專利名稱：治療用蛋白和核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的蛋白，肽片段及其結(jié)合體(conjugate)，以及編碼此蛋白及其片段的核酸，它們都能用于腫瘤疾病的診斷和治療，尤其是食管癌的診斷和治療。
人食管癌(EC)是最常見的遍及世界的癌癥之一，中國、南非、烏拉圭、法國和意大利(見

圖1和2)發(fā)病率很高。美國EC發(fā)病率較低，大多數(shù)發(fā)生在美國黑人。
中國食管癌的死亡率是全世界最高的，占全世界死亡人數(shù)的50％。河南邊界的太行山南部地區(qū)、山西和湖北省食管癌死亡率高，尤其是河南省林縣年齡相關(guān)死亡率最高，男性為151/100 000，女性為115/100 000(見圖3)。以往對中國的研究表明許多腫瘤抑制基因和癌基因參與此病的發(fā)病和進(jìn)展過程，然而沒有確定與EC直接相關(guān)的基因。
本發(fā)明人分離了四個不同的基因片段，并用mRNA差異顯示技術(shù)將其克隆，比較正常食管上皮和EC之間異常基因表達(dá)的不同之處。
在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性分析發(fā)現(xiàn)這些片段與已知序列無顯著相似性，因而這四個片段可能是新的基因。用5’-RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)技術(shù)測定了一個序列的全長，稱為食管癌相關(guān)基因-1(ECRG-1)。對這些基因研究表明，它們的失活或刪除將促使食管形成腫瘤，這對EC基礎(chǔ)和臨床研究有很強(qiáng)的重要性，使得將其用于制備抗體、設(shè)計新的藥物、基因診斷、基因治療和抑制或清除基因產(chǎn)物方面的進(jìn)展成為可能。
用逆轉(zhuǎn)錄酶PCR確定ECRG1在正常食管上皮和食管癌上皮表達(dá)有明顯的不同。Northern雜交分析發(fā)現(xiàn)正常食管細(xì)胞出現(xiàn)長約1kb的ECRG1陽性信號，而食管癌細(xì)胞未出現(xiàn)此信號(見圖4N＝正常，C＝食管癌)。此外，還將ECRG1的融合蛋白在體外和體內(nèi)應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞，能顯著抑制腫瘤生長。
本發(fā)明的第一個方面提供了分離或純化的編碼含有SEQ ID NO 2的氨基酸序列，與之有至少50％同源性的氨基酸序列或其片段的蛋白的核酸序列，其中所說的蛋白或肽片段具有抑制食管上皮細(xì)胞腫瘤生長速度的活性。
該蛋白優(yōu)選分子量在43和47kD之間。更優(yōu)選是絲氨酸蛋白酶型。更優(yōu)選該蛋白具有SEQ ID NO 3(NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVTIGLLVHFLVFDQ)或其保守取代突變體的氨基酸序列的跨膜位點。更優(yōu)選該蛋白具有下列一個或優(yōu)選全部的位點N-糖基化位點、蛋白激酶糖基化位點、酪氨酸激酶II磷酸化位點、N-豆蔻?；稽c、酰胺化位點、異戊二烯基組結(jié)合位點(CAAX盒)、微體C-末端靶信號、細(xì)胞粘附序列和絲氨酸蛋白酶(胰島素型)組氨酸位點。更優(yōu)選的的位點顯示于下面的表1中。
該蛋白可包括前面所述的與一個或更多編碼標(biāo)記序列的區(qū)域聯(lián)結(jié)或相連的活性蛋白或片段序列，例如GST或GFP融合序列，或與能增強(qiáng)細(xì)胞膜，尤其是食管上皮細(xì)胞膜穿透力的序列聯(lián)結(jié)或相連。
優(yōu)選的核酸序列是能夠在標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格雜交條件下與SEQ ID NO 1的核酸序列雜交的核酸序列，標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格雜交條件是2×SSC，65℃；更優(yōu)選的高度嚴(yán)格條件是0.2×SSC，65℃。雜交步驟優(yōu)選按照Church和美國國家科學(xué)院院報(USA)(1984)81，1991-1995(通過引用被在此合并)。
更優(yōu)選的核酸是mRNAs和cDNAs，盡管用于診斷食管癌的探針和引物在下述本發(fā)明更進(jìn)一步的方面也能想到。
本發(fā)明更優(yōu)選的核酸是DNAs，尤其是cDNAs，它與啟動序列及其他選擇性調(diào)控序列可操縱地連接，這些序列允許DNA表達(dá)，從而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明所述的能抑制食管腫瘤生長的蛋白或片段，從中分離并純化作為抗腫瘤試劑、疫苗或poart fo診斷試劑盒。這類細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，但優(yōu)選是真核細(xì)胞，更優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞，尤其是人細(xì)胞。這些細(xì)胞可以替換為靶腫瘤細(xì)胞，靶腫瘤細(xì)胞需要該蛋白或片段抑制其分裂，從而抑制腫瘤生長。
本發(fā)明的第二個方面提供了一種分離純化、無菌或無熱原質(zhì)形式的含有SEQ ID NO 2的氨基酸序列，或與之有至少50％同源性的氨基酸序列或片段的蛋白，其中蛋白或肽片段具有抑制食管上皮細(xì)胞腫瘤生長速度的活性。
該蛋白優(yōu)選分子量在43和47kD之間，更優(yōu)選約47kD。更優(yōu)選是絲氨酸蛋白酶型。更優(yōu)選該蛋白具有SEQ ID NO 3(NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVTIGLLVHFLVFDQ)或其保守取代突變體的跨膜位點的氨基酸序列。更優(yōu)選該蛋白具有下列一個或最好全部的位點N-糖基化位點、蛋白激酶糖基化位點、酪氨酸激酶II磷酸化位點、N-豆蔻酰化位點、酰胺化位點、異戊二烯基組結(jié)合蛋白(CAAX盒)、微體C-末端靶信號、細(xì)胞粘附序列和絲氨酸蛋白酶(胰島素型)組氨酸位點。更優(yōu)選的的位點顯示于下面的表1中。
該蛋白可能包括前面所述的活性蛋白或與一個或更多編碼標(biāo)記序列的區(qū)域結(jié)合或側(cè)接的片段序列，例如GST或GFP融合序列，或與能增強(qiáng)細(xì)胞膜，尤其是食管上皮細(xì)胞膜穿透力的序列聯(lián)結(jié)或相連。
同源性是指氨基酸或核酸序列同一性的百分比，或?qū)τ诎被醽碚f，相同或保守取代氨基酸同一性的百分比。同一性是指氨基酸序列相同的百分比。這兩個百分比術(shù)語允許在序列缺失時仍能進(jìn)行下述的比對。
特別是，術(shù)語同一性是指當(dāng)進(jìn)行選擇性序列排列比較時，要求保護(hù)的氨基酸或堿基序列在參考文獻(xiàn)中序列的同一相應(yīng)位點出現(xiàn)的百分比，盡管實際上序列可能在一定位點有缺失或增加，此時在該位點需要加入缺口來排列比較氨基酸或堿基相同的最高百分比。尤其是在序列排列比較是使用了20或20個以下缺口，即加入到兩個序列之間的所有缺口總數(shù)之和為20或20以下，更優(yōu)選是10或小于10。這些缺口的長度不是非常重要，只要兩個有關(guān)E2F結(jié)合和E2FDNA結(jié)合調(diào)節(jié)的中一個或另一個的確定活性存在，但一般不超過50個氨基酸，優(yōu)選不超過10個，或不超過150個堿基，優(yōu)選不超過30個堿基。
前述突變形式序列優(yōu)選保守取代。關(guān)于氨基酸“保守取代”涉及用同一族中有相同物理化學(xué)特性的氨基酸取代一給定的氨基酸。這樣當(dāng)某氨基酸有一個疏水性基團(tuán)時，它被另一個也含有疏水性基團(tuán)的氨基酸保守取代；其他這類族是特性基團(tuán)包括親水、陽離子、陰離子或含有一個硫醇或硫醚的族。這樣的取代只是在預(yù)計取代后的蛋白具有DP肽或蛋白活性時，討論有關(guān)E2F異二聚化和E2F-DNA結(jié)合或轉(zhuǎn)錄活化調(diào)節(jié)。
氨基酸或核苷酸序列排列比較以及計算序列同源性或同一性的適當(dāng)運算法和軟件都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這類工具的主要例子是Pearson和基于FAST的Lipman以及BLAST程序。具體可在Altschul et al(1990)，J.Mol.Biol.215403-10；Lipman D J and Pearson W R(1985)Science 227，p143541中找到。公眾可在互聯(lián)網(wǎng)‘http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast-help.html’中得到BLAST詳情。因而可經(jīng)商業(yè)、公眾可得軟件包，例如FASTA和BLASTn軟件或通過網(wǎng)絡(luò)計算機(jī)服務(wù)商來確定同源性和同一性百分比。前者的例子是GCG程序包(Devereux et al Nucelic Acids Research(1984)12(1)387)和Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，eg.Version 8 for Unix or IBM equivalent，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)，他們使用Smith和Waterman當(dāng)?shù)赝葱运惴?，Advances in Mathematics 2482-489(1981)。許多國際機(jī)構(gòu)，例如GenBank(見http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和EMBL(見http//www.embl-heidelberg.de/Blast2)提供網(wǎng)絡(luò)服務(wù)。
軟件包使用的參數(shù)和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)商應(yīng)該與適當(dāng)?shù)男蛄虚L度和前述缺口特性一起應(yīng)用。排列比較策略在W098/40483第39-41頁有敘述，此文獻(xiàn)通過引用被在此合并。
BLAST檢索中方便的參數(shù)時缺省值，即對EMBL Advanced Blast2Blastp Matrix BLOSUMS 62，F(xiàn)ilter缺省值，Echofilter X，Ecpect 10，Cutoff缺省值，雙鏈，描述50，排列比較50。優(yōu)選使用BLASTn的缺省值。GCG Wisconsin軟件包的缺口缺省值為12，長度缺省權(quán)值4。更優(yōu)選的同源性算法的FASTDB參數(shù)時錯配罰值＝1.00，缺口罰值＝1.00，缺口大小罰值＝0.33及增加堿基罰值＝30.0。
關(guān)于氨基酸“保守取代”涉及用同一族中有相同物理化學(xué)特性的氨基酸取代一給定的氨基酸。這樣當(dāng)某氨基酸有一個疏水性基團(tuán)時，它被另一個也含有疏水性基團(tuán)的氨基酸保守取代；其他這類族是特性基團(tuán)包括親水、陽離子、陰離子或含有一個硫醇或硫醚的保守取代。此種取代被具體描述在參考文獻(xiàn)US5380712中。
本發(fā)明的核酸可被序列列表中的例子變性取代?！冃匀〈婕昂塑账岜痪幋a相同氨基酸的密碼子核苷酸序列取代；這些在細(xì)胞或載體表達(dá)蛋白時具有優(yōu)越性的變性取代的類型與源生物細(xì)胞DNA不同，它含有與源細(xì)胞cDNA不同的轉(zhuǎn)錄/翻譯優(yōu)選密碼子。這類變性取代由此可能成為宿主特異性取代。
本發(fā)明的第三個方面是提供了寡核苷酸探針和引物，它用于第一個方面所述的核酸的鑒定、分離和復(fù)制，以及在研究食管腫瘤和食管腫瘤細(xì)胞時，用于鑒定組織中ECRG1基因的存在和/或缺失。
該探針的長度足夠在標(biāo)準(zhǔn)或嚴(yán)格雜交條件下與ECGR1基因特異性結(jié)合。它們可能是SEQ ID NO 1序列相應(yīng)的全長探針，但其長度為10-100個堿基可能更合適一些，更優(yōu)選是15-30個堿基，每一探針含有與前述長度片段鄰近的序列。
同樣地，用于擴(kuò)增DNA的引物本身可被鑒定來檢測是否存在活性ECRG1基因或其他的關(guān)鍵序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知引物的合適長度，例如長度為8-30個堿基。特別優(yōu)選的引物和探針是那些通過用標(biāo)記核苷酸進(jìn)行連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來檢測單一核苷酸表現(xiàn)的多肽性，例如位點直接突變，使有關(guān)腫瘤生長抑制的蛋白發(fā)生失活或與此處公開的野生型蛋白相比活性降低。
本發(fā)明的第四個方面是提供了可表達(dá)本發(fā)明的蛋白或蛋白片段的表達(dá)載體，該蛋白或蛋白片段包括本發(fā)明第一個方面所述的與啟動子和其他可引起蛋白或片段在靶腫瘤細(xì)胞表達(dá)或產(chǎn)生蛋白的選擇性調(diào)節(jié)區(qū)域可操縱連接的核酸。
優(yōu)選載體被用于所謂的基因治療，包括突變病毒形式的載體，所述病毒能感染食管上皮并在食管表達(dá)該蛋白或片段。此病毒可方便地是腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒或細(xì)小病毒，但也包括其他治療病毒是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的適合用于基因治療的病毒。特別優(yōu)選的病毒是在非靶細(xì)胞中復(fù)制的能力比它們在靶細(xì)胞中弱。因此，優(yōu)選定向到達(dá)上皮細(xì)胞的病毒突變體。
本發(fā)明的第五個方面是提供了被本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
本發(fā)明的第六個方面提供了本發(fā)明的蛋白或片段的抗體，例如在實施例中提供的。這些抗體可能與純化分離SEQ ID NO 1蛋白或與其抗原結(jié)合片段結(jié)合，如實施例中所列，或與聯(lián)接著標(biāo)記蛋白(例如谷光苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或綠熒光蛋白(GFP))的蛋白或片段結(jié)合。這些抗體可能由各種動物產(chǎn)生，例如豬、兔、小鼠或大鼠，也可能是多克隆抗體，但更優(yōu)選的為單克隆抗體，例如由熟知的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的單克隆抗體。
本發(fā)明的第七個方面是提供了一種診斷編碼異常食管腫瘤生長抑制蛋白的基因ECRG1存在的方法，包括確定患者食管組織樣本中是否存在所述基因序列，并與已知SEQ ID NO 2及其突變體序列比較，該序列能誘導(dǎo)或增強(qiáng)抑制食管上皮細(xì)胞腫瘤生長的效果，確定所述基因序列丟失或具誘導(dǎo)活性的ECRG1丟失的患者存在發(fā)生食管腫瘤的高危因素。用本發(fā)明的探針或引物能方便地作出診斷。
本發(fā)明的第八個方面提供了一種治療可疑癌癥患者的方法，包括給藥于患者有效量的本發(fā)明第二個方面的蛋白或片段，抑制腫瘤的生長。該可疑癌癥優(yōu)選食管腫瘤。
本發(fā)明的第九個方面提供了一種治療可疑癌癥患者的方法，包括給患者施與有效量的本發(fā)明第四個方面的病毒載體，感染任何腫瘤細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生有效量的蛋白或蛋白片段來抑制腫瘤的生長。該可疑癌癥優(yōu)選食管癌。
本發(fā)明的第十個方面提供了一種延長癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的方法，包括用本發(fā)明第二或第四個方面的蛋白或片段或載體處理該細(xì)胞。
本發(fā)明的第十一個方面提供了一種藥物組合物，包括第二個方面的蛋白或片段與藥物可接受的載體、稀釋液或賦形劑。優(yōu)選無菌和無熱原質(zhì)形式的組合物。
本發(fā)明的第十二個方面提供了第二個方面所述蛋白或片段在制備治療癌癥，尤其是食管腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第十三個方面提供了一種藥物組合物，其包含第四方面的載體，尤其是病毒載體，與藥物可接受的載體、稀釋液或賦形劑。優(yōu)選無菌和無熱原質(zhì)形式的組合物。更優(yōu)選該組合物與類固醇或其它抗細(xì)胞因子，例如TNF受體，聯(lián)合進(jìn)行治療，以減輕炎癥反應(yīng)。
下面用下列非限制的附圖、序列表和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。進(jìn)一步體現(xiàn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員按照這些描述所作的改動都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
附圖附圖1食管癌在全世界的發(fā)病率地圖。
附圖2遍及世界的各種癌癥的死亡率。
附圖3食管癌在中國的分布。
附圖4正常和異常食管癌組織的Northern雜交結(jié)果。
附圖5本發(fā)明全長ECRG1蛋白在各個pH值的凈電荷。
附圖6全長ECRG1蛋白的抗原決定部位分析，SEQ ID NO 2中所列氨基酸序列位于水平軸。
附圖7本發(fā)明蛋白的穩(wěn)定構(gòu)型。
附圖8ECRG1基因染色體4q22-25上的位置。
附圖9在E coli中表達(dá)融合蛋白所用質(zhì)粒pGEX-4T-1-ECRG1的構(gòu)建步驟。
附圖10和11蛋白表達(dá)的Western雜交雜交凝膠圖譜。
附圖12抗BALB/C小鼠來源的純化蛋白的抗體與GST融合蛋白的抗血清免疫反應(yīng)活性。
附圖13與GST的抗血清免疫反應(yīng)活性，其顯示與蛋白的不同。
附圖14一個能在人細(xì)胞中表達(dá)GST-ECRG1的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-ECRG1的構(gòu)建步驟。
附圖15GST-ECRG1通過pcDNA-ECRG1質(zhì)粒在NEC細(xì)胞中表達(dá)。
附圖16用GST融合蛋白處理過的NEC細(xì)胞的生長曲線。
附圖17NEC細(xì)胞接觸GST融合蛋白后的抑制率。
附圖18體外培養(yǎng)的NEC細(xì)胞的幻燈片，證明加入編碼質(zhì)粒的GST-ECRG1融合蛋白后對生長的作用。
附圖19GST-ECRG1融合蛋白劑量從0.05mg/ml增加到0.4mg/ml的作用。
附圖20ECRG1基因轉(zhuǎn)染的NEC細(xì)胞生長抑制圖。
附圖21ECRG1基因轉(zhuǎn)染的NEC細(xì)胞生長抑制速度。
附圖22細(xì)胞數(shù)與DNA含量的細(xì)胞周期測定，表明NEC細(xì)胞的細(xì)胞周期各個階段的細(xì)胞比例。
附圖23細(xì)胞數(shù)與DNA含量的細(xì)胞周期測定，表明經(jīng)GST融合蛋白處理的NEC細(xì)胞的細(xì)胞周期各個階段的細(xì)胞比例。
附圖24細(xì)胞數(shù)與DNA含量的細(xì)胞周期測定，表明經(jīng)pcDNA3-ECRG1轉(zhuǎn)染的NEC細(xì)胞的細(xì)胞周期各個階段的細(xì)胞比例。
附圖25細(xì)胞數(shù)與DNA含量的細(xì)胞周期測定，表明經(jīng)pcDNA3-ECRG1轉(zhuǎn)染的NEC細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤后，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期各個階段的細(xì)胞比例。
附圖26細(xì)胞數(shù)與DNA含量的細(xì)胞周期測定，表明用無ECRG1基因的pcDNA3轉(zhuǎn)染的NEC細(xì)胞的細(xì)胞周期各個階段的細(xì)胞比例。
附圖27細(xì)胞數(shù)與DNA含量的細(xì)胞周期測定，表明經(jīng)pcDNA3轉(zhuǎn)染的NEC細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤后，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期各個階段的細(xì)胞比例。
附圖28細(xì)胞數(shù)與DNA含量的細(xì)胞周期測定，表明經(jīng)pcDNA3-ECRG1轉(zhuǎn)染的NEC細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤后，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期各個階段的細(xì)胞比例。
序列表SEQ ID NO 1表示ECRG1的cDNA序列，其5’端有80個堿基，3’端有122個堿基，包括多聚腺苷酸尾。
SEQ ID NO 2表示ECRG1蛋白的氨基酸序列。
實施例1使用設(shè)計而成的長引物利用cDNA末端(RACE)5’快速擴(kuò)增法獲得全長ECRG 1，并測定全部核苷酸序列。Northern雜交分析ECRG-1 mRNA得到約1.2kb的單一信號。GENBANK中序列同源性分析表明現(xiàn)登錄號AF071882的新序列沒有與其高度同源的序列，由此鑒定出該序列是新的序列。
逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)法檢測ECRG-1在EC中的表達(dá)。在正常胎兒大腦、成人大腦、肝臟、腎臟、睪丸、骨髓和骨骼肌7個cDNA文庫以及8個人胎兒組織，例如腦、肺、肌肉、皮膚、腎臟、腸道和腺體中，發(fā)現(xiàn)ECRG-1的表達(dá)。ECRG-1在7個正常食管上皮的表達(dá)100％陽性，但在44個EC患者中僅4.55％，p＜0.01。在26個腫瘤附近組織，其表達(dá)為46.15％，p＜0.05。這些結(jié)果表明ECRG-1基因產(chǎn)物是腫瘤抑制基因，其在EC發(fā)病和進(jìn)展過程中起著重要的作用。
實施例2用放射雜交法測定ECRG-1基因在染色體上的位置。發(fā)現(xiàn)此基因位于染色體4q22-25。
實施例3通過生物信息來預(yù)測ECRG-1蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能，表明它是一種與絲氨酸蛋白酶類似的跨膜蛋白。蛋白分子量約為45kD，三維晶體結(jié)構(gòu)同絲氨酸蛋白酶。
表1 ECRG-1蛋白的功能位點
信息肽和跨膜位點被鑒定為NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVTIGLLVHFLVFDQ。
實施例3將ECRG-1 cDNA插入到可被ITPG誘導(dǎo)的表達(dá)質(zhì)粒中，用Western雜交法鑒定表達(dá)蛋白。用純化蛋白免疫BLAB/C小鼠，產(chǎn)生多克隆抗體。直接ELISA測定抗體的效價是1∶3200。
用質(zhì)粒PGEX型PGEX-4T-ECRG-1在E.coli中表達(dá)GST-ECRG-1蛋白。
實施例4構(gòu)建含ECRG-1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染先前缺乏ECRG-1表達(dá)活性的NEC細(xì)胞。通過RT-PCR和Western雜交鑒定ECRG-1基因轉(zhuǎn)染克隆。
與未被ECRG-1基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，ECRG-1基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的增殖率降低，腫瘤重量和體積也降低。當(dāng)ECRG-1基因轉(zhuǎn)染到NEC細(xì)胞中，NEC細(xì)胞的增殖率降低(表2)。還發(fā)現(xiàn)ECRG-1基因轉(zhuǎn)染的NEC細(xì)胞較未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，腫瘤重量和體積顯著降低。我們的發(fā)現(xiàn)表明ECRG-1基因在體外和體內(nèi)都能顯著抑制NEC細(xì)胞的生長。
表2 ECRG-1基因轉(zhuǎn)染和無ECRG-1基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞腫瘤抑制速度
實施例5ECRG-1基因編碼的蛋白能抑制食管癌細(xì)胞增殖。經(jīng)NMBA2A(NEC)誘導(dǎo)的人胎兒的食管癌細(xì)胞與融合蛋白培養(yǎng)，將NEC細(xì)胞腫瘤移植到裸鼠，然后注射ECRG-1融合蛋白。重組融合蛋白在體外和體內(nèi)都能顯著抑制腫瘤生長。
與未被ECRG-1基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，ECRG-1基因轉(zhuǎn)染的NEC細(xì)胞的增殖率降低，腫瘤重量和體積也顯著降低。這些結(jié)果表明ECRG-1及其蛋白在體外和體內(nèi)均可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G2期延長。此外，被ECRG-1基因轉(zhuǎn)染的NEC細(xì)胞腫瘤血管形成減少。
表2經(jīng)GST-ECRG-1蛋白處理的NEC腫瘤重量和體積
融合蛋白組與對照組P＜0.05表3融合蛋白對NEC細(xì)胞周期的影響
表4 ECRG-1轉(zhuǎn)染NEC細(xì)胞對細(xì)胞周期的影響
序列表<110>BTG國際有限公司<120>藥用蛋白和核酸<130>ECRG1<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1375<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(81)..(1253)<400>1atcacgagat gtcatatagt tgattagtta gttgagttca gtgggtgcag acctgcaaga 60tcatattctt cctcctgtac atg atg tat cgg aca gta gga ttt ggc acc cga 113Met Met Tyr Arg Thr Val Gly Phe Gly Thr Arg1 5 10agc aga aat ctg aag cca tgg atg att gcc gtt ctc att gtg ttg tcc 161ser Arg Asn Leu Lys Pro Trp Met Ile Ala Val Leu Ile Val Leu Ser15 20 25ctg aca gtg gtg gca gtg acc ata ggt ctc ctg gtt cac ttc cta gta 209Leu Thr Val Val Ala Val Thr Ile Gly Leu Leu Val His Phe Leu Val30 35 40ttt gac caa aaa aag gag ttc tat cct ggc tcc ttt aaa att tta gat 257Phe Asp Gln Lys Lys Glu Phe Tyr Pro Gly Ser Phe Lys Ile Leu Asp45 50 55ccg caa atc aat aac aat ttc gga caa agc aac aca tat caa ctt aag 305Pro Gln Ile Asn Asn Asn Phe Gly Gln Ser Asn Thr Tyr Gln Leu Lys60 65 70 75gac tta cga gag acg acc gaa aat ttg gtg gat gag ata ttt ata gat 353Asp Leu Arg Glu Thr Thr Glu Asn Leu Val Asp Glu Ile Phe Ile Asp80 85 90tca gcc tgg aag aaa aat tat atc aag aac caa gta gtc aga ctg act 401ser Ala Trp Lys Lys Asn Tyr Ile Lys Asn Gln Val Val Arg Leu Thr95 100 105cca gag gaa gat ggt gtg aaa gta gat gtc att atg gtg ttc cag ttc 449Pro Glu Glu Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile Met Val Phe Gln Phe110 115 120ccc tct act gaa caa agg gca gta aga gag aag aaa atc caa agc atc 497Pro Ser Thr Glu Gln Arg Ala Val Arg Glu Lys Lys Ile Gln Ser Ile125 130 135tta aat cag aag ata agg aat tta aga gcc ttg cca ata aat gcc tca 545Leu Asn Gln Lys Ile Arg Asn Leu Arg Ala Leu Pro Ile Asn Ala Ser140 145 150 155tca gtt caa gtt aat gca atg agc tca tca aca ggg gag tta att gtc 593Ser Val Gln Val Asn Ala Met Ser Ser Ser Thr Gly Glu Leu Ile Val160 165 170caa gca agt tgt ggt aaa cga gtt gtt cca cta aac gtc aac aga ata 641Gln Ala Ser Cys Gly Lys Arg Val Val Pro Leu Asn Val Asn Arg Ile175 180 185gca tct gga gtc att gca ccc aag gcg gcc tgg cct tgg caa gct tcc 689Ala Sar Gly Val Ile Ala Pro Lys Ala Ala Trp Pro Trp Gln Ala Ser190 195 200ctt cag tat gat aac atc cat cag tgt ggg gcc acc ttg att agt aac 737Leu Gln Tyr Asp Asn Ile His Gln Cys Gly Ala Thr Leu Ile Ser Asn205 210 215aca tgg ctt gtc act gca gca cac tgc ttc cag aag tat aaa aat cca 785Thr Trp Leu Val Thr Ala Ala His Cys Phe Gln Lys Tyr Lys Asn Pro220 225 230 235Cat caa tgg act gtt agt ttt gga aca aaa atc aac cct ccc tta atg 833His Gln Trp Thr Val Ser Phe Gly Thr Lys Ile Asn Pro Pro Leu Met240 245 250aaa aga aat gtc aga aga ttt att atc cat gag aag tgc cgc tct gca 881Lys Arg Asn Val Arg Arg Phe Ile Ile His Glu Lys Cys Arg Ser Ala255 260 265cca aga aag tac gac att gct gtt gtg cag gtc tct tcc aga gtc acc 929Pro Arg Lys Tyr Asp Ile Ala Val Val Gln Val Ser Ser Arg Val Thr270 275 280ttt ccg gat gac ata cgc cgg att tgt ttg cca gaa gcc tct gca tcc 977Phe Pro Asp Asp Ile Arg Arg Ile Cys Leu Pro Glu Ala Ser Ala Ser285 290 295ttc caa cca aat ttg act gtc cac atc aca gga ttt gga gca ctt tac 1025Phe Gln Pro Asn Leu Thr Val His Ile Thr Gly Phe Gly Ala Leu Tyr300 305 310 315tat ggt ggg gaa tcc caa aat gat ctc cga gaa gtc aga gtg aaa atc 1073Tyr Gly Gly Glu Ser Gln Asn Asp Leu Arg Glu Val Arg Val Lys Ile320 325 330ata agt gat gat gtc tgc aag caa cca cag gtg tat ggc aat gat ata 1121Ile Ser Asp Asp Val Cys Lys Gln Pro Gln Val Tyr Gly Asn Asp Ile335 340 345aaa cct gga atg ttc tgt gcc gga tat atg gaa gga att tat gat gcc 1169Lys Pro Gly Met Phe Cys Ala Gly Tyr Met Glu Gly Ile Tyr Asp Ala350 355 360tgc agg ggt gat tcc tgg ggg acc ttt agt cac aag gga tct gaa aga 1217Cys Arg Gly Asp Ser Trp Gly Thr Phe Ser His Lys Gly Ser Glu Arg365 370 375tac gtg gta tct cat tgg aat tgt aag ctg ggg aga taactgtggt1263Tyr Val Val Ser His Trp Asn Cys Lys Leu Gly Arg380 385 390caaaaggaca agcctggagt ctacacacaa gtgacttatt accgaaactg gattgcttca 1323aaaacaggca tctaattcac aataaaagtt aaacaaagaa aaaaaaaaaa aa 1375<210>2<211>391<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Mat Met Tyr Arg Thr Val Gly Phe Gly Thr Arg Ser Arg Asn Leu Lys1 5 10 15Pro Trp Met Ile Ala Val Leu Ile Val Leu Ser Leu Thr Val Val Ala20 25 30Val Thr Ile Gly Leu Leu Val His Phe Leu Val Phe Asp Gln Lys Lys35 40 45Glu Phe Tyr Pro Gly Ser Phe Lys Ile Leu Asp Pro Gln Ile Asn Asn50 55 60Asn Phe Gly Gln Ser Asn Thr Tyr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Glu Thr65 70 75 80Thr Glu Asn Leu Val Asp Glu Ile Phe Ile Asp Ser Ala Trp Lys Lys85 90 95Asn Tyr Ile Lys Asn Gln Val Val Arg Leu Thr Pro Glu Glu Asp Gly100 105 110Val Lys Val Asp Val Ile Met Val Phe Gln Phe Pro Ser Thr Glu Gln115 120 125Arg Ala Val Arg Glu Lys Lys Ile Gln Ser Ile Leu Asn Gln Lys Ile130 135 140Arg Asn Leu Arg Ala Leu Pro Ile Asn Ala Ser Ser Val Gln Val Asn145 150 155 160Ala Met Ser Ser Ser Thr Gly Glu Leu Ile Val Gln Ala Ser Cys Gly165 170 175Lys Arg Val Val Pro Leu Asn Val Asn Arg Ile Ala Ser Gly Val Ile190 185 190Ala Pro Lys Ala Ala Trp Pro Trp Gln Ala Ser Leu Gln Tyr Asp Asn195 200 205Ile His Gln Cys Gly Ala Thr Leu Ile Ser Asn Thr Trp Leu Val Thr210 215 220Ala Ala His Cys Phe Gln Lys Tyr Lys Asn Pro His Gln Trp Thr Val225 230 235 240Ser Phe Gly Thr Lys Ile Asn Pro Pro Leu Met Lys Arg Asn Val Arg245 250 255Arg Phe Ile Ile His Glu Lys Cys Arg Ser Ala Pro Arg Lys Tyr Asp260 265 270Ile Ala Val Val Gln Val Ser Ser Arg Val Thr Phe Pro Asp Asp Ile275 280 285Arg Arg Ile Cys Leu Pro Glu Ala Ser Ala Ser Phe Gln Pro Asn Leu290 295 300Thr Val His Ile Thr Gly Phe Gly Ala Leu Tyr Tyr Gly Gly Glu Ser305 310 315 320Gln Asn Asp Leu Arg Glu Val Arg Val Lys Ile Ile Ser Asp Asp Val325 330 335Cys Lys Gln Pro Gln Val Tyr Gly Asn Asp Ile Lys Pro Gly Met Phe340 345 350Cys Ala Gly Tyr Met Glu Gly Ile Tyr Asp Ala Cys Arg Gly Asp Ser355 360 365Trp Gly Thr Phe Ser His Lys Gly Ser Glu Arg Tyr Val Val Ser His370 375 380Trp Asn Cys Lys Leu Gly Arg385 390
權(quán)利要求
1.分離或純化的編碼蛋白或其片段的核酸序列，所述蛋白含有SEQ IDNO 2的氨基酸序列，或與之有至少50％同源性的氨基酸序列，其中所說的蛋白或其肽片段具有抑制食管上皮細(xì)胞腫瘤生長速度的活性。
2.權(quán)利要求1的核酸，其特征在于其分子量在43和47kD之間。
3.權(quán)利要求1或2的核酸，其特征在于它編碼的活性蛋白或片段序列結(jié)合或側(cè)接于一個或更多編碼標(biāo)記序列，例如GST或GFP融合序列的區(qū)域，或能增強(qiáng)對細(xì)胞膜，尤其是食管上皮細(xì)胞膜穿透力的序列的區(qū)域。
4.權(quán)利要求1至3任一項的核酸序列，其特征在于能夠在標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格雜交條件下與SEQ ID NO 1的核酸雜交，標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格雜交條件是2×SSC，65℃；更優(yōu)選的高度嚴(yán)格條件是0.2×SSC，65℃。
5.權(quán)利要求1-4任一項的核酸，其特征在于該核酸是mRNA，cDNA，探針或引物。
6.權(quán)利要求1-5任一項所述的DNA，它與啟動子序列及任選的其他調(diào)控序列可操縱地連接，這些序列允許DNA表達(dá)，從而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明所述的食管腫瘤生長抑制蛋白或片段。
7.權(quán)利要求6的DNA，其中細(xì)胞用于產(chǎn)生蛋白，然后由細(xì)胞中分離并純化蛋白作為抗腫瘤藥劑、疫苗或診斷試劑盒的一部分。
8.分離、純化、無菌或無熱原質(zhì)形式的蛋白或其片段，其包含SEQ IDNO 2的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列有至少50％同源性，其中所說的蛋白或肽片段具有抑制食管上皮細(xì)胞腫瘤生長速度的活性。
9.權(quán)利要求8的蛋白，其分子量在43和47kD之間。
10.權(quán)利要求8或9的蛋白或片段，其結(jié)合或側(cè)接于一個或更多標(biāo)記物氨基酸序列，例如GST或GFP融合序列，或能增強(qiáng)對細(xì)胞膜，尤其是食管上皮細(xì)胞膜穿透力的序列。
11.包含權(quán)利要求1-7任一項的核酸的能表達(dá)權(quán)利要求8，9或10的蛋白或蛋白片段的表達(dá)載體，所述核酸與啟動子或任選的其他能引起蛋白或片段在靶腫瘤細(xì)胞或蛋白生成細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控區(qū)域可操縱地連接。
12.權(quán)利要求11的載體，其特征在于它是具有感染食管上皮細(xì)胞并表達(dá)蛋白或片段的突變病毒。
13.權(quán)利要求1-7任一項的核酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
14.權(quán)利要求8-10任一項的蛋白或片段的抗體。
15.一種診斷編碼異常食管腫瘤生長抑制蛋白的基因ECRG1存在的方法，包括確定患者食管組織樣本中是否存在所述基因和/或測序，并將其蛋白產(chǎn)物與已知的SEQ ID NO 2及其具有減低或增強(qiáng)的抑制食管上皮細(xì)胞腫瘤生長效果的變體序列的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行比較，確定所述基因序列丟失或ECRG1活性降低的患者存在發(fā)生食管腫瘤的高危因素。
16.一種治療可疑癌癥患者的方法，包括給患者施用有效量的權(quán)利要求8-10中任一項的蛋白或片段，抑制腫瘤的生長。該可疑癌癥優(yōu)選食管腫瘤。
17.一種治療可疑癌癥患者的方法，包括給患者施用有效量的權(quán)利要求12的病毒載體，感染任何腫瘤細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生有效量的蛋白或蛋白片段來抑制腫瘤的生長。該可疑癌癥優(yōu)選食管癌。
18.一種延長癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的方法，包括用權(quán)利要求8-12任一項的蛋白或片段或載體處理該細(xì)胞。
19.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求8-10任一項的蛋白或其片段與藥物可接受的載體、稀釋液或賦形劑。優(yōu)選無菌和無熱原質(zhì)形式的組合物。
20.權(quán)利要求8-10任一項的蛋白或片段在制備治療癌癥，尤其是食管腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
21.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求11的載體，尤其是病毒載體，與藥物可接受的載體、稀釋液或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以前未被鑒定的蛋白和片段，其具有抑制食管腫瘤生長的活性。
文檔編號C07K14/47GK1425681SQ0113838
公開日2003年6月25日 申請日期2001年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月12日
發(fā)明者S·H·盧 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所, 國家癌癥研究基金