專利名稱：選擇性控制基因表達(dá)的植物調(diào)節(jié)序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及控制植物中基因表達(dá)的核酸分子的分離和用途，特別是新型植物啟動(dòng)子。本發(fā)明要求1999年9月1日提交的美國臨時(shí)申請60/151,892的優(yōu)先權(quán)，在此引入其完整內(nèi)容作為參考。
背景技術(shù)：
植物基因工程的目標(biāo)之一是產(chǎn)生具有農(nóng)業(yè)上重要的特征或性狀的植物。基因工程最近的發(fā)展為將植物轉(zhuǎn)化為包含并表達(dá)外來基因提供了必備的工具(Kahl et al.(1995)World Journal of Microbiology andBiotechnology 11449-460)。植物基因工程特別需要的性狀或感興趣的特性應(yīng)該包括，但不限于抗昆蟲和其它害蟲及致病劑、耐受除草劑、增加的穩(wěn)定性、產(chǎn)量或儲(chǔ)存期、環(huán)境耐受和營養(yǎng)增強(qiáng)。植物轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)的發(fā)展使研究者可以從異源來源或修飾為有不同的或改進(jìn)的特性的原生來源取出DNA片段，如基因，并將外源性DNA整合進(jìn)植物基因組。然后基因可以在植物細(xì)胞中表達(dá)，顯示添加的特征或性狀。在一種方法中，正常情況下在特定植物或植物組織不表達(dá)的新型基因的表達(dá)可以賦予需要的表型效果。在另一種方法中，以反義方向進(jìn)行的基因或基因一部分的轉(zhuǎn)錄可以通過防止或抑制內(nèi)源性基因的表達(dá)產(chǎn)生需要的作用。
分離植物啟動(dòng)子對(duì)通過基因工程修飾植物而產(chǎn)生需要的表型特征是有用的。為產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)基因植物，將包括在植物中表達(dá)時(shí)賦予需要表型的異源基因序列的載體引入植物細(xì)胞。此載體也包括可操作連接到異源基因序列的植物啟動(dòng)子，通常啟動(dòng)子在正常情況下與異源基因不相關(guān)聯(lián)。然后將載體引入植物細(xì)胞而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生到轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)。啟動(dòng)子控制引入的與啟動(dòng)子可操作連接的DNA序列的表達(dá)并因此影響DNA序列賦予的所需特征。
由于啟動(dòng)子是在基因的總體表達(dá)中不可或缺的5’調(diào)節(jié)元件，具有多種啟動(dòng)子而適應(yīng)基因表達(dá)使得基因在植物生長和發(fā)育過程中的恰當(dāng)時(shí)間、在植物的最佳位置和以產(chǎn)生所需效果的必要量有效轉(zhuǎn)錄是有利的。例如，在一種情況下，基因產(chǎn)物的組成型表達(dá)在植物的一個(gè)位置可能是有益的，而在植物的另一個(gè)部分可能無益。在其它情況下，使基因產(chǎn)物在植物的某個(gè)發(fā)育階段或應(yīng)答于某種環(huán)境或化學(xué)刺激而產(chǎn)生是有益的。遺傳改進(jìn)種質(zhì)的商業(yè)發(fā)展也已經(jīng)進(jìn)展到將多種性狀引入農(nóng)作物，也稱作基因堆積法。在這種方法中，賦予不同感興趣特征的多種基因可以被引入植物。當(dāng)把多種基因引入植物時(shí)，重要的是每種植物被調(diào)節(jié)或控制進(jìn)行最優(yōu)表達(dá)以及調(diào)節(jié)元件為多樣的，從而減少可以由同源序列重組導(dǎo)致的潛在基因沉默。根據(jù)這些和其它考慮，很明顯的是，基因表達(dá)的最優(yōu)控制和調(diào)節(jié)元件多樣性在植物生物技術(shù)中是很重要的。
適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列必需出現(xiàn)在感興趣的DNA序列的適當(dāng)位置，使新插入的DNA轉(zhuǎn)錄并且如果需要，可以在植物細(xì)胞中翻譯為蛋白質(zhì)。這些調(diào)節(jié)序列包括但不限于啟動(dòng)子，5’非翻譯前導(dǎo)序列和3’端聚腺苷酸化序列。選擇轉(zhuǎn)錄這種外來DNA的組織的能力和獲得這種外來DNA轉(zhuǎn)錄的植物生長時(shí)間的能力通過選擇控制這些基因轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子序列而成為可能。
許多不同類型的啟動(dòng)子可以用于植物基因工程。啟動(dòng)子可以根據(jù)范圍或組織特異性分類。例如，被稱作組成型啟動(dòng)子的啟動(dòng)子可以有效轉(zhuǎn)錄操作連接的DNA序列并在多種組織中表達(dá)該DNA序列。組織增強(qiáng)型或組織特異性啟動(dòng)子可以在DNA序列上游并與其操作連接，這些DNA序列正常情況下以高水平在某些植物組織或特異性在某些植物組織中轉(zhuǎn)錄。其它啟動(dòng)子類型包括，但不限于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它可以被外部刺激如化學(xué)試劑、發(fā)育刺激或環(huán)境刺激觸發(fā)。這樣，所需不同類型的啟動(dòng)子可以通過分離以組成、組織增強(qiáng)或可誘導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的DNA序列上游5’端調(diào)節(jié)區(qū)而獲得。
高流通量測序和生物信息學(xué)的技術(shù)發(fā)展為啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)提供了額外的分子工具。可以將處在特定發(fā)育階段，或在特定化學(xué)、環(huán)境或生理狀況下的特定靶植物細(xì)胞、組織或器官作為來源物質(zhì)而分離mRNA和構(gòu)建cDNA文庫。迅速測序cDNA文庫并電子分類表達(dá)序列。使用序列分析軟件，可以在短時(shí)間內(nèi)分析成千上萬的序列，并且可以對(duì)比所選cDNA文庫中的序列。實(shí)驗(yàn)室和基于計(jì)算機(jī)的扣除法的結(jié)合允許研究者掃描和對(duì)比cDNA文庫并識(shí)別有所需表達(dá)形態(tài)的序列。例如，可以通過對(duì)比一種組織的cDNA文庫與其它組織的cDNA文庫并電子“扣除”共同序列從而找到只在感興趣的靶組織中表達(dá)的序列而識(shí)別優(yōu)先在一種組織中表達(dá)的序列。然后組織增強(qiáng)序列可以用于探針和引物而克隆對(duì)應(yīng)的全長cDNA。然后靶植物的基因組文庫可以用于分離對(duì)應(yīng)基因和相關(guān)調(diào)節(jié)元件，包括啟動(dòng)子序列。
可以通過選擇性對(duì)比cDNA靶胚發(fā)生或愈傷組織文庫與非靶或本底cDNA文庫如葉和根組織文庫而找到與靶文庫中的被表達(dá)序列相關(guān)的5’調(diào)節(jié)區(qū)，從而分離賦予所需表達(dá)形態(tài)的多種啟動(dòng)子序列如胚發(fā)生或愈傷組織增強(qiáng)或特異性啟動(dòng)子。分離的啟動(dòng)子序列可以在基因堆積法中用于選擇性調(diào)節(jié)任何操作連接基因的表達(dá)并在植物表達(dá)載體中提供額外的調(diào)節(jié)元件多樣性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含位于植物DNA結(jié)構(gòu)編碼序列5’端上游的調(diào)節(jié)序列的核酸序列，這些序列在胚發(fā)生或愈傷組織中轉(zhuǎn)錄，如SEQ IN NOS36-51所示。
一方面，本方面提供了包含選自SEQ ID NOS36-51或此序列的任何片段、區(qū)域或順式元件的可以調(diào)節(jié)可操作連接的DNA序列的轉(zhuǎn)錄的核酸序列。
本發(fā)明也提供了包含選自啟動(dòng)子序列SEQ ID NOS36-51之一的序列的核酸序列。
本發(fā)明的另一方面涉及公開的5’啟動(dòng)子序列的至少一種順式元件，或片段或區(qū)域的用途，它們可以結(jié)合起來建立新型啟動(dòng)子或應(yīng)用于與另一種異源調(diào)節(jié)序列的新穎結(jié)合而建立可以調(diào)節(jié)可操作連接的DNA序列的轉(zhuǎn)錄的嵌合啟動(dòng)子。
所以，本發(fā)明涉及公開于SEQ ID NOS36-51，或當(dāng)與DNA序列可操作連接時(shí)可以調(diào)節(jié)DNA序列轉(zhuǎn)錄的該公開序列的任何片段、區(qū)域或順式元件的用途。所以，本發(fā)明不僅包括公開于SEQ ID NOS36-51的序列，也包括可以作為啟動(dòng)子獨(dú)立行使功能的其任何截短或缺失衍生物，或其片段或區(qū)域，包括當(dāng)可操作連接到可轉(zhuǎn)錄序列時(shí)可以與一種或更多調(diào)節(jié)序列結(jié)合作為調(diào)節(jié)序列行使功能的順式元件。
因此本發(fā)明包括含公開于SEQ ID NOS36-51的核酸序列的新型啟動(dòng)子，或嵌合或雜合啟動(dòng)子。嵌合或雜合啟動(dòng)子可以由與其它任何有轉(zhuǎn)錄活性的最小或全長啟動(dòng)子結(jié)合的公開序列SEQ ID NOS36-51的任何長度的片段、區(qū)域或順式元件組成。例如，選自SEQ ID NOS36-51的啟動(dòng)子序列可以與CaMV 35S或其它啟動(dòng)子結(jié)合而構(gòu)建新型啟動(dòng)子。最小啟動(dòng)子也可以與本發(fā)明的核酸序列結(jié)合使用。新型啟動(dòng)子也可以包含任何由以足夠轉(zhuǎn)錄可操作連接的DNA序列的方式制造公開于SEQ IDNOS36-51的序列或公開序列的任何片段、區(qū)域或順式元件而構(gòu)建的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的另一方面涉及啟動(dòng)子序列SEQ ID NOS36-51，或其片段、區(qū)域或順式元件調(diào)節(jié)胚發(fā)生或愈傷組織中可操作連接的可轉(zhuǎn)錄序列的能力。在某些組織能夠調(diào)節(jié)可操作連接的SEQ ID NOS36-51的片段、區(qū)域或順式元件可以從核酸序列SEQ ID NOS36-51分離出來并用于制造賦予可操作連接DNA序列胚發(fā)生增強(qiáng)或愈傷組織增強(qiáng)表達(dá)或與其它異源調(diào)節(jié)序列結(jié)合的新型啟動(dòng)子。
本發(fā)明也包括含SEQ ID NOS36-51所表示的公開序列或其任何片段、區(qū)域或順式元件的DNA構(gòu)建體，包括用公開序列或公開序列的片段、區(qū)域或順式元件產(chǎn)生的新型啟動(dòng)子。
本發(fā)明也包括任何含公開于SEQ ID NOS36-51所表示的DNA或其任何片段、區(qū)域或順式元件的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明也提供了一種調(diào)節(jié)DNA序列轉(zhuǎn)錄的方法，包括將DNA序列可操作連接到任何包含選自SEQ ID NOS36-51的序列的所有或任何片段、區(qū)域或順式元件。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案提供了一種通過可操作連接選自SEQ IDNOS36-51的序列，或公開序列的任何片段、區(qū)域或順式元件到可轉(zhuǎn)錄DNA序列而賦予胚發(fā)生或愈傷組織增強(qiáng)或特異性表達(dá)的方法。以SEQID NOS36-51表示的，賦予可操作連接的DNA序列在胚發(fā)生或愈傷組織增強(qiáng)表達(dá)的公開啟動(dòng)子的片段、區(qū)域或順式元件可以被工程改造并獨(dú)立用于包括多聚體，或截短的衍生物的新組合，并且新型啟動(dòng)子可以與可轉(zhuǎn)錄DNA序列可操作連接。可以賦予可操作連接的DNA序列在胚發(fā)生或愈傷組織中增強(qiáng)表達(dá)的公開序列的公開片段、區(qū)域或順式元件可以與包括最小啟動(dòng)子的異源啟動(dòng)子結(jié)合而建立新型啟動(dòng)子或雜合啟動(dòng)子。
本發(fā)明也提供了一種通過將含(i)包含含有選自SEQ ID NOS36-51，或其片段、區(qū)域或順式元件的序列并操作連接到啟動(dòng)子的核酸的啟動(dòng)子，(ii)可轉(zhuǎn)錄DNA序列和(iii)3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)的DNA構(gòu)建體引入植物細(xì)胞中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法。
本發(fā)明也提供了一種從感興趣的靶植物分離所需表達(dá)圖譜的至少一個(gè)5’調(diào)節(jié)序列的方法，包含通過評(píng)價(jià)源于由感興趣的植物細(xì)胞類型制備的至少一種cDNA文庫的ESTs核酸序列集合，比較至少一種靶植物cDNA文庫的EST序列和至少一種不同植物細(xì)胞類型中的非靶cDNA文庫的ESTs，扣除在靶和非靶文庫中共同的EST序列，從扣除后剩余的代表靶表達(dá)序列的ESTs設(shè)計(jì)基因特異性引物，并分離至少一種對(duì)應(yīng)的5’側(cè)翼和調(diào)節(jié)序列，它包括用基因特異性引物從靶植物制備的基因組文庫中得到的至少一種啟動(dòng)子序列。
從下面的發(fā)明詳述和附圖將更明顯得到本發(fā)明前面的內(nèi)容和其它方面。
附圖簡述

圖1是pMON19469的質(zhì)粒2是pMON39721的質(zhì)粒3是pMON51002的質(zhì)粒4是pMON51008的質(zhì)粒5是pMON51001的質(zhì)粒6是pMON51009的質(zhì)粒7是pMON51003的質(zhì)粒8是pMON51010的質(zhì)粒圖質(zhì)粒pMON19469是由下列基因成分組成的表達(dá)載體P-CaMV.35S是CaMV的35S RNA的啟動(dòng)子，含有-90到-300區(qū)的一個(gè)串聯(lián)重復(fù)(美國專利No.5,322,938，在此引入其完整內(nèi)容作為參考)；I-Zm.Hsp70內(nèi)含子是玉米熱休克蛋白的間插序列，如美國專利5,593,874和5,859,347所描述，在此引入其完整內(nèi)容作為參考；Ec.GUS1為大腸桿菌β葡糖醛酸糖苷酶的編碼區(qū)；T-AGRTU.nos是胭脂堿合成酶基因的終止信號(hào)；ori-M13和ori-pUC為復(fù)制起點(diǎn)；AMP為氨芐青霉素選擇的編碼區(qū)。
質(zhì)粒pMON39721為雙邊(右(RB)和左(LB)T-DNA邊)植物轉(zhuǎn)化載體，由下列基因成分組成P-CaMV.35S是CaMV 35S啟動(dòng)子(美國專利No.5,352,605，在此引入其完整內(nèi)容作為參考)；AGRTU.npt II為根癌土壤桿菌的編碼序列，賦予卡那霉素抗生素的耐藥性；T-AGRTU.nos為從根癌土壤桿菌分離的胭脂堿合成酶基因的3’終止序列；ori322和oriV為復(fù)制起點(diǎn)，aad為賦予放線菌素和鏈霉素抗生素耐藥性的編碼序列。
質(zhì)粒pMON51002為下列基因成分組成的表達(dá)載體ZM-70025861是從玉米胚基因組文庫中分離的進(jìn)行胚增強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子；I-Zm.Hsp70內(nèi)含子是玉米熱休克蛋白的間插序列，如美國專利5,593,874和5,859,347所描述，在此引入其完整內(nèi)容作為參考；Ec.GUS1為大腸桿菌β葡糖醛酸糖苷酶的編碼區(qū)；T-AGRTU.nos是胭脂堿合成酶基因的終止信號(hào)；ori-M13和ori-pUC為復(fù)制起點(diǎn)；AMP為氨芐青霉素選擇的編碼區(qū)。
質(zhì)粒pMON51008為雙邊，右(RB)和左(LB)T-DNA邊，植物轉(zhuǎn)化載體，由下列基因成分組成ZM-70025861是從玉米胚基因組文庫中分離的進(jìn)行胚增強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子；I-Zm.Hsp70內(nèi)含子是玉米熱休克蛋白的間插序列，如美國專利5,593,874和5,859,347所描述，在此引入其完整內(nèi)容作為參考；Ec.GUS1為大腸桿菌β葡糖醛酸糖苷酶的編碼區(qū)；T-AGRTU.nos是胭脂堿合成酶基因的終止信號(hào)；P-CaMV.35S是CaMV35S啟動(dòng)子(美國專利No.5,352,605，在此引入其完整內(nèi)容作為參考)；AGRTU.npt II為根癌土壤桿菌的編碼序列，賦予卡那霉素抗生素的耐藥性；T-AGRTU.nos為從根癌土壤桿菌分離的胭脂堿合成酶基因的3’終止序列；ori322和oriV為復(fù)制起點(diǎn)，aad為賦予放線菌素和鏈霉素抗生素耐藥性的編碼序列。
質(zhì)粒pMON51001為下列基因成分組成的表達(dá)載體ZM-700267629是從玉米胚基因組文庫中分離的進(jìn)行胚增強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子；I-Zm.Hsp70內(nèi)含子是玉米熱休克蛋白的間插序列，如美國專利5,593,874和5,859,347所描述，在此引入其完整內(nèi)容作為參考；Ec.GUS1為大腸桿菌β葡糖醛酸糖苷酶的編碼區(qū)；T-AGRTU.nos是胭脂堿合成酶基因的終止信號(hào)；ori-M13和ori-pUC為復(fù)制起點(diǎn)；AMP為氨芐青霉素選擇的編碼區(qū)。
質(zhì)粒pMON51009為雙邊，右(RB)和左(LB)T-DNA邊，的植物轉(zhuǎn)化載體，由下列基因成分組成ZM-700267629是從玉米胚基因組文庫中分離的進(jìn)行胚增強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子；I-Zm.Hsp70內(nèi)含子是玉米熱休克蛋白的間插序列，如美國專利5,593,874和5,859,347所描述，在此引入其完整內(nèi)容作為參考；Ec.GUS1為大腸桿菌β葡糖醛酸糖苷酶的編碼區(qū)；T-AGRTU.nos是胭脂堿合成酶基因的終止信號(hào)；P-CaMV.35S是CaMV 35S啟動(dòng)子(美國專利No.5,352,605，在此引入其完整內(nèi)容作為參考)；AGRTU.npt II為根癌土壤桿菌的編碼序列，賦予卡那霉素抗生素的耐藥性；T-AGRTU.nos為從根癌土壤桿菌分離的胭脂堿合成酶基因的3’終止序列；ori322和oriV為復(fù)制起點(diǎn)，aad為賦予放線菌素和鏈霉素抗生素耐藥性的編碼序列。
質(zhì)粒pMON51001為下列基因成分組成的表達(dá)載體ZM-700263624是從玉米胚基因組文庫中分離的進(jìn)行胚增強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子；I-Zm.Hsp70內(nèi)含子是玉米熱休克蛋白的間插序列，如美國專利5,593,874和5,859,347所描述，在此引入其完整內(nèi)容作為參考；Ec.GUS1為大腸桿菌β葡糖醛酸糖苷酶的編碼區(qū)；T-AGRTU.nos是胭脂堿合成酶基因的終止信號(hào)；ori-M13和ori-pUC為復(fù)制起點(diǎn)；AMP為氨芐青霉素選擇的編碼區(qū)。
質(zhì)粒pMON51009為雙邊，右(RB)和左(LB)T-DNA邊，的植物轉(zhuǎn)化載體，由下列基因成分組成ZM-700263624是從玉米胚基因組文庫中分離的進(jìn)行胚增強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子；I-Zm.Hsp70內(nèi)含子是玉米熱休克蛋白的間插序列，如美國專利5,593,874和5,859,347所描述，在此引入其完整內(nèi)容作為參考；Ec.GUS1為大腸桿菌β葡糖醛酸糖苷酶的編碼區(qū)；T-AGRTU.nos是胭脂堿合成酶基因的終止信號(hào)；P-CaMV.35S是CaMV 35S啟動(dòng)子(美國專利No.5,352,605，在此引入其完整內(nèi)容作為參考)；AGRTU.npt II為根癌土壤桿菌的編碼序列，賦予卡那霉素抗生素的耐藥性；T-AGRTU.nos為從根癌土壤桿菌分離的胭脂堿合成酶基因的3’終止序列；ori322和oriV為復(fù)制起點(diǎn)，aad為賦予放線菌素和鏈霉素抗生素耐藥性的編碼序列。
發(fā)明詳述本申請要求99年9月1日提交的美國臨時(shí)申請60/151,892的權(quán)益。
感興趣的基因(GOI)賦予除草劑或抗生素耐受，例如，殺昆蟲蛋白基因，抗疾病基因，影響植物生長、代謝或發(fā)育、產(chǎn)油或修飾油的基因和編碼藥物蛋白的基因，被考慮為本發(fā)明的各方面。這里公開的組合物和方法可以用于任何可以通過植物生物技術(shù)方法進(jìn)行遺傳修飾的植物。這里描述的組合物和方法描述對(duì)植物胚和植物種子中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的表達(dá)有用的DNA序列。
為在本發(fā)明實(shí)施過程更好地定義本發(fā)明和指導(dǎo)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，提供了下列定義和方法。除非有其它注解，應(yīng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員的常規(guī)用法理解各名詞。使用了闡述于37 CFR§1.882的DNA堿基命名。使用了氨基酸殘基的標(biāo)準(zhǔn)1和3字母命名。
“核酸(序列)”或“多核苷酸(序列)”是指基因組或合成來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA，即分別為脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的聚合物，從5’(上游)端到3’(下游)端。核酸可以表示有意義或互補(bǔ)(反義)鏈。
“天然的”是指天然存在的(“野生型”)核酸序列。
“異源性”序列是指從外部來源或物種起源的序列，如果來自于相同來源，其原始形式經(jīng)過了修飾。
“分離的”核酸序列基本與在核酸天然存在的生物細(xì)胞中與其正常相關(guān)的其它核酸序列即其它染色體或染色體外DNA分開或從中被純化出來。此名詞包含了生化上被純化，因而基本去掉污染核酸和其它細(xì)胞成分的核酸。此名詞也包括了重組核酸和化學(xué)合成核酸。
這里使用的名詞“基本純化的”是指基本與在其天然狀態(tài)下與其正常相關(guān)的其它分子分離的分子。更優(yōu)選地，基本純化的分子是在制劑中的主要種類。基本純化的分子可以是大于60％，優(yōu)選70％，更優(yōu)選90％從其它存在于天然混合物中的分子(除溶劑)分離開。名詞“基本純化的”不準(zhǔn)備包括以天然狀態(tài)存在的分子。
如果第一個(gè)核酸序列顯示“基本等同”于一個(gè)參照核酸序列，當(dāng)與另一條核酸(或其互補(bǔ)鏈)進(jìn)行最優(yōu)對(duì)比(有適當(dāng)核苷酸插入或缺失，在比較窗中總共小于20％)時(shí)，在至少20個(gè)核苷酸位置，優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸位置，更優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸位置，最優(yōu)選在第一個(gè)核酸的全長的比較窗中有至少約75％的核苷酸序列等同性，優(yōu)選至少約80％的等同性，更優(yōu)選至少約85％的等同性，最優(yōu)選約90％的等同性?？梢酝ㄟ^Smith and Waterman局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2482,1981；通過Needleman and Wunsch同源性算法，J.Mol.Biol.48443，1970；通過Pearson and Lipman相似性搜索法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988；優(yōu)選通過這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)(GAP，BBSTFIT，F(xiàn)ASTA，and TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI.)進(jìn)行對(duì)比比較窗的序列最優(yōu)對(duì)比。參照核苷酸可以是全長分子或更長分子的一部分。另外，如果一個(gè)核酸與另一個(gè)核酸在下面定義的嚴(yán)格條件下雜交，那么兩個(gè)核酸具有基本等同性。
當(dāng)序列排列為第一個(gè)核酸序列影響第二個(gè)核酸序列的功能時(shí)，第一個(gè)核酸序列與第二個(gè)核酸序列“可操作連接”。優(yōu)選地，這兩個(gè)序列是單個(gè)連續(xù)核酸序列的一部分并優(yōu)選鄰近。例如，如果啟動(dòng)子調(diào)節(jié)或介導(dǎo)細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子可操作連接于此基因。
“重組”核酸由兩個(gè)分開的序列片段的人工結(jié)合，如通過化學(xué)合成或通過用基因工程技術(shù)操作核酸的分離片段而產(chǎn)生。核酸操作的技術(shù)是熟知的(見如Sambrook et al.，1989，和Ausubel et al.，1992)。核酸的化學(xué)合成方法討論于，例如，Beaucage and Carruthers，Tetra.Letts.221859-1862，1981，和Matteucci et al.，JAm.Chem.Soc.1033185，1981。核酸的化學(xué)合成可以用例如可以買到的自動(dòng)寡核苷酸合成器進(jìn)行。
為在特定宿主細(xì)胞中增強(qiáng)表達(dá)和克隆到適當(dāng)載體中的目的，可以設(shè)計(jì)并化學(xué)合成“合成的核酸序列”。宿主細(xì)胞通常顯示優(yōu)選的密碼子使用模式(Murray et al.，1989)。設(shè)計(jì)為在特定宿主細(xì)胞中增強(qiáng)表達(dá)的合成DNA因此應(yīng)該反映宿主細(xì)胞中的密碼子使用模式?？梢杂糜谶@些目的的計(jì)算機(jī)程序包括但不限于序列分析軟件包的“BestFit”或“Gap”程序，Genetics Computer，Inc.University of Wisconsin BiotechnologyCenter，Madison，WI 53711。
核酸“擴(kuò)增”或“核酸復(fù)制”是指生成核酸序列的額外拷貝并用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)執(zhí)行。許多擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域中公知的，描述于美國專利4,683,195和4,683,202及描述于PCR方案A Guide toMethods and Applications，ed.Innis et al.，Academic Press，San Diego，1990。在PCR中，引物是指序列確定的短寡聚核苷酸，與DNA模板退火以起始聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)基因的”是指引入了外來核酸，如重組載體的細(xì)胞、組織、器官或生物體。優(yōu)選地，引入的核酸被整合到接受細(xì)胞、組織、器官或生物體的基因組DNA中，使得引入的核酸由以后的后代遺傳?！稗D(zhuǎn)基因的”或“轉(zhuǎn)化”的細(xì)胞或生物體也包括由在雜交中使用這種“轉(zhuǎn)基因”植物作為親代的雜交程序產(chǎn)生并表現(xiàn)出由于重組結(jié)構(gòu)或載體存在導(dǎo)致的改變表型的細(xì)胞或生物體或后代的后代。
名詞“基因”是指編碼肽、多肽、蛋白質(zhì)或RNA分子的染色體DNA、質(zhì)粒DNA、cDNA、合成DNA、或其它DNA，和參與表達(dá)調(diào)節(jié)的編碼序列側(cè)翼區(qū)。一些基因可以被轉(zhuǎn)錄為mRNA并翻譯為多肽(結(jié)構(gòu)基因)；其它基因可以被轉(zhuǎn)錄為RNA(如rRNA，tRNA)；另外一些類型的基因作為表達(dá)的調(diào)節(jié)物(調(diào)節(jié)物基因)。
基因的“表達(dá)”是指基因的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的mRNA及此mRNA的翻譯而產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的基因產(chǎn)物，即肽、多肽或蛋白質(zhì)?；虮磉_(dá)由包括5’調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)元件控制或調(diào)節(jié)。
“基因成分”是指也可以作為表達(dá)載體的成分或部分的任何核酸序列或基因元件。基因成分的例子包括，但不限于啟動(dòng)子區(qū)、5’非翻譯先導(dǎo)序列、內(nèi)含子、基因、3’非翻譯區(qū)和其它調(diào)節(jié)序列或影響一種或更多核酸序列轉(zhuǎn)錄或翻譯的序列。
名詞“重組DNA構(gòu)建體”、“重組載體”、“表達(dá)載體”或“表達(dá)盒”是指來自于任何來源、可以進(jìn)行基因組整合或自主復(fù)制的任何介質(zhì)如質(zhì)粒、粘粒、病毒、BAC(細(xì)菌人工染色體)、自主復(fù)制序列、噬菌體或線性或環(huán)形單鏈或雙鏈DNA或RNA核苷酸序列，包含一個(gè)或更多DNA序列以功能操作方式連接的DNA分子。
“互補(bǔ)的”是指核酸序列通過堿基配對(duì)(A-G-T與互補(bǔ)序列T-C-A配對(duì))天然相關(guān)。如果只有一些核酸對(duì)是互補(bǔ)的，兩個(gè)單鏈分子間的互補(bǔ)性可以是部分的；如果所有堿基對(duì)是互補(bǔ)的，互補(bǔ)性是完全的?；パa(bǔ)性的程度影響雜交和擴(kuò)增反應(yīng)的效率和強(qiáng)度。
“同源性”是指分別以核苷酸或氨基酸位置等同性百分比表示的核酸或氨基酸序列間的相似性水平，即序列的相似性或等同性。同源性也指不同核酸或蛋白質(zhì)之間相似的功能特性的概念。
“ESTs”或表達(dá)序列標(biāo)記是從cDNA(或互補(bǔ)DNA)文庫中隨機(jī)選擇的代表隨機(jī)選擇克隆的cDNA插入物的短序列(McCombie，et al.，Nature Genetics，1124，1992；Kurata，et al.，Nature Genetics，8365,1994；Okubo，et al.，Nature Genetics，2173，1992)。
名詞“電子Northern”是指一種基于計(jì)算機(jī)的序列分析，它允許多個(gè)cDNA文庫中的序列以研究者指定的參數(shù)包括多個(gè)cDNA文庫的EST群或?qū)ｉT由一種或多種文庫的結(jié)合建立的EST的豐度進(jìn)行電子對(duì)比。
“Subsetting”是指一種對(duì)比不同或多種來源的核酸序列的方法，可以用于估計(jì)反應(yīng)在特定組織、特定時(shí)間或在特定條件下的基因轉(zhuǎn)錄活性和信息穩(wěn)定性的核酸序列的表達(dá)圖譜。
“啟動(dòng)子”是指基因中位于開放讀框(或蛋白編碼區(qū))翻譯起始密碼子上游或5’的核酸序列，它參與識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶II和其它蛋白而起始轉(zhuǎn)錄。“植物啟動(dòng)子”是一種在植物細(xì)胞中起作用的天然或非天然啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子在植物發(fā)育中的大多數(shù)或所有植物組織中起作用。組織、器官或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子分別只在或主要在特定組織、器官或細(xì)胞類型中表達(dá)。除了在某些組織、器官或細(xì)胞類型中“特異性”表達(dá)，與植物其它部分相比，啟動(dòng)子可以在植物一部分表現(xiàn)出“增強(qiáng)的”表達(dá)，即高水平表達(dá)。時(shí)間調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子僅僅或主要在植物發(fā)育中的某些時(shí)間段或在一天中的某些時(shí)間起作用，例如，與晝夜節(jié)律相關(guān)的基因。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子應(yīng)答于內(nèi)源性或外源性刺激，例如化學(xué)化合物(化學(xué)誘導(dǎo)劑)或應(yīng)答于環(huán)境、激素、化學(xué)和/或發(fā)育信號(hào)而選擇性表達(dá)可操作連接的DNA序列。誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子包括，例如，由光、熱、壓力、洪水或干旱、植物激素、創(chuàng)傷、或化學(xué)物質(zhì)如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。
植物啟動(dòng)子可以用作調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)的5’調(diào)節(jié)序列。一種優(yōu)選的啟動(dòng)子將是植物RNA聚合酶II啟動(dòng)子。與其它高等真核生物的啟動(dòng)子相似，植物RNA聚合酶II啟動(dòng)子具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)并由一些不同的元件組成。這種元件之一是TATA盒或Goldberg-Hogness盒，是正確體外表達(dá)真核基因并準(zhǔn)確、有效起始體內(nèi)轉(zhuǎn)錄所需要的。TATA盒一般位于約-25到-35，即位于確定為+1位置的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或帽位點(diǎn)上游(5’)25到35堿基對(duì)(bp)的位置。(Breathnach and Chambon，Ann.Rev.Biochem.50349-383，1981；Messing et al.，InGenetic Engineering ofPlants，Kosuge et al.，eds.，pp.21 1-227，1983)。另一種常見的元件，CCAAT盒，位于-70和-100bp之間。在植物中，CCAAT盒可以與哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的功能相似物序列有不同的共有序列(植物相似物曾命名為“AGGA盒”，使其區(qū)分于動(dòng)物相似物；Messing et al.，InGeneticEngineering of Plants，Kosuge et al.，eds.，pp.211-227，1983)。另外，幾乎所有啟動(dòng)子都包括附加的上游激活序列或增強(qiáng)子(Benoist and Chambon，nature 290304-310，1981；Gruss et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA78943-947，1981；及Khoury and Gruss，Cell 27313-314，1983)，從約-100bp伸展到-1,000bp或在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的更上游。
當(dāng)與異源DNA序列融合時(shí)，這種啟動(dòng)子一般使融合序列以與啟動(dòng)子天然相關(guān)的基因序列的轉(zhuǎn)錄方式相似的方式轉(zhuǎn)錄。包括調(diào)節(jié)序列的啟動(dòng)子片段可以添加到(例如，與5’端融合，或插入)有自己的部分或完整的調(diào)節(jié)序列的活性的啟動(dòng)子(Fluhr et al.，Science 2321106-1112，1986；Ellis et al.，EMBO J.611-16，1987；Strittmatter and Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 848986-8990，1987；Poulsen and Chua，Mol.Gen.Genet.21416-23，1988；Comal Ct al.，Plant Mol.Biol.15373-381，1991)。另外，異源調(diào)節(jié)序列可以添加到無活性、截短的啟動(dòng)子如僅包括核心TATA和有時(shí)包括CCAAT元件的啟動(dòng)子的5’上游區(qū)(Flukir et al.，Science2321106-1112，1986；Strittmatter and Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA848986-8990，1987；Aryan et al.，Mol.Gen.Genet.22565-71，1991)。
啟動(dòng)子一般由多種不同的“順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件”，或簡稱為“順式元件”組成，每種可以賦予基因表達(dá)總體控制的不同方面(Stritttnatterand Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8439g6-g990，1987；Ellis et al.，EMBO J.611-16，1987；Benfey et al.，EMBO J.91677-1684，1990)?！绊樖皆迸c調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的反式作用蛋白因子結(jié)合。一些順式元件與一個(gè)以上的因子結(jié)合，反式轉(zhuǎn)錄因子可以以不同的親和性與一個(gè)以上順式元件相互作用(Johnson and McKnight，Ann.Rev.Biocliem.58799-839，1989)。對(duì)應(yīng)于順式元件的植物轉(zhuǎn)錄因子及它們的相互作用的分析討論于，例如Martin，Curr.Opinions Biotech.7130-138，1996；Murai，InMethods in Plant Biochemistry and Molecular Biology，Dashek，ed.，CRCPress，1997，pp.397422；and Methods in Plant Molecular Biology，Maligaet al.，eds.，Cold Spring Harbor Press，1995，pp.233-300。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以包含可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的“順式元件”。
可以用許多技術(shù)，包括缺失分析即從啟動(dòng)子5’端或內(nèi)部去除一個(gè)或更多核苷酸；使用DNA酶I印跡的DNA結(jié)合蛋白分析，甲基化干擾分析、電泳遷移率變異分析、通過連接介導(dǎo)PCR進(jìn)行的體內(nèi)基因組印跡及其它常規(guī)分析法；或通過常規(guī)序列比較法得到與已知順式元件基序的相似性來鑒定順式元件?？梢酝ㄟ^誘變(或替換)一個(gè)或更多核苷酸或通過其它常規(guī)方法進(jìn)一步研究順式元件的適當(dāng)結(jié)構(gòu)。見，如，Method inPlant Biochemistry and Molecular Biology，Dashek，ed.，CRC Press，1997，pp.397-422；和Methods in Plant Molecular Biology，Maliga et al.，eds.，Cold Spring Harbor Press，1995，pp.233-300。
順式元件可以通過化學(xué)合成或通過從包括這些元件的啟動(dòng)子克隆，它們可以用包含有用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的額外的側(cè)翼序列合成而促進(jìn)后續(xù)操作。在一種實(shí)施方案中，啟動(dòng)子由多種不同的“順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件”或簡稱為“順式元件”組成，每一個(gè)可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)總體控制中的不同方面(Strittmatter and Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA848986-8990，1987；Ellis et al.，EMBO J.611-16，1987；Benfey et al.，EMBO J.91677-1684，1990)。例如，順式元件區(qū)或35S啟動(dòng)子的片段的結(jié)合可以表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)模式(見美國專利5,097,025，在此引入其完整內(nèi)容作為參考)。在一種實(shí)施方案中，可以用設(shè)計(jì)為通過比較已知順式元件而特異性識(shí)別順式元件、結(jié)構(gòu)域或基序或可以用于對(duì)比多個(gè)5’調(diào)節(jié)序列而識(shí)別新型順式元件的計(jì)算機(jī)程序識(shí)別包含SEQ IDNOS36-51的核酸序列中的“順式元件”的序列區(qū)。
本發(fā)明包括SEQ ID Nos36-51的順式元件或已知影響基因調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出與本發(fā)明的核酸序列的同源性的順式元件同系物。許多這種元件是文獻(xiàn)中已知的，如由許多因子如光、熱或應(yīng)激調(diào)節(jié)的元件，由病原體或化學(xué)物質(zhì)調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)的元件等。這些元件可以正或負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，這取決于條件。順式元件的例子可以包括但不限于氧反應(yīng)元件(Cowen etal.，3.Biol.Chem.268(36)26904，1993)，光調(diào)節(jié)元件(見例如，Bruceand Quajil，Plant Cell 2(11)1081.1990，及Bruce et al.，EMBO J.103015，1991)，應(yīng)答于茉莉酮酸甲酯處理的順式元件(Beaudoin andRothstein，Plant Mol.Biol.33835，1997)，水楊酸反應(yīng)元件(Strange et al.，Plant 3.111315，1997)，熱休克反應(yīng)元件(Pelham et al.，Trends Genet131，1985)，應(yīng)答于創(chuàng)傷和應(yīng)激的元件(Loace et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.899230，1992；Mhiri et al.，Plant Mol.Biol.33257，1997)，低溫元件(Baker et al.，Plant Mol.Biol.24701，1994；Jiang et al.，Plant Mol.Biol.30679，1996；Nordin et al.，Plant Mol.Biol.21641，1993；Zhou etal.，3.Biol.Chem.26723515，1992)，和干旱反應(yīng)元件(Yamaguchi et al.，Plant Cell 6251-264，1994；Wang et al.，Plant Mol.Biol.28605，1995；Bray E.A.Trends in Plant Science 248，1997)。
所以本發(fā)明包括公開核酸分子的區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、片段或“順式元件”，并且核酸片段可以包括公開序列的任何連續(xù)區(qū)域。以SEQ IDNos36-51表示的本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)域可以包含一個(gè)或更多包括但不限于“順式元件”或可以調(diào)節(jié)植物種子和植物種子組織中可操作連接的DNA序列的轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件。植物種子組織包括由胚細(xì)胞和胚組織如盾片、胚乳、aluerone、和種皮組成的胚。
植物啟動(dòng)子可以包括通過操作已知啟動(dòng)子而產(chǎn)生合成、嵌合或雜合的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可以結(jié)合來自一個(gè)或更多啟動(dòng)子的順式元件，例如，通過添加一個(gè)異源調(diào)節(jié)序列到有自己的部分或完全的調(diào)節(jié)序列的活性啟動(dòng)子(Ellis et al.，EMBO J.611-16，1987；Strittmatter and Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 848986-8990，1987；Poulsen and Chua，Mol.Gen.Genet.21416-23，1988；Comai et al.，Plant.Mol.Biol.15373-381，1991)。通過添加異源性調(diào)節(jié)序列到無活性的、截短的啟動(dòng)子，即僅包括核心TATA和選用CCAAT元件的5’上游區(qū)可以產(chǎn)生嵌合啟動(dòng)子(Fluhr et al.，Science 2321106-1112，1986；Strittrnatter and Chua，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 848986-8990，1987；Aryan et al.，Mol.Gen.Genet.22565-71，1991)。所以包含至少一種調(diào)節(jié)可操作連接的核酸序列表達(dá)的SEQ ID Nos36-51的順式元件的嵌合或雜合啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和用途包括在本發(fā)明的范圍中。
SEQ ID Nos36-51的啟動(dòng)子序列、片段、區(qū)域或順式元件可以在胚發(fā)生或愈傷組織中轉(zhuǎn)錄DNA序列并因此可以選擇性調(diào)節(jié)這些組織中的基因表達(dá)。優(yōu)選在胚發(fā)生或愈傷組織中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的啟動(dòng)子序列在轉(zhuǎn)化和選擇性表達(dá)母體組織基因中有用。例如，愈傷組織增強(qiáng)的或胚增強(qiáng)的啟動(dòng)子可以可操作連接到可測量(scorable)標(biāo)記如GUS或GFP。當(dāng)這些分別為編碼葡糖醛酸糖苷酶和綠色熒光蛋白的報(bào)道基因與本發(fā)明的5’調(diào)節(jié)序列可操作連接時(shí)，可以提供胚發(fā)生組織的轉(zhuǎn)化潛能的指示和為最優(yōu)化轉(zhuǎn)化和再生參數(shù)提供指示。本發(fā)明的5’調(diào)節(jié)序列也可用于選擇性轉(zhuǎn)錄任何基因或感興趣的基因，包括，但不限于那些增強(qiáng)種子質(zhì)量性狀的基因。
包括分子和生物信息技術(shù)的基因組學(xué)的出現(xiàn)，產(chǎn)生了對(duì)來自于大量目標(biāo)，包括但不限于農(nóng)業(yè)上重要的植物種的大量DNA樣品的迅速測序和分析。為從cDNA序列數(shù)據(jù)庫或集合中識(shí)別本發(fā)明的核酸序列，第一步包括從感興趣的植物組織目標(biāo)中構(gòu)建cDNA文庫。簡言之，首先從那些在特定發(fā)育階段或在特定環(huán)境條件下收獲的組織建立cDNA文庫。通過識(shí)別在不同發(fā)育階段或不同條件下在植物組織中不同表達(dá)的基因，可以識(shí)別并分離那些基因的對(duì)應(yīng)調(diào)節(jié)序列。轉(zhuǎn)錄成像使以從cDNA文庫中得到的核苷酸序列的特異性成像為基礎(chǔ)的對(duì)組織優(yōu)選序列的識(shí)別成為可能。這里使用的轉(zhuǎn)錄成像是表示比較在一個(gè)或更多文庫中表達(dá)的基因豐度的分析。包含在cDNA文庫中的克隆被測序，與此序列比較的序列來自于公共數(shù)據(jù)庫?；谟?jì)算機(jī)的方法允許研究者提供查詢序列，它從多個(gè)文庫中比較序列。與本領(lǐng)域中的技術(shù)人員公知的常規(guī)雜交扣除方法相比，此方法使迅速識(shí)別感興趣的克隆成為可能。
使用常規(guī)的方法學(xué)，可以用聚dT引物和反轉(zhuǎn)錄酶從某種組織或生物體的mRNA(信使RNA)構(gòu)建cDNA文庫(Efstmtiadis，et al.，Cell 7279，1976；Higuchi，et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.)733146，1976；Maniatis，et al.，Cell 8163，1976；Land et al.，Nucleic Acids Res.92251，1981；Okayama，et al.，Mol.Cell.Biol.2161，1982；Gubler，et al.，Gene25263，1983)。
可以使用一些方法獲得全長cDNA構(gòu)建體。例如，可以用末端轉(zhuǎn)移酶將dC殘基的同聚物尾添加到游離的3’羥基基團(tuán)(Land，et al.，NucleicAcids Res.92251，1981)。這個(gè)尾然后可以與作為全長的第二條cDNA鏈的合成引物的寡聚dG雜交。Okayama和Berg報(bào)道了一種獲得全長cDNA構(gòu)建體的方法。此方法通過使用合成的引物-連接物而簡化，合成的引物-連接物具有引發(fā)第一和第二條合成和克隆到質(zhì)粒(Coleclough，et al.，Gene 34305，1985)和噬菌體載體(Krawinkel，et al.，Nucleic Acids Res.141913，1986；and Han，et al.，Nucleic Acids Res.156304，1987)的限制性位點(diǎn)的聚合物尾。
這些策略可以配合其它分離稀少mRNA群的策略。例如，典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含10,000-20,000個(gè)不同的mRNA序列。Davidson，GeneActivity in Early Development，2nd ed.，Academic Press，New York，1976。獲得低豐度mRNA出現(xiàn)在cDNA文庫中的某個(gè)概率的要求克隆數(shù)為N＝(ln(1-P)/ln(1-1/n))，其中N為要求的克隆數(shù)，P為需要的概率，1/n為以一條稀有mRNA為單位表示的總mRNA的分?jǐn)?shù)部分(Sambrook，et al.，1989)。
一種富集mRNA制劑中感興趣序列的方法是根據(jù)大小區(qū)分。一種方法是通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分(Pennica，et al.，Nature 301214，1983)。另一種方法在一種試劑如變性RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的羥化甲基汞存在時(shí)使用蔗糖梯度離心(Schweinfest，et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.(U.S.A.)794997-5000，1982)。
一種經(jīng)常采納的方法是構(gòu)建均等化或標(biāo)準(zhǔn)化的cDNA文庫(Ko，Nucleic Acids Res.185705，1990；Patanjali，S.R.et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.(U.S.A.)881943，1991)。一般說來，cDNA群通過扣除雜交法而標(biāo)準(zhǔn)化(Schinid，et al.，J.Neurochem.48307，1987；Fargnoli，et al.，Anal.Biochem.187364 1990 Travis，et al.，Proc.Nati.Acad.Sci(U.S.A.)851696，1988；Kato，Bur.J.Neurosci.2704 1990 and Schweinfest，et al.，Genet.Anal.Tech.Appi.764，1990)?？鄢砹肆硪环N減少cDNA文庫中某些序列群的方法。(Swaroop，et al.，Nucleic Acids Res.191954，1991).標(biāo)準(zhǔn)化文庫可以用Soares程序構(gòu)建(Soares et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.(U.S.A.)919228，1994)。這種方法的設(shè)計(jì)是為了減少個(gè)體cDNA頻率的初始10,000倍改變而獲得在一個(gè)數(shù)量級(jí)中的豐度并同時(shí)保持文庫的總體序列復(fù)雜性。在標(biāo)準(zhǔn)化程序中，高豐度cDNA克隆劇減，中間水平豐度的克隆相對(duì)未受影響，稀少轉(zhuǎn)錄克隆的豐度有效增加。
ESTs可以用許多方法測序。兩種基本方法可以用于DNA測序，即Sanger et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A 745463，1977中描述的鏈終止法和Maxam and Gilbert，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.74560，1977中描述的化學(xué)降解法。技術(shù)的自動(dòng)化和發(fā)展如用基于熒光的測序替代放射性同位素法減少了測序DNA要求的努力(Craxton，Methods，220，1991；Ju et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.(U.S.A.)924347，1995；Tabor andRichardson，Proc.Nati.Acad.Sci.(U.S.A.)926339，1995)。從許多生產(chǎn)商可以獲得自動(dòng)測序儀，例如，Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，New Jersey(Pharmacia ALF)，LI-COR，Inc.，Lincoln，Nebraska (LI-COR 4,000)and Millipore，Bedford，Massachusetts(MilliporeBaseStation)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)長于150bp的ESTs對(duì)相似性搜索和作圖很有用(Adams，et al.，Science 2521651，1991)。EST序列一般為150-450個(gè)堿基。用單次運(yùn)行序列數(shù)據(jù)可以常規(guī)并可靠產(chǎn)生序列長度信息。一般說來，從cDNA文庫只獲得單次運(yùn)行序列數(shù)據(jù)，Adams，et al.，Science 2521651，1991。自動(dòng)化的單次運(yùn)行測序一般產(chǎn)生約2-3％錯(cuò)誤或堿基混淆率(Boguski，et al.，Nature Genetics，4332，1993)。
EST數(shù)據(jù)庫由例如(McCombrie，et al.，Nature Genetics 1124，1992)；人肝細(xì)胞系HepG2(Okubo，et al.，Nature Genetics 2173，1992)；人腦RNA(Adams，et al.，Science 2521651，1991；Adams，et al.，Nature355632，1992)；Arabidopsis，(Newnian，et al.，Plant Physiol.1061241，1994)；以及小鼠(Kurata，et al.，Nature Genetics 8365，1994)構(gòu)建或部分構(gòu)建。本發(fā)明使用從許多從玉米胚和愈傷組織制備的文庫中分離的ESTs作為識(shí)別與在這些需要的組織中表達(dá)的基因相關(guān)的啟動(dòng)子序列的工具，然后它促進(jìn)調(diào)節(jié)基因的5’調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子的分離。
基于計(jì)算機(jī)的序列分析可以用于識(shí)別不同表達(dá)的序列，包括但不限于與另一種組織相比在一種組織中表達(dá)的序列。例如，從根組織和葉組織中分離的植物組織中分離的cDNA中可以發(fā)現(xiàn)不同系列的序列。因此，可以從在不同環(huán)境或生理?xiàng)l件下生長的植物制備的cDNA文庫中比較序列。當(dāng)從感興趣的cDNA文庫中識(shí)別出優(yōu)選序列時(shí)，可以從植物組織制備的基因組文庫中分離基因組克隆，對(duì)應(yīng)的調(diào)節(jié)序列包括但不限于5’調(diào)節(jié)序列可以被識(shí)別并分離。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，從許多cDNA文庫中得到的表達(dá)序列標(biāo)記(EST)序列在序列數(shù)據(jù)庫中分類。該數(shù)據(jù)庫用于從特定感興趣的組織中識(shí)別啟動(dòng)子目標(biāo)。為隨后的啟動(dòng)子分離而進(jìn)行的表達(dá)序列標(biāo)記的篩選反映了在從單個(gè)cDNA文庫或cDNA文庫集合中的隨機(jī)取樣得到的代表性ESTs中一種或更多序列的存在。例如，調(diào)節(jié)胚發(fā)生或愈傷組織中轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的識(shí)別是通過識(shí)別出現(xiàn)在從胚發(fā)生或愈傷組織中制備的cDNA文庫中并在數(shù)據(jù)庫中的其它c(diǎn)DNA文庫中不存在或低豐度ESTs而進(jìn)行的。然后估計(jì)被識(shí)別的EST先導(dǎo)序列在文庫中的相對(duì)豐度以及被估計(jì)的某種EST的表達(dá)圖譜。這里使用的豐度表示克隆或克隆簇在文庫中出現(xiàn)的次數(shù)。在特定組織或器官中被增強(qiáng)或高豐度，代表靶表達(dá)圖譜的序列是以這種方式被識(shí)別并可以從所識(shí)別的EST序列設(shè)計(jì)引物。一種基于PCR的方法可以用于從感興趣的靶植物基因組文庫中擴(kuò)增側(cè)翼區(qū)。許多用于擴(kuò)增鄰近已知序列核心區(qū)的未知DNA序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些方法包括，但不限于反相PCR(IPCR)，vectorette PCR，Y形PCR和基因組步行法。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，與連接物連接的基因組DNA用基因特異性引物和與連接物序列退火的引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。然后將PCR產(chǎn)物作為模板用基因特異性引物和第二種連接物進(jìn)行嵌套的PCR擴(kuò)增。然后將從嵌套PCR反應(yīng)得到的片段分離、純化并亞克隆到適當(dāng)?shù)妮d體。當(dāng)從截短的cDNA得到EST時(shí)，將片段測序并識(shí)別翻譯起點(diǎn)。然后可以將片段作為與報(bào)道基因如β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的融合克隆到植物表達(dá)載體中。然后可以在瞬時(shí)分析中檢驗(yàn)這些構(gòu)建體并隨后在適當(dāng)?shù)闹参镛D(zhuǎn)化載體中將5’調(diào)節(jié)區(qū)可操作連接到其它基因，然后通過許多本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法分析轉(zhuǎn)化植物中感興趣基因的表達(dá)。
可以選擇任何植物進(jìn)行基因和調(diào)節(jié)序列識(shí)別。分離基因和調(diào)節(jié)序列的適當(dāng)植物目標(biāo)將包括但不限于金合歡、紫花苜蓿、蘋果、杏、擬南芥、洋薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆角、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、卷心菜，canola，哈密瓜、胡蘿卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、櫻桃、菊苣、芫荽、柑橘、克萊門小柑橘、苜蓿、椰子、咖啡、玉米、棉花、黃瓜、道格拉斯冷杉、茄子、菊苣、苣荬菜、桉樹、茴香、無花果、大蒜、葫蘆、葡萄、葡萄果、蜜瓜、涼薯、獼猴桃、萵苣、韭菜、檸檬、酸橙、火炬松、亞麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、堅(jiān)果、燕麥、油棕櫚、油菜、黃秋葵、橄欖、洋蔥、桔子、觀賞植物、棕櫚、番木瓜、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松樹、菠蘿、車前草、李子、石榴、白楊、土豆、西葫蘆、溫柏、radiatapine、radiscchio、蘿卜、油菜籽、覆盆子、大米、黑麥、高梁、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、橘子、茶葉、煙草、番茄、黑小麥、草、蕪箐、藤本植物、西瓜、小麥、山藥、夏季產(chǎn)南瓜，特別優(yōu)選的植物目標(biāo)應(yīng)包括玉米、棉花、大豆和小麥。
本發(fā)明的核酸分子從玉米(Zea mays)中分離。玉米發(fā)育約20-21個(gè)葉，在發(fā)芽后約65天抽絲，在發(fā)芽后約121天成熟。正常的玉米植物遵循普通的發(fā)育模式，但不同階段間的時(shí)間間隔和形態(tài)在不同雜交、生長和環(huán)境條件間是不同的。
在玉米植物發(fā)育中有許多可識(shí)別的階段。這些階段被定義為營養(yǎng)期(V)和生殖(R)期。V期的細(xì)分按數(shù)字指定為V1，V2，V3等到V(n)，(n)表示抽穗前的最后一個(gè)出葉期，第一個(gè)V階段為發(fā)芽(VE)期。例如，VE是幼苗葉從土壤中突出，V1表示第一片真葉，V2表示第二片葉，等。生殖階段包括第一條絲的出現(xiàn)到成熟的種子，按如下表示R1為抽絲，R2為發(fā)皰，R3為乳熟期，R4為臘熟期、R5為dent期，R6為生理成熟期(見，例如Ritchie SW et al.(1986)How a Corn PlantDevelops，Iowa State University of Science and Technology CooperativeExension Service，Ames，IA 481-21)。
任何植物組織類型都可用作識(shí)別基因和相關(guān)調(diào)節(jié)序列包括但不限于啟動(dòng)子序列的靶組織。對(duì)于本發(fā)明，使用了玉米組織。更優(yōu)選地，玉米胚發(fā)生或愈傷組織為識(shí)別啟動(dòng)子序列的靶組織。玉米cDNA文庫用從傳粉后21天(21-DAP)和傳粉后13天(13-DAP)的玉米分離的胚組織和II型玉米愈傷組織構(gòu)建。
任何允許在不同類型序列之間進(jìn)行示差比較的方法都可以用于分離感興趣的基因或調(diào)節(jié)序列。例如，在一種示差篩選方法中，可以用買到的克隆試劑盒在噬菌體宿主中制備從特定組織mRNA得到的cDNA文庫。將斑片鋪展到含細(xì)菌宿主如大腸桿菌菌苔的平皿上產(chǎn)生噬菌體斑。只有DNA結(jié)合膜可以產(chǎn)生105-106個(gè)噬斑。用靶組織和非靶組織產(chǎn)生的探針探測復(fù)制膜，從而判斷靶組織和非靶或本底組織的差別表達(dá)。探針被標(biāo)記，從而促進(jìn)雜交和發(fā)育后的檢測。與靶組織來源的探針雜交但不與非靶組織來源的探針雜交，表現(xiàn)出所需差別表達(dá)模式的噬斑可以選作進(jìn)一步分析。也可以通過用限制性酶部分消化和在特定大小范圍內(nèi)對(duì)DNA片段進(jìn)行大小篩選而從選擇物種制備基因組DNA文庫?；蚪MDNA可以被克隆到適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于噬菌體，并用前面所描述的適當(dāng)試劑盒制備(見例如，Stratagene，La Jolla，CA or Gibeo BREGaithersburg，MD)這里使用的示差雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并可以用于分離需要的序列類型。這里使用的序列類型表示以共同的識(shí)別物包括但不限于可以以從共同靶植物中分離的序列、共同文庫或共同植物組織類型為基礎(chǔ)而分成組的序列。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，感興趣的序列是以序列分析和查詢不同組織類型的文庫中的不同cDNA序列集合而識(shí)別的。公開的方法提供了以從不同cDNA文庫中得到的植物ESTs的電子序列分析為基礎(chǔ)的示差篩選的一個(gè)例子。
許多用于評(píng)估基因表達(dá)的方法是以測量器官、組織或細(xì)胞樣品中的mRNA水平為基礎(chǔ)的。典型的方法包括但不限于RNA印跡、核糖核酸酶保護(hù)測定和RT-PCR。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了高流通量的方法從轉(zhuǎn)錄作圖(transcript profiling)法中識(shí)別調(diào)節(jié)序列。cDNA微陣列(microarray)技術(shù)的發(fā)展使系統(tǒng)監(jiān)測成千上萬基因的基因表達(dá)圖譜成為可能(Schena et al，Science，270467，1995)。這種以DNA芯片為基礎(chǔ)的技術(shù)將成千上萬的cDNA序列排列在支持面上。同時(shí)將這些陣列與許多從不同細(xì)胞或組織類型的RNA樣品制備的標(biāo)記cDNA探針雜交，允許直接的表達(dá)比較分析。此技術(shù)首先是通過分析48個(gè)擬南芥基因在根和芽的差別表達(dá)而證明的(Schena et al，Science，270467，1995)。更近一些，用cDNA微陣列技術(shù)監(jiān)測了超過1400個(gè)基因的表達(dá)圖譜(Ruan et al，The Plant Journal 15821，1998)。微陣列提供了高產(chǎn)量、定量的和可再生的方法而分析基因表達(dá)和鑒定基因功能。這樣使用微陣列的轉(zhuǎn)錄作圖法為分離調(diào)節(jié)序列如與這些基因相關(guān)的啟動(dòng)子提供了另一種有價(jià)值的工具。
本發(fā)明使用高產(chǎn)量的序列分析而形成感興趣序列的迅速的計(jì)算機(jī)識(shí)別的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解序列分析可用的資源。可以通過判斷檢驗(yàn)或詢問序列與公共或私有數(shù)據(jù)庫中序列的相似性(“相似性分析”)或通過搜索某些基序(內(nèi)在序列分析)(如順式元件)而進(jìn)行序列比較(Coulson，Trends in Biotechnology，1276，1994；Birren，et al.，Genome Analysis，1543，1997)。
SEQ ID Nos36-51或其片段提供的核酸序列或其互補(bǔ)序列，或至少90％等同于，優(yōu)選95％等同于甚至更優(yōu)選99％或100％等同于SEQ IDNos36-51或其片段提供的序列或其互補(bǔ)序列的核苷酸序列，可以“被提供”于許多介質(zhì)中。這種介質(zhì)也可以以允許本領(lǐng)域技術(shù)人員檢驗(yàn)序列的形式提供其亞型。
在此實(shí)施方案的一種應(yīng)用中，本發(fā)明的核苷酸序列可以被記錄在計(jì)算機(jī)可讀的介質(zhì)上。這里使用的“計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)”是指任何可以由計(jì)算機(jī)直接讀入和存取的介質(zhì)。這種介質(zhì)包括，但不限于磁性存儲(chǔ)介質(zhì)，如軟盤、硬盤、存儲(chǔ)介質(zhì)和磁帶；光學(xué)存儲(chǔ)介質(zhì)如CD-ROM；電子存儲(chǔ)介質(zhì)如RAM和ROM；以及這些類別的雜合物如磁性/光學(xué)存儲(chǔ)介質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易了解目前已知的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)如何創(chuàng)建包含記錄本發(fā)明核苷酸序列的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的產(chǎn)品。
通過提供一種或更多本發(fā)明的核酸序列，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以為多種目的而常規(guī)存取序列信息?？梢酝ㄟ^許多方法分析序列，如通過在沒有為這種目的而設(shè)計(jì)的軟件的幫助下分析序列。計(jì)算機(jī)軟件也是公共的，允許本領(lǐng)域中的技術(shù)人員存取提供于計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的序列信息。公共數(shù)據(jù)庫的例子包括但不限于日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)(http//www.ddbj.nig.ac.jp/)；基因庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank/Index.html)；以及歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室核酸序列數(shù)據(jù)庫(EMBL)(http//www.ebi.ac.uk/ebi_docs/embl_db.html)或其譯本。已經(jīng)開發(fā)了許多不同的搜索算法，包括但不限于稱作BLAST程序的一套程序。有五種BLAST執(zhí)行，三種是為核苷酸序列查詢而設(shè)計(jì)(BLASTN，BLASTX和TBLASTX)，兩種是為蛋白序列查詢而設(shè)計(jì)(BLASTP and TBLASTN)(Coulson，Trends in Biotechnology，1276-80，1994；Birren，et al.，Genome Analysis 1543.l997)。
為基序搜索而設(shè)計(jì)的程序在本發(fā)明中也有用。為基序搜索而設(shè)計(jì)的序列分析程序可以用于識(shí)別順式元件。優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序可以包括但不限于MEME，SIGNAL SCAN和GENESCAN。Meme是一個(gè)在一組未對(duì)比序列中識(shí)別保守基序(核酸或肽)的程序。Meme將這些基序保存為一系列分布圖。這些分布圖可以用于搜索序列數(shù)據(jù)庫。MEME算法(2.2版)可以在GCG軟件包10.0版中找到；MEME(T.Bailey and C.Elkan，Machine Learning，21(1-2)51-80，1995)站點(diǎn)位置如下(http/Iwww.sdsc.edu/MEMEImeme/website/COPYRIGHT.html.)。SignalScan是一個(gè)用其它數(shù)據(jù)庫中的信息識(shí)別檢驗(yàn)序列的已知基序的程序(Prestridge，D.S.，CABIOS 7，203-206(1991)。SignalScan 4.0信息在以下站點(diǎn)可以找到http//biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html。用于SignalScan的ftp站點(diǎn)為ftp//biosci.cbs.umn.edu/sofiw～e/sig5can.html。Signal Scan使用的數(shù)據(jù)庫包括PLACE(http//www.dna.affrc.go.ip/htdocs/PLACE(Higo et al.，Nucleic AcidsResearch 27(1)297-300(1999)和TRANSFAC(Heinemeye，X.et al.，Nucleic Acid Research 27(1)318-322)，可以在如下站點(diǎn)找到http//taansfac.gbf.deA。GeneScan是另一個(gè)適合基序搜索的程序(Burge，C and Karlin，S.J.Mol.Biol.268，78-94(1997)，1.0版的信息在以下站點(diǎn)可以找到http//gnomic.stanford.edu/GENESCANW.html.。這里用到的“靶結(jié)構(gòu)基序”或“靶基序”是指任何合理選擇的序列或序列結(jié)合，其中序列是以靶基序折疊而形成的三維構(gòu)象為基礎(chǔ)而選擇的。許多靶基序是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所公知的。蛋白的靶基序包括但不限于酶活性位點(diǎn)和信號(hào)序列。本發(fā)明的優(yōu)選靶基序包括但不限于啟動(dòng)子序列、順式元件、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和其它表達(dá)元件如蛋白結(jié)合序列。
這里使用的“搜索”是指在基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)中運(yùn)行而比較靶序列或靶結(jié)構(gòu)基序與儲(chǔ)存在數(shù)據(jù)儲(chǔ)存設(shè)備中的序列信息的一種或更多程序。搜索方法是用于識(shí)別與特定靶序列或靶基序匹配的本發(fā)明的序列片段或區(qū)域。也可以比較多個(gè)序列以便識(shí)別負(fù)責(zé)特定功能的共同區(qū)域或基序。例如，當(dāng)用某些軟件包對(duì)比和分析相似類型啟動(dòng)子的多個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域時(shí)，可以識(shí)別賦予特定表達(dá)圖譜的順式元件或序列結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明還提供了包含這里所描述的序列信息的系統(tǒng)，特別是基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)。這里使用的“基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)”是指用于分析本發(fā)明核苷酸序列信息的硬件設(shè)備、軟件設(shè)備和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備。本發(fā)明的最低硬件設(shè)備包括中央處理單元(CPU)、輸入設(shè)備、輸出設(shè)備和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存設(shè)備。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解任何數(shù)量的基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)都適合用于本發(fā)明，這種程序與沒有計(jì)算機(jī)系統(tǒng)輔助的檢查相比提供了有效的序列數(shù)據(jù)分析手段。
SEQ ID Nos6-35是從基于計(jì)算機(jī)的序列比較而識(shí)別的cDNA序列設(shè)計(jì)的引物。這些序列是用于用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增技術(shù)延伸核酸序列(見，例如，Mullis et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51263，1986；Erlich等，歐洲專利申請50,424；歐洲專利申請84,796，歐洲專利申請258,017；歐洲專利申請237,362；Mullis，歐洲專利申請201,184；Mullis等，美國專利4,683,202；Erlich，美國專利4,582,788；和Saiki等，美國專利4,683,194)。許多PCR擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所公知的，并用于識(shí)別鄰近于已知序列的核酸序列。例如，描述了擴(kuò)增鄰近于已知序列的核心區(qū)的未知DNA序列的反相PCR(IPCR)方法。也提供了其它方法，如捕捉PCR(Lagerstrom M.，et al.，PCR Methods Applic.1111，1991)，及步行PCR(Parker，JD et al.，Nucleic Acids Res 193055，1991)。為識(shí)別感興趣的序列，許多生產(chǎn)商也開發(fā)了以這些方法的修飾為基礎(chǔ)的試劑盒。技術(shù)的發(fā)展包括引物和連接物的改進(jìn)、聚合酶的改進(jìn)和溫度循環(huán)能力促進(jìn)了分離感興趣序列的更快和更有效的方法。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，用基因組步行方法(UniversalGenomeWalkerTMKit，CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo，Alto，CA)分離含有本發(fā)明的5’調(diào)節(jié)元件的側(cè)翼序列。簡言之，使純化的基因組DNA接受限制性內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生末端與GenomeWalkerTM連接物連接的基因組DNA片段。GenomeWalkerTM引物與基因特異性引物一起在兩個(gè)連續(xù)的PCR反應(yīng)中使用(初級(jí)和嵌套PCR反應(yīng))，從而產(chǎn)生含有隨后被克隆和測序的5’調(diào)節(jié)序列的PCR產(chǎn)物。
除了用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)，本發(fā)明的啟動(dòng)子序列也具有在核酸雜交實(shí)驗(yàn)中作為探針和引物的應(yīng)用。本發(fā)明的核酸探針和引物可以在嚴(yán)格條件下與靶DNA序列雜交。名詞“嚴(yán)格的雜交條件”定義為探針或引物與靶序列特異性雜交但不與非靶序列雜交的條件，可以由經(jīng)驗(yàn)判斷。名詞“嚴(yán)格條件”是關(guān)于核酸探針與靶核酸(即與感興趣的特定核酸序列)通過討論于Sambrook et al.，1989，9.52-9.55的特異性雜交程序而雜交的功能性定義。也見Sambrook et al.，1989 at 9.47-9.52，9.56-9.58；Kanehisa，Nucl.Acids Res.12203-213，1984；及Wetmur and Davidson，J Mol.Biol.31349-370，1968。促進(jìn)DNA雜交的適當(dāng)嚴(yán)格條件為，例如，在約45℃下6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，然后是在50℃下用2.0xSSC洗滌，這是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的，或可以在Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選用50℃下約2.0xSSC的低嚴(yán)格性到50℃下約0.2xSSC的高嚴(yán)格性。另外，洗滌步驟中的溫度可以從在室溫下的約22℃的低嚴(yán)格性條件到約65℃的高嚴(yán)格雜交條件。溫度和鹽都可以改變，或當(dāng)其它變量改變時(shí)溫度和鹽濃度可以保持恒定。
例如，對(duì)于高嚴(yán)格性，用DNA或RNA探針或引物進(jìn)行的雜交可以在65℃下，6x SSC，0.5％SDS，5x Denhardt試劑，100ug/mL非特異性DNA(如超聲波降解的鮭魚精子DNA)下進(jìn)行，在65℃下，0.5xSSC，0.5％SDS洗滌。
考慮到了如果保留了探針或引物對(duì)靶序列的結(jié)合特異性，較低嚴(yán)格的雜交條件如更低的雜交和/或洗滌溫度可以用于識(shí)別具有更低度序列相似性的相關(guān)序列。因此，由于它們選擇性與DNA片段互補(bǔ)鏈形成雙螺旋分子的能力，可以使用本發(fā)明的核苷酸序列。通過雜交檢測DNA節(jié)段是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的，因此根據(jù)本申請所預(yù)見的，將需要使用不同雜交條件而獲得探針對(duì)靶序列的不同程度的選擇性，選擇方法將取決于所需的結(jié)果。
SEQ ID Nos36-51的核酸序列和任何其變體可以在適當(dāng)選擇的嚴(yán)格條件下與其它核酸序列雜交。如這里所用到的，如果兩個(gè)分子可以形成反向平行的、雙鏈核酸結(jié)構(gòu)那么兩個(gè)核酸分子就稱為可以特異性互相雜交。如果兩個(gè)核酸分子表現(xiàn)出完全互補(bǔ)，那么就稱一個(gè)核酸分子與另一個(gè)核酸分子“互補(bǔ)”。如這里所用到的，當(dāng)一個(gè)分子的所有核苷酸每個(gè)核苷酸都與另一個(gè)分子的核苷酸互補(bǔ)，那么就稱這兩個(gè)分子表現(xiàn)出“完全互補(bǔ)”。如果兩個(gè)分子的互相雜交有充分的穩(wěn)定性而允許它們在至少常規(guī)“低嚴(yán)格”條件下互相退火，那么就稱它們是“最小互補(bǔ)”的。如果兩個(gè)分子的互相雜交有充分的穩(wěn)定性而允許它們在至少常規(guī)“高嚴(yán)格”條件下互相退火，那么就稱它們是“互補(bǔ)的”。常規(guī)的嚴(yán)格雜交條件描述于Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，and by Haymes et al.，Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC，1985。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸序列SEQ ID Nos36-51或這些序列的片段、區(qū)域、順式元件或寡聚物，可以用于其它植物組織的雜交分析而識(shí)別密切相關(guān)或同源的基因和相關(guān)調(diào)節(jié)序列。這些包括但不限于在任何底物包括但不限于適當(dāng)制備的植物組織、纖維素、尼龍或組合過濾器、芯片或載玻片上進(jìn)行的DNA或RNA雜交分析。這些方法學(xué)是本領(lǐng)域中公知的，可以從銷售商提供的試劑盒或制劑中得到。
當(dāng)然，也可以通過其它技術(shù)如通過化學(xué)方法直接合成片段而獲得片段，通常用自動(dòng)寡核苷酸合成器執(zhí)行。也可通過核酸復(fù)制技術(shù)，如通過分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組DNA技術(shù)進(jìn)行的PCRTM(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)獲得片段。關(guān)于用特定擴(kuò)增引物對(duì)擴(kuò)增靶核酸序列(如通過PCR)，“嚴(yán)格PCR條件”是指允許引物對(duì)僅僅與靶核酸序列雜交的條件，靶核苷酸序列將與具有對(duì)應(yīng)野生型序列(或其互補(bǔ)序列)的引物結(jié)合并優(yōu)選產(chǎn)生唯一的擴(kuò)增產(chǎn)物。
這里使用的核酸片段是指小于全長的任何核酸部分。片段也可以包含至少一個(gè)可以在前面定義的嚴(yán)格雜交條件下特異性與天然核酸雜交的最小長度。這種最小片段的長度優(yōu)選為天然核酸序列的至少8個(gè)連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選為15個(gè)連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選為至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，最優(yōu)選為至少30個(gè)連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明的核酸序列也可以用于探針和引物?？梢愿鶕?jù)天然基因序列制備核酸探針和引物?！疤结槨笔浅Ｒ?guī)可檢測標(biāo)記物或受體分子，如放射活性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑或酶連接的分離核酸?！耙铩笔峭ㄟ^核酸雜交而退火到互補(bǔ)靶DNA鏈的分離核酸，從而形成引物和靶DNA鏈的雜交物，然后通過聚合酶，如DNA聚合酶沿靶DNA鏈延伸。引物對(duì)可以用于如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其它常規(guī)核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增核酸序列。
探針和引物一般為15個(gè)核苷酸或更長，優(yōu)選20個(gè)核苷酸或更多，更優(yōu)選25個(gè)核苷酸，最優(yōu)選30個(gè)核苷酸或更多。這種探針和引物在高嚴(yán)格雜交條件下特異性與靶DNA或RNA序列雜交，并在低嚴(yán)格條件下特異性與另一物種的靶天然序列雜交。盡管可以用常規(guī)方法設(shè)計(jì)與天然序列不同并保持與靶天然序列雜交的能力的探針，本發(fā)明的探針和引物優(yōu)選與天然序列有完全的序列相似性。制備和使用探針和引物的方法描述于，例如Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，ed.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989(以下稱為，″Sambrook et al.，1989″)；CurrentProtocols in Molecular Biology，ed.Ausubel et al.，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，1992(有定期更新)(以下為，″Ausubel etal.，1992)；and Innis et al.，PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications，Academic PressSan Diego，1990。PCR引物對(duì)可以，例如，通過使用針對(duì)該目的如引物的計(jì)算機(jī)程序(Version 0.5，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)可以從已知序列得到引物對(duì)。這里公開的以天然啟動(dòng)子序列為基礎(chǔ)的引物和探針可以用于證實(shí)，如果需要，用于通過常規(guī)方法如通過再克隆和再測序而修飾公開序列。
在另一種實(shí)施方案中，這里公開的啟動(dòng)子核苷酸序列可以被修飾。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以建立核苷酸序列有改變的DNA分子。以SEQ ID NOS36-51表示的本發(fā)明的核苷酸序列可以被修飾或改變而增強(qiáng)它們的控制特征。一種改變核酸序列的優(yōu)選方法是用PCR修飾選定的核苷酸或序列區(qū)。這些方法是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員公知的?？梢酝ㄟ^以PCR為基礎(chǔ)的DNA修飾法例如插入、去除或替代模板序列而修飾序列?！白凅w”DNA分子為含有天然序列的一個(gè)或更多核苷酸被去除、添加和/或替代的改變的DNA分子，優(yōu)選基本保持啟動(dòng)子功能。在啟動(dòng)子片段的情況下，“變體”DNA可以包括影響與其可操作連接的最小的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的改變?？梢酝ㄟ^例如，標(biāo)準(zhǔn)DNA誘變技術(shù)或通過化學(xué)合成變體DNA分子或其部分而產(chǎn)生變體DNA分子。
在另一種實(shí)施方案中，以SEQ ID NOS36-51表示的核苷酸序列包括可以調(diào)節(jié)可操作連接的DNA序列的任何長度的序列。例如，公開于SEQ ID NOS36-51的序列可以被截短或去除并仍然保持可以調(diào)節(jié)可操作連接的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。在一種相關(guān)的實(shí)施方案中，公開序列的順式元件可以賦予特定的特異性如賦予胚發(fā)生或愈傷組織中可操作連接的DNA序列增強(qiáng)的表達(dá)并因此也可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。所以，公開序列的任何序列片段、部分或區(qū)域可以用于調(diào)節(jié)序列，包括，但不限于順式元件或基序。例如，可以將一個(gè)或更多堿基對(duì)從啟動(dòng)子序列的5’或3’端去除而產(chǎn)生“截短的”啟動(dòng)子。也可以將一個(gè)或更多堿基對(duì)插入、去除或內(nèi)部替代到啟動(dòng)子序列?？梢詫?dòng)子構(gòu)建為使啟動(dòng)子片段或元件被可操作連接，例如，通過將這種片段放置在最小啟動(dòng)子的上游。最小或基本啟動(dòng)子是可以募集并結(jié)合基本轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的DNA片段。真核細(xì)胞中的基本轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)是RNA聚合酶II復(fù)合物和它的輔助蛋白。這種基本轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的酶成分可以利用最小或基本啟動(dòng)子起始和延長某種基因的轉(zhuǎn)錄。也就是說，在啟動(dòng)子區(qū)沒有可以募集和結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，如增強(qiáng)、阻遏、導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激素依賴性等的轉(zhuǎn)錄因子的添加的順式作用序列。替代、去除、插入或其結(jié)合可以結(jié)合而產(chǎn)生終末構(gòu)建體。
本發(fā)明的天然或合成核酸可以摻入重組核酸構(gòu)建體，一般是DNA構(gòu)建體，可以導(dǎo)入宿主細(xì)胞并在其中復(fù)制。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，以SEQ ID NOS36-51表示的核苷酸序列或其片段、變體或衍生物被摻入包括可操作連接到基因成分如可選擇、可篩選或可測量的標(biāo)記基因的本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)的表達(dá)載體盒中。本發(fā)明的公開核酸序列優(yōu)選可以可操作連接到基因成分如賦予與所需與植物形態(tài)、生理、生長和發(fā)育、產(chǎn)量、營養(yǎng)增強(qiáng)、抗疾病或抗害蟲、或環(huán)境或化學(xué)耐受相關(guān)的特征的核酸。這些基因成分如標(biāo)記基因或感興趣的農(nóng)業(yè)基因可以在識(shí)別轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物中起作用，或產(chǎn)生有農(nóng)業(yè)應(yīng)用的產(chǎn)品。本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可以用于調(diào)節(jié)任何可操作連接的可轉(zhuǎn)錄序列的表達(dá)。特別優(yōu)選的可操作連接的可轉(zhuǎn)錄序列將包括但不限于那些優(yōu)選在胚發(fā)生或愈傷組織中表達(dá)的序列。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種基因成分產(chǎn)生作為選擇設(shè)備和作用于可再生植物組織中產(chǎn)生可以賦予植物組織耐受其它毒性化合物的化合物的產(chǎn)物。用作可選擇的、可篩選或可測量標(biāo)記的感興趣基因可以包括但不限于GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶的編碼區(qū))、GFP(綠色熒光蛋白的編碼序列)或抗生素或除草劑耐受基因。轉(zhuǎn)座子和相關(guān)的抗生素耐藥基因包括Tns(bla)，Tn5(npt II)，Tn7(dhfr)，青霉素，卡那霉素(以及新霉素、G418、博萊霉素)；氨甲喋呤(以及甲氧芐氨嘧啶；氯霉素；卡那霉素和四環(huán)素轉(zhuǎn)座子。
對(duì)植物中可選擇的標(biāo)記有用的特征在一項(xiàng)關(guān)于微生物的使用的報(bào)告中有概述(Advisory Committee on Novel Foods and Processes，July1994)。這些特征包括最小數(shù)目的未轉(zhuǎn)化組織的嚴(yán)格選擇，大量獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件而沒有對(duì)再生的嚴(yán)重干擾，應(yīng)用于大量物種，存在一種為組織中標(biāo)記的存在評(píng)分的測定。
許多可選擇的標(biāo)記基因是本領(lǐng)域中公知的，并且一些抗生素耐藥標(biāo)記滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，包括耐卡那霉素(npt II)、潮霉素(aph IV)和慶大霉素(aac3和aac4)的標(biāo)記。有用的顯性可選擇標(biāo)記基因包括編碼抗生素耐藥基因的基因(如耐潮霉素、卡那霉素、博萊霉素、G418、鏈霉素或奇放線菌素)；以及除草劑抗性基因(如膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)。選擇抗除草劑的轉(zhuǎn)化突變型的一種有用的策略描述于如，Vasil，Cell Cultureand Somatic Cell Genetics of Plants，Vols.I-III，Laboratory Proceduresand Their Applications Academic Press，New York，1984。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的可選擇標(biāo)記將包括賦予抗化合物如抗生素如卡那霉素以及除草劑如草甘膦(Della-Cioppa et al.，Bioffechnology 5(6)，1987，U.S.Patent 5,463,175，U.S.Patent 5,633,435)。也可執(zhí)行其它選擇裝置并仍處在本發(fā)明的范圍中。
對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施，使用了制備和使用載體的常規(guī)組合物和方法及宿主細(xì)胞，如Sambrook et al.，1998等所討論的。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。許多適于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞或建立轉(zhuǎn)基因植物的載體描述于如，Pouwels et al.，Cloning VectorsA LaboratoryManual，1985，supp.1987；Weissbach and Weissbach，Methods for PlantMolecular Biology，Academic Press，1989；Gelvin et al.，Plant MolecularBiology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990；and R.R.D.Croy，Plant Molecular Biology LabFax，BIOS Scientific Publishers，1993。植物表達(dá)載體可以包括，如在5’和3’調(diào)節(jié)序列轉(zhuǎn)錄控制下的一種或更多克隆植物基因。這種植物表達(dá)載體也可以含啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(如，控制誘導(dǎo)型或組成型，環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的或細(xì)胞或組織特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)域)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，RNA加工信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和聚腺苷酸化信號(hào)。在表達(dá)載體中視為基因成分的其它類型的調(diào)節(jié)序列包括但不限于可以與啟動(dòng)子偶聯(lián)的非翻譯先導(dǎo)序列。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞，植物表達(dá)載體包含SEQ ID Nos36-51的啟動(dòng)子區(qū)域。植物表達(dá)載體也可以包含額外序列，包括但不限于用于克隆目的的限制性酶位點(diǎn)。
任何感興趣基因的許多對(duì)植物基因表達(dá)有用的啟動(dòng)子包括但不限于可選擇標(biāo)記，可測量標(biāo)記，耐受害蟲、耐受疾病、營養(yǎng)增強(qiáng)的基因或其它農(nóng)業(yè)上感興趣的基因。對(duì)植物基因表達(dá)有用的組成型啟動(dòng)子的例子包括但不限于，賦予在大多數(shù)植物組織中組成型、高水平表達(dá)的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子(見，如，Odel et al.，Nature 313810，1985)，包括單子葉植物(見如Dekeyser et al.，Plant Cell 2591，1990；Teradaand Shimamoto，Mol.Gen.Genet.220389，1990)；胭脂堿合成酶啟動(dòng)子(An et al.，Plant Physiol.88547，1988)及章魚堿合成酶啟動(dòng)子(Fromm etal.，Plant Cell 1977，1989)和玄參花葉病毒(FMV)啟動(dòng)子(美國專利No.5,378,619，是一種雙邊，右(RB)和左(LB)T-DNA邊的植物轉(zhuǎn)化載體，由下列基因成分組成ZM-700267629是從玉米胚基因組文庫中分離的進(jìn)行玉米胚增強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子；I-Zm.Hsp70內(nèi)含子是玉米熱休克蛋白的間插序列，如美國專利5,593,874和5,859,347所描述，在此引入其完整內(nèi)容作為參考)；Ec.GUS1為大腸桿菌β葡糖醛酸糖苷酶的編碼區(qū)；T-AGRTU.nos是胭脂堿合成酶基因的終止信號(hào)；P-CaMV.35S是CaMV 35S啟動(dòng)子(美國專利No.5,352,605，在此引入其完整內(nèi)容作為參考)。
許多植物啟動(dòng)子是應(yīng)答于環(huán)境、化學(xué)和/或發(fā)育信號(hào)而調(diào)節(jié)的，可以用以表達(dá)植物細(xì)胞中可操作連接的基因，包括由(1)熱(Callis et al.，Plant Physiol.88965，1988)，(2)光(如，pea rbcS-3A promoter，Kuhlemeier et al.，Plant Cell 1471，1989；maize rbcS promoter，Schaffner and Sheen，Plant Cell 3997，1991；或chlorophyll a/b-bindingprotein promoter，Simpson et al.，EMBO J.42723，1985)，(3)激素如脫落酸(M & cotte et al.，Plant Cell 1969，1989)，(4)創(chuàng)傷(如，wuni，Siebertz etal.，Plant Cell 1961，1989)；或(5)化學(xué)物質(zhì)如茉莉酸、水楊酸或安全劑調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。使用(6)器官特異性啟動(dòng)子(如，Roshal et al.，EMBO J.61155，1987；Schernthaner et al.，EMBO J.71249，1988；Bustos et al.，Plant Cell 1839，1989)也可以是有益的。本發(fā)明的啟動(dòng)子是胚細(xì)胞增強(qiáng)的和胚發(fā)生組織增強(qiáng)的或愈傷組織增強(qiáng)的植物啟動(dòng)子，可以可操作連接到表達(dá)載體中的任何感興趣基因。
植物表達(dá)載體可以包括RNA加工信號(hào)，如內(nèi)含子，可以位于轉(zhuǎn)基因的多肽編碼序列的上游或下游。另外，表達(dá)載體可以包括植物基因3’非翻譯區(qū)的額外調(diào)節(jié)序列(Thomburg et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.USA84744(1987)；An et al.，Plant Cell 1115(1989)，如增加mRNA的mRNA穩(wěn)定性的終止子區(qū)，如土豆的PI-II終止子區(qū)或章魚堿或胭脂堿合成酶3’終止子區(qū)。mRNA的5’非翻譯區(qū)可以在翻譯起始中起重要作用并且也可以是植物表達(dá)載體的基因成分。例如，已經(jīng)證明從熱休克蛋白基因得到的非翻譯5’先導(dǎo)序列可以增強(qiáng)植物中的基因表達(dá)(見，例如美國專利5,352,865，在此引入其完整內(nèi)容作為參考)。這些額外的上游和下游調(diào)節(jié)序列可以源于與存在于表達(dá)載體中的其它元件的天然或異源的來源。
本發(fā)明的啟動(dòng)子序列被用于控制植物細(xì)胞中的基因表達(dá)。更優(yōu)選將此啟動(dòng)子序列用于控制植物種子中的基因表達(dá)。甚至更優(yōu)選將此啟動(dòng)子序列用于控制植物胚中的基因表達(dá)。公開的啟動(dòng)子序列是用于植物轉(zhuǎn)化的載體的一部分的基因成分。本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可以與任何適當(dāng)?shù)暮蛇x擇或可篩選標(biāo)記和相關(guān)調(diào)節(jié)元件的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蜉d體，以及如本文所述的以足夠賦予特別需要的性狀的方式表達(dá)的一種或更多核酸一起使用。本發(fā)明預(yù)見的適當(dāng)有農(nóng)業(yè)益處的基因包括但不限于一種或更多昆蟲耐受基因如B.t.，害蟲耐受如真菌疾病控制基因，除草劑耐受如授予草甘膦耐受的基因，以及改進(jìn)質(zhì)量的基因如產(chǎn)量、增強(qiáng)營養(yǎng)如維生素、油和氨基酸組成、環(huán)境或壓力耐受或植物生理、生長、發(fā)育、形態(tài)或植物產(chǎn)品的任何需要的改變。
另外，DNA編碼序列可以通過編碼例如通過反義或共抑制介導(dǎo)機(jī)制導(dǎo)致定向抑制內(nèi)源性基因表達(dá)的非翻譯RNA分子影響這些表型(見，例如，Bird et al.，Biotech.Gen.Engin.Rev.9207，1991)。RNA也可以是經(jīng)加工而切除需要的內(nèi)源性mRNA產(chǎn)物的催化性RNA分子(即核酶)(見例如Gibson and Shillitoe，Mol.Biotech.7125，197)。這樣，任何產(chǎn)生表達(dá)感興趣的表型或形態(tài)改變的蛋白或mRNA的基因?qū)?shí)施本發(fā)明都是有用的。
除了位于DNA序列上游(5’)或內(nèi)部的調(diào)節(jié)元件或序列，還有影響基因表達(dá)的下游序列，因此這里使用的名詞調(diào)節(jié)序列是指任何位于DNA序列上游、內(nèi)部或下游，與細(xì)胞的蛋白合成裝置結(jié)合控制、介導(dǎo)或影響基因產(chǎn)物表達(dá)的核苷酸序列。
例如，為在其它植物系統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明的啟動(dòng)子序列，可以修飾本發(fā)明的啟動(dòng)子序列。在另一種方法中，可以通過許多方法設(shè)計(jì)或加工新穎的嵌合或雜合啟動(dòng)子。許多啟動(dòng)子包含激活、增強(qiáng)或定義強(qiáng)度和/或啟動(dòng)子特異性的上游序列(Atchison，Ann.Rev.Cell Biol.4127，1988)。T-DNA基因，如含有定義轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的TATA盒和位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的其它上游元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平(Gelvin，In TransgenicPlants(Kung，S.-D.And Us，R.，eds)，San DiegoAcademic Press，pp.49-87，1988)。另一種嵌合啟動(dòng)子將章魚堿合成酶(ocs)激活劑三聚體結(jié)合到甘露堿合成酶(mas)激活劑與啟動(dòng)子，并報(bào)道了報(bào)道基因表達(dá)的增加(Min Ni et al.，The Plant Joumal 7661，1995)。本發(fā)明的上游調(diào)節(jié)序列可以用于構(gòu)建這種嵌合或雜合啟動(dòng)子。用于構(gòu)建本發(fā)明的變異啟動(dòng)子的方法包括但不限于將不同啟動(dòng)子的控制元件或啟動(dòng)子的復(fù)制部分或區(qū)域結(jié)合起來(見例如美國專利5,110,732，在此引入其完整內(nèi)容作為參考，以及美國專利5,097,025，在此引入其完整內(nèi)容作為參考)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉描述構(gòu)建、操作和分離大分子(如DNA分子，質(zhì)粒等)的特定條件和程序，產(chǎn)生重組生物體和篩選及分離基因的標(biāo)準(zhǔn)來源物質(zhì)(見例如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，1989；Mailga et al.，Methods in Plant MolecularBiology，Cold Spring Harbor Press，1995；Birren et al.，Genome Analysisvolume 1，Analyzing DNA，(1997)；volume 2，Detecting Genes，(1998)；volume 3，Cloning Systems，(1999)，volume 4，Mapping Genomes，(1999)，Cold Spring Harbor，New York)。
如文中所描述可以用可篩選或可測量的標(biāo)記將本發(fā)明的啟動(dòng)子序列插入表達(dá)載體中并在提供穩(wěn)定植物系統(tǒng)中的基因表達(dá)的指示的瞬時(shí)測定中對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)。在瞬時(shí)測定中檢驗(yàn)基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員公知的。用許多植物、組織和DNA運(yùn)送系統(tǒng)報(bào)道了標(biāo)記基因的瞬時(shí)表達(dá)。例如，瞬時(shí)分析的類型可以包括但不限于在使用任何感興趣的植物種的瞬時(shí)測定中通過電穿孔或粒子轟擊組織而指導(dǎo)基因運(yùn)送。這種瞬時(shí)系統(tǒng)包括但不限于從小麥懸浮液培養(yǎng)物中得到的原生質(zhì)體(Zhou et al.，Plant Cell Reports 12612.1993)，小麥葉原生質(zhì)的電穿孔(Sethi et al.，J.Crop Sci.52152，1983)；從玉米組織制備的原生質(zhì)的電穿孔(Sheen，J.The Plant Cell 3225，1991)，或感興趣的特定組織的粒子轟擊。本發(fā)明包含用任何瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)評(píng)估操作連接到選擇的報(bào)道基因，標(biāo)記基因或感興趣的農(nóng)業(yè)基因的調(diào)節(jié)序列。預(yù)備通過適當(dāng)?shù)倪\(yùn)送系統(tǒng)在瞬時(shí)系統(tǒng)中檢驗(yàn)的植物組織的例子包括但不限于葉基組織、愈傷組織、子葉、根、胚乳、胚發(fā)生組織、花組織、花粉和表皮組織。
任何可測量或可篩選的標(biāo)記都可以用于瞬時(shí)測定。瞬時(shí)分析本發(fā)明的啟動(dòng)子或5’調(diào)節(jié)序列的優(yōu)選標(biāo)記基因包括GUS基因(β葡糖醛酸糖苷酶的編碼序列)或GFP(綠色熒光蛋白編碼序列)。將含有與標(biāo)記基因可操作連接的5’調(diào)節(jié)序列的表達(dá)載體運(yùn)送到組織中，并用適當(dāng)?shù)臋C(jī)制根據(jù)標(biāo)記分析組織。數(shù)量或質(zhì)量分析被用作評(píng)估當(dāng)啟動(dòng)子序列在穩(wěn)定植物中與農(nóng)業(yè)上感興趣的基因操作連接時(shí)的潛在表達(dá)圖譜。最終，將本發(fā)明的5’調(diào)節(jié)序列直接摻入適當(dāng)?shù)闹参镛D(zhuǎn)化表達(dá)載體中，將本發(fā)明的5’調(diào)節(jié)序列操作連接到可選擇的標(biāo)記和感興趣的基因，轉(zhuǎn)化到植物中，并分析轉(zhuǎn)化植物及其后代中由5’調(diào)節(jié)序列賦予的表達(dá)圖譜。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知適于植物轉(zhuǎn)化的載體。適當(dāng)?shù)妮d體將包括但不限于用于土壤桿菌介導(dǎo)方法的disarmed Ti質(zhì)粒。這些載體可以含抗性標(biāo)記、1-2個(gè)T-DNA邊和大腸桿菌和土壤桿菌的復(fù)制起點(diǎn)以及一種或更多感興趣的基因及相關(guān)調(diào)節(jié)區(qū)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知對(duì)于土壤桿菌介導(dǎo)途徑，可以使用許多菌株和方法。這些菌株包括但不限于土壤桿菌株C58，LBA44O4，EHAIOl和EHAl05。特別優(yōu)選的株為根癌土壤桿菌株。其它用于植物轉(zhuǎn)化的DNA運(yùn)送系統(tǒng)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并包括但不限于選定植物組織的粒子轟擊。其它用于植物轉(zhuǎn)化的DNA運(yùn)送系統(tǒng)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并包括但不限于一般為感興趣的特定植物宿主優(yōu)化的選定植物組織的粒子轟擊。
可以用本發(fā)明范圍中的方法引入的核酸的例子包括，例如從另一物種得到的DNA序列或基因，或甚至是同一物種起源或存在于同一物種中，但是是通過經(jīng)典復(fù)制或雜交技術(shù)以外的基因工程方法摻入受體細(xì)胞的序列。然而，名詞外源性的，也意欲指通常在被轉(zhuǎn)化細(xì)胞中不存在，或也許僅僅是不以轉(zhuǎn)化DNA片斷或基因中的形式、結(jié)構(gòu)等存在的基因或通常存在，但需要如過度表達(dá)的基因。這樣，名詞“外源性”基因或DNA意欲指任何引入受體細(xì)胞的任何基因或DNA片段，不管此細(xì)胞中是否已經(jīng)有相似的基因。包括在外源性DNA中的DNA類型可以包括已經(jīng)存在于植物細(xì)胞中的DNA，另一種植物的DNA，不同生物體的DNA，或外部產(chǎn)生的DNA，如含基因反義信息的DNA序列，或編碼基因的合成或修飾版本的DNA序列。
可以通過植物轉(zhuǎn)化方法將包含本發(fā)明的啟動(dòng)子序列的植物轉(zhuǎn)化載體引入植物。有一些方法可以將DNA序列引入植物細(xì)胞并且是本領(lǐng)域中熟知的。適當(dāng)?shù)姆椒ò?xì)菌感染，二元細(xì)菌人工染色體載體，直接運(yùn)送DNA(如通過PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)，干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取，電穿孔，用氧化硅纖維攪拌，以及加速DNA包被的顆粒(綜述于Potrykus，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42205，1991)。
特異性轉(zhuǎn)化雙子葉植物的方法主要使用根癌土壤桿菌。例如，報(bào)道過的轉(zhuǎn)基因植物包括但不限于棉花(美國專利5,004,863；美國專利5,159,135；美國專利5,518,908，WO 97/43430)，大豆(美國專利5,569,834；美國專利5,416,011；McCabe et al.，Bio/Technology，6923，1988；Christou et al.，Plant Physiol.，87671，1988)；蕓苔(美國專利5,463,174)，和花生(Cheng et al.，Plant Cell Rep.，15653，1996)。
在單子葉植物轉(zhuǎn)化中報(bào)道了相似的方法。已經(jīng)描述了許多農(nóng)作物包括但不限于蘆筍(Asparagus officinalis；Bytebier et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，845345，1987)；大麥(Hordeum vulgarae；Wan and Lemaux，Plant Physiol.，10437，1994)；玉米(Zea mays；Rhodes，C.A.，et al.，Science，240204，1988；Gordon-Kamni，et al.，Plant Cell，2603，1990；Fromm，et al.，Bio/Teclinology，8833，1990；Koziel，et al.，Bio/Technology，11194，1993)；燕麥(Avena sativa；Somers，et al.，Bio/Technology，101589，1992)；鴨茅(Dactylis glomerata；Horn，et al.，Plant Cell Rep.，7469，1988)；大米(Oryza sativa，including indica andjaponica varieties，Toriyama，et al.，Bio/Technology，610，1988；Zhang，et al.，Plant Cell Rep.，7379，1988；Luo and Wu，Plant Mol.Biol.Rep.，6165，1988；Zhang and Wu，Theor.AppI.Genet.，76835，1988；Christou，et al.，Bio/Technology，9957，1991)；高梁(Sorghum bicolor；Casas，A.M.，et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.，9011212，1993)；甘蔗(Saecharumspp.Bower and Birch，Plant 3.，2409，1992)；高羊茅(Festucaarundinacea；Wang，Z.Y.et al.，Bioffechnology，10691，1992)；草(Agrostis palustris；Zhong et al.，Plant Cell Rep.，131，1993)；小麥(Triticum aestivum；Vasil et al.，Biotechnology，10667，1992；Weeks T.，et al.，Plant Physiol.，1021077，1993；Becker，et al.，Plant，J.5299，1994)，以及紫花苜蓿(Masoud，S.A.，et al.，Transgen.Res.，5313，1996)。對(duì)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員很明顯的是，為從任何感興趣的靶農(nóng)作物產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物，可以使用或修飾許多轉(zhuǎn)化方法。
分析了轉(zhuǎn)化植物中感興趣基因的存在和表達(dá)水平和/或由本發(fā)明的啟動(dòng)子序列賦予的形態(tài)。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知有很多方法可以用于分析轉(zhuǎn)化植物。使用了許多方法估計(jì)基因表達(dá)和判斷引入基因是否按照預(yù)期目標(biāo)恰當(dāng)整合、作用及遺傳。對(duì)于本發(fā)明，可以通過判斷操作連接了啟動(dòng)子的基因的表達(dá)水平而評(píng)價(jià)啟動(dòng)子。對(duì)啟動(dòng)子功能的初步分析可以通過使用報(bào)道基因的瞬時(shí)測定方法而判斷，但更權(quán)威性的啟動(dòng)子評(píng)估可以通過穩(wěn)定植物的分析而判斷。植物分析的方法包括但不限于DNA或RNA印跡，基于PCR的方法，生化分析，表型篩選法，大田評(píng)估和免疫診斷測定。
本發(fā)明的方法包括但不限于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的cDNA文庫制備、基因組文庫制備、測序、序列分析、PCR技術(shù)、載體構(gòu)建、瞬時(shí)測定和植物轉(zhuǎn)化方法，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或其修飾執(zhí)行。
下面的實(shí)施例是為了證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案而引入的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，遵照發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的代表技術(shù)的實(shí)施例中公開的技術(shù)在本發(fā)明的實(shí)施中可以正常行使作用。然而，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員按照本公開內(nèi)容應(yīng)該理解在公開的特定實(shí)施方案中可以進(jìn)行許多改變而仍然獲得相似或相同的結(jié)果，并且不離開本發(fā)明的精神和范圍。所以在附圖中闡述或表示的內(nèi)容應(yīng)該解釋為說明而不是限制意義。
實(shí)施例選用了許多組織和植物發(fā)育階段制備玉米文庫。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知組織選擇和制備中一種組織樣品與另一種組織樣品會(huì)有不同。下面是靶文庫的條件。
實(shí)施例1分別用傳粉后13天的玉米胚(13-DAP)(SATMON033文庫)或傳粉后21天的玉米胚(21-DAP)(SATMON017文庫)作為胚-13-DAP或胚-21-DAP cDNA文庫的來源物質(zhì)。這些文庫是從玉米產(chǎn)生的(DK604，Dekalb Genetics，Dekalb，Illinois U.S.A.)。將種子種植在含Metro 200生長培養(yǎng)基的2″-3″的罐中約3厘米深度的土壤并在2-3周之后移植到含同樣土壤的更大的10″的罐中。在移植后每周使用Peters 15-16-17肥料3次，濃度為150ppm，植物從移植到開花的生命中共2-3次。每個(gè)罐中添加總共約900mg鐵，在植物從移植到開花的生命周期中共添加2到3次。玉米植物以白天15小時(shí)/夜晚9小時(shí)的循環(huán)在溫室中生長。白晝溫度為約80°F，夜晚溫度為約70°F。用1000W的鈉蒸汽燈提供補(bǔ)充的光照。
選擇的玉米植物超過了V10期，在抽絲前將準(zhǔn)備進(jìn)行受精的穗芽包在紙袋中阻止花粉。傳粉后13天(13-DAP)或傳粉后21天(21-DAP)，抽出谷穗并將谷粒從谷穗上摘下。解剖谷粒的胚和胚乳并去除糊粉層。解剖后將胚在液氮中冷凍并在RNA制備前在-80℃下儲(chǔ)存。
為制備再生的HI II II型愈傷組織文庫(SATMON025)，制備了含愈傷組織起始培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿。此培養(yǎng)基含N6鹽和維生素，3％的蔗糖，2.3g/l的脯氨酸，0.1g/l的酪蛋白水解產(chǎn)物，2mg/l的2，4-D，15.3mg/l的AgNO3和0.8％的Bacto-Agar(商品名，細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂)，并在高壓滅菌前將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為pH6.0。在傳粉后9-11天，選擇具有測量為約1-2mm長的未成熟胚的谷穗。去除谷殼和絲，將谷穗分成兩半并將其放置于高壓滅菌的Clorox/tween 20溶液。用去離子水沖洗谷穗并將每個(gè)胚從谷粒中提取出來。將完整的胚放置于與培養(yǎng)基接觸，去除盾片。將多個(gè)胚放置于每個(gè)平皿上并在黑暗中25℃下孵育(所有培養(yǎng)基成分都是可以買到的，大多數(shù)是從Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO購買的)。將形成的易碎的II型愈傷組織轉(zhuǎn)移到?jīng)]有AgNO3的培養(yǎng)基中并且每7-10天進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)。在胚分離后約4周，將愈傷組織從平皿中取出并在液氮中冷凍。在RNA制備前將收獲的組織在-80℃下儲(chǔ)存。
使用從Life Technologies公司(Gaithersburg，Maryland)購買的Trizol試劑基本按生產(chǎn)商所推薦的從收獲組織中純化出RNA。用磁性寡dT珠基本按生產(chǎn)商所推薦的(Dynabeads，Dynal Corporation，LakeSuccess，New York)純化聚腺苷酸+RNA(mRNA)。
構(gòu)建cDNA文庫是本領(lǐng)域中熟知的，并且存在許多克隆策略?？梢再I到許多cDNA文庫構(gòu)建試劑盒。按生產(chǎn)商建議的條件使用SuperscriptTM質(zhì)粒系統(tǒng)用于cDNA合成和質(zhì)?？寺?Gibco BRL，LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。
將cDNA文庫平鋪于含適當(dāng)用于選擇的抗生素的LB瓊脂上并在37℃下孵育充足時(shí)間，以便允許個(gè)體克隆的生長。將單個(gè)克隆逐個(gè)置于含包括選擇性抗生素的LB液體的96孔微量滴定板的每個(gè)加樣孔中。在約37℃將這些滴定板孵育過夜并輕輕振蕩促進(jìn)培養(yǎng)物生長。用Qiaprep質(zhì)粒分離試劑盒(Qiagen Inc.，Santa Clara，CA)，采用生產(chǎn)商推薦的條件將質(zhì)粒DNA從每個(gè)克隆分離。
將模板質(zhì)粒DNA克隆用于隨后的測序。為進(jìn)行測序，使用ABIPRISM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction試劑盒與AmpliTaqDNA聚合酶(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。
實(shí)施例2
從源于各種玉米組織包括胚細(xì)胞和胚發(fā)生組織增強(qiáng)的或愈傷組織增強(qiáng)的mRNA制備的cDNA文庫的EST序列的數(shù)據(jù)庫中識(shí)別啟動(dòng)子。此序列也用作對(duì)包含前面識(shí)別和注釋序列的GenBank的詢問序列并用BLAST程序搜索同源區(qū)。用于隨后的啟動(dòng)子分離的表達(dá)序列標(biāo)記(EST)的選擇反映了個(gè)體cDNA文庫或cDNA文庫集合中隨機(jī)取樣得到的代表性EST中一種或更多序列的存在。為識(shí)別調(diào)節(jié)玉米胚中的轉(zhuǎn)錄序列表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，運(yùn)行了subsetting函數(shù)，要求所有ESTs在靶胚文庫中找到并且在數(shù)據(jù)庫中的其它非靶EST文庫不存在或以低豐度存在。使產(chǎn)生的候選EST接受電子northern函數(shù)，其中顯示了特定EST的假定組織表達(dá)圖譜和文庫中的豐度水平。識(shí)別出具有需要的組織表達(dá)圖譜和豐度的靶ESTs，并以識(shí)別的EST序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)基因特異性引物。產(chǎn)物得分是指感興趣的EST克隆和GenBank序列的BLAST匹配程度。百分比豐度是指一組相關(guān)表達(dá)的序列在得到EST文庫中出現(xiàn)的次數(shù)。可以執(zhí)行任何數(shù)目的查詢而獲得需要的ESTs并將取決于EST數(shù)據(jù)庫和可用于序列分析的計(jì)算機(jī)程序。對(duì)于本發(fā)明，通過選擇相對(duì)豐度，嚴(yán)格性和/或產(chǎn)物得分的需要值識(shí)別序列。對(duì)于SEQ ID Nos36-51啟動(dòng)子序列，在本底≤0，嚴(yán)格性≥50和產(chǎn)物得分≤100的情況下，選擇靶豐度≥1。
以這些數(shù)據(jù)庫查詢?yōu)榛A(chǔ)識(shí)別代表具有靶表達(dá)圖譜的cDNA的感興趣的EST序列的克隆IDs。表1為用于隨后分離SEQ ID Nos36-51啟動(dòng)子序列的ESTs提供了本底克隆ID(EST)信息，文庫來源和Genbank識(shí)別(gi)信息。為基于以10-8P值截止的GenBank BLAST查詢的克隆IDs列出序列注釋。當(dāng)向序列數(shù)據(jù)庫提交新序列時(shí)信息接受改變。ESTs的注解如下，注解信息在括號(hào)中克隆700614347(印度稻胚特異性蛋白(Ose731)基因，完整cds).；克隆700257959(稻類球蛋白mRNA，克隆Ose709，部分cds).；克隆700265029(玉米肌醇-1磷酸合成酶mRNA，完整cds).；克隆700321659(第3組Lea蛋白MGL3的玉米R(shí)NA).；克隆700616085(印度稻胚特異性蛋白(Ose731)基因，完整cds)。表1.啟動(dòng)子概括信息序列ID No.克隆ID文庫來源GenBank識(shí)別器(gi)36 700264271胚，21-DAP無37 700265872胚，21-DAP無38 700263624胚，21-DAP無39 700267629胚，21-DAP無40 700258061胚，21-DAP無41 700614347胚，13-DAPg410569142 700257959胚，21-DAPg409709943 700265029胚，21-DAPg310805244 700266438胚，21-DAP無45 700259522胚，21-DAP無46 700321659玉米愈傷組織 g44404451 700266176胚，21-DAP無47 700257969胚，21-DAP無48. 700613864胚，13-DAP無49，50 700260279胚，21-DAP無實(shí)施例3從使用根據(jù)Ausubel et al.，1992的CsCl純化方案，或通過CTAB純化方法(Rogers and Bendich，Plant Mol.Biol.，569(1985)分離的玉米DNA(從玉米雜交物Fr27 x FrMo 17得到)制備基因組文庫?？梢再I到試劑(例如，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明(GENOME WALKER，是CLONTECH Laboratories，Inc，Palo Alto，CA的商標(biāo))制備文庫。在單獨(dú)的反應(yīng)中，用下列鈍端內(nèi)切核酸酶使DNA在37℃下接受限制性酶過夜消化EcoRV，Scal，Dral，PvuII，or StuI(CLONThCH Laboratories，Inc.Palo Alto，CA)。用苯酚氯仿萃取反應(yīng)混合物，用乙醇沉淀，并重新懸浮于Tris-EDTA緩沖液中。然后將純化的鈍端基因組片段連接于GenomeWalkerTM連接物，根據(jù)生產(chǎn)商的方案完成產(chǎn)生的DNA片段與連接物的連接。等分GenomeWalkerTM亞文庫并在-20℃下儲(chǔ)存。
用基因特異性引物1(GSPI)和退火為連接物序列的引物，SEQ IDNO1表示的連接物引物1(AP1)使與GenomeWalkerTM連接物(前面所述)連接的DNA基因組接受初級(jí)PCR。將稀釋的(1∶50)初級(jí)PCR反應(yīng)的等分物作為嵌套輪PCR擴(kuò)增的輸入DNA，這一輪使用基因特異性引物2(GSP2)和SEQ ID NO2表示的連接物引物2(AP2)，或SEQ IDNO3表示的連接物引物3(AP3)。Genome Walker第一引物(AP1)和嵌套引物(AP2)的退火溫度分別為59℃和71℃。一般說來，基因特異性引物被設(shè)計(jì)為有下列特性26-30個(gè)核苷酸長，40-60％的GC含量，對(duì)于大多數(shù)基因特異性引物，產(chǎn)生溫度為60℃范圍的高溫或約70℃。使用的Taq聚合酶為Amplitaq GoldTM，可以從Perkin-Elmer Biosystems(Branchbury，New Jersey)得到。為進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，許多溫度循環(huán)儀器和試劑盒可以從許多生產(chǎn)商購買，如PE Biosystems(Foster City，CA)，Strategene(La Jolla，CA)，and MJ Research Inc.(Watertown，MA)。在初級(jí)PCR之后，用等分物(10-15μg)進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析。每一種未知序列從5亞基因組文庫和陰性對(duì)照組(無DNA)擴(kuò)增。
PCR成分和條件如下初級(jí)PCR成分要求量/體積亞文庫等分物 1μl基因特異性引物1 1μl(100pmol)GenomeWalkerTM連接物引物1(AP1) 1μldNTP混合物(每種dNTP 10mM) 1μlDMSO 2.5μl(或2-5％終濃度)10X PCR緩沖液(含MgCl2) 5μl(終濃度為1X)Amplitaq GoldTM0.5μl蒸餾水 到50μl的終反應(yīng)體積初級(jí)PCR的反應(yīng)條件A.在95℃下9分鐘B.94℃下2秒，70℃下3分鐘；重復(fù)94℃/70℃循環(huán)共7次C.94℃下2秒，65℃下3分鐘；重復(fù)94℃/65℃循環(huán)共36次D.65℃下4分鐘作為最終延長E.10℃下延長孵育嵌套PCR(二級(jí)PCR反應(yīng))成分要求量/體積初級(jí)PCR反應(yīng)物的1∶50稀釋液1μl基因特異性引物2 1μl(100pmol)GenomeWalkerTM連接物引物2或3(AP2或AP3) 1μldNTP混合物(每種dNTP 10mM) 1μlDMSO 2.5μl(或2-5％終濃度)10X PCR緩沖液(含MgCl2)5μl(終濃度為1X)Amplitaq GoldTM0.5μl蒸餾水 到50μl的終反應(yīng)體積嵌套PCR的反應(yīng)條件A.在95℃下9分鐘B.94℃下2秒，70℃下3分鐘；重復(fù)94℃/70℃循環(huán)共5次C.94℃下2秒，65℃下3分鐘；重復(fù)94℃/65℃循環(huán)共24次D.65℃下4分鐘作為最終延長E.10℃下延長孵育為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO36(克隆ID 700264271)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1(A)與SEQ ID NO6結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO7結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO37(克隆ID 700265872)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO8結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO9結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO38(克隆ID 700263624)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO10結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO11結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO39(克隆ID 700267629)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO12結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO13結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO40(克隆ID 700258061)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO14結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO15結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO41(克隆ID 700614347)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO16結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO17結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO42(克隆ID 700257959)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO18結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO19結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO43(克隆ID 700265029)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO20結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO21結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO44(克隆ID 700266438)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO22結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO23結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO45(克隆ID 700259522)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO24結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO25結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO46(克隆ID 700321659)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO26結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO27結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO47(克隆ID 700257969)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO28結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO29結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO48(克隆ID 70061864)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO30結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ ID NO31結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO49(克隆ID 700260279-PvuII文庫)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO32結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO2與SEQ IDNO33結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO50(克隆ID 700260279-Dral文庫)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO32結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO3與SEQ ID NO34結(jié)合。
為分離啟動(dòng)子序列SEQ ID NO51(克隆ID 700266176)，在初級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO1與SEQ ID NO34結(jié)合。為進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)，在二級(jí)PCR反應(yīng)中將SEQ ID NO3與SEQ ID NO35結(jié)合。
實(shí)施例4分離并凝膠純化從嵌套PCR擴(kuò)增得到的DNA片段。在瓊脂糖凝膠中電泳二級(jí)PCR的40μl的等分物。按生產(chǎn)商建議的條件使用BIO101Geneclean II試劑盒(Midwest Scientific，Valley Park，MO)將DNA片段將二級(jí)PCR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠中純化出來。按生產(chǎn)商建議的條件將純化DNA與pGEM-T Easy載體(pGEM-T Easy Vector System I，PromegaCorp.，Madison，WI)連接。將連接反應(yīng)的等分物轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主如DH10B并將細(xì)胞平鋪于選擇培養(yǎng)基(對(duì)于DH10B，100μg/ml羧芐青霉素)。選擇細(xì)菌轉(zhuǎn)化株，在液體培養(yǎng)基中生長并用可買到的試劑盒如Qiaprep Spin Microprep試劑盒(Qiagen Corp.，Valencia，CA)分離質(zhì)粒DNA。用SEQ ID NO4(M13向前引物)和SEQ ID NO5(M13反向引物)所表示的M13向前和反向引物的向兩個(gè)方向的染色終止子方法測序含根據(jù)限制性酶分析預(yù)測插入大小的純化質(zhì)粒。使用的限制性酶也可以從許多生產(chǎn)商處買到(例如，Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。判斷含啟動(dòng)子序列的5′側(cè)翼區(qū)并以SEQ ID NOS36-51表示。用于克隆啟動(dòng)子片段到適當(dāng)載體的工程化限制位點(diǎn)一般是用本領(lǐng)域技術(shù)人員公子的PCR方法完成的。
實(shí)施例5為進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析，將啟動(dòng)子片段克隆到表達(dá)載體。如果識(shí)別了靶啟動(dòng)子的起始密碼子(AUG)，則將啟動(dòng)子片段克隆到圖1(pMON19469)所示的載體，替代P-CaMV.35S基因元件。如果沒有識(shí)別AUG，則將啟動(dòng)子片段克隆到允許報(bào)道基因如GUS或GFP翻譯融合的表達(dá)載體。
在瞬時(shí)植物測定中檢驗(yàn)表達(dá)構(gòu)建體?？梢允褂迷S多本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的測定。為進(jìn)行GUS活性的組化分析，在13-DAP收集胚并與II型胚發(fā)生愈傷組織一起放置于培養(yǎng)基如MS培養(yǎng)基(PhysiologiaPlantarum 15473(1962)。為在瞬時(shí)測定中分析啟動(dòng)子，使用適當(dāng)粒子槍設(shè)備用表達(dá)載體DNA轟擊13-DAP谷粒胚乳的切片和受精(DAG)后14天的幼苗的黃化葉片段(見例如Clrristou et al.，Plant Physiol.，87671(1989)；Klein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，854305(1988)；Ye，G.-N.，et al.，Plant Mol.Biol.，15809(1990)。每個(gè)表達(dá)載體被轟擊到兩個(gè)獨(dú)立的平皿上。允許組織恢復(fù)48小時(shí)然后用X-Gluc(5-溴-4-氯-3-碘β-D-葡糖醛酸糖苷酶)染色檢測GUS基因在感興趣組織中的表達(dá)(Jefferson et al.，EMBO J.，63901(1987)。
實(shí)施例6
為進(jìn)行穩(wěn)定植物轉(zhuǎn)化，將啟動(dòng)子序列克隆到圖2所示(pMON39721)轉(zhuǎn)化載體并通過適當(dāng)運(yùn)送系統(tǒng)如土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(見例如美國專利5,569,834，5,416,011，5,631,152，5,159,135和5,004,863，在此引入其全部內(nèi)容作為參考)或粒子轟擊方法(見例如專利申請WO 92/15675，WO97/48814和歐洲專利586,355，以及美國專利5,120,657，5,503,998，5,830,728和5,015,580，在此引入其全部內(nèi)容作為參考)轉(zhuǎn)化到感興趣的靶農(nóng)作物。
為玉米的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，分離包括驅(qū)動(dòng)Ec.GUS基因表達(dá)的啟動(dòng)子Zm.700258061(SEQ ID NO40)的pMON51002(圖3)的NotI片段，并將其克隆到植物轉(zhuǎn)化載體pMON39721(圖2)的NotI位點(diǎn)產(chǎn)生pMON51008(圖4)。為玉米的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，分離包括驅(qū)動(dòng)Ec.GUS基因表達(dá)的啟動(dòng)子Zm.700267629(SEQ ID NO39)的pMON51001(圖5)的NotI片段，并將其克隆到植物轉(zhuǎn)化載體pMON39721的NotI位點(diǎn)產(chǎn)生pMON51009(圖9)。為玉米的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，分離包括驅(qū)動(dòng)Ec.GUS基因表達(dá)的啟動(dòng)子Zm.700263624(SEQ ID NO38)的pMON51003(圖7)的NotI片段，并將其克隆到植物轉(zhuǎn)化載體pMON39721的NotI位點(diǎn)產(chǎn)生pMON51010(圖8)。在構(gòu)建這些植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建體時(shí)使用了分子生物學(xué)領(lǐng)域中公知的方法，如內(nèi)切核酸酶消化、DNA片段純化、連接、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、抗生素選擇、質(zhì)粒純化(Sambrook et al.，1989)。用三親代交配程序(Ditta et al.Proc.Natl Acad.Sci USA 777347(1980)將植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌。
使用根癌土壤桿菌(ABI株)并在27℃下將其在含100mg/L卡那霉素、50mg/L奇放線菌素和25mg/L氯霉素的(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)LB液體培養(yǎng)基(每250ml的燒瓶中50ml)中培養(yǎng)約24小時(shí)(在150-160rpm的旋轉(zhuǎn)臺(tái)上)。在3400rpm離心培養(yǎng)物并在250ml的燒瓶中將其重新懸浮于含用于LB的1/2水平的奇放線菌素和卡那霉素以及200μM乙酰丁香酮(AS；用于引入毒性)的AB液體培養(yǎng)基(在660nm下將OD調(diào)節(jié)為0.2)。在與LB培養(yǎng)物相同的條件下培養(yǎng)15-16小時(shí)后。收獲土壤桿菌懸浮液并將其在含AS的1/2 VI培養(yǎng)基中洗滌并離心，然后重新懸浮于1/2 MS PL培養(yǎng)基(也含同樣水平的AS)。土壤桿菌的終濃度為約1×109cfu/ml(等于660nm下OD為1.0)。
在我們的實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)化使用了玉米三倍雜合體(Pa9 1xH99)xA188。無菌收集大小為0.5mm到2.0mm長的玉米不成熟胚并浸入含土壤桿菌和200μM AS的1/2 MS PL的液體培養(yǎng)基中。在一頁紙上干燥不成熟胚，然后將其放置于含3.0mg/L 2，4-D，200μM乙酰丁香酮，2％蔗糖，1％葡萄糖，12mM脯氨酸和20μM硝酸銀的1/2 MS協(xié)同培養(yǎng)基在23℃下培養(yǎng)2或3天。然后將不成熟胚轉(zhuǎn)移到由15AA大分子和小分子鹽，1mg/L 2，4-D，12mM脯氨酸和500mg/l羧芐青霉素組成的15AA延遲培養(yǎng)基并在27℃下培養(yǎng)5天。將胚轉(zhuǎn)移到含有含1.0mg/L2，4-D，12mM脯氨酸，750mg/l羧芐青霉素和50mg/L巴龍霉素的15AA培養(yǎng)基的首選培養(yǎng)基并在27℃下培養(yǎng)2周。然后將胚轉(zhuǎn)移到同樣的但含更高水平選擇試劑(100mg/L巴龍霉素)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，然后將這些胚轉(zhuǎn)移到含200mg/L巴龍霉素的培養(yǎng)基中再進(jìn)行一次或兩次選擇。將所選的愈傷組織放入MS 6BA再生培養(yǎng)基約2周，然后將它們再轉(zhuǎn)移到MS OD培養(yǎng)基并在照明室中培養(yǎng)。選擇有旺盛生長的根和莖的幼苗并將其置于土壤中健化7天，然后放置于溫室中。
將溫室中的轉(zhuǎn)基因植物與H99雜交，在傳粉后13天和21天收獲它們的不成熟胚進(jìn)行GUS染色(表2)和MUG(表3)活性測定。轉(zhuǎn)基因植物組織的GUS染色測定(Jefferson et al.，EMl30 J.，63901(1987)為判斷玉米葉、根、胚、胚乳和種皮組織的表達(dá)模式提供了本發(fā)明玉米胚增強(qiáng)型啟動(dòng)子的定性分析。不檢測葉中本發(fā)明啟動(dòng)子序列的GUS表達(dá)，而且不經(jīng)常檢測根組織中發(fā)明啟動(dòng)子序列的GUS表達(dá)。檢測種子中特別是種子胚中的GUS表達(dá)。這些啟動(dòng)子表現(xiàn)出在種子和與根、葉或其它植物組織中的表達(dá)相關(guān)的種子相關(guān)組織中增強(qiáng)的表達(dá)。
表2.在轉(zhuǎn)基因玉米組織提取物中的定性GUS活性Zm.700258061Zm.700267629 Zm.700263624pMON51008 pMON51009 pMON51010葉中的GUS- - -活性根中的GUS 15％+/85％-*18％+/82％-*16％+/84％-*活性胚中的GUS+ + +活性胚乳中的GUS 糊粉中的部分+- 糊粉中的部分+活性 其它部分- 其它部分-
種皮中的GUS +/-+ +/-活性+有GUS活性-沒有可檢測的GUS活性+/-不確定或陰性*一些植物的根組織是陽性的MUG測定提供了轉(zhuǎn)基因種子中胚和胚乳表達(dá)的定性分析。從解剖轉(zhuǎn)基因玉米植物的每一半穗得到的10個(gè)胚和10個(gè)胚乳中提取蛋白。在13dpp的時(shí)間點(diǎn)測定陰性對(duì)照PHxA/CK野生型玉米組織。MUG測定使用加入組織的500μl GUS提取緩沖液，在1.5ml的eppendorf管中用聚四氟乙烯杵研磨組織并在4℃下以10K RPM離心5分鐘(BeckmanGS-15R)。將400μl上清液轉(zhuǎn)移到96個(gè)深加樣孔的新滴定板。在干冰上冷凍提取物并在使用前在-80℃下儲(chǔ)存。MUG測定由一下步驟組成，用4-甲基傘形酮(SIGMA Ml 381)進(jìn)行從31.2pmol到2000pmol的連續(xù)稀釋產(chǎn)生活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在預(yù)讀植物將本底調(diào)零后以雙份將5μl的每種提取物加入平底96孔滴定板(Falcon 3872)。將200μl GUS測定溶液(0.1M KPO4 pH7.8，1.0mM EDTA，5％甘油，1.0mM DDT，2mM 4-甲基傘形酮葡糖醛酸糖苷酶Fluka 69602)加入每個(gè)加樣孔并用加樣頭與樣品混合。在37℃下用過濾器對(duì)在F-max(分子設(shè)備)上動(dòng)態(tài)讀取滴定板激活-655/散射460。典型的讀數(shù)由以3分鐘為間隔持續(xù)1小時(shí)讀出的21個(gè)讀數(shù)組成。根據(jù)每個(gè)樣品的MUG結(jié)果和蛋白結(jié)果計(jì)算GUS活性(pmol/min/μg蛋白)。用Bio-Rad蛋白測定試劑盒測定總蛋白。將BSA蛋白連續(xù)稀釋為0.05mg/ml到0.5mg/ml，用于制造標(biāo)準(zhǔn)曲線。將雙份1.5μl的提取物加入平底96孔滴定板(Falcon)。加入200μl稀釋染色試劑并與樣品混合。在室溫下孵育5分鐘后在室溫下Spectromax 250(分子設(shè)備)中測量595nm下的吸收。MUG分析證明了前面描述的本發(fā)明分離的啟動(dòng)子在玉米種子組織中表達(dá)并且在胚和胚乳組織中的表達(dá)不同?？梢詮谋景l(fā)明的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的，在種子中胚和胚發(fā)育的不同階段表達(dá)的植物群中選擇獨(dú)立轉(zhuǎn)化的玉米系。表3.MUG測定/pmol/min/μg蛋白構(gòu)建體啟動(dòng)子植物#胚/ 胚乳/ 胚/ 胚乳/13dpp13dpp21dpp21dpppMON51008 700258061 s1281150.4 00.3 0.1s1282223.3 0s128230.4 0.1 8.6 0.3s12824 0 0s128292.7 019.1 0.6s128320.2 046.9 2.4s128349.8 0.3s128365.4 1.412 0.3s128260.9 0 210 0s128281.9 0135.9 0s128336.6 0.2 135.5132.9s1281372.22.70.8 0.5s128356.7 0.266.2 1.8pMON51009 700267629 s13745 0 1s137460.9 0 20.3 1.1s13747 0 0.2 0.7 0.9s13750 0 0.1s13752 0 0s13753 0 0s13754 0 0s13755 0 0 0 0s13756 0 0s137570.2 0.2s137591.6 0 1.2s13760 0 0 0s13761 0s13763 0 0 0 0s13764 0 0s13766 0 0s13767 0 0s13768 0 0s138110.6s13813 0 0s13814 0 1.4s13815 0 0.3s13816 0.7 0.6
s13817 0 2.7s13818 0.8 0 5.2s13819 3.8 0s13820 0.1 0.4s13821 0 0.1構(gòu)建體啟動(dòng)子植物#胚/ 胚乳/胚/ 胚乳/13dpp13dpp21dpp21dpppMON51010700263624 s13769 00s13770 00s1377100s13772 00s13773 5.6 0s13774 00s13775 00s13776 6.4s13777 00 6.6s13778 00s13779 00 27.3 1.8s13780 3.3 0s13781 00s13782 00s13783 00 5.4s13785 0.5 2.3 0s13786 3.6s13789 00s13791 00s13792 2.8 0 23.4 0s13793 005s13794 00 4.3s13795 0 3.8 0s13797 00 4.1 0s13799 00s13801 1.8 0 5.9s13802 00 47.5 6.1s13805 00 5.1s13806 00s13807 00s13809 00s13810 00s13826 00s13827 0.4 050s13828 00 0.4 0PhxA/CK-00
許多轉(zhuǎn)化和再生系統(tǒng)和方法都是可用的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。隨后用任何數(shù)目的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的分子、免疫診斷、生化和/或大田評(píng)價(jià)方法分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物和后代中基因在感興趣的組織中的表達(dá)。
實(shí)施例7適當(dāng)?shù)膯?dòng)子調(diào)節(jié)所必需的順式作用調(diào)節(jié)元件可以用許多方法識(shí)別。在一種方法中，執(zhí)行缺失分析而去除啟動(dòng)子區(qū)域并測定產(chǎn)生的啟動(dòng)子片段的啟動(dòng)子活性。如果截短的啟動(dòng)子活性與原始啟動(dòng)子片段的活性相比有改變，那么就認(rèn)為DNA片段是啟動(dòng)子調(diào)節(jié)所必需的。通過這種缺失分析，可以識(shí)別哪些小的DNA區(qū)域是轉(zhuǎn)錄的正或負(fù)調(diào)節(jié)所必需的。也可識(shí)別啟動(dòng)子序列基序和制造為含這些調(diào)節(jié)可操作連接的轉(zhuǎn)錄序列的表達(dá)的順式元件的新型啟動(dòng)子。見例如，美國專利5,223,419，在此引入其完整內(nèi)容作為參考，美國專利4,990,607，在此引入其完整內(nèi)容作為參考，以及美國專利5,097025，在此引入其完整內(nèi)容作為參考。
另一種方法是尋找有相似表達(dá)圖譜的啟動(dòng)子之間的相似序列。有重疊活性模式的啟動(dòng)子可以有共同的調(diào)節(jié)機(jī)制。一些計(jì)算機(jī)程序可以用于識(shí)別啟動(dòng)子之間的保守序列基序，包括但不限于MEME，SIGNALSCAN，或GENE SCAN。這些基序可以代表調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)識(shí)別了序列基序后，可以測定它們的功能。例如，可以將基序序列從啟動(dòng)子去除從而判斷此基序是否是正確啟動(dòng)子功能所必需的。此外，可以將基序添加到最小啟動(dòng)子而檢驗(yàn)它是否足夠激活轉(zhuǎn)錄?？梢酝ㄟ^添加活性啟動(dòng)子并尋找啟動(dòng)子活性減少而檢驗(yàn)懷疑的陰性調(diào)節(jié)元件的豐度。一些順式作用調(diào)節(jié)元件可能要求其它元件的作用。所以，可以以任何數(shù)目的本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的方法的結(jié)合檢驗(yàn)多種元件。
當(dāng)識(shí)別了功能性的啟動(dòng)子元件后，可以在核苷酸水平修飾啟動(dòng)子元件而影響蛋白結(jié)合。這些修飾可以導(dǎo)致更高或更低的親和結(jié)合，這將影響啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平。
啟動(dòng)子元件可以補(bǔ)充或協(xié)同作用而影響總體啟動(dòng)子活性。在這點(diǎn)上，可以將不同5’調(diào)節(jié)區(qū)的啟動(dòng)子元件置于一前一后的位置，從而獲得有不同表達(dá)譜或更高水平表達(dá)的啟動(dòng)子。另外，可以將啟動(dòng)子元件多聚化，從而增加特異性以該啟動(dòng)子元件影響的模式的表達(dá)水平。
構(gòu)建含新型的工程化的5’調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體所需要的技術(shù)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。在表達(dá)載體中檢驗(yàn)工程化的啟動(dòng)子并通過將新型啟動(dòng)子與適當(dāng)報(bào)告基因如GUS可操作連接并在瞬時(shí)植物測定中進(jìn)行瞬時(shí)檢驗(yàn)。將新型啟動(dòng)子與一種或更多感興趣的基因與一種或更多額外的調(diào)節(jié)元件插入植物轉(zhuǎn)化載體并用適當(dāng)?shù)腄NA運(yùn)送系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到感興趣的靶植物中。用任何數(shù)目的適合評(píng)估所需農(nóng)業(yè)特征的分子、免疫診斷、生化、表型或大田方法評(píng)估穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物和后代。
按照這里公開的方法，植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以分離能夠調(diào)節(jié)與啟動(dòng)子異源的可操作連接的DNA序列轉(zhuǎn)錄的DNA啟動(dòng)子序列。這些啟動(dòng)子對(duì)增強(qiáng)植物種子、植物胚發(fā)生組織核植物愈傷組織中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)有用，這種表達(dá)與這些啟動(dòng)子可以在其它植物細(xì)胞和組織，如根和葉中指導(dǎo)的表達(dá)水平相關(guān)。作為本發(fā)明的啟動(dòng)子序列的DNA分子包含各種順式作用元件，它們是從具有已知啟動(dòng)子序列的DNA分子中分離并與其融合建立雜合啟動(dòng)子序列。這些雜合啟動(dòng)子將有不同于已知啟動(dòng)子序列和通過本領(lǐng)域中的方法分離的啟動(dòng)子的表達(dá)模式。在植物中行使功能的熟知的啟動(dòng)子包括，但不限于花椰菜花葉病毒35S和19S啟動(dòng)子，玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子，甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子和其它植物病毒啟動(dòng)子，植物肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子如大米肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和擬南芥肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和植物泛素啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子具有識(shí)別用于指導(dǎo)在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的最小序列。這些最小序列是本發(fā)明DNA分子的順式作用元件的雜合啟動(dòng)子的成分。
已經(jīng)舉例說明并描述了本發(fā)明的原則，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該很明顯的是，可以在不離開這些原則的前提下對(duì)本發(fā)明的安排合細(xì)節(jié)進(jìn)行修飾。我們要求保護(hù)所有在所附權(quán)利要求精神和范圍內(nèi)的所有修飾。
在此引入在本說明中引用的所有出版物和公開的專利文獻(xiàn)作為參考，其范圍與特定和個(gè)別指出引入作為參考的每個(gè)個(gè)別出版物或?qū)＠暾埾嗤?br> 序列表<110>T.W.康納(Conner，Timothy W)I.察夫里爾(Tzafrir，Iris)<120>選擇性控制基因表達(dá)的植物調(diào)節(jié)序列<130>06009.0019.NPUS00(RENN019)<140>US/09/651,169<141>2000-08-30<160>51<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>1gtaatacgac tcactatagg gc 22<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>2actatagggc acgcgtggt 19<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>3agggcaagct tggtcgacgg cccgggctgg30<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>4cggcagggtt ttcccagtca cga 23<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>5agcggataac aatttcacac agga 24<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>6cagaaagcct ccattcctta tcaggca27<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>7cgagaggaag tgcctggcgt aatcaaa 27<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明引物<400>8gctcatcaga gttgccgtcg 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1.一種分離DNA分子，包含選自SEQ ID NOS36-51或具有至少20個(gè)核苷酸的其片段的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的分離DNA分子，進(jìn)一步包含與該DNA分子連接的第二種多核苷酸分子。
3.權(quán)利要求2的分離DNA分子，其中多核苷酸使得轉(zhuǎn)基因植物胚發(fā)生組織或植物愈傷組織或植物種子中第二種多核苷酸分子的表達(dá)增強(qiáng)。
4.權(quán)利要求2的分離DNA分子，其中多核苷酸分子為雜合啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求4的分離DNA分子，進(jìn)一步包含最小啟動(dòng)子序列。
6.一種分離DNA構(gòu)建體，包含選自SEQ ID NOS36-51或具有至少20個(gè)核苷酸的其片段的分離多核苷酸，其中該分離DNA分子，其中該分離DNA構(gòu)建體與第二種多核苷酸和3’非翻譯區(qū)可操作連接。
7.一種轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，包含權(quán)利要求6的分離DNA構(gòu)建體。
8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物，其中該植物為單子葉植物。
9.一種制造轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(i)將包含(a)包含選自SEQ IDNOS36-51或具有至少20個(gè)核苷酸的其片段的多核苷酸的啟動(dòng)子，其中啟動(dòng)子被可操作連接到(b)第二種多核苷酸以及(c)3’非翻譯區(qū)的DNA構(gòu)建體引入植物細(xì)胞；(ii)選擇該植物細(xì)胞；(iii)將該植物細(xì)胞再生成植物。
10.一種從植物中分離賦予可操作連接的多核苷酸在胚、胚發(fā)生或愈傷組織中增強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子的方法，包括(i)評(píng)估源于一個(gè)或更多從靶植物胚、胚發(fā)生或愈傷細(xì)胞類型制備的cDNA文庫的ESTs的集合；及(ii)比較來自于至少一個(gè)靶植物cDNA文庫的ESTs和一種或更多來自于非胚、非胚發(fā)生或愈傷植物細(xì)胞類型的非靶cDNA文庫的ESTs；及(iii)扣除在靶和非靶文庫中共同的ESTs；及(iv)在該扣除后從剩余ESTs設(shè)計(jì)基因特異性引物；及(v)使用該引物從靶植物制備的基因組文庫中分離對(duì)應(yīng)的5’側(cè)翼和調(diào)節(jié)區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)植物中基因表達(dá)的核酸序列。具體地說,本發(fā)明涉及對(duì)調(diào)節(jié)植物中異源DNA表達(dá)有用的5’調(diào)節(jié)序列和識(shí)別當(dāng)可操作連接到DNA序列時(shí)賦予特定表達(dá)圖譜的5’調(diào)節(jié)序列的方法。本發(fā)明也涉及含5’調(diào)節(jié)序列的表達(dá)載體和含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1387572SQ00815225
公開日2002年12月25日 申請日期2000年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月1日
發(fā)明者T·W·康納, I·察夫里爾 申請人:孟山都技術(shù)有限公司