專利名稱：：桑葉γ-氨基丁酸的提取方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及桑葉生物活性物質(zhì)Y_氨基丁酸的的提取方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：Y-氨基丁酸(GABA)是一種功能性的非蛋白質(zhì)氨基酸。自Stewatd等(1949)首次在土豆莖塊中發(fā)現(xiàn)之后，Roberts和Udenfriend在1950年也分別在哺乳動(dòng)物大腦中發(fā)現(xiàn)了GABA的存在，隨后的研究表明，GABA分布廣泛，在動(dòng)物、植物和微生物中均有存在，是哺乳動(dòng)物神經(jīng)中樞的一種抑制性遞質(zhì)，具有重要的生理功能，有調(diào)節(jié)血壓、促使精神安定、促進(jìn)腦部血流、增進(jìn)腦活力、營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、健肝利腎等多種功效。臨床醫(yī)學(xué)的研究認(rèn)為，GABA對(duì)改善動(dòng)物的生理代謝有著重要的活性功能，能有效改善腦血流通，增加氧的供給，促進(jìn)腦的代謝功能和提高生物機(jī)體的免疫能力，且具有抑制抗利尿荷爾蒙激素的分泌，擴(kuò)張血管，降低血壓，防止動(dòng)脈硬化的作用，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中具有營養(yǎng)作用，是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，應(yīng)用前景廣闊。隨著對(duì)GABA生理功能的深入了解，它被作為一種新型的功能性因子越來越引起醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)等行業(yè)的關(guān)注，成為開發(fā)研究的熱點(diǎn)。自古以來，作為藥食同源的桑葉，它除用作養(yǎng)蠶之外，早被人們用于治療疾病和作為保健品的藥膳用材料，如具有清熱解毒功能的夏桑菊中藥制劑，其主成分之一就是桑葉。桑樹在我國大部分地區(qū)可以種植，尤其是廣東廣西，全年生長時(shí)間長，有栽培容易成本低的資源優(yōu)勢，全國現(xiàn)有桑田約75萬公頃，高產(chǎn)的桑田每公頃產(chǎn)量約4550噸，故對(duì)桑葉GABA進(jìn)行研究并加以開發(fā)利用，這不僅挖掘、發(fā)展一種新的GABA生物新材料，而且對(duì)我國桑葉在非絹絲產(chǎn)業(yè)上的利用是一種創(chuàng)新，將有十分重要的科學(xué)價(jià)值和廣闊的市場前景。申請?zhí)枮?00410089069.2的中國專利公開了一種從桑葉中提取Y—氨基丁酸化合物的方法。以鮮桑葉為原料，通過烘前處理、真空烘燥、浸泡與濃縮、樹脂分離與富集四大工序，得到含有Y—氨基丁酸化合物的桑葉提取物。該技術(shù)需要對(duì)桑葉進(jìn)行費(fèi)時(shí)耗能的烘前處理步驟，提取過程也比較繁瑣，浸泡需要加熱，容易對(duì)Y—氨基丁酸造成破壞，能耗高、產(chǎn)率低，而且得到的Y—氨基丁酸是一種混和物，純度只能達(dá)到70%左右，不適合作為食品的添加劑或醫(yī)藥衛(wèi)生使用的藥物原料，不利于大規(guī)模應(yīng)用生產(chǎn)。如何改進(jìn)從桑葉中提取Y—氨基丁酸化合物的方法和提取條件，獲得更高純度的Y-氨基丁酸并研究其活性，對(duì)桑葉Y—氨基丁酸的開發(fā)應(yīng)用十分重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服桑葉Y—氨基丁酸提取工藝的不足，提供一種簡單、高效和得到高純度產(chǎn)品的桑葉Y—氨基丁酸的提取方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述Y—氨基丁酸的應(yīng)用。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)提供一種桑葉Y—氨基丁酸的提取方法，包括以下步驟(1)桑葉干燥后進(jìn)行粉碎；(2)取干桑葉粉加水浸泡，超聲波一微波協(xié)同萃取，收集萃取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮制得Y-氨基丁酸粗提液；(3)Y-氨基丁酸粗提液經(jīng)無水乙醇沉淀去除部分雜蛋白和多糖類物質(zhì)，再經(jīng)三級(jí)分離純化制得Y—氨基丁酸白色結(jié)晶體。步驟(l)所述桑葉干燥是采摘桑葉葉片，包括桑葉嫩葉或成熟葉，用清水沖洗干凈，晾干，置于烘箱中在8387'C烘2832min后降溫至6367。C烘44.5h，干燥后的樣品進(jìn)行粉碎，過40目篩，裝袋密封后低溫(50°C)保存?zhèn)溆?。步驟(2)所述加水浸泡是取干桑葉粉加水浸泡，按照桑葉粉重量克數(shù)(g):水體積毫升數(shù)(mL)為1:301:35的比例加水，浸泡1317min;所述萃取是將浸泡液置于微波144W、超聲波50W的條件下進(jìn)行常規(guī)超聲波一微波協(xié)同萃取，萃取時(shí)間為160170秒，萃取液通過離心去沉淀，收集上清液，按照常規(guī)方法旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。歩驟(3)包括以下步驟A用無水乙醇沉淀法去除部分雜蛋白和多糖類物質(zhì)；B用大孔樹脂S-8進(jìn)行一級(jí)分離純化；C用葡聚糖凝膠G-10進(jìn)行二級(jí)分離純化；D用732磺酸型陽離子樹脂進(jìn)行三級(jí)分離純化；E將經(jīng)過三級(jí)分離純化后的桑葉Y—氨基丁酸產(chǎn)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥進(jìn)行濃縮，獲得結(jié)晶。其中:步驟A:沉淀法去除部分雜蛋白和多糖類物質(zhì)取粗提液，按體積比1:2倍量加入無水乙醇，過夜，在3000r/min離心10min，棄沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；步驟B:大孔樹脂S-8分離及除色素樹脂濕法裝柱(2.5X70cm)，充分平衡后，取經(jīng)醇沉淀法分離的提取液，調(diào)pH值為5，上樣，流速控制2mL/min，進(jìn)行分離及除色素處理，收集含GABA的洗脫液，濃縮；步驟C:葡聚糖凝膠G-10分離純化將經(jīng)過去除色素處理后的濃縮液上柱，蒸餾水洗脫，流速3mL/min，自動(dòng)收集器收集洗脫液，Berthelot法檢測或用茚三酮試紙檢測，收集含GABA的洗脫液，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮；步驟D:陽離子樹脂分離純化用732磺酸型陽離子樹脂作進(jìn)一步的分離純化將經(jīng)過G-10分離的濃縮液調(diào)pH值為3，上柱，流速控制2mL/min，吸附完畢后用蒸餾水洗至pH值為6，然后用0.25mol/L氨水進(jìn)行洗脫，洗脫過程中不斷用茚三酮丙酮試紙檢測pH值變化，當(dāng)茚三酮反應(yīng)呈藍(lán)色，pH值為6時(shí)，收集流出液，直至茚三酮藍(lán)色反應(yīng)消失為止(也可用硅膠薄板層析進(jìn)行檢測)，合并流出液，進(jìn)行濃縮，-2(TC冷凍干燥。經(jīng)過上述分離純化后，獲得高純度的GABA晶體。樣品的測定將按照本發(fā)明方法制得的桑葉GABA晶體，送中國廣州分析測試中心進(jìn)行結(jié)構(gòu)和純度檢測。經(jīng)中國廣州分析測試中心檢定，制備得到的桑葉GABA晶體，結(jié)構(gòu)與Y—氨基丁酸相符，經(jīng)高效液相色譜法檢測其純度為90.3%。本發(fā)明同時(shí)提供了所述桑葉Y-氨基丁酸在制備促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育和/或增強(qiáng)抗疲勞能力藥物或食品方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明利用桑葉為原料，利用簡單易行的生物化學(xué)和生物分子篩的技術(shù)方法，從桑葉中分離制備出高純度的Y-氨基丁酸白色結(jié)晶體，并進(jìn)行了活性研究，分析了桑葉GABA的生物活性和作用功能，證明了桑葉含有豐富的GABA，具有容易提取，生產(chǎn)成本較低的資源優(yōu)勢，為進(jìn)一步開發(fā)桑葉在非絹絲產(chǎn)業(yè)上的新用途提供了相應(yīng)的新技術(shù)。并提出了將桑葉GABA應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品、畜牧業(yè)等領(lǐng)域的新思路，使之成為延伸與發(fā)展絲綢之路的新亮點(diǎn)。(2)本發(fā)明不僅從桑葉中提取得到了Y-氨基丁酸，而且成功制備出高純度的白色結(jié)晶的桑葉Y-氨基丁酸，通過動(dòng)物試驗(yàn)證明了具有促進(jìn)生長發(fā)育、增強(qiáng)抗疲勞的功能，且證實(shí)其無不良的副作用，是一種新型的、源自桑葉具有活性功能的天然新原料，在醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用前景。(3)本發(fā)明從桑葉中提取Y-氨基丁酸的方法簡單，工藝條件成熟，適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求，容易應(yīng)用推廣。圖1本發(fā)明y—氨基丁酸提取工藝流程圖具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明Y—氨基丁酸提取工藝流程圖見附圖1所示。本發(fā)明使用的實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備-無水甲醇，蒸餾水，無水乙醇，鹽酸，NaOH,氨水等均為國產(chǎn)分析純；S-8樹脂，南開大學(xué)化工廠；732樹脂，廣州名竣化工有限公司；葡聚糖凝膠G-IO，美國波仕特(amresco)公司；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀，上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；自動(dòng)收集器BS-100A上海精科實(shí)業(yè)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A上海亞榮生化儀器廠；HL-2恒流泵，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；UV-1700紫外分光光度計(jì)島津儀器(蘇州)有限公司；普通層析柱，2.5X70cm，上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠；高效液相色譜儀(1100):美國安捷倫公司。實(shí)施例1Y—氨基丁酸的提取制備1、具體操作步驟如下(1)桑葉干燥后進(jìn)行粉碎采摘桑品種抗青io號(hào)的成熟葉片，采后用清水沖洗去掉附著在桑葉表面的灰塵，晾干，置烘箱中用85。C烘30min，然后降溫至65。C烘4.2h。干燥后的樣品進(jìn)行粉碎，裝袋密封后低溫(50°C)保存?zhèn)溆谩?2)制備Y-氨基丁酸的粗提液按照按照桑葉粉重量(g):水體積(mL)為1:30的比例往干桑葉粉中加水，浸泡15min，然后在微波144W、超聲波50W的條件下進(jìn)行超聲波一微波協(xié)同萃取，時(shí)間160s，萃取液通過離心去沉淀，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。(3)Y-氨基丁酸的分離純化A:沉淀法去除部分雜蛋白和多糖類物質(zhì)按粗提液無水乙醇的體積比為1:2倍量加入無水乙醇，過夜，然后3000r/min離心10min，棄沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。B:大孔樹脂S-8分離及除色素樹脂濕法裝柱(2.5X70cm)，充分平衡后，取經(jīng)醇沉淀法分離的提取液，調(diào)pH為5,上樣，流速控制2mL/min,進(jìn)行分離及除色素處理，收集溶液，濃縮。'C:葡聚糖凝膠G-10分離純化將經(jīng)過去除色素處理后的濃縮液上柱，蒸餾水洗脫，流速3mL/min，自動(dòng)收集器收集洗脫液，Berthelot法檢測或用茚三酮試紙檢測，收集含GABA的濾液，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮。D:陽離子樹脂分離純化用732磺酸型陽離子樹脂作進(jìn)一步的分離純化。將經(jīng)過G-10分離的濃縮樣本液調(diào)pH為3，上柱，流速控制2mL/min，吸附完畢后用蒸餾水洗至pH6，然后用0.25mol/L氨水進(jìn)行洗脫，洗脫過程中不斷用茚三酮丙酮試紙檢測pH變化，當(dāng)茚三酮反應(yīng)呈藍(lán)色，pH為6時(shí)，收集流出液，直至茚三酮藍(lán)色反應(yīng)消失為止(也可用硅膠薄板層析進(jìn)行檢測)，合并流出液，進(jìn)行濃縮，冷凍干燥。經(jīng)過上述分離純化后，獲得高純度的GABA晶體。實(shí)施例2Y—氨基丁酸的提取制備(1)桑葉干燥后進(jìn)行粉碎；采摘桑品種抗青10號(hào)的成熟葉片，采后用清水沖洗去掉附著在桑葉表面的灰塵，晾干，置烘箱中用83。C烘32min，然后降溫至67。C烘4h。干燥后的樣品進(jìn)行粉碎，裝袋密封后低溫(50°C)保存?zhèn)溆谩?2)制備Y-氨基丁酸的粗提液按照按照桑葉粉重量(g):水體積(mL)為1:35的比例往干桑葉粉中加水，浸泡13min，然后在微波144W、超聲波50W的條件下進(jìn)行超聲波—微波協(xié)同萃取，時(shí)間170s，萃取液通過離心去沉淀，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。(3)Y-氨基丁酸的分離純化A:沉淀法去除部分雜蛋白和多糖類物質(zhì)按粗提液無水乙醇的體積比為1:2倍量加入無水乙醇，過夜，然后3000r/min離心10min，棄沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。B:大孔樹脂S-8分離及除色素樹脂濕法裝柱(2.5X70cm)，充分平衡后，取經(jīng)醇沉淀法分離的提取液，調(diào)pH為5，上樣，流速控制2mL/min，進(jìn)行分離及除色素處理，收集溶液，濃縮。C:葡聚糖凝膠G-10分離純化將經(jīng)過去除色素處理后的濃縮液上柱，蒸餾水洗脫，流速3mL/min，自動(dòng)收集器收集洗脫液，Berthelot法檢測或用茚三酮試紙檢測，收集含GABA的濾液，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮。D:陽離子樹脂分離純化用732磺酸型陽離子樹脂作進(jìn)一步的分離純化。將經(jīng)過G-10分離的濃縮樣本液調(diào)pH為3，上柱，流速控制2mL/min，吸附完畢后用蒸餾水洗至pH6，然后用0.25mol/L氨水進(jìn)行洗脫，洗脫過程中不斷用茚三酮丙酮試紙檢測pH變化，當(dāng)茚三酮反應(yīng)呈藍(lán)色，pH為6時(shí)，收集流出液，直至茚三酮藍(lán)色反應(yīng)消失為止(也可用硅膠薄板層析進(jìn)行檢測)，合并流出液，進(jìn)行濃縮，冷凍干燥。實(shí)施例3Y—氨基丁酸的提取制備(1)桑葉干燥后進(jìn)行粉碎；采摘桑品種抗青10號(hào)的成熟葉片，采后用清水沖洗去掉附著在桑葉表面的灰塵，晾干，置烘箱中用87"C烘28min，然后降溫至63'C烘4.5h。干燥后的樣品進(jìn)行粉碎，裝袋密封后低溫(5(TC)保存?zhèn)溆谩?2)制備Y-氨基丁酸的粗提液按照按照桑葉粉重量(g):水體積(mL)為1:32的比例往干桑葉粉中加水，浸泡17min，然后在微波144W、超聲波50W的條件下進(jìn)行超聲波一微波協(xié)同萃取，時(shí)間165s，萃取液通過離心去沉淀，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。(3)Y-氨基丁酸的分離純化A:沉淀法去除部分雜蛋白和多糖類物質(zhì)按粗提液無水乙醇的體積比為1:2倍量加入無水乙醇，過夜，然后3000r/min離心10min，棄沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。B:大孔樹脂S-8分離及除色素樹脂濕法裝柱(2.5X70cm)，充分平衡后，取經(jīng)醇沉淀法分離的提取液，調(diào)pH為5，上樣，流速控制2mL/min，進(jìn)行分離及除色素處理，收集溶液，濃縮。C:葡聚糖凝膠G-10分離純化將經(jīng)過去除色素處理后的濃縮液上柱，蒸餾水洗脫，流速3mL/min，自動(dòng)收集器收集洗脫液，Berthelot法檢測或用茚三酮試紙檢測，收集含GABA的濾液，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮。D:陽離子樹脂分離純化用732磺酸型陽離子樹脂作進(jìn)一歩的分離純化。將經(jīng)過G-10分離的濃縮樣本液調(diào)pH為3，上柱，流速控制2mL/min，吸附完畢后用蒸餾水洗至pH6，然后用0.25mol/L氨水進(jìn)行洗脫，洗脫過程不斷用茚三酮丙酮試紙檢測pH變化，當(dāng)茚三酮反應(yīng)呈藍(lán)色，pH為6時(shí)，收集流出液，直至茚三酮藍(lán)色反應(yīng)消失為止(也可用硅膠薄板層析進(jìn)行檢測)，合并流出液，進(jìn)行濃縮，冷凍干燥。實(shí)施例4Y-氨基丁酸的純度鑒定將實(shí)施例13制備的桑葉GABA晶體，送中國廣州分析測試中心進(jìn)行結(jié)構(gòu)和純度檢測。儀器AgilentLC1200，G1362ARID檢測器，色譜柱Hypersil0DS分析柱(2.1X200腿)，5-Micro(美國)。色譜條件色譜柱Hypersil0DS分析柱。流動(dòng)相A液取三水醋酸鈉1.20g、三乙胺100uL、醋酸1-2滴和四氫呋喃1.8mL，定容至500rnL;流動(dòng)相B液取三水醋酸鈉L35g、乙腈200mL和甲醇200mL，用無水醋酸調(diào)pH至7.30。流動(dòng)相均以0.45um濾膜過濾，超聲脫氣后使用。在020min內(nèi)，由100%A變化到100%B，繼續(xù)用B液洗脫5min。然后以B相洗脫5min，A相平衡5min。流速0.450mL/min。柱溫38°C，激發(fā)波長340nm、發(fā)射波長450nm。進(jìn)樣量20"L。標(biāo)準(zhǔn)曲線精量取配制好的1.0mg/mLY-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)液，酉己制成0.03125、0,0625、0.125、0.25、0.50、1.0mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)液，按照樣品衍生歩驟衍生并用HPLC測定，以峰面積A對(duì)濃度C(mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A=8083.6X-15.7，相關(guān)系數(shù)為r二O.9999(n二5)，最小檢測濃度為0.0mg/mL。精密度試驗(yàn)精確吸取樣品的超濾液3份，按上述衍生法處理測定，Y-氨基丁酸測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.1%?；厥章试囼?yàn)精確稱取Y-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，加入樣品中，按樣品制備方法處理后，進(jìn)行HPLC測定，其平均回收率為99.7°/o。經(jīng)中國廣州分析測試中心檢定，制備得到的桑葉GABA晶體，結(jié)構(gòu)與Y—氨基丁酸相符。檢測報(bào)告編號(hào)是BW20082458，出具的檢測結(jié)果是送檢樣品經(jīng)超導(dǎo)核磁共振儀測1H麗R，13C腹R，DEPT和紅外光譜，經(jīng)譜圖分析，其結(jié)構(gòu)與Y—氨基丁酸相符。經(jīng)高效液相色譜法檢測其純度為90.3%。實(shí)施例5本發(fā)明桑葉Y—氨基丁酸的生物活性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法將本發(fā)明制備得到的桑葉GABA用灌胃法處理NIH系雄性小鼠(NIH系雄性小鼠和喂養(yǎng)飼料購自南方醫(yī)科大學(xué))，自由攝食和飲水。用桑葉Y—氨基丁酸灌胃處理前，先進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，然后開始灌胃處理，受試小鼠設(shè)低劑量組、中劑量組、高劑量組和對(duì)照組，每組6只，設(shè)2個(gè)重復(fù)。每天的GABA灌胃量分別為0.15g/kg、0.3g/kg、0.9g/kg(GABA/小鼠體重，為人體推薦用量的5、10、30倍)，連續(xù)灌胃4周。每天記錄小鼠的生長發(fā)育狀況，稱量體重，檢測相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)行差異性的比較分析。l.對(duì)小鼠生長發(fā)育的影響用桑葉GABA采取灌胃法處理NIH系雄性小鼠4周后，稱量體重，比較各劑量對(duì)小鼠生長發(fā)育的影響，結(jié)果見表l。表1GABA對(duì)小鼠發(fā)育體重增長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>低劑量組30.23±2.7038.81±2.2628.4中劑量組30.22±1.8638.35±3.2026.9高劑量組_29.51±3.3937.36±1.80_26.6注體重增加率=初始體重/結(jié)束體重；表中小鼠體重為平均值，n=12實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從灌胃處理開始到結(jié)束經(jīng)過4周后，小鼠的體重增長率，對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的增重比率分別為26.1%、28.4%、26.9%、26.6%，低劑量試驗(yàn)組比對(duì)照組的體重增加率提高了2.3個(gè)百分點(diǎn)，說明本發(fā)明桑葉Y—氨基丁酸對(duì)小鼠生長發(fā)育有促進(jìn)作用。比較其差異水平，經(jīng)t檢驗(yàn)，各劑量組與空白對(duì)照組之間的體重差異不顯著(p〉0.05)。從不良影響的角度去分析，桑葉GABA對(duì)小鼠發(fā)育體重的增長無不良影響。2.增強(qiáng)抗疲勞能力的效果實(shí)驗(yàn)用桑葉GABA采取灌胃法處理NIH系雄性小鼠4周后，通過負(fù)重游泳，觀察小鼠在水中游泳時(shí)間的長短，以游泳時(shí)間的長短來衡量其抗疲勞的能力，結(jié)果見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注游泳經(jīng)過時(shí)間為小鼠從放下水至體力衰竭下沉?xí)r；*:表示差異顯著(p<0.05，n二6);**:表示差異極顯著(p〈0.01，n二6)從表2的結(jié)果可以明顯看到，經(jīng)用桑葉GABA灌胃法處理的NIH系雄性小鼠，負(fù)重游泳經(jīng)過的時(shí)間比對(duì)照組長，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別比對(duì)照組提高53.92%、169.35%和111,47%。經(jīng)t檢驗(yàn)低劑量組與對(duì)照組相比，差異顯著；中、高劑量組與對(duì)照組相比，差異極顯著。說明桑葉GABA具有增強(qiáng)抗疲勞的顯著效果。3.對(duì)發(fā)育生理影響的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)為評(píng)價(jià)桑葉GABA的生物安全性，解剖用桑葉GABA灌胃法處理4周后的NIH系雄性小鼠，選擇了重要的組織器官進(jìn)行生理生化的檢測分析。(1)小鼠臟體組織器官比值的變化比較處理組與對(duì)照組的臟體發(fā)育情況，調(diào)査結(jié)果如表3所示。表3處理組與對(duì)照組小鼠的臟體組織與體重的比值組別體重(g)肝臟/體重心臟/體重脾臟/體重腎臟/體重(g/100g)(g/100g)(g/100g)(g/100g)對(duì)照組138.5±4.69±0.120.50±0.030.48±0.071.59±0.170.85對(duì)照組238.6±4.71±0.090.46±0,020.52土0.101.53±0.172.12低劑量38.0±組4.57±0.260.48±0.040.49±0.071.54土0.072.02中劑量37.6±組4.84±0.200.48±0,040.37±0.081.62±0.102.48高劑量38.2±組5.56±0.37*0.45±0,070.42±0.121.62±0.131.70注對(duì)照組1為沒有經(jīng)過負(fù)重游泳處理；對(duì)照組2和各處理組均經(jīng)過負(fù)重游泳處理；*:表示差異顯著(p〈0.05，n=6)。在臟體組織器官/體重比方面，高劑量處理組的NIH系雄性小鼠的肝臟/體重比，比對(duì)照組重，差異達(dá)到顯著，表明高劑量的GABA喂養(yǎng)，會(huì)引起小鼠肝臟的增重增大。對(duì)心臟、脾臟和腎臟的影響，從臟體組織器官比值的變化來看，則差異不明顯，認(rèn)為無不良的影響。(2)小鼠血液中乳酸、尿素氮和肝糖原的變化為分析桑葉GABA對(duì)小鼠生理代謝的影響，檢測了處理組和對(duì)照小鼠血液中的乳酸、尿素氮和肝糖原的含量變化，結(jié)果如表4所示。表4處理組與對(duì)照組小鼠血乳酸、血尿素氮、肝糖原的含量血尿素氮肝糖原(mmol/L)(mmol/U組別對(duì)照組1對(duì)照組2低劑量組中劑量組高劑量組血乳酸(mmol/L)4.26±0.828.33±0.56**6.97±0.62*7.10±0.73*6.35±0.66*6.48±0.629.40±0.53**7.02±0.81**6.78±0.42**8.83土0.0410.23±0.324.89±0.15承沐6.20±0.39**6.65±0.49承承5.12±0.36注對(duì)照組1為沒有經(jīng)過負(fù)重游泳處理；對(duì)照組2和各處理組均經(jīng)過負(fù)重游泳處理。差異性比較時(shí)，對(duì)照組1與對(duì)照組2作比較；處理組則與對(duì)照組2作比較。*:表示差異顯著(p〈0.05，)；**:表示表示差異極顯著(P〈0.01)從表中結(jié)果可以看到，同是對(duì)照組的小鼠，游泳處理與不游泳處理，小鼠血液中的乳酸、尿素氮和肝糖原會(huì)發(fā)生很大的變化，小鼠經(jīng)過游泳處理后，血尿素氮、血乳酸水平升高，肝糖原含量顯著降低，說明游泳時(shí)，小鼠會(huì)改變體內(nèi)的生理生化代謝，從而獲取能量，支持其運(yùn)動(dòng)。比較處理組與對(duì)照組2的差異變化，小鼠的血乳酸含量，處理組的顯著低于游泳對(duì)照組。血尿素氮，低、中劑量處理組極顯著低于游泳對(duì)照組，高劑量處理組也低于游泳對(duì)照組。肝糖原含量是處理組高于游泳對(duì)照組，尤其是低、中劑量處理組極顯著高于游泳對(duì)照組。由此表明，小鼠經(jīng)過桑葉GABA喂養(yǎng)后，在發(fā)生劇烈運(yùn)動(dòng)(放在水中游泳至力衰竭下沉)時(shí)，其血乳酸、血尿素氮的升高比對(duì)照組低，而肝糖原的下降比對(duì)照組少，這表明桑葉GABA有增強(qiáng)小鼠抗疲勞的耐受能力的作用。權(quán)利要求1、一種桑葉γ-氨基丁酸的提取方法，其特征在于包括以下步驟(1)桑葉干燥后進(jìn)行粉碎；(2)取干桑葉粉加水浸泡，超聲波-微波協(xié)同萃取，收集萃取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮制得γ-氨基丁酸粗提液；(3)γ-氨基丁酸粗提液經(jīng)無水乙醇沉淀去除部分雜蛋白和多糖類物質(zhì)，再經(jīng)三級(jí)分離純化制得γ-氨基丁酸白色結(jié)晶體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉Y—氨基丁酸的提取方法，其特征在于步驟(1)所述桑葉干燥是采摘桑葉葉片，洗凈晾干后烘干粉碎；所述烘干是置于烘箱，在8387。C烘2832min后降溫至6367。C烘44.5h。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉Y—氨基丁酸的提取方法，其特征在于步驟(2)所述桑葉粉與水的料液比按照桑葉粉重量克數(shù)水體積毫升數(shù)為1:301:35;浸泡時(shí)間為1317min;所述微波為144W、超聲波為50W;萃取時(shí)間為160170秒。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述桑葉Y—氨基丁酸的提取方法，其特征在于歩驟(3)包括以下歩驟A用無水乙醇沉淀法去除部分雜蛋白和多糖類物質(zhì)；B用大孔樹脂S-8進(jìn)行一級(jí)分離純化；C用葡聚糖凝膠G-10進(jìn)行二級(jí)分離純化；D用732磺酸型陽離子樹脂進(jìn)行三級(jí)分離純化；E將經(jīng)過三級(jí)分離純化后的桑葉Y—氨基丁酸產(chǎn)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥，獲得結(jié)晶。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述桑葉Y—氨基丁酸的提取方法，其特征在于步驟A是取粗提液，按體積比1:2倍量加入無水乙醇，過夜，在3000r/min離心10min,棄沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述桑葉Y—氨基丁酸的提取方法，其特征在于步驟B是樹脂濕法裝柱，充分平衡后，取經(jīng)醇沉淀法分離的提取液，調(diào)pH值為5，上樣，流速控制2mL/min，收集洗脫液得濃縮液。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述桑葉Y—氨基丁酸的提取方法，其特征在于步驟C是將濃縮液上柱，蒸餾水洗脫，流速3mL/min，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得濃縮液。8、根據(jù)權(quán)利要求4所述桑葉Y—氨基丁酸的提取方法，其特征在于步驟D是將步驟C制備的濃縮液調(diào)pH值為3，上柱，流速控制2mL/min，吸附完畢后用蒸餾水洗至pH值為6，用0.25mol/L氨水進(jìn)行洗脫，洗脫過程中不斷用茚三酮丙酮試紙檢測pH變化，當(dāng)茚三酮反應(yīng)呈藍(lán)色，pH值為6時(shí)，收集流出液，直至茚三酮藍(lán)色反應(yīng)消失為止，合并流出液，進(jìn)行濃縮，冷凍干燥。9、一種權(quán)利要求l所述桑葉Y-氨基丁酸的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于制備促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育或/和增強(qiáng)抗疲勞能力方面藥物或食品。全文摘要本發(fā)明公開了一種桑葉γ-氨基丁酸的提取方法及其應(yīng)用。本發(fā)明利用桑葉為原料，經(jīng)過干燥桑葉、粉碎、水浸提和超聲波—微波協(xié)同萃取制得粗提液，粗提液去除部分雜蛋白和多糖類物質(zhì)后再經(jīng)三級(jí)分離純化制得高純度γ-氨基丁酸白色結(jié)晶體。本發(fā)明提供了所述桑葉γ-氨基丁酸有促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育、增強(qiáng)抗疲勞能力的活性功能。本發(fā)明方法簡單，工藝條件成熟，適合工業(yè)化生產(chǎn)，為進(jìn)一步開發(fā)桑葉在非絹絲產(chǎn)業(yè)上的新用途提供了技術(shù)基礎(chǔ)，提出將桑葉GABA應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品、畜牧業(yè)等領(lǐng)域，使之成為延伸與發(fā)展絲綢之路的新亮點(diǎn)。文檔編號(hào)C07C229/00GK101633623SQ20091004051公開日2010年1月27日申請日期2009年6月24日優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日發(fā)明者廖富蘋,林健榮,王葉元,藍(lán)年新,鐘楊生,陳恒文申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)