辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，包括以下步驟：1）利用辣椒花藥進(jìn)行蛋白質(zhì)的提??；2）第一向IPG等電聚焦電泳；3）膠條的平衡；4）膠條的轉(zhuǎn)移及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；5）凝膠掃描和圖像分析；從而得辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜。運用本發(fā)明的方法能獲得蛋白質(zhì)點清晰、數(shù)目較多、分布均勻、背景清楚的辣椒花藥蛋白質(zhì)的雙向電泳凝膠圖譜，且實驗結(jié)果穩(wěn)定，此發(fā)明為進(jìn)一步開展辣椒蛋白組學(xué)和分子生物學(xué)的研究奠定了重要的工作基礎(chǔ)。
【專利說明】辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]辣椒(Chili P印per)原產(chǎn)于中拉丁美洲熱帶地區(qū)，原產(chǎn)國是墨西哥。為一年生或多年生植物，其Vc的含量在蔬菜中居第一位，具有較高的營養(yǎng)價值。辣椒為常異花授粉植物，雜交優(yōu)勢顯著。但在雜交繁種中，由于母本去雄費時費工，且雜交種子純度難以保證。而利用CMS三系配套法生產(chǎn)雜交種子，不但可減少人工去雄的麻煩，降低制種成本，而且能保障雜交種子的純度。目前，國內(nèi)外已選育出多個辣椒胞質(zhì)雄性不育系，并逐步應(yīng)用于辣椒雜交種子的生產(chǎn)。因此，利用CMS三系配套法生產(chǎn)雜交種子在辣椒生產(chǎn)上具有極大的潛力和市場需求。但是通過自然變異獲得不育系的概率比較小，且數(shù)量少。另外，如果引進(jìn)不育系，其需要穩(wěn)定的時間周期又比較長。因此，穩(wěn)定不育系的難獲得，已成為目前辣椒利用CMS三系配套法雜交制種的最大障礙。利用基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以快速挖掘出辣椒育性不同的差異基因表達(dá)的產(chǎn)物，從而闡述不育機(jī)制，為將來辣椒雜交制種工作提供重要技術(shù)支撐。
[0003]現(xiàn)有研究辣椒不育機(jī)理的方法往往借助于基因組學(xué)技術(shù)，可以在一定程度上挖掘植物不育的重要基因。但是因為蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物，所以找出與不育相關(guān)的直接差異蛋白將更有助于不育機(jī)理的研究。利用基于雙向電泳的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，獲得高質(zhì)量的差異蛋白圖譜，是研究不育機(jī)理的強有力工具。目前利用雙向電泳獲得蛋白圖譜的方法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和部分植物研究(如蘋果葉片)等植物種類有一定程度的應(yīng)用，但是在辣椒，特別是花藥研究方面幾乎空白。張彩霞等借助酚抽提法在蘋果葉片中得到了高質(zhì)量的蛋白質(zhì)點圖譜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能得到高質(zhì)量辣椒花藥雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，包括以下步驟:
[0006]I)、利用辣椒花藥進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取；
[0007]2)、第一向IPG等電聚焦(IEF)電泳:
[0008]取步驟I)所得的蛋白提取液40 μ L、240?280 μ L的IPG buffer混勻后配成水
化溶液，裝入等電聚焦槽中；利用等電聚焦膠條進(jìn)行等電聚焦；設(shè)定參數(shù)如下:
[0009]
【權(quán)利要求】
1.辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，其特征是包括以下步驟: 1)、利用辣椒花藥進(jìn)行蛋白質(zhì)的提??； 2)、第一向IPG等電聚焦電泳: 取步驟I)所得的蛋白提取液40 μ L、240~280 μ L的IPG buffer混勻后配成水化溶液，裝入等電聚焦槽中；利用等電聚焦膠條進(jìn)行等電聚焦；設(shè)定參數(shù)如下:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，其特征是: 所述步驟4)中的SDS-PAGE膠的制備方法中所用的凝膠溶液為12%的凝膠溶液；所述12%的凝膠溶液的制備方法為: 在13.4ml的超純水中加入16.0ml的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的混合水溶液、IOml的Tris-Hcl緩沖液(1.5mol/L, ρΗ8.8),0.4ml的SDS水溶液、200 μ L的過硫酸銨水溶液、20 μ L的N, N，N，，N，-四甲基乙二胺； 每ml丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的混合水溶液含292mg的丙烯酰胺、8mg的甲叉雙丙烯酰胺，其余為水；每ml SDS水溶液中含有IOOmg的SDS，其余為水；每ml過硫酸銨水溶液中含有IOOmg的過硫酸銨，其余為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的辣椒花藥雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，其特征是: 所述蛋白質(zhì)的提取包括以下步驟: ①、取0.4g辣椒花藥用液氮研磨后將其懸浮于IOml的三氯乙酸/丙酮溶液中，-200C沉淀10小時; 所述三氯乙酸/丙酮溶液由8%的三氯乙酸和92%的丙酮組成，上述％為體積％ ； ②、將步驟①的所得物 離心，棄上清； ③、將步驟②所得的沉淀懸浮于IOml的B-巰基乙醇冷丙酮溶液；離心； 所述B-巰基乙醇冷丙酮溶液的制備方法為:將冷丙酮與B-巰基乙醇按照1:0.09的體積比進(jìn)行混合；所述冷丙酮為溫度為4°C的丙酮； ④、將步驟③所得的沉淀真空抽干至含水量<0.05% (質(zhì)量％)，得到粗蛋白干粉；加入Iml裂解液A以溶解上述粗蛋白干粉，離心，所得的即為蛋白提取液； 所述裂解液A為在每ml水中加入380mg尿素、IOOmg硫脲、30mg3-[3_(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽、6.2m g 二硫蘇糖醇、10 μ L載體兩性電解質(zhì)Ampholine ρΗ3_10,，0.174mg苯甲基磺酰氟制備 而得。
【文檔編號】G01N1/28GK103884765SQ201410060630
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】呂曉菡, 柴偉國, 方獻(xiàn)平 申請人:杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院