶EcoRI和10單元的限制性內(nèi)切酶BsiWI(NewEngland Biolabs公司生產(chǎn))，于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約0.2μg的約0.45kb的EcoRI-BsiWI片段。
然后用10單元的限制性內(nèi)切酶EcoRI和限制性內(nèi)切酶BsiWI與上述得到的3μg的質(zhì)粒pKANTEX1334H于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約2μg的約13.30kb的EcoRI-BsiWI片段。
接下來，將上述得到的來自質(zhì)粒pKM1334CH-L4的EcoRI-BsiWI片段0.1μg和來自質(zhì)粒pKANTEX1334H的EcoRI-BsiWI片段0.1μg加到總量10μl的滅菌水中，用Ligation High進(jìn)行連接。用這樣得到重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue株，得到圖21所示的質(zhì)粒pKANTEX1334。
使用Big Dye Terminator Kit Ver.2和DNA測序儀，用得到的質(zhì)粒pKANTEX1334 400ng進(jìn)行堿基序列解析。結(jié)果確認(rèn)得到了目的DNA被克隆的質(zhì)粒。
(4)抗FGF-8中和嵌合抗體用CHO/DG44細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)用上述參考例1的2.(3)得到的抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX1334，象以下那樣進(jìn)行以DHFR基因缺損的CHO細(xì)胞CHO/DG44細(xì)胞(Urlaub G.and Chasin L.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4216-4220，1980)作為宿主的抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)。
將10μg的質(zhì)粒pKANTEX1334通過電穿孔法(Miyaji H.etal.，Cytotechnology，3，133-140，1990)導(dǎo)入到1.6×106細(xì)胞的CHO/GD44細(xì)胞后，懸浮于10～30mL的IMDM-1×HTsupplement-dFBS(10)[含有10％透析FBS(以下略為dFBS)和1×HTsupplement(インビトロジエン公司生產(chǎn))的IMDM培養(yǎng)基(インビトロジエン公司生產(chǎn))]，注入96孔微量培養(yǎng)板(旭テクノゲラス公司生產(chǎn))，每孔分注100μL。于5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃下培養(yǎng)24小時后，將培養(yǎng)液換成培養(yǎng)基IMDM-dFBS(10)[不含有HTsupplement，而含有10％dFBS的IMDM培養(yǎng)基]，再培養(yǎng)1～2周。從抗性菌落出現(xiàn)，且鋪滿的孔回收上清，通過下述的參考例1的2.(6)所示的ELISA測定上清中的抗FGF-8中和嵌合抗體的抗原結(jié)合活性。
對于確認(rèn)培養(yǎng)上清中抗FGF-8中和嵌合抗體的表達(dá)的孔的轉(zhuǎn)化體，再接種到24孔板中，目的是利用dhfr基因擴(kuò)增體系，使抗體表達(dá)量增加，用含有50nmol/L的作為dhfr的抑制劑的甲氨蝶呤(Sigma Aldrich公司生產(chǎn)，以下略為MTX)IMDM-dFBS(10)培養(yǎng)2周。再將MTX濃度提高到200nmol/L、500nmol/L，在各個階段各培養(yǎng)2周，誘導(dǎo)表現(xiàn)出500nmol/L MTX抗性的轉(zhuǎn)化株。在轉(zhuǎn)化株鋪滿孔時，通過參考例1的2.(6)所述的ELISA測定上清中的抗FGF-8中和嵌合抗體的抗原結(jié)合活性。最終，得到在含有500nmol/L MTX的IMDM-dFBS(10)的培養(yǎng)基中可增殖、而且高效表達(dá)抗FGF-8中和嵌合抗體的轉(zhuǎn)化株。對于得到的轉(zhuǎn)化株，通過限界稀釋法進(jìn)行單一細(xì)胞化(克隆)，將抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)最高的轉(zhuǎn)化細(xì)胞命名為KM3034。而KM3034于平成13年12月26日以FERM BP-7836保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地中央第6)。
(5)抗FGF-8中和嵌合抗體用YB2/0細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)用上述參考例1的2.(3)得到的抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)載體pKANTEX1334，象以下那樣進(jìn)行抗FGF-8中和嵌合抗體在大鼠雜交瘤YB2/0細(xì)胞(ATCC No.CRL-1662)的表達(dá)。
將10μg的質(zhì)粒pKANTEX1334通過電穿孔法導(dǎo)入4×106細(xì)胞的YB2/0細(xì)胞后，懸浮于40mL的雜交瘤-SFM-FBS(5)[含有5％FBS(PAA實(shí)驗(yàn)室公司生產(chǎn))的雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(インビトロジエン公司生產(chǎn))]，注入96孔培養(yǎng)板(住友ベ-クライト公司生產(chǎn))，每孔分注200μL。于5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃下培養(yǎng)24小時后，添加終濃度為1mg/mL的G418后，培養(yǎng)1～2周。從出現(xiàn)表現(xiàn)出G418抗性的轉(zhuǎn)化株的菌落，且鋪滿的孔回收培養(yǎng)上清，通過下述的參考例1的2.(6)所述的ELISA測定上清中的抗FGF-8中和嵌合抗體的抗原結(jié)合活性。
對于確認(rèn)培養(yǎng)上清中抗FGF-8中和嵌合抗體的表達(dá)的孔的轉(zhuǎn)化株，為了利用dhfr基因擴(kuò)增體系使抗體表達(dá)量增加，將上述轉(zhuǎn)化株懸浮于用含有1mg/mL的G418和50nmol/L MTX的雜交瘤-SFM-FBS(5)培養(yǎng)基中，使之變?yōu)?～2×105細(xì)胞/mL，分注于24孔培養(yǎng)板，每孔為1mL。于5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃下培養(yǎng)1～2周誘導(dǎo)表現(xiàn)出50nmol/L MTX抗性的轉(zhuǎn)化株。通過參考例1的2.(6)所述的ELISA測定確認(rèn)轉(zhuǎn)化株增殖的孔的培養(yǎng)上清中的抗FGF-8中和嵌合抗體的抗原結(jié)合活性。
對于確認(rèn)培養(yǎng)上清中的抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)的孔的轉(zhuǎn)化株，按照與上述同樣的方法，使MTX濃度上升，得到在含有終濃度為1mg/mL的G418、200nmol/L MTX的雜交瘤-SFM-FBS(5)培養(yǎng)基中可增殖、而且高效表達(dá)抗FGF-8中和嵌合抗體的轉(zhuǎn)化株5-D。對于得到的轉(zhuǎn)化株，通過限界稀釋法進(jìn)行單一細(xì)胞化(克隆)，得到抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)最高的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株。將抗FGF-8中和嵌合抗體表達(dá)最高的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株命名為KM3334。
(6)通過ELISA測定抗體對FGF-8部分肽的結(jié)合活性作為可與抗FGF-8抗體反應(yīng)的人FGF-8的部分肽，合成由與抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334(特開平9-271391)的抗原肽相同序列的序列17表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。序列17是在人FGF-8的氨基酸序列的23～46的序列的C末端附加了用于制作結(jié)合的半胱氨酸殘基的序列。以下，將該肽稱之為化合物1。為了用于ELISA，用以下的方法制作與牛血清清蛋白(ナカライテスク公司生產(chǎn)，以下略稱為BSA)的結(jié)合(以下稱之為BSA-化合物1)。即，在一邊攪拌下，一邊向含有10mg的BSA的PBS 900μL滴入100μL的25mg/mL SMCC[4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧基N-羥基琥珀酰亞胺酯，Sigma Aldrich公司生產(chǎn)]的DMSO溶液，緩慢攪拌30分鐘。將1mL反應(yīng)液載到用25mL的PBS平衡的凝膠過濾柱(NAP-10柱)，將用1.5mL的PBS洗脫的洗脫液作為BSA-SMCC溶液。各個級分的BSA濃度用280nm的吸光度進(jìn)行測定。然后向1.0mg的化合物1中加入200μL DMSO，再加入800μL PBS，使其完全溶解后，在攪拌下添加上述的BSA-SMCC溶液(BSA換算2.5mg)，于室溫下緩慢攪拌3小時。于4℃下將反應(yīng)液對PBS透析過夜，添加終濃度為0.05％的迭氮鈉后，將經(jīng)孔徑0.22μm膜過濾器過濾后的溶液作為BSA-化合物1溶液。
以0.5～1.0μg/ml的濃度向96孔的ELISA用板(ゲライナ-公司生產(chǎn))分注上述制備的BSA-化合物1溶液，每孔50μL，于4℃下放置過夜，使其吸附。用PBS洗凈后，加入含有1％BSA的PBS(以下稱之為BSA-PBS)，每孔100μL，于室溫下反應(yīng)1小時，封閉殘存的活性基團(tuán)。用含有0.05％Tween的PBS(以下稱之為Tween-PBS)洗凈各孔后，加入轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)上清或純化抗體，每孔50μl，于室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)后的各孔用Tween-PBS洗凈后，將用BSA-PBS稀釋到3000～6000倍的過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG(H&L)抗體溶液[American Qualex公司生產(chǎn)]作為二次抗體溶液，每孔加50μL，于室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)后的各個孔用Tween-PBS洗凈后，每孔加入50μL的ABTS底物溶液
，進(jìn)行發(fā)色反應(yīng)，5分鐘后，每孔加入50μL的5％SDS溶液，終止反應(yīng)。然后測定415nm的吸光度。
3.抗FGF-8中和嵌合抗體的純化(1)來自CHO/DG44細(xì)胞的表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)和抗體的純化將參考例1的2.(4)中得到的表達(dá)抗FGF-8中和嵌合抗體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株KM3034，使終濃度為1～2×105細(xì)胞/ml那樣懸浮于含有500nmol/LMTX的IMDM-dFBS(10)的培養(yǎng)基中，向175cm2燒瓶(ゲライナ-公司生產(chǎn))中各注入40mL。在5％CO2培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)5～7日，達(dá)到鋪滿時除去培養(yǎng)上清，用20mL的PBS洗凈細(xì)胞。除去PBS，加入40mL的EX-CELL 301培養(yǎng)基(JRH生物科學(xué)公司生產(chǎn))，在5％CO2培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)7～14日后，回收培養(yǎng)上清。用Prosep-A[Millipore公司生產(chǎn)]柱，按照附帶的說明書，從培養(yǎng)上清中純化抗FGF-8中和嵌合抗體。得到的抗FGF-8中和嵌合抗體取名為KM3034。
(2)來自YB2/0細(xì)胞的表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)和抗體的純化將參考例1的2.(5)中得到的表達(dá)抗FGF-8中和嵌合抗體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株KM3334，在175cm2燒瓶，用含有200nmol/L MTX和5％ダイゴGF21(和光純藥公司生產(chǎn))雜交瘤-SFM培養(yǎng)基，在5％CO2培養(yǎng)箱中于37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)8～10天后，從回收的培養(yǎng)上清用Prosep-A柱，按照附帶的說明書，純化抗FGF-8中和嵌合抗體。得到的抗FGF-8中和嵌合抗體取名為KM3334。
4.純化的抗FGF-8中和嵌合抗體的解析按照眾所周知的方法(Nature，227，680，1970)對在參考例1的3.中得到的通過各種動物細(xì)胞表達(dá)、純化的2種抗FGF-8中和嵌合抗體KM3034和KM3334各4μg進(jìn)行電泳，對分子量和純度進(jìn)行解析。確認(rèn)純化的各個抗FGF-8中和嵌合抗體無論哪一種在非還原條件下分子量都是約150Kd的單一的帶，而在還原條件下存在約50Kd和約25Kd的2條帶。這些分子量幾乎與由抗體的H鏈和L鏈的cDNA的堿基序列推定的分子量(H鏈約49Kd，L鏈約23Kd，分子全體約144Kd)一致，另外，IgG型抗體與在非還原條件下分子量約150Kd，在還原條件下分子內(nèi)的S-S鍵被切斷，分解為分子量約為50Kd的H鏈和約25Kd的L鏈的報道(AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Chapter 14，1988；Monoclonal AntibodiesPrinciples andpractice Academic Press Limited，1996)一致，由此確認(rèn)抗FGF-8中和嵌合抗體是以正確的結(jié)構(gòu)的抗體分子表達(dá)的，而且被純化的。
5.純化的抗FGF-8中和嵌合抗體的中和活性評價純化的抗FGF-8中和嵌合抗體的中和活性的評價通過以下所示的小鼠乳腺癌細(xì)胞株SC-3的FGF-8依賴性增殖的抑制效果(TanakaA.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，8928-8932，1992)測定。即，向含有2％濃度的經(jīng)活性炭處理的FBS的DMEMHam’s F12(1∶1)培養(yǎng)基[DMEM培養(yǎng)基和Ham’s F12培養(yǎng)基，(インビトロジエン公司生產(chǎn))以1∶1混合的培養(yǎng)基]以3.0×104細(xì)胞/mL的濃度懸浮SC-3細(xì)胞，以每孔150μL(4.5×103細(xì)胞)接種到96孔板。在5％CO2培養(yǎng)箱中于37℃下18小時后，用每孔100μL的試驗(yàn)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基交換。試驗(yàn)培養(yǎng)基通過將50ng/mL的FGF-8(R&D公司生產(chǎn))和各種稀釋濃度的抗FGF-8中和嵌合抗體溶解于含有0.1％BSA的DMEMHam’s F12(1∶1)培養(yǎng)基制作。而作為陰性對照的抗體使用WO01/64754報道的針對人趨化因子CCR4的嵌合抗體KM2760。在5％CO2培養(yǎng)箱中于37℃下48小時后，換成新配制的試驗(yàn)培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48小時。每孔添加10μL的WST-1試劑(ロシユ公司生產(chǎn))，輕輕攪拌后，在5％CO2培養(yǎng)箱中于37℃下1小時，然后測定吸光度(OD450/650)。圖22中橫軸表示添加的抗體濃度、縱軸表示相對于只添加50ng/mL的FGF-8時增殖的相對增殖(％)。相對于只添加50ng/mL的FGF-8時增殖的相對增殖(％)通過下面式子算出。
(式)相對于添加FGF-8時增殖的相對增殖(％)＝{(添加FGF-8和抗體時的吸光度-未添加FGF-8和抗體時的吸光度)/(只添加FGF-8時的吸光度-未添加FGF-8和抗體時的吸光度)}×100就象圖22所示的那樣，抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334、抗FGF-8中和嵌合抗體KM3034和KM3334無論哪一個都表現(xiàn)出同等的SC-3細(xì)胞增殖抑制活性，沒有看到嵌合抗體化引起中和活性的降低。
參考例2抗FGF-8中和CDR移植抗體的制作1.編碼抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH和VL的DNA的構(gòu)建(1)抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH和VL的氨基酸序列的設(shè)計首先象以下那樣設(shè)計抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH和VL的氨基酸序列。選擇用于移植參考例1的1項(xiàng)(4)中鑒定的抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的VH的CDR的氨基酸序列的人抗體的VH的FR的氨基酸序列。カバツト等人報道了從氨基酸序列的同源性將已知的各種各樣的人抗體的VH分為3種亞類(HSG I～I(xiàn)I)，以及對于每個亞類的共通序列(Sequences of Proteins of Immunological interest)。由于認(rèn)為這些共有序列對于人免疫原性有降低的可能性，所以以這些共有的序列作為基礎(chǔ)，設(shè)計了抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH的氨基酸序列。為了制作活性更高的抗FGF-8中和CDR移植抗體，在設(shè)計時，在人抗體的VH的3種亞類的共有序列的FR的氨基酸序列中，選擇與KM1334的VH的FR的氨基酸序列具有最高的同源性的FR的氨基酸序列。在第4表中，給出了同源性檢索的結(jié)果。就象第4表所示那樣，KM1334的VH的FR的氨基酸序列具有與亞類1最高的同源性。
第4表人抗體的VH的各個亞類的共通序列的FR的氨基酸序列和KM1334的VH的FR的氨基酸序列的同源性HSG I HSG IIHSG III79.3％ 51.7％ 59.8％根據(jù)以上結(jié)果，將KM1334的VH的CDR的氨基酸序列移植到人抗體的VH的亞類I的共有序列的FR的氨基酸序列的適當(dāng)位置，設(shè)計了序列18給出的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH的氨基酸序列HV.0。
然后象以下那樣設(shè)計抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL的氨基酸序列。選擇用于移植參考例1的1.(4)中鑒定的抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的VL的CDR的氨基酸序列的人抗體的VL的FR的氨基酸序列。カバツト等人報道了從氨基酸序列的同源性將已知的各種各樣的人抗體的VL分為4種亞類(HSG I～I(xiàn)V)，以及對于每個亞類的共有序列(Sequences of Proteins of Immunological interest)。與VH的情形一樣，在人抗體的VL的4種亞類的共通序列的FR的氨基酸序列中，選擇與KM1334的VL的FR的氨基酸序列具有最高的同源性的FR的氨基酸序列。
在第5表中，給出了同源性檢索的結(jié)果。就象第5表所示那樣，KM1334的VL的FR的氨基酸序列具有與亞類II最高的同源性。
第5表人抗體的VL的各個亞類的共通序列的FR的氨基酸序列和KM1334的VL的FR的氨基酸序列的同源性HSG I HSG II HSG III HSG IV66.3％83.8％66.2％ 73.8％
根據(jù)以上結(jié)果，將KM1334的VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗體的VH的亞類II的共有序列的FR的氨基酸序列的適當(dāng)位置，設(shè)計了序列19給出的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL的氨基酸序列LV.0。
上述設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH的氨基酸序列HV.0和VL的氨基酸序列LV.0只是將抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的CDR的氨基酸序列移植到選擇的人抗體的FR的氨基酸序列的序列。在多數(shù)場合下，就人型CDR移植抗體來說，只是通過小鼠抗體的CDR的氨基酸序列的移植，結(jié)合活性就已經(jīng)降低了。為了避免這一現(xiàn)象，比較人抗體和鼠抗體的FR的氨基酸序列，在不同的FR的氨基酸殘基中，可以將認(rèn)為對結(jié)合活性有影響的氨基酸殘基與CDR的氨基酸序列一起進(jìn)行移植。因此在本參考例中，也研究了認(rèn)為對結(jié)合活性有影響的FR的氨基酸殘基的鑒定。
首先，利用計算機(jī)模擬手法構(gòu)建了由上述設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH的氨基酸序列HV.0和VL的氨基酸序列LV.0構(gòu)成的抗體V區(qū)(HVOLVO)的三維結(jié)構(gòu)。關(guān)于三維結(jié)構(gòu)座標(biāo)制作使用softwareAbM[Oxford Molecular公司生產(chǎn)]，關(guān)于三維結(jié)構(gòu)的表示使用軟件Pro-Explore(Oxford Molecular公司生產(chǎn))或RasMol[Glaxo公司生產(chǎn)]，分別按照附帶的使用說明書進(jìn)行。而抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的V區(qū)的三維結(jié)構(gòu)的計算機(jī)模型也同樣構(gòu)建。另外，在HVOLVO的VH和VL的FR的氨基酸序列中，就與抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334不同的氨基酸殘基，由為依次改變?yōu)樵诳笷GF-8中和小鼠抗體KM1334的相當(dāng)位置看到的氨基酸殘基的氨基酸序列構(gòu)成的改變體的V區(qū)三維結(jié)構(gòu)模型也同樣構(gòu)建，對抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334、HVOLVO以及改變體的V區(qū)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。結(jié)果，在HVOLVO的FR的氨基酸殘基中，作為認(rèn)為使抗原結(jié)合部位的三維結(jié)構(gòu)變化、對抗體活性有影響的殘基，在HV.0中選擇12位的Lys、13位的Lys、40位的Ala、41位的Pro、48位的Met、68位的Val、70位的Ile、74位的Thr、76位的Thr、82位的Glu、87位的Arg、95位的Tyr，在LV.0中選擇2位的Ile、3位的Val、14位的Thr、15位的Pro、50位的Gln、51位的Leu、92位的Tyr，進(jìn)行氨基酸改變。在這些選擇的氨基酸殘基中，至少有一個以上改變?yōu)樾∈罂贵wKM1334中出現(xiàn)的氨基酸殘基，象以下那樣設(shè)計具有各種各樣改變的人型CDR移植抗體的VH和VL。
具體來說，作為VH，設(shè)計了將序列12位的Lys、13位的Lys、40位的Ala、41位的Pro、48位的Met、95位的Tyr 6個殘基分別改變?yōu)槭罂贵wKM1334中出現(xiàn)的氨基酸殘基Ala、Arg、Arg、Ser、Ile、Phe的序列20給出的氨基酸序列HV.6。作為VL，設(shè)計了將序列2位的Ile、14位的Thr、15位的Pro、50位的Gln、51位的Leu、92位的Tyr 6個殘基分別改變?yōu)槭罂贵wKM1334中出現(xiàn)的氨基酸殘基Val、Ser、Leu、Lys、Val、Phe的序列21給出的氨基酸序列LV.6。
(2)編碼抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH的DNA的構(gòu)建利用PCR，象以下那樣構(gòu)建編碼參考例2的1項(xiàng)(1)設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH氨基酸序列HV.0的DNA。
首先，將抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的H鏈的分泌信號序列(序列2的1～19位的氨基酸序列)與設(shè)計的氨基酸序列相連。然后將得到的氨基酸序列轉(zhuǎn)換為遺傳密碼子。當(dāng)對一個氨基酸存在多個遺傳密碼子時，考慮抗體的基因的堿基序列中出現(xiàn)的使用頻率(Sequences ofProteins of Immunological interest)，決定對應(yīng)的遺傳密碼子。連接決定的遺傳密碼子，設(shè)計編碼完全抗體V區(qū)的氨基酸序列的DNA的堿基序列。在該堿基序列的5’端和3’端付加含有用于對人源化抗體表達(dá)用載體克隆的限制性內(nèi)切酶識別序列，另外在5’末端付加M13引物RV(寶酒造公司生產(chǎn))的序列、3’末端付加與M13引物M4(寶酒造公司生產(chǎn))序列互補(bǔ)的序列。將設(shè)計的堿基序列(序列22)從5’末端一側(cè)開始每141個堿基，末端20個堿基重復(fù)那樣分成4段，化學(xué)合成相當(dāng)于各個序列的有意義鏈、反意義鏈、有意義鏈、反意義鏈的序列23～26所示序列構(gòu)成的4條DNA(GENSET公司生產(chǎn))。
按照KOD聚合酶附帶的使用說明書，用0.1μmol/L的各個合成DNA、0.5μmol/L的M13引物RV、0.5μmol/L的M13引物M4以及2.5單位的KOD聚合酶(東洋紡織公司生產(chǎn))，配制總量50μL的PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件為在94℃加熱5分鐘后，進(jìn)行每一循環(huán)為94℃30秒鐘、50℃30秒鐘、74℃60秒鐘的30次循環(huán)，再于74℃加熱5分鐘。將該反應(yīng)液進(jìn)行乙醇沉淀后，溶解于滅菌水中，用10單位的限制性內(nèi)切酶EcoRI和10單位的限制性內(nèi)切酶SpeI(寶酒造公司生產(chǎn))，于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約0.3μg的約0.47kb的EcoRI-SpeI片段。
然后使10單位的限制性內(nèi)切酶EcoRI和10單位的限制性內(nèi)切酶SpeI與3μg的質(zhì)粒pBluescript II SK(-)(ストラタジ-ン公司生產(chǎn))于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約2.9μg的約2.95kb的EcoRI-SpeI片段。
然后，將上述得到的編碼抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH的PCR產(chǎn)物的EcoRI-SpeI片段0.1μg和質(zhì)粒pBluescript SK(-)的EcoRI-SpeI片段0.1μg加到總量10μl的滅菌水中，用ligation high進(jìn)行連接。用這樣得到重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司生產(chǎn))，從轉(zhuǎn)化株的10個克隆制備各個質(zhì)粒DNA，利用Big Dye Terminator KitVer.2和DNA測序儀進(jìn)行堿基序列解析。堿基序列解析的結(jié)果，得到了圖23給出的含有目的堿基序列的質(zhì)粒pKM1334HVO。
與上述編碼HV.0的DNA同樣設(shè)計(序列27)，用由序列28～31所示序列構(gòu)成的4條合成DNA(GENSET公司生產(chǎn))，與上述同樣通過PCR進(jìn)行構(gòu)建編碼在參考例2的1.(1)設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH的氨基酸序列HV.6的DNA。采取與pKM1334HVO同樣的過程，得到含有編碼HV.6的DNA的質(zhì)粒pKM1334HV6。
(3)編碼抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL的DNA的構(gòu)建與編碼HV.0的DNA同樣設(shè)計編碼參考例2的1項(xiàng)(1)設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL氨基酸序列LV.0的DNA(序列32)。但合成DNA的設(shè)計時，作為分泌信號序列，使用抗FGF-8中和小鼠抗體KM1334的L鏈的分泌信號序列(序列4的1～19位的氨基酸序列)。與編碼HV.0的DNA同樣，通過使用分別由序列33至36的序列構(gòu)成的4條合成DNA(GENSET公司生產(chǎn))的PCR，構(gòu)建編碼LV.0的DNA。采取與pKM1334HVO同樣的過程，得到含有編碼LV.6的DNA的質(zhì)粒pKM1334LV0。
另外，與編碼LV.0的DNA同樣設(shè)計編碼參考例2的1項(xiàng)(1)設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL的氨基酸序列LV.6的DNA(序列37)，用分別由序列38至41的序列構(gòu)成的4條合成DNA(GENSET公司生產(chǎn))，象上述那樣通過PCR構(gòu)建。采取與pKM1334HVO同樣的過程，得到含有編碼LV.6的DNA的質(zhì)粒pKM1334LV6。
2.抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體的構(gòu)建用WO97/10354所述的人源化抗體表達(dá)用載體pKANTEX93和參考例2的1.(2)和(3)得到的質(zhì)粒pKM1334HVO和pKM1334LV0，象下述那樣構(gòu)建抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體pKANTEX1334HVOLVO。
向參考例2的1.(2)得到的3μg的質(zhì)粒pKM1334HVO中添加10單元的限制性內(nèi)切酶ApaI和10單元的限制性內(nèi)切酶NotI(寶酒造公司生產(chǎn))，于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約0.3μg的約0.47kb的ApaI-NotI片段。
然后向3μg的人源化抗體表達(dá)用載體pKANTEX93中添加10單元的限制性內(nèi)切酶ApaI(寶酒造公司生產(chǎn))和10單元的限制性內(nèi)切酶NotI，于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約2μg的約12.8kb的ApaI-NotI片段。
接下來，將上述得到的來自質(zhì)粒pKM1334HVO的NotI-ApaI片段0.1μg和來自質(zhì)粒pKANTEX93的NotI-ApaI片段0.1μg加到總量10μl的滅菌水中，用ligation high進(jìn)行連接。用這樣得到重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，得到圖24所示的pKANTEX1334HVO。
然后，向參考例2的1.(3)得到的3μg的質(zhì)粒pKM1334LVO中添加10單元的限制性內(nèi)切酶EcoRI和10單元的限制性內(nèi)切酶BsiWI，于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約0.3μg的約0.45kb的EcoRI-BsiWI片段。
然后用10單元的限制性內(nèi)切酶EcoRI和10單元的限制性內(nèi)切酶BsiWI與上述得到的3μg的質(zhì)粒pKANTEX1334HVO于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約2μg的約13.30kb的EcoRI-BsiWI片段。
接下來，將上述得到的來自質(zhì)粒pKM1334LVO的EcoRI-BsiWI片段0.1μg和來自質(zhì)粒pKANTEX1334HVO的EcoRI-BsiWI片段0.1μg加到總量10μl的滅菌水中，用ligation high進(jìn)行連接。用這樣得到重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，得到圖24所示的pKANTEX1334HVOLVO。
使用Big Dye Terminator Kit Ver.2和DNA測序儀，用得到的質(zhì)粒400ng進(jìn)行堿基序列解析。結(jié)果確認(rèn)得到了目的DNA被克隆的質(zhì)粒。
另外，用上述參考例2的1.(2)得到的質(zhì)粒pKM1334HVO和參考例2的1.(3)得到的質(zhì)粒pKM1334LV6，用與上述同樣的方法構(gòu)建表達(dá)載體pKANTEX1334HVOLV6。
另外，用上述參考例2的1.(2)得到的質(zhì)粒pKM1334HV6和參考例2的1.(3)得到的質(zhì)粒pKM1334LV6，用與上述同樣的方法構(gòu)建表達(dá)載體pKANTEX1334HV6LV6。
3.抗FGF-8中和CDR移植抗體用YB2/0細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)分別用上述參考例2的2.得到的抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體pKANTEX1334HVOLVO、pKANTEX1334HVOLV6、pKANTEX1334HV6LV6，按照上述參考例1的2.(5)所述的方法通過YB2/0細(xì)胞進(jìn)行抗FGF-8中和CDR移植抗體的穩(wěn)定表達(dá)。
4.抗FGF-8中和CDR移植抗體的純化按照上述參考例1的3.(2)所述的方法，從參考例2的3.中得到的來自表達(dá)各種抗FGF-8中和CDR移植抗體的YB2/0的轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)和上清純化抗FGF-8中和CDR移植抗體。將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLVO的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLVO，將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLV6的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLV6，將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HV6LV6轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HV6LV6。
5.純化的抗FGF-8中和CDR移植抗體的解析按照上述參考例1的4.所述的方法，對在參考例2的4.得到的各種抗FGF-8中和CDR移植抗體進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果確認(rèn)無論哪一種抗體都是以正確結(jié)構(gòu)的抗體分子表達(dá)的，而且被純化了。
6.通過ELISA進(jìn)行抗FGF-8中和CDR移植抗體對FGF-8的結(jié)合活性的測定在參考例2的4.得到的各種抗FGF-8中和CDR移植抗體對FGF-8的結(jié)合活性通過上述參考例1的2.(6)所述的ELISA測定。作為陽性對照使用來自參考例1的3.(2)得到的YB2/0細(xì)胞的抗FGF-8中和嵌合抗體KM1334。結(jié)果如圖25所示。就象圖25所示的那樣，無論哪一種抗FGF-8中和嵌合抗體都表現(xiàn)出與KM3334同等的FGF-8結(jié)合活性，沒有看到由于CDR移植引起的明顯的結(jié)合活性的下降。
7.抗FGF-8中和CDR移植抗體對FGF-8的結(jié)合活性的測定為了對在參考例2的4.得到的各種抗FGF-8中和CDR移植抗體對FGF-8的結(jié)合活性進(jìn)行更詳細(xì)地研究，利用BIAcore 2000[BIACORE公司生產(chǎn)]，象以下那樣對各種抗FGF-8中和CDR移植抗體對FGF-8的結(jié)合活性進(jìn)行測定、比較。作為陽性對照使用來自參考例1的3.(2)得到的YB2/0細(xì)胞的抗FGF-8中和嵌合抗體KM1334。
以下作為樣品的稀釋和測定中的緩沖液使用HBS-EP(BIACORE公司生產(chǎn))。首先，組裝傳感器片CM5(BIACORE公司生產(chǎn))，通過胺偶合法將用10mmol/L乙酸緩沖液(pH4.0)溶解的31.25μg/mL的FGF-8(R&D公司生產(chǎn))固定于傳感器片表面。以共振信號(RU)為指標(biāo)的固定化量是4498RU。
向FGF-8固定化流動池中以20μL/分的流速，添加60μL的各種抗體溶液，然后，過3分鐘后監(jiān)測解離反應(yīng)。解離反應(yīng)后，連續(xù)2次向流動池中添加20μL的10mmol/L甘氨酸-鹽酸溶液(pH1.5)，使片表面再生。就各種濃度(50-0.068μg/mL)的抗體溶液進(jìn)行該循環(huán)，得到各種濃度下的傳感曲線。各個抗體的傳感曲線是通過扣除作為陰性對照使用針對GD3的嵌合抗體KM871(Shitara K.et al.，CancerImmunol.Immunother.，36，373-380，1993)得到的傳感曲線作為特異的反應(yīng)的傳感曲線。圖25表示50μg/mL的各種抗體的傳感曲線。就象傳感曲線所表明的那樣，無論哪一種抗體在解離反應(yīng)中幾乎看不到解離，求正確的解離速度常數(shù)是困難的。在此，各種抗體的結(jié)合活性的比較是通過比較結(jié)合反應(yīng)時的結(jié)合[共振信號(RU)]的強(qiáng)弱進(jìn)行的。結(jié)果如圖26所示，嵌合抗體KM3334表現(xiàn)出最高的結(jié)合反應(yīng)，CDR移植抗體HVOLV6也表現(xiàn)出與KM3334同等高的結(jié)合反應(yīng)。另外，CDR移植抗體HVOLVO和CDR移植抗體HV6LV6與KM3334和HVOLV6比較，表現(xiàn)出低一些的結(jié)合反應(yīng)。以上結(jié)果表明用ELISA沒有確認(rèn)的抗體間的結(jié)合活性的比較可以通過BIAcore 2000進(jìn)行，而且通過VL的FR的6氨基酸殘基的改變，CDR移植抗體的結(jié)合活性恢復(fù)到與嵌合抗體同等水平。而有關(guān)VH的FR的6氨基酸殘基沒有看到對應(yīng)于結(jié)合活性恢復(fù)的效果。
將來自表現(xiàn)出與嵌合抗體KM3334同等高的結(jié)合反應(yīng)的YB2/0細(xì)胞的CDR移植抗體HVOLV6命名為KM8037，來自高表達(dá)KM8037的YB2/0細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株也同樣命名為KM8037。轉(zhuǎn)化細(xì)胞株KM8037于平成14年6月20日以FERM BP-8084保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地中央第6)。
參考例3免疫原性更低的抗FGF-8中和CDR移植抗體的制作(1)參考例2的結(jié)果清楚表明VL的FR含有來自小鼠抗體KM1334的6氨基酸殘基的改變的抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLV6表現(xiàn)出與嵌合抗體同等的結(jié)合活性。在此，進(jìn)一步對6殘基的活性恢復(fù)的效果進(jìn)行研究，象以下那樣進(jìn)行期待具有充分活性，而且來自小鼠抗體的氨基酸殘基少，免疫原性更低的抗FGF-8中和CDR移植抗體的制作。
1.VL的氨基酸材料的設(shè)計就上述6氨基酸殘基設(shè)計具有以下那樣改變的6種VL氨基酸序列。無論哪一種都表現(xiàn)出來自LV.0的氨基酸殘基的改變。
在LV.4-1中，將2位的Ile、50位的Gln、51位的Leu、92位的Tyr 4個殘基分別改變?yōu)槭罂贵wKM1334中出現(xiàn)的氨基酸殘基Val、Lys、Val、Phe。
在LV.4-2中，將序列2位的Ile、14位的Thr、15位的Pro、92位的Tyr 4個殘基分別改變?yōu)樾∈罂贵wKM1334中出現(xiàn)的氨基酸殘基Val、Ser、Leu、Phe。
在LV.3-1中，將2位的Ile、51位的Leu、92位的Tyr 3個殘基分別改變?yōu)樾∈罂贵wKM1334中出現(xiàn)的氨基酸殘基Val、Val、Phe。
在LV.3-2中，將14位的Thr、15位的Pro、92位的Tyr 3個殘基分別改變?yōu)樾∈罂贵wKM1334中出現(xiàn)的氨基酸殘基Ser、Leu、Phe。
在LV.2-1中，將51位的Leu、92位的Tyr 2個殘基分別改變?yōu)樾∈罂贵wKM1334中出現(xiàn)的氨基酸殘基Val、Phe。
在LV.2-2中，將2位的Ile、92位的Tyr 2個殘基分別改變?yōu)樾∈罂贵wKM1334中出現(xiàn)的氨基酸殘基Val、Phe。
序列42～47分別表示LV.4-1、LV.4-2、LV.3-1、LV.3-2、LV.2-1、LV.2-2的氨基酸序列。
2.編碼VL的DNA的構(gòu)建象以下那樣構(gòu)建編碼參考例3的1.設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的各種VL的氨基酸序列DNA。
(1)編碼LV.4-1的DNA的構(gòu)建編碼LV.4-1的DNA用由序列38、34、40、41的序列構(gòu)成的4條合成DNA(GENSET公司生產(chǎn))，按照參考例2的1.(3)所述方法進(jìn)行構(gòu)建。結(jié)果得到了含有編碼LV.4-1的DNA的質(zhì)粒pKM1334LV4-1。
(2)編碼LV.3-1的DNA的構(gòu)建以參考例2的1.(3)得到的質(zhì)粒pKM1334LV6 50ng為模板，以由M13引物RV和由序列48的堿基序列構(gòu)成的合成DNA(GENSET公司生產(chǎn))作為引物，終濃度為0.3μmol/L，按照KOD聚合酶附帶的使用說明書，總量50μL，首先在94℃加熱2分鐘后，進(jìn)行每一循環(huán)為94℃15秒鐘、50℃30秒鐘、68℃1分鐘秒鐘的35次循環(huán)的PCR。將該反應(yīng)液進(jìn)行純化后，溶解于滅菌水中，用10單位的限制性內(nèi)切酶KpnI(寶酒造公司生產(chǎn))和10單位的限制性內(nèi)切酶SpeI，于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約0.3μg的約0.22kb的KpnI-SpeI片段。
然后使10單位的限制性內(nèi)切酶KpnI與參考例3的2.(1)得到3μg的質(zhì)粒pKM1334LV4-1于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約0.2μg的約0.21kb的KpnI片段。
然后使10單位的限制性內(nèi)切酶KpnI和10單位的限制性內(nèi)切酶SpeI與3μg的質(zhì)粒pBluescript II SK(-)于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約2μg的約2.95kb的KpnI-SpeI片段。
然后，將上述得到的VL DNA的KpnI-SpeI片段0.1μg和來自質(zhì)粒pKM1334LV4-1的KpnI片段0.1μg，以及來自質(zhì)粒pBluescript SK(-)的KpnI-SpeI片段0.1μg加到總量10μl的滅菌水中，用Ligation high進(jìn)行連接。用這樣得到重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，得到了圖27給出的含有編碼LV.3-1的DNA的質(zhì)粒pKM1334LV3-1。
(3)編碼LV.2-1的DNA的構(gòu)建除了使用參考例2的1.(3)得到的質(zhì)粒pKM1334LVO代替質(zhì)粒pKM1334LV4-1以外，利用與參考例3的2.(1)所述方法同樣的方法得到含有編碼LV.2-1的DNA的質(zhì)粒pKM1334LV2-1。
(4)編碼LV.2-2的DNA的構(gòu)建除了作為引物用序列49的合成DNA代替序列48的合成DNA以外，利用與參考例3的2.(1)所述方法同樣的方法得到含有編碼LV.2-2的DNA的質(zhì)粒pKM1334LV2-2。
(5)編碼LV.4-2的DNA的構(gòu)建使10單位的限制性內(nèi)切酶KpnI與參考例參考例3的2.(4)得到的3μg質(zhì)粒pKM1334LV2-2于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約2μg的約3.16kb的KpnI片段。
然后使10單位的限制性內(nèi)切酶KpnI與參考例2的1.(3)得到的3μg質(zhì)粒pKM1334LV6于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約0.2μg的約0.21kb的KpnI片段。
將上述得到的來自質(zhì)粒pKM1334LV2-2的KpnI片段0.1μg和來自質(zhì)粒pKM1334LV6的KpnI片段0.1μg加到總量10μl的滅菌水中，用Ligationhigh進(jìn)行連接。用這樣得到重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，得到了圖28給出的含有編碼LV.4-2的DNA的質(zhì)粒pKM1334LV4-2。
(6)編碼LV.3-2的DNA的構(gòu)建使10單位的限制性內(nèi)切酶Tth111I(寶酒造公司生產(chǎn))和Xmn I(NewEngland Biolabs公司生產(chǎn))與參考例3的2.(5)得到的3μg質(zhì)粒pKM1334LV4-2于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約2μg的約2.24kb的Tth111I-Xmn I片段。
然后使10單位的限制性內(nèi)切酶Tth111I和Xmn I與參考例參考例2的1.(3)得到的3μg質(zhì)粒pKM1334LVO于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約1μg的約1.11kb的Tth111I-XmnI片段。
然后，將上述得到的來自質(zhì)粒pKM1334LV4-2的Tth111I-Xmn I片段0.1μg和來自質(zhì)粒pKM1334LVO的Tth111I-Xmn I片段0.1μg加到總量10μl的滅菌水中，用Ligation high進(jìn)行連接。用這樣得到重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，得到了圖29給出的含有編碼LV.3-2的DNA的質(zhì)粒pKM1334LV3-2。
3.抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體的構(gòu)建通過用含有在參考例3的2.構(gòu)建的編碼各種VL的DNA的EcoRI-BsiWI片段置換參考例2的2.得到的含有編碼表達(dá)載體pKANTEX1334HVOLV6的DNA的EcoRI-BsiWI片段，構(gòu)建含有編碼各種VL的抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體。具體來說構(gòu)建pKANTEX1334HVOLV4-1、pKANTEX1334HVOLV4-2、pKANTEX1334HVOLV3-1、pKANTEX1334HVOLV3-2、pKANTEX1334HVOLV2-1、pKANTEX1334HVOLV2-26種。
4.抗FGF-8中和CDR移植抗體用CHO/DG44細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)分別用上述參考例2的2.得到的抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體pKANTEX1334HVOLVO、pKANTEX1334HVOLV6和參考例3的3.得到的各種抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)用載體，按照上述參考例1的2.(4)所述的方法進(jìn)行FGF-8中和CDR移植抗體在CHO/DG44細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)。
5.抗FGF-8中和CDR移植抗體的純化按照上述參考例1的3.(1)所述的方法，從參考例3的4.中得到的來自表達(dá)各種抗FGF-8中和CDR移植抗體的CHO/DG4細(xì)胞的轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)和上清純化抗FGF-8中和CDR移植抗體。
將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLVO的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLVO/CHO，將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLV6的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLV6/CHO，將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLV4-1的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLV4-1/CHO，將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLV4-2的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLV4-2/CHO，將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLV3-1的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLV3-1/CHO，將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLV3-2的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLV3-2/CHO，將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLV2-1的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLV2-1/CHO，將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLV2-2的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLV2-2/CHO。
6.純化的抗FGF-8中和CDR移植抗體的解析按照上述參考例1的4.所述的方法，對在參考例3的5.得到的各種抗FGF-8中和CDR移植抗體進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果確認(rèn)無論哪一種抗體都是以正確結(jié)構(gòu)的抗體分子表達(dá)的，而且被純化了。
7.利用BIAcore生物傳感器對抗FGF-8中和CDR移植抗體對FGF-8的結(jié)合活進(jìn)行測定為了對在參考例3的5.得到的各種抗FGF-8中和CDR移植抗體對FGF-8的結(jié)合活性進(jìn)行更詳細(xì)地研究，利用BIAcore 2000，用對FGF-8的部分肽化合物1的C末端進(jìn)行生物素標(biāo)記的標(biāo)記化合物，象以下那樣對各種抗FGF-8中和CDR移植抗體對FGF-8的結(jié)合活性進(jìn)行測定、比較。作為陽性對照使用來自參考例1的3.(1)得到的CHO/DG44細(xì)胞的抗FGF-8中和嵌合抗體KM3034。
以下作為樣品的稀釋和測定中的緩沖液使用HBS-EP。首先，組裝傳感器片SA(BIACORE公司生產(chǎn))，以5μL/min的流速添加5μL的制備成0.05μg/mL的C末端標(biāo)記生物素的標(biāo)記化合物1，然后，連續(xù)2次添加5μL的10mmol/L甘氨酸-鹽酸溶液(pH1.5)，將片洗凈。FGF-8肽的固定化量是35RU。
以20μL/分的流速，向FGF-8固定化流動池中添加60μL的各種抗體溶液，然后，過3分鐘后監(jiān)測解離反應(yīng)。解離反應(yīng)后，連續(xù)2次向流動池中添加20μL的10mmol/L甘氨酸-鹽酸溶液(pH1.5)，使片表面再生。就各種濃度(50-1.85μg/mL)的抗體溶液進(jìn)行該循環(huán)，得到各種濃度下的傳感曲線。各個抗體的傳感曲線是通過扣除作為陰性對照使用針對GD3的嵌合抗體KM871得到的傳感曲線作為特異的反應(yīng)的傳感曲線。
圖30表示16.7μg/mL的各種抗體的傳感曲線。就象傳感曲線所表明的那樣，無論哪一種抗體在解離反應(yīng)時幾乎看不到解離，求正確的解離速度常數(shù)是困難的。在此，各種抗體的結(jié)合活性的比較是通過比較結(jié)合反應(yīng)時的結(jié)合[共振信號(RU)]的強(qiáng)弱進(jìn)行的。
結(jié)果如圖30所示，嵌合抗體KM3034和HVOLV6/CHO表現(xiàn)出最高的結(jié)合反應(yīng)，其次，HVOLV3-1/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV2-1/CHO也表現(xiàn)出高的結(jié)合反應(yīng)。而HVOLV3-2/CHO、HVOLV2-2/CHO、HVOLV4-2/CHO表現(xiàn)出低的結(jié)合反應(yīng)，HVOLVO/CHO表現(xiàn)出最低的結(jié)合反應(yīng)。這些結(jié)果與用參考例2的7.所述的來自YB2/0細(xì)胞的CDR移植抗體的結(jié)果一致。
8.抗FGF-8中和CDR移植抗體對FGF-8的中和活性的測定按照參考例2的5項(xiàng)所述的方法對在參考例3的7項(xiàng)中對FGF-8有高的結(jié)合反應(yīng)的4種抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLV6/CHO、HVOLV3-1/CHO、HVOLV4-1/CHO、HVOLV2-1/CHO的FGF-8中和活性進(jìn)行評價。作為陽性對照使用參考例1的3項(xiàng)(1)得到的來自CHO/DG44細(xì)胞的抗FGF-8中和嵌合抗體KM3034，作為陰性對照使用W001/64754所述的針對人趨化因子CCR4的嵌合抗體KM2760。結(jié)果如圖31所示。就象圖31所示的那樣，HVOLV6/CHO表現(xiàn)出與嵌合抗體KM3034同等的FGF-8中和活性，其次HVOLV3-1/CHO也表現(xiàn)出高的FGF-8中和活性。HVOLV4-1/CHO與HVOLV3-1/CHO相比，表現(xiàn)出比較低的FGF-8中和活性，HVOLV2-1/CHO的FGF-8中和活性最低。確認(rèn)FGF-8中和活性的強(qiáng)弱與利用BIAcore的結(jié)合反應(yīng)的強(qiáng)弱之間存在相關(guān)性。
參考例4.免疫原性更低的抗FGF-8中和CDR移植抗體的制作(2)參考例3的結(jié)果清楚表明LV6的6個氨基酸殘基的改變中，51位的改變對于活性恢復(fù)是必需的。另外還暗示了2位的改變?nèi)绻麊为?dú)改變，對活性恢復(fù)的效果小，而通過與51位的改變組合，協(xié)同地對活性恢復(fù)有貢獻(xiàn)。對于14位、15位的改變也表明通過與51位的改變的組合協(xié)調(diào)對活性恢復(fù)有貢獻(xiàn)。另外，暗示了50位的改變效果小。在此為了對2位的改變和14位、15位的改變的哪一個對活性恢復(fù)的效果是否更高進(jìn)行研究，另外為了對92位的改變的效果進(jìn)行研究，對抗FGF-8中和CDR移植抗體的制作再進(jìn)行研究。
1.VL的氨基酸序列的再設(shè)計設(shè)計具有以下那樣改變的2種VL氨基酸序列。無論哪一種都表現(xiàn)出來自LV.0的氨基酸殘基的改變。
在LV.4-3中，將14位的Thr、15位的Pro、51位的Leu、92位的Tyr4個殘基分別改變?yōu)樾∈罂贵wKM1334中出現(xiàn)的氨基酸殘基Ser、Leu、Val、Phe。
在LV.3-3中，將14位的Thr、15位的Pro、51位的Leu 3個殘基分別改變?yōu)樾∈罂贵wKM1334中出現(xiàn)的氨基酸殘基Ser、Leu、Val。
序列50表示LV.4-3的氨基酸序列，而序列表示51LV.3-3的氨基酸序列。
2.編碼VL的DNA的構(gòu)建象以下那樣構(gòu)建編碼參考例4的1.設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的各種VL的氨基酸序列DNA。
(1)編碼LV.4-3的DNA的構(gòu)建按照參考例3的2.(5)所述方法構(gòu)建。但是，用參考例3的2.(3)得到的質(zhì)粒pKM1334LV2-1代替質(zhì)粒pKM1334LV2-2，用參考例3的2.(6)得到的質(zhì)粒pKM1334LV3-2代替質(zhì)粒pKM1334LV6。結(jié)果得到了含有編碼LV.4-3的DNA的質(zhì)粒pKM1334LV4-3。
(2)編碼LV.3-3的DNA的構(gòu)建使10單位的限制性內(nèi)切酶BamHI和10單位的限制性內(nèi)切酶SpeI與3μg參考例4的2.(1)得到的質(zhì)粒pKM1334LV4-3于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約2.5μg的約3.23kb的BamHI-SpeI片段。
然后使10單位的限制性內(nèi)切酶BamHI和10單位的限制性內(nèi)切酶SpeI與3μg的參考例2的1.(3)得到的質(zhì)粒pKM1334LVO于37℃下反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分級，回收約0.15μg的約0.13kb的BamHI-SpeI片段。
然后，將上述得到的質(zhì)粒pKM1334LV4-3的BamHI-SpeI片段0.1μg和來自質(zhì)粒pKM1334LVO的BamHI-SpeI片段0.1μg加到總量10μl的滅菌水中，用ligation high進(jìn)行連接。用這樣得到重組質(zhì)粒DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株，得到了圖32給出的含有編碼LV.3-3的DNA的質(zhì)粒pKM1334LV3-3。
3.抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體的構(gòu)建通過用含有在參考例4的2.構(gòu)建的編碼各種VL的DNA的EcoRI-BsiWI片段置換參考例2的2.得到的含有編碼表達(dá)載體pKANTEX1334HVOLV6的VL的DNA的EcoRI-BsiWI片段，構(gòu)建含有編碼各種VL的DNA的抗FGF-8中和CDR移植抗體表達(dá)載體。具體來說構(gòu)建pKANTEX1334HVOLV4-3、pKANTEX1334HVOLV3-3這2種載體。
4.抗FGF-8中和CDR移植抗體用CHO/DG44細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)用上述參考例4的3.得到的各種抗FGF-8中和移植抗體表達(dá)載體，按照上述參考例1的2.(4)所述的方法進(jìn)行各種FGF-8中和CDR移植抗體在CHO/DG44細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)。
5.抗FGF-8中和CDR移植抗體的純化按照上述參考例1的3.(1)所述的方法，從參考例4的4.中得到的來自表達(dá)各種抗FGF-8中和CDR移植抗體的CHO/DG4細(xì)胞的轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)和上清純化抗FGF-8中和CDR移植抗體。將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLV4-3的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLV4-3/CHO，將來自導(dǎo)入pKANTEX1334HVOLV3-3的轉(zhuǎn)化株的抗體取名為HVOLV3-3/CHO。
6.純化的抗FGF-8中和CDR移植抗體的解析按照上述參考例1的4.所述的方法，對在參考例4的5.得到的各種抗FGF-8中和CDR移植抗體進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果確認(rèn)無論哪一種抗體都是以正確結(jié)構(gòu)的抗體分子表達(dá)的，而且被純化了。
7.抗FGF-8中和CDR移植抗體對FGF-8的結(jié)合活性的測定按照參考例3的7.所示的方法，對參考例3的5.得到的抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLV6/CHO和HVOLV3-1/CHO、參考例4的5.得到的抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLV4-3/CHO和HVOLV3-3/CHO對FGF-8的結(jié)合活性進(jìn)行測定。作為陽性對照使用來自參考例1的3.(1)得到的CHO/DG44細(xì)胞的抗FGF-8中和嵌合抗體KM3034。
圖33表示16.7μg/mL的各種抗體的傳感曲線。就象傳感曲線所表明的那樣，無論哪一種抗體在解離反應(yīng)中幾乎看不到解離，求正確的解離速度常數(shù)是困難的。在此，各種抗體的結(jié)合活性的比較是通過比較結(jié)合反應(yīng)時的結(jié)合[共振信號(RU)]的強(qiáng)弱進(jìn)行的。結(jié)果就象圖33所表示的那樣，嵌合抗體KM3034表現(xiàn)出最高的結(jié)合反應(yīng)，其次，HVOLV4-3/CHO比HVOLV3-1/CHO還高、表現(xiàn)出與HVOLV6/CHO同等的結(jié)合反應(yīng)。而HVOLV3-3/CHO比HVOLV3-1/CHO更低。以上結(jié)果表明有關(guān)結(jié)合反應(yīng)的強(qiáng)弱，比起2位的改變，14位、15位的改變更協(xié)調(diào)地起作用，另外92位的改變對于活性的恢復(fù)是必需的。
8.抗FGF-8中和CDR移植抗體的對FGF-8的中和活性的測定按照參考例2的5項(xiàng)所述的方法對在參考例3的5中得到的抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLV6/CHO和HVOLV3-1/CHO、參考例4的5中得到的抗FGF-8中和CDR移植抗體HVOLV4-3/CHO和HVOLV3-3/CHO的FGF-8中和活性進(jìn)行評價。作為陽性對照使用參考例1的3項(xiàng)(1)得到的來自CHO/DG44細(xì)胞的抗FGF-8中和嵌合抗體KM3034，作為陰性對照使用W001/64754所述的針對人趨化因子CCR4的嵌合抗體KM2760。結(jié)果如圖34所示。就象圖34所表示的那樣，HVOLV6/CHO和HVOLV3-1/CHO表現(xiàn)出與嵌合抗體KM3034同等的FGF-8中和活性。而HVOLV4-3/CHO和HVOLV3-3/CHO表現(xiàn)出同等的中和活性，其活性是嵌合抗體KM3034的1/2左右。HVOLV3-1/CHO和HVOLV4-3/CHO的FGF-8中和活性與由BIAcore引起的結(jié)合反應(yīng)的強(qiáng)弱不相關(guān)，2位的氨基酸殘基和14位、15位的氨基酸殘基在對FGF-8的結(jié)合活性和對細(xì)胞的FGF-8中和活性中給予獨(dú)立的影響。
通過以上的各種評價結(jié)果，將表現(xiàn)出與嵌合抗體KM3034同等的高結(jié)合反應(yīng)和FGF-8中和活性的CHO/DG4細(xì)胞由來的CDR移植抗體HVOLV6/CHO命名為KM8034，而來自高表達(dá)KM8034的CHO/DG4細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆也同樣命名為KM8034，將表現(xiàn)出與KM8034同等的高結(jié)合反應(yīng)的CHO/DG4細(xì)胞的CDR移植抗體HVOLV4-3/CHO命名為KM8035，而來自高表達(dá)KM8035的CHO/DG4細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株也同樣命名為KM8035。序列38給出了KM8035的VL的氨基酸序列LV.4-3。轉(zhuǎn)化細(xì)胞株KM8035于平成14年6月20日以FERM BP-8082保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地中央第6)。將表現(xiàn)出與KM8034同等的高FGF-8中和活性的CHO/DG4細(xì)胞由來的CDR移植抗體HVOLV3-1/CHO命名為KM8036，而來自高表達(dá)KM8036的CHO/DG4細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆也同樣命名為KM8036。序列39給出了KM8036的VL的氨基酸序列LV.3-1。轉(zhuǎn)化細(xì)胞株KM8036于平成14年6月20日以FERM BP-8083保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地中央第6)。
抗FGF-8中和CDR移植抗體KM8034表現(xiàn)出與嵌合抗體KM3034同等的高結(jié)合反應(yīng)和FGF-8中和活性，而且，在人的免疫原性比嵌合抗體更低，所以預(yù)期治療效果比嵌合抗體更高。就抗FGF-8中和CDR移植抗體KM8036和KM8035來說，與KM8034相比，結(jié)合活性和FGF-8中和活性可能低一些，由于各個來自小鼠抗體KM1334的V區(qū)FR的氨基酸殘基變成了3殘基和4殘基，所以預(yù)期免疫原性比KM8034更低。
本發(fā)明提供作為有效成分含有抗FGF-8中和抗體的關(guān)節(jié)炎預(yù)防藥或治療藥、軟骨保護(hù)劑、關(guān)節(jié)破壞抑制劑、滑膜增殖抑制劑、以及作為有效成分含有抗FGF-8中和抗體的關(guān)節(jié)炎診斷藥和使用該抗體的關(guān)節(jié)炎的判定方法。
序列表<110>協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社<120>關(guān)節(jié)炎的治療藥<130>1442<150>JP2001-400677<151>2001-12-28<160>51<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>420<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<223>發(fā)明人田村忠史；內(nèi)井雅子；須田敏郎發(fā)明人三木一郎；田中亨<220>
<221>來源<222>(1)..(420)<223>/生物＝″小家鼠″<220>
<221>CDS<222>(1)..(420)<220>
<221>信號肽<222>(1)..(57)<400>1atg gaa tgg atc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt48Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly1 5 10 15gtc tac tcc cag gtt cag ctg cag cag tct gga gct gag gtg gcg agg96Val Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg
20 25 30ccc ggg gct tca gtg aaa ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc144Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45act gac tac tat cta aac tgg gtg aag cag agg tct gga cag ggc ctt192Thr Asp Tyr Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu50 55 60gag tgg att gga gag att gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat240Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn65 70 75 80gaa aac ttg gag ggc agg gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc288Glu Asn Leu Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95aca gcc tac atg cag ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110tat ttc tgt gca aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc384Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val115 120 125tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct aca420Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr130 135 140<210>2<211>140<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>信號<222>(1)..(19)<400>2Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly1 5 10 15
Val Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Asp Tyr Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn65 70 75 80Glu Asn Leu Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val115 120 125Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr130 135 140<210>3<211>393<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>來源<222>(1)..(393)<223>/生物＝″小家鼠″<220>
<221>CDS<222>(1)..(393)<220>
<221>信號肽<222>(1)..(57)<400>3atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct48Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala1 5 10 15tcc agg agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc96Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agt ctt144Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu35 40 45gta cat agt aat gga aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cct192Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60ggc cag tca cca aag gtc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga att tct240Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser65 70 75 80ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca288Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95ctc aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc336Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys100 105 110ttt cag ggt tca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg384Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125gaa ata aaa393Glu Ile Lys130
<210>4<211>131<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>信號<222>(1)..(19)<400>4Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala1 5 10 15Ser Arg Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu35 40 45Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser65 70 75 80Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys100 105 110Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Ile Lys130<210>5<211>121<212>PRT<213>小家鼠
<400>5Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu50 55 60Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Thr115 120<210>6<211>112<212>PRT<213>小家鼠<400>6Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110<210>7<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>7Asp Tyr Tyr Leu Asn1 5<210>8<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>8Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu Glu1 5 10 15Gly
<210>9<211>12<212>PRT<213>小家鼠<400>9Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr1 5 10<210>10<211>16<212>PRT<213>小家鼠<400>10Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu1 5 10 15<210>11<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>11Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>12Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr1 5<210>13<211>22
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于KM1334的VH的擴(kuò)增的引物<400>13ctgaattcgc ggccgctagt cc 22<210>14<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于KM1334的VH的擴(kuò)增的引物<400>14atgggccctt ggtggaggct gtagagacag tgaccagag 39<210>15<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于KM1334的VL的擴(kuò)增的引物<400>15ctgaattcgc ggccgctgct gt 22<210>16<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于KM1334的VL的擴(kuò)增的引物<400>16atcgtacgtt ttatttccag cttggtcc 28
<210>17<211>25<212>PRT<213>人工的<220>
<223>C末端附加半胱氨酸殘基的人FGF-8的肽(23～46的氨基酸殘基)<400>17Gln Val Thr Val Gln Ser Ser Pro Asn Phe Thr Gln His Val Arg Glu1 5 10 15Gln Ser Leu Val Thr Asp Gln Leu Cys20 25<210>18<211>121<212>PRT<213>人工的<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH氨基酸序列、HV.0<400>18Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu50 55 60
Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>19<211>112<212>PRT<213>人工的<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL氨基酸序列、LV.0<400>19Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>20<211>121<212>PRT<213>人工的<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VH氨基酸序列、HV.6<400>20Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu50 55 60Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>21<211>112<212>PRT<213>人工的<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL氨基酸序列、LV.6<400>21Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110
<210>22<211>504<212>DNA<213>人工的<220>
<223>編碼HV.0的DNA<220>
<221>CDS<222>(47)..(466)<220>
<221>信號肽<222>(47)..(103)<400>22caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaacc atg gaa tgg 55Met Glu Trpatc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt gtc tac tcc103Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly Val Tyr Ser-15 -10 -5 -1cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag ccc ggg gcc151Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act gac tac199Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30tat cta aac tgg gtg cgg cag gcc ccc gga caa ggg ctt gag tgg atg247Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga gag atc gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat gaa aac ttg295Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu50 55 60gag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aca tcc acg agc aca gcc tac343Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt391Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc tac tgg ggc439Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly100 105 110cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcctccacca agggcccact 486Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115120agtcgtgact gggaaaac504<210>23<211>141<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼HV.0的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>23caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaaccatgg aatggatctg60gatctttctc ttcttcctct caggaactac aggtgtctac tcccaggtgc agctggtgca120gtctggggct gaggtgaaga a 141<210>24<211>141<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼HV.0的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>24aggatcgatc tctcccatcc actcaagccc ttgtccgggg gcctgccgca cccagtttag60
atagtagtca gtgaaggtgt atccagaagc cttgcaggag accttcactg aggccccggg120cttcttcacc tcagccccag a 141<210>25<211>141<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼HV.0的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>25ggatgggaga gatcgatcct ggaagtgata gtatatatta taatgaaaac ttggagggca60gagtcacgat taccgcggac acatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga120gatctgagga cacggccgtg t 141<210>26<211>141<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼HV.0的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>26gttttcccag tcacgactag tgggcccttg gtggaggctg aggagacggt gaccagggtt60ccctggcccc agtagacaaa ccttacgtcg tatctagaat acccatatct cgcacagtaa120tacacggccg tgtcctcaga t 141<210>27<211>504<212>DNA<213>人工的<220>
<223>編碼HV.6的DNA
<220>
<221>CDS<222>(47)..(466)<220>
<221>信號肽<222>(47)..(103)<400>27caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaacc atg gaa tgg 55Met Glu Trpatc tgg atc ttt ctc ttc ttc ctc tca gga act aca ggt gtc tac tcc103Ile Trp Ile Phe Leu Phe Phe Leu Ser Gly Thr Thr Gly Val Tyr Ser-15 -10 -5 -1cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg gcg agg ccc ggg gcc151Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act gac tac199Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30tat cta aac tgg gtg cgg cag agg tct gga caa ggg ctt gag tgg att247Tyr Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45gga gag atc gat cct gga agt gat agt ata tat tat aat gaa aac ttg295Gly Glu Ile Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu50 55 60gag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aca tcc acg agc aca gcc tac343Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat ttc tgt391Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95gcg aga tat ggg tat tct aga tac gac gta agg ttt gtc tac tgg ggc439Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Arg Tyr Asp Val Arg Phe Val Tyr Trp Gly
100 105110cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcctccacca agggcccact486Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120agtcgtgact gggaaaac 504<210>28<211>141<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼HV.6的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>28caggaaacag ctatgacgaa ttcgcggccg cacactgact ctaaccatgg aatggatctg60gatctttctc ttcttcctct caggaactac aggtgtctac tcccaggtgc agctggtgca120gtctggggct gaggtggcga g 141<210>29<211>141<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼HV.6的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>29aggatcgatc tctccaatcc actcaagccc ttgtccagac ctctgccgca cccagtttag60atagtagtca gtgaaggtgt atccagaagc cttgcaggag accttcactg aggccccggg120cctcgccacc tcagccccag a 141<210>30<211>141<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>用于編碼HV.6的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>30ggattggaga gatcgatcct ggaagtgata gtatatatta taatgaaaac ttggagggca60gagtcacgat taccgcggac acatccacga gcacagccta catggagctg agcagcctga120gatctgagga cacggccgtg t 141<210>31<211>141<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼HV.6的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>31gttttcccag tcacgactag tgggcccttg gtggaggctg aggagacggt gaccagggtt60ccctggcccc agtagacaaa ccttacgtcg tatctagaat acccatatct cgcacagaaa120tacacggccg tgtcctcaga t 141<210>32<211>459<212>DNA<213>人工的<220>
<223>編碼LV.0的DNA<220>
<221>CDS<222>(40)..(432)<220>
<221>信號肽<222>(40)..(96)
<400>32caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaa atg aag ttg cct gtt 54Met Lys Leu Pro Val-15agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct tcc agg agt gat atc102Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Arg Ser Asp Ile-10 -5 -1 1gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga gag ccg150Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro5 10 15gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cag agt ctt gta cat agt aat gga198Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly20 25 30aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca cag246Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln35 40 45 50ctc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga att tct ggg gtc cca gac agg294Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro Asp Arg55 60 65ttc agt ggc agt gga tcc ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc agc agg342Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg70 75 80gtg gag gct gag gac gtc ggg gtt tat tac tgc ttt cag ggt tca cat390Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His85 90 95gtt ccg tac acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa432Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110cgtacgacta gtcgtgactg ggaaaac 459<210>33<211>130
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼LV.0的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>33caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaaa tgaagttgcc tgttaggctg60ttggtgctga tgttctggat tcctgcttcc aggagtgata tcgtgatgac tcagtctcca120ctctccctgc 130<210>34<211>130<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼LV.0的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>34agactggcct ggcttctgca ggtaccattc taaataggtt cttccattac tatgtacaag60actctgacta gatctgcagg agatggaggc cggctctcca ggggtgacgg gcagggagag120tggagactga 130<210>35<211>130<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼LV.0的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>35tgcagaagcc aggccagtct ccacagctcc tgatctataa agtttccaac cgaatttctg60gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat ccgggacaga tttcacactg aaaatcagca120gggtggaggc 130
<210>36<211>129<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼LV.0的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>36gttttcccag tcacgactag tcgtacgttt gatttccacc ttggtccctt ggccgaacgt60gtacggaaca tgtgaaccct gaaagcagta ataaaccccg acgtcctcag cctccaccct120gctgatttt129<210>37<211>459<212>DNA<213>人工的<220>
<223>編碼LV.6的DNA<220>
<221>CDS<222>(40)..(432)<220>
<221>信號肽<222>(40)..(96)<400>37caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaa atg aag ttg cct gtt 54Met Lys Leu Pro Val-15agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct tcc agg agt gat gtt102Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Arg Ser Asp Val-10 -5 -1 1gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc agt ctt gga gag ccg150
Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Glu Pro5 10 15gcc tcc atc tcc tgc aga tct agt cag agt ctt gta cat agt aat gga 198Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly20 25 30aga acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aag 246Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys35 40 45 50gtc ctg atc tat aaa gtt tcc aac cga att tct ggg gtc cca gac agg 294Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro Asp Arg55 60 65ttc agt ggc agt gga tcc ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc agc agg 342Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg70 75 80gtg gag gct gag gac gtc ggg gtt tat ttc tgc ttt cag ggt tca cat 390Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly Ser His85 90 95gtt ccg tac acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 432Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys120 125 130cgtacgacta gtcgtgactg ggaaaac459<210>38<211>130<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼LV.6的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>38caggaaacag ctatgacgaa ttcaggttgc ctcctcaaaa tgaagttgcc tgttaggctg60ttggtgctga tgttctggat tcctgcttcc aggagtgatg ttgtgatgac tcagtctcca120
ctctccctgc 130<210>39<211>130<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼LV.6的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>39agactggcct ggcttctgca ggtaccattc taaataggtt cttccattac tatgtacaag60actctgacta gatctgcagg agatggaggc cggctctcca agactgacgg gcagggagag120tggagactga 130<210>40<211>130<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼LV.6的DNA的構(gòu)建的合成DNA<400>40tgcagaagcc aggccagtct ccaaaggtcc tgatctataa agtttccaac cgaatttctg60gggtcccaga caggttcagt ggcagtggat ccgggacaga tttcacactg aaaatcagca120gggtggaggc 130<210>41<211>129<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼LV.6的DNA的構(gòu)建的合成DNA
<400>41gttttcccag tcacgactag tcgtacgttt gatttccacc ttggtccctt ggccgaacgt60gtacggaaca tgtgaaccct gaaagcagaa ataaaccccg acgtcctcag cctccaccct120gctgatttt129<210>42<211>112<212>PRT<213>人工的<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL氨基酸序列、LV.4-1<400>42Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110
<210>43<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL氨基酸序列、LV.4-2<400>43Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>44<211>112<212>PRT<213>人工的<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL氨基酸序列、LV.3-1<400>44Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>45<211>112<212>PRT<213>人工的<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL氨基酸序列、LV.3-2<400>45Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>46<211>112<212>PRT<213>人工的<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL氨基酸序列、LV.2-1<400>46Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>47<211>112<212>PRT<213>人工的<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL氨基酸序列、LV.2-2<400>47Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>48<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼LV.3-1的DNA的構(gòu)建的引物<400>48atggtacctg cagaagccag gccagtctcc acaggtcct 39<210>49<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于編碼LV.2-2的DNA的構(gòu)建的引物<400>49atggtacctg cagaagccag gccagtctcc acagctcct 39<210>50<211>112<212>PRT<213>人工的<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL氨基酸序列、LV.4-3<400>50Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110<210>51<211>112<212>PRT<213>人工的<220>
<223>設(shè)計的抗FGF-8中和CDR移植抗體的VL氨基酸序列、LV.3-3<400>51Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 6ln Ser Leu Val His Ser20 25 30
Asn Gly Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110
權(quán)利要求
1.一種關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥，其中，作為有效成分含有與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥，其特征在于，與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的抗體是單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的醫(yī)藥，其中，單克隆抗體是選自雜交瘤產(chǎn)生的抗體、人源化抗體以及它們的抗體片段中的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的醫(yī)藥，其中，雜交瘤是雜交瘤KM1334(FERMBP-5451)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的醫(yī)藥，其中，人源化抗體是人型嵌合抗體或人型互補(bǔ)決定區(qū)CDR移植抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的醫(yī)藥，其中，人型嵌合抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的單克隆抗體的抗體重鏈可變區(qū)VH和抗體輕鏈可變區(qū)VL、以及人抗體的抗體重鏈恒定區(qū)CH以及抗體輕鏈恒定區(qū)CL構(gòu)成的人型嵌合抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的醫(yī)藥，其中，人型嵌合抗體是以下(a)～(c)中任一種人型嵌合抗體(a)VH含有序列編號5所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(b)VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(c)VH含有序列編號5所示氨基酸序列并且VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的醫(yī)藥，其中，人型嵌合抗體是轉(zhuǎn)化體KM3034(FERM BP-7836)產(chǎn)生的人型嵌合抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是含有與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的單克隆抗體的VH和VL的CDR以及人抗體的CH以及CL的人型CDR移植抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的單克隆抗體的VH以及VL的CDR、人抗體的VH以及VL的框架區(qū)FR、以及人抗體的CH以及CL構(gòu)成的人型CDR移植抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列，并且VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VH含有序列編號18所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號44所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18所示氨基酸序列，并且含有為VL序列編號50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的醫(yī)藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)轉(zhuǎn)化體KM8037(FERM BP-8084)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體(b)轉(zhuǎn)化體KM8035(FERM BP-8082)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體(c)轉(zhuǎn)化體KM8036(FERM BP-8083)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求3所述的醫(yī)藥，其中，抗體片段是選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體scFv、二聚體可變區(qū)V區(qū)片段diabody、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)片段dsFv以及含有CDR的肽的抗體片段。
17一種關(guān)節(jié)炎的診斷藥，其中，作為有效成分含有與FGF-8特異性結(jié)合的抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的診斷藥，其中，與FGF-8特異性結(jié)合的抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的診斷藥，其中，單克隆抗體是選自雜交瘤產(chǎn)生的抗體、人源化抗體以及它們的抗體片段中的抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的診斷藥，其中，雜交瘤是雜交瘤KM1334(FERM BP-5451)。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的診斷藥，其中，人源化抗體是人型嵌合抗體或人型CDR移植抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的診斷藥，其中，人型嵌合抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL、以及人抗體的CH以及CL構(gòu)成的人型嵌合抗體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的診斷藥，其中，人型嵌合抗體是以下(a)～(c)中任一種人型嵌合抗體(a)VH含有序列編號5所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(b)VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(c)VH含有序列編號5所示氨基酸序列并且VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的診斷藥，其中，人型嵌合抗體是轉(zhuǎn)化體KM3034(FERM BP-7836)生產(chǎn)的人型嵌合抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是含有與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL的CDR和人抗體的CH以及CL的人型CDR移植抗體。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL的CDR、人抗體的VH以及VL的FR、以及人抗體的CH以及CL構(gòu)成的人型CDR移植抗體。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
28.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的以上氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)含有VH序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
29.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)含有LV為序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示氨基酸序列并且VL含有序列編號21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VH含有序列編號18所示氨基酸序列并且VL含有序列編號44所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18所示氨基酸序列并且VL含有序列編號50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
31.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的診斷藥，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)轉(zhuǎn)化體KM8037(FERM BP-8084)產(chǎn)生的人型CDR移植抗體(b)轉(zhuǎn)化體KM8035(FERM BP-8082)產(chǎn)生的人型CDR移植抗體(c)轉(zhuǎn)化體KM8036(FERM BP-8083)產(chǎn)生的人型CDR移植抗體。
32.根據(jù)權(quán)利要求19所述的診斷藥，其中，抗體片段是選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體scFv、二聚體化V區(qū)片段diabody、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)片段dsFv以及含有CDR的肽的抗體片段。
33.一種關(guān)節(jié)炎的判定方法，其特征在于，利用與FGF-8特異性結(jié)合的抗體檢測和/或定量試樣中的FGF-8。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的判定方法，其中，與FGF-8特異性結(jié)合的抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的判定方法，其中，單克隆抗體是選自雜交瘤產(chǎn)生的抗體、人源化抗體以及它們的抗體片段中的抗體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的判定方法，其中，雜交瘤是雜交瘤KM1334(FERM BP-5451)。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的判定方法，其中，人源化抗體是人型嵌合抗體或人型CDR移植抗體。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的判定方法，其中，人型嵌合抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL、以及人抗體的CH以及CL構(gòu)成的人型嵌合抗體。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的判定方法，其中，人型嵌合抗體是以下(a)～(c)中任一種人型嵌合抗體(a)VH含有序列編號5所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(b)VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體(c)VH含有序列編號5所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號6所示氨基酸序列的人型嵌合抗體。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的判定方法，其中，人型嵌合抗體是轉(zhuǎn)化體KM3034(FERM BP-7836)生產(chǎn)的人型嵌合抗體。
41.根據(jù)權(quán)利要求37所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是含有與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL的CDR和人抗體的CH以及CL的人型CDR移植抗體。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是由與FGF-8特異性結(jié)合的單克隆抗體的VH以及VL的CDR、人抗體的VH以及VL的FR、以及人抗體的CH以及CL構(gòu)成的人型CDR移植抗體。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號7、8和9所示的氨基酸序列、并且VL的CDR1、CDR2以及CDR3分別含有序列編號10、11和12所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
44.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18所示的氨基酸序列中選自第12號的Lys、13號的Lys、40號的Ala、41號的Pro、48號的Met、68號的Val、70號的Ile、74號的Thr、76號的Thr、82號的Glu、84號的Ser、87號的Arg以及95號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19所示的氨基酸序列中選自第2號的Ile、3號的Val、14號的Thr、15號的Pro、50號的Gln、51號的Leu以及92號的Tyr中的至少一種以上氨基酸殘基被取代為其它氨基酸殘基的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
45.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18或20所示的氨基酸序列、并且VL含有序列編號19、21、42、43、44、45、46、47、50或51所示的氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)VH含有序列編號18所示氨基酸序列并且VL含有序列編號21所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體(b)VH含有序列編號18所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號44所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體(c)VH含有序列編號18所示氨基酸序列，并且VL含有序列編號50所示氨基酸序列的人型CDR移植抗體。
47.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的判定方法，其中，人型CDR移植抗體是以下(a)～(c)中的任一種人型CDR移植抗體(a)轉(zhuǎn)化體KM8037(FERM BP-8084)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體(b)轉(zhuǎn)化體KM8035(FERM BP-8082)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體(c)轉(zhuǎn)化體KM8036(FERM BP-8083)生產(chǎn)的人型CDR移植抗體。
48.根據(jù)權(quán)利要求(35)所述的判定方法，其中，抗體片段是選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體scFv、二聚體V區(qū)片段diabody、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)片段(dsFv)以及含有CDR的肽的抗體片段。
49.一種關(guān)節(jié)破壞抑制劑，其中，作為有效成分含有與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的抗體。
50.一種軟骨保護(hù)劑，其中，作為有效成分含有與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的抗體。
51.一種滑膜增殖抑制劑，其中，作為有效成分含有與FGF-8特異性結(jié)合并且抑制FGF-8活性的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供作為有效成分含有抗FGF－8中和抗體的關(guān)節(jié)炎的預(yù)防藥或治療藥、軟骨保護(hù)劑、關(guān)節(jié)破壞抑制劑、滑膜增殖抑制劑，以及作為有效成分含有抗FGF－8抗體的關(guān)節(jié)炎的診斷藥和使用該抗體的關(guān)節(jié)炎的判定方法。
文檔編號C07K16/22GK1607961SQ02826290
公開日2005年4月20日 申請日期2002年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月28日
發(fā)明者田村忠史, 內(nèi)井雅子, 須田敏郎, 三木一郎, 田中亨 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社