專利名稱：定量轉(zhuǎn)化生長因子－β1的方法以及通過使用該方法檢測癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種定量一種體液中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的濃度的方法，一種通過使用相同的方法檢測癌癥的方法，一種檢測癌癥的組合物，以及一種TGF-β1特異的單克隆抗體。
在哺乳動物中存在三種形式的TGF-β因子，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，并且，在這些當(dāng)中，據(jù)信TGF-β1在生理機制和疾病進展中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。已經(jīng)報道它在一種發(fā)病過程中作用反常，例如，癌癥發(fā)生。這暗示TGF-β1作為癌癥診斷中的一種腫瘤標(biāo)志是有用的，并且一種定量一種體液中的TGF-β1的高精度的方法在癌癥診斷中可能是決定性的。
歐洲專利公開第0 722 773 A1號(EP Publication No.0 722 773 A1)公開一種通過用一種吸附劑，OH-碳酸化的羥基磷灰石，接觸一種含有TGF-β1的血液樣品，從而吸附其中的TGF-β1，用一種緩沖液洗脫被吸附的TGF-β1，并用紫外分光光度法確定被洗脫的TGF-β1的量的檢測癌癥的方法。然而，這個方法忍受著有限的敏感性和為測量值的大波動所證明的不精確的問題。
因此，已經(jīng)存在一個開發(fā)一種改進的定量血漿中TGF-β1的量的方法的需要。
本發(fā)明的概述因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種定量一種樣品中TGF-β1的量的具有高精度和敏感性的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種通過使用所說的方法檢測癌癥的方法。
本發(fā)明的進一步的目的是提供一種檢測癌癥的組合物。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種TGF-β1特異的單克隆抗體和一種生產(chǎn)此單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種定量一種樣品中TGF-β1的量的方法，包括用一種TGF-β1特異的受體處理此樣品從而在TGF-β1與此受體之間形成一種復(fù)合物，并測量此復(fù)合物的量。
本發(fā)明的詳細(xì)描述在本發(fā)明中可以被使用的TGF-β1特異的受體包括TGF-β I型，II型，III型受體(R I，RII和RIII)，并優(yōu)選TGF-β1 III型受體，RIII。這些TGF-β1受體可以根據(jù)一種常規(guī)的方法(Burand，J.P.等.病毒學(xué)(Virology)101，286-290(1980))通過在一種哺乳動物或昆蟲細(xì)胞系中表達一種TGF-β1受體基因而獲得。例如，此TGF-β1受體可以如下獲得用一種含有一種TGF-β1受體基因的重組桿狀病毒感染一種昆蟲細(xì)胞系，例如，Sf21(Invitrogen，Netherlands)；提取在此昆蟲細(xì)胞中表達的不溶于水的受體蛋白；用鹽酸胍或尿素溶解此不溶于水的受體蛋白；通過去除胍或尿素重新折疊被溶解的受體蛋白，從而恢復(fù)對TGF-β1的親和力。
在本發(fā)明中可以使用的TGF-β1特異的抗體可以通過用TGF-β1或其中的一個部分免疫一種哺乳動物制備。此TGF-β1特異的抗體可以是僅對TGF-β1具有特異性的一種單克隆抗體或一種多克隆抗體。
一種定量一種體液，例如，血漿或尿中的TGF-β1的量的優(yōu)選方法，根據(jù)本發(fā)明包括(a)將一種TGF-β1特異的受體結(jié)合到一種固體支持物上；(b)將一種體液樣品加入此被支持的受體中從而形成一種TGF-β1-受體復(fù)合物；(c)將一種與一種標(biāo)記物結(jié)合的TGF-β1特異的抗體結(jié)合到此復(fù)合物上；和(d)使用此種作為一種檢測標(biāo)記的標(biāo)記物測量TGF-β1的量。
在本發(fā)明中可以被使用的代表性標(biāo)記物包括辣根過氧化物酶，生物素和熒光。
本發(fā)明的第一個優(yōu)選實施方案包括將TGF-β1受體結(jié)合到一種固體支持物上，例如，一塊微量滴定板的孔；將一種適當(dāng)稀釋的含有TGF-β1的樣品加入到此TGF-β1受體中，從而使得TGF-β1與此TGF-β1受體之間能夠形成一種復(fù)合物；用一種磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌此支持物；向其中加入一種生色的酶聯(lián)抗-TGF-β1抗體并形成生色的酶；以及測量所產(chǎn)生的溶液的光密度從而定量此樣品中TGF-β1的含量。
在本發(fā)明的第二個優(yōu)選實施方案中，一種含有一種TGF-β1特異的受體的液體可以被用于替換被支持的TGF-β1受體。在這個方法中，一種樣品中的TGF-β1的量可以如下定量將此樣品加入此含有TGF-β1特異的受體的液體中；加入一種TGF-β1特異的與其中一種標(biāo)記物結(jié)合的抗體；沉淀一種抗體-TGF-β1受體復(fù)合物；并且測量其光密度。
本發(fā)明的方法能夠檢測在30 pg/ml或更低的一個非常低濃度范圍的TGF-β1。
以上方法在癌癥診斷中特別有用，因為癌癥患者體液中的TGF-β1濃度顯然不同于健康人的那個。因此，癌癥可以通過重復(fù)以上方法從而定量患者體液樣品，例如血漿或尿中TGF-β1水平，并將此TGF-β1濃度與健康人的那個比較而被檢測。
本發(fā)明的檢測一種癌癥的方法的一個優(yōu)選實施方案包括(a)將一種TGF-β1特異的受體結(jié)合到一種固體支持物上；(b)將一種體液樣品加入此被支持的受體中從而形成此TGF-β1-受體復(fù)合物；(c)將一種TGF-β1特異的與一種標(biāo)記物結(jié)合的抗體結(jié)合到此復(fù)合物上；(d)使用此種作為一種診斷標(biāo)記物的標(biāo)記物測量TGF-β1的量；和(e)將此TGF-β1量與健康人的那個比較。
以上方法在檢測胃癌，肝癌，乳腺癌，肺癌，直腸結(jié)腸癌，前列腺癌和子宮頸癌中特別有效。
在此檢測一種癌癥的方法中可以被使用的一種組合物包括一種TGF-β1受體，優(yōu)選RIII，和一種TGF-β1特異的抗體。
為了改進敏感性，此單克隆抗體可以如下獲得根據(jù)一種常規(guī)的細(xì)胞融合方法，使用TGF-β1或其中的一種抗原決定簇部分作為一種免疫原，制備一種生產(chǎn)TGF-β1特異的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系；并從此雜交瘤細(xì)胞系分離此單克隆抗體。例如，這樣一種雜交瘤細(xì)胞系可以如下制備用人TGF-β1免疫一種小鼠；根據(jù)Kohler和Milstein(歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)，6，511-519(1976))所描述的細(xì)胞融合方法，將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；通過使用ELISA選擇一種僅對人TGF-β1具有特異性的雜交瘤細(xì)胞系；使用一種免疫擴散的方法，確定此雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體的亞類；并且，選擇一種分泌IgG1亞類的具有最高抗體滴度的雜交瘤細(xì)胞系。這樣獲得的此雜交瘤細(xì)胞系被定名為hTGF-46，并根據(jù)關(guān)于因?qū)＠绦蛑⑸锉２匚锏膰H識別的布達佩斯條約的條款(The Budapest Treaty on the International Recognition ofthe Deposit of Microorganism for the Purpose of Patent Procedure)在1998年4月20日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for TypeCulture)(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-600，Republic ofKorea)，其保藏號為KCTC 0460BP。
雜交瘤細(xì)胞系hTGF-46起源于β-淋巴瘤，并且在產(chǎn)生TGF-β1特異的IgG1亞類的抗體的同時連續(xù)地分裂。此雜交瘤細(xì)胞系可以在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL，USA)中在37℃在5％CO2的空氣中和100％濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞數(shù)在12到14小時內(nèi)倍增。此雜交瘤細(xì)胞系懸浮在此培養(yǎng)基中，自身不結(jié)合到培養(yǎng)瓶的底部，呈圓形，直徑為15到20μm。
為了用此雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)大量的TGF-β1特異的單克隆抗體，將此雜交瘤細(xì)胞系注射到一種小鼠中，并當(dāng)其腹腔膨脹時獲取含有高濃度的雜交瘤細(xì)胞的腹水從而分離來自其中的此單克隆抗體。
當(dāng)TGF-β1，-β2，和-β3進行電泳隨后進行Western印跡時，本發(fā)明的此單克隆抗體僅識別TGF-β1，但是不識別TGF-β2或-β3。這暗示此單克隆抗體對TGF-β1有獨特的特異性。本發(fā)明的此單克隆抗體還對人TGF-β1顯示高親和力，并且結(jié)合到對應(yīng)于TGF-β1的第5到80氨基酸殘基的表位區(qū)域。
計劃用以下的實施例進一步說明本發(fā)明，而不限制其范圍。
進一步地，以下給出的固體在液體中的混合物，液體在液體中混合物和固體在液體中的混合物的百分?jǐn)?shù)分別基于wt/wt，vol/vol和wt/vol，除非另外明確說明。實施例1TGF-β1對受體的敏感性(步驟1)TGF-β1 III型受體的制備使用引物RIII和RIII2(SEQ ID Nos1和2)，用含有一個人TGF-β1 III型受體的全長cDNA的質(zhì)粒pCEP4(Invitrogen，Netherlands)進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，從而獲得編碼包括400氨基酸殘基(1到400)的此受體的一個細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的一個DNA片段。這樣獲得的DNA片段被插入桿狀病毒載體pCRBac(Invitrogen，Netherlands)，從而獲得重組質(zhì)粒pCRBac-TGFR。用此重組質(zhì)粒pCRBac-TGFR轉(zhuǎn)化了E.coli細(xì)胞，并在一種選擇培養(yǎng)基，含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇了被轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞。
使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Burand，J.P.，病毒學(xué)(Virology)，101，286-290(1980))，將載體pCRBac-TGFR和Bac-N-Blue DNA(Invitrogen，Netherlands)共同導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞系Sf21(Invitrogen，Netherlands)中，并培養(yǎng)3天，從而獲得一種病毒產(chǎn)物。3天之后，用lacZ基因作為一種選擇性標(biāo)記，對這樣獲得的病毒進行了噬斑分析，從而選擇此重組病毒。使用正向引物(SEQ ID NO3)和反向引物(SEQ ID NO4)，對這樣獲得的重組病毒進行了PCR，從而確認(rèn)此TGF-β1受體基因的存在。野生桿狀病毒顯示了839 bp PCR產(chǎn)物，而此重組病毒給出了一個1.5 kbp PCR產(chǎn)物。
用此重組病毒感染昆蟲細(xì)胞系SF21，并在此后培養(yǎng)5天。離心此培養(yǎng)物，從而去除細(xì)胞碎片并收集含有病毒的上清。
用此上清接種昆蟲細(xì)胞系Sf21，并在此后在27℃在含有10％胎牛血清(FBS)，7.3％ TC yeastolate和73％乳清蛋白水解產(chǎn)物的Grace昆蟲培養(yǎng)基(Invitrogen，Netherlands)中培養(yǎng)72天。離心此培養(yǎng)物，從而收集細(xì)胞，并用PBS洗滌此細(xì)胞。向其中加入蛋白裂解溶液(50 mM Tris-HCl(pH 7.5)，50 mM NaCl，10 mMβ-巰基乙醇，1％Triton X-100和2 mMBMSF)，并在此后在100℃加熱所產(chǎn)生的溶液10分鐘，從而制備一種樣品。
用此樣品在12.5％ SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行了SDS-PAGE，并用考馬斯亮藍對所產(chǎn)生的凝膠染色。如下對此凝膠進行了Western印跡將在凝膠上被分離的蛋白電轉(zhuǎn)移到一張膜上，從R&D Systems Inc.，USA(美國研究與發(fā)展系統(tǒng)股份有限公司)獲得的TGF-β1受體的抗體結(jié)合此膜上的蛋白，并在此后使用結(jié)合了辣根過氧化物酶(HRP)的抗IgG第二抗體分析TGF-β1(Chemicon，USA)，從而確認(rèn)TGF-β1 III型受體的表達。
因為此TGF-β1受體不溶解于水，所以向此樣品中加入8M鹽酸胍，并攪拌所產(chǎn)生的溶液1小時。所產(chǎn)生的溶液在7,000rpm離心40分鐘，并在此后將上清調(diào)整到2mg/ml蛋白濃度。為了恢復(fù)此TGF-β1受體結(jié)合TGF-β1的活性，將所產(chǎn)生的溶液加入一種折疊緩沖液中(100mMTris，0.5M精氨酸，0.2M EDTA，pH8.0)，至蛋白濃度為150μg/ml，并在10℃保存40小時，所產(chǎn)生的溶液用20mM Tris溶液(pH8.0)，接連地按照每4小時兩次，過夜之后一次，并在此后每2小時兩次透析，從而有效地重新折疊此TGF-β1受體。(步驟2)TGF-β1III型受體對TGF-β1的敏感性將在步驟1中獲得的每一份2μg的TGF-β1III型受體放置于一塊微量滴定板的孔中，并將所產(chǎn)生板子在環(huán)境溫度保存24小時，從而將此受體結(jié)合在此板上。將2ng的純化的TGF-β1(R&D systems Inc.，USA)溶解在PBS中，并連續(xù)稀釋。將每一個稀釋溶液按100μl的量加入孔中，并在此后在環(huán)境溫度保存3小時，從而使此TGF-β1能夠結(jié)合此受體。用含有0.05％Tween 20(PBST)的PBS洗滌各孔，并在此后向其中加入結(jié)合HRP的抗-TGF-β1抗體(R&D systems Inc.，USA)。將產(chǎn)生的板子在室溫保存1.5小時。用PBST洗滌每一個孔。向其中加入100μl的TMB-ELISA(Gibco-BRL，USA)，一種HRP底物，并將所產(chǎn)生的板子在室溫放置20分鐘從而顯色。通過加入25μl 2N硫酸終止了此顯色反應(yīng)。在450nm的測量波長和570nm的校正波長測定了此反應(yīng)混合物的光密度，并將結(jié)果繪制成圖，從而獲得一條標(biāo)準(zhǔn)的光密度-濃度相關(guān)曲線。


圖1說明這樣獲得的相關(guān)曲線是一條相關(guān)系數(shù)為0.999，斜率為0.28的直線。此斜率代表在這些測量中所使用的受體的敏感性，并且此TGF-β1III型受體被認(rèn)為對TGF-β1結(jié)合具有良好的敏感性。在圖1中的相關(guān)曲線還說明本方法可以檢測極低濃度的TGF-β1，低至10pg/ml。
使用TGF-β1II型受體(R&D systems Inc.，USA)重復(fù)了以上過程，從而確定TGF-β1II型受體的敏感性。這些結(jié)果也被繪制在圖1中，說明使用TGF-β1II型受體獲得的相關(guān)曲線也是一條相關(guān)系數(shù)為0.999，斜率為0.57的直線。因此，II型受體也可以被用于定量TGF-β1的濃度，但是其敏感性顯著地比III型受體的那個低。實施例2TGF-β1III型受體對TGF-β1的特異性除了使用含有2,000pg/ml TGF-β1，2,000pg/ml TGF-β2和2,000pg/ml TGF-β3(R&D Systems Inc.，USA)的混合物替換了TGF-β1之外，重復(fù)了實施例1的步驟2的過程。使用2,000pg/ml TGF-β1作為一個對照，重復(fù)了實施例1的步驟2的過程。結(jié)果被顯示在表I中。
表I
正如從表I可以見到的一樣，TGF-β1III型受體僅與TGF-β1結(jié)合，不與TGF-β2或TGF-β3發(fā)生交叉反應(yīng)。實施例3使用單克隆抗體測量癌癥患者的血漿TGF-β1濃度從101個健康人，111胃癌患者，100個肝癌患者和151個乳腺癌患者獲得血液樣品。用含有0.081ml作為一種抗凝劑的15％乙二胺四乙酸(EDTA)的真空容器收集血液樣品，并在此后將所獲得的混合物在3,000rpm離心20分鐘，從而獲得一種血漿樣品。將0.1ml的此血漿樣品加到0.1ml的2.5N乙酸/10M尿素溶液中。將所產(chǎn)生的混合物在室溫保存10分鐘，并用0.1ml的含有1M乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的2.7N NaOH中和。用PBST4倍稀釋這樣獲得的被活化的血漿，從而獲得一種進行以下測量其TGF-β1濃度之過程的血漿樣品。
0.1ml的這樣獲得的血漿樣品溶液，以及0.1ml一份的TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)溶液(0，100，1,000和2,000pg/ml)被分別地加入到一塊含有TGF-β1III型受體的96-孔板的孔中，在室溫保存3小時，并在此后，用PBST洗滌了3次。將純化的TGF-β1單克隆抗體-HRP復(fù)合物(Sigma)加入每一個孔，并在此后將此板在室溫保存1.5小時，此后用PBST洗滌這些孔3次。將100μl的TMB-ELISA(Gibco-BRL，USA)，一種HRP底物，加入每一個孔，并將此板在室溫保存20分鐘從而顯色。通過加入25μl的2N硫酸終止了此顯色反應(yīng)。在450nm的測量波長和570nm的校正波長測定了此反應(yīng)混合物的光密度?；谑褂脴?biāo)準(zhǔn)溶液獲得的校正曲線，確定了此血漿樣品的TGF-β1濃度，并將結(jié)果顯示于表II和圖2.
表II
正如在描述各患者組的血漿TGF-β1濃度分布模式的圖2中可以看見的一樣，癌癥患者的血漿樣品呈現(xiàn)與健康人組的那個顯然不同的TGF-β1濃度模式。這暗示上述癌癥可以根據(jù)以上過程通過測量血漿TGF-β1濃度被檢測。實施例4使用單克隆測量癌癥患者的血漿TGF-β1濃度使用從288個健康人，29個肺癌患者，48個直腸-結(jié)腸癌患者，50個前列腺癌患者和88個子宮頸癌患者所獲得的血液樣品，重復(fù)了實施例3的過程，從而測量各血漿TGF-β1濃度，并將結(jié)果顯示在表III和圖3中。
表III
P＜0.01正如在說明各患者組的血漿TGF-β1濃度分布模式的圖3中可以看見的一樣，癌癥患者的血漿樣品呈現(xiàn)與健康人組的那個顯然不同的TGF-β1濃度模式。這暗示上述癌癥可以根據(jù)以上過程通過測量血漿TGF-β1濃度而被檢測。實施例5使用多克隆抗體測量癌癥患者的血漿TGF-β1濃度除了使用了一種多克隆抗體代替此單克隆抗體以外，使用從50個健康人，50個肝癌患者，和50個乳腺癌患者所獲得的血液樣品，重復(fù)了實施例3的過程，從而測量各血漿TGF-β1濃度，并將結(jié)果顯示于表IV。
表IV
P＜0.05
正如在表IV中可以看見的一樣，癌癥患者的血漿樣品呈現(xiàn)與健康人組的那個顯然不同的TGF-β1濃度模式。這暗示上述癌癥可以根據(jù)以上過程通過測量血漿TGF-β1濃度而被檢測。實施例6生產(chǎn)一種TGF-β1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的制備(步驟1)免疫小鼠將TGF-β1與等體積的弗氏完全佐劑混合，直至此混合物變成液體，并且所產(chǎn)生的混合物按100μl/小鼠的量，注射到一只7周齡的Balb/c小鼠的尾靜脈。2周之后，將與弗氏不完全佐劑混合的與第一次注射中相同量的TGF-β1，注射到此小鼠的尾靜脈。在4到5天之后，從尾獲得小量血液，并通過ELISA確認(rèn)了TGF-β1抗體的存在。此后，在下面的細(xì)胞融合過程之前3到4天，用溶解在0.85％PBS中的30μg的人TGF-β1靜脈注射。(步驟2)細(xì)胞融合在此細(xì)胞融合過程中使用骨髓瘤細(xì)胞SP2/0·Ag14(ATCC CRL 1581)作為一種母細(xì)胞。此母細(xì)胞在含有10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時維持5×105/ml的最大細(xì)胞密度。
使用乙醚麻醉在步驟1中所獲得的被免疫的小鼠，并摘除其脾臟，從而用組織勻漿器勻漿。將所產(chǎn)生的勻漿懸浮在HBSS(Gibco-BRL，USA)中，并將所產(chǎn)生的懸浮液放置于一支15ml離心管中離心。重復(fù)此過程兩次，從而徹底地洗滌脾細(xì)胞。將此母細(xì)胞，SP2/0·Ag14細(xì)胞，懸浮在HBSS中并離心之。重復(fù)此過程兩次。脾細(xì)胞和SP2/0·Ag14分別被懸浮在10ml的HBSS中從而計數(shù)每一種懸浮液中的細(xì)胞數(shù)量。將從各懸浮液獲得的108個脾細(xì)胞和107個SP2/0·Ag14細(xì)胞在一支離心管中混合，此后離心，從而使細(xì)胞沉淀。用手指輕輕敲打此離心管從而分散被沉淀的細(xì)胞，并在此后，在37℃保存1分鐘。歷時1分鐘向其中加入1ml的含有45％PEG(w/v)和5％DMSO的HBSS，此后搖動此管1分鐘。歷時3分鐘向其中加入9ml的RPMI培養(yǎng)基，并在此后向其中加入RPMI培養(yǎng)基直至細(xì)胞懸浮液的總體積變成50ml，同時搖動此管。將所產(chǎn)生的懸浮液離心，并將這樣獲得的細(xì)胞沉淀按1-2×105/ml的濃度重新懸浮在HAT培養(yǎng)基(Gibco-BRL，USA)中。將0.2ml一份的所產(chǎn)生的懸浮液置于一塊96-孔微量滴定板的孔中，并在此后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)了數(shù)天，條件維持在37℃，5％CO2和100％濕度。(步驟3)生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的選擇如同下面所描述的一樣，使用人TGF-β1抗原對在步驟2中獲得的雜交瘤細(xì)胞系進行了ELISA，從而獲得特異性地與TGF-β1反應(yīng)的細(xì)胞。
將人TGF-β1抗原按50μl(2μg/ml)/孔的量加入一塊微量滴定板的孔中，并在室溫保存12小時，從而將抗原結(jié)合到孔的表面上。用PBST洗滌了這些孔，從而去除沒有結(jié)合的抗原。
將在步驟2中獲得的此雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物按50μl/細(xì)胞的量加入每一個孔中，并在37℃保存1小時。用PBST洗滌這些孔，從而去除此培養(yǎng)物。向其中加入羊抗鼠IgG-HRP(Sigma，USA)，在室溫保存1小時，并用PBST洗滌。向其中加入100μl的底物溶液(OPD，Sigma)，在室溫保存20分鐘，并在492nm測量了所產(chǎn)生的反應(yīng)混合液的光密度。
最先選擇了分泌針對人TGF-β1抗原的具有高特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞系，并使用人TGF-β1，-β2和-β3對這些雜交瘤細(xì)胞系中的每一種都進行了ELISA，從而篩選僅對人TGF-β1抗原具有特異性的雜交瘤細(xì)胞。對這樣獲得的雜交瘤細(xì)胞中的每一種進行了有限稀釋，從而獲得7個產(chǎn)生一種單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系克隆，hTGF-7，-8，-31，-46，-70，-119和-207。每一個克隆都被冷凍干燥。
離心雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，并將上清進行ELISA，從而確定此抗體滴度，并在此后用免疫分型試劑盒(immunotype kit)(Sigma，USA)分析，從而確定此抗體的亞類。將結(jié)果顯示于表V。
表V
正如表V中可以看見的一樣，全部7個克隆都是IgG1。
在這7個克隆當(dāng)中，選擇了具有最高滴度的克隆，hTGF-46，并腹膜內(nèi)注射給一只小鼠。此后，收集其腹水，并進行了Western印跡。結(jié)果說明此雜交瘤細(xì)胞系克隆hTGF-46分泌一種對人TGF-β1具有高特異性的單克隆抗體。根據(jù)關(guān)于因?qū)＠绦蛑⑸锉２匚锏膰H識別的布達佩斯條約的條款，在1998年4月20日將此雜交瘤細(xì)胞系hTGF-46保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon305-600，Republic of Korea)，其保藏號為KCTC 0460BP。實施例7TGF-β1的單克隆抗體的生產(chǎn)為了使用在實施例6中獲得的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)TGF-β1的單克隆抗體，給Balb/c小鼠腹膜內(nèi)注射了0.5ml的降植烷，并在1周之后，給每一只小鼠注射了5×106個雜交瘤細(xì)胞。從具有膨脹的腹腔的小鼠獲取含有高濃度的雜交瘤細(xì)胞的腹水，并在10,000rpm離心，從而去除此雜交瘤細(xì)胞。上清被保存在-20℃。
柱子用蛋白G珠子填充，并在此后用1×PBS洗滌了4次。將2ml的上清按5滴/分鐘的速率一滴一滴地上樣到此柱子上，并將0.1M甘氨酸-鹽酸溶液按1滴/10分鐘的速率引進此柱子從而洗脫IgG。
HRP在含有1.25％戊二醛0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.5)中被活化，并將被活化的HRP對碳酸鹽緩沖液(pH9.2)透析。將被透析的HRP與此IgG反應(yīng)，從而獲得一種結(jié)合了HRP的IgG。在此反應(yīng)完成之后，通過在280nm和403nm測量此反應(yīng)混合液的光密度確定了RZ值(A403/A280)。為了確定酶聯(lián)抗體的活性，用1μg的TGF-β1包被了一塊微量滴定板的每一個孔，并在此后與此結(jié)合了HRP的IgG反應(yīng)，從而確定活性。進一步地，對此結(jié)合了HRP的抗體進行了Western印跡，從而確定其活性。
在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上對人TGF-β1，-β2和-β3蛋白進行了SDS-PAGE，并在此后將其電轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維素濾膜上。將此膜與此單克隆抗體反應(yīng)數(shù)小時。所產(chǎn)生的膜在室溫用牛血清白蛋白處理12到14小時，從而封閉這些蛋白的非特異反應(yīng)。用含有0.5％Tween 20的PBS洗滌此膜3次，并在此后與結(jié)合了HRP的抗小鼠IgG(Sigma，USA)在室溫反應(yīng)。用含有0.5％Tween 20的PBS洗滌此膜3次，此后，向此膜加入一種底物緩沖液(TMB，Gibco-BRL，USA)從而顯色。
結(jié)果說明了本發(fā)明的此單克隆抗體僅與人TGF-β1反應(yīng)，并且不與人TGF-β2和-β3反應(yīng)。因此，本單克隆僅對人的TGF-β1具有特異性。
盡管關(guān)于以上特定實施例，本發(fā)明已經(jīng)被描述了，應(yīng)該承認(rèn)本領(lǐng)域中的熟練人員可以對本發(fā)明進行各種修飾和改變并仍然在被附加的權(quán)利要求書所規(guī)定的范圍中。
微生物國際保藏證明(譯文)
序列表<110>韓美藥品工業(yè)株式會社<120>定量轉(zhuǎn)化生長因子-β1的方法以及通過使用該方法檢測癌癥的方法<130>PCA00418/HMY<150>KR 1999-12568<151>1999-04-09<150>KR 1999-43935<151>1999-10-12<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer RIII1<400>1atggcagtga catcccac18<210>2<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>Primer RIII2<400>2atttgggctt cc 12<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物<400>3tttactgttt tcgtaacagt tttg24<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物<400>4caacaacgca cagaatctag c 2權(quán)利要求
1.一種定量樣品中TGF-β1的量的方法，包括用一種TGF-β1特異的受體處理樣品從而在TGF-β1與此受體之間形成一種復(fù)合物，并測定此復(fù)合物的量。
2.權(quán)利要求1的方法，包括(a)將TGF-β1特異的受體結(jié)合到一種固體支持物上；(b)將此樣品加入此被支持的受體從而形成TGF-β1-受體復(fù)合物；(c)將一種結(jié)合了一種標(biāo)記物的TGF-β1特異的抗體結(jié)合到此復(fù)合物上；和(d)使用該標(biāo)記物作為檢測標(biāo)記測定TGF-β1的量。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中TGF-β1特異的受體是TGF-β1 III型受體。
4.權(quán)利要求2的方法，其中TGF-β1特異的抗體是一種通過用TGF-β1或其中的一個部分免疫一種哺乳動物所制備的抗體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中此抗體是一種單克隆抗體或多克隆抗體抗體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中此單克隆抗體是用一種雜交瘤細(xì)胞系hTGF-46(KCTC 0460BP)生產(chǎn)的。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中在此樣品中TGF-β1的濃度是30pg/ml或更低。
8.權(quán)利要求2的方法，其中此標(biāo)記物是辣根過氧化物酶，生物素或熒光。
9.一種在患者中檢測癌癥的方法，包括用TGF-β1特異的受體處理取自患者的體液樣品從而在此受體與存在于此樣品中的TGF-β1之間形成復(fù)合物；測量此復(fù)合物的量從而定量此樣品中的TGF-β1的濃度；并且將此TGF-β1濃度與健康人的進行比較。
10.權(quán)利要求9的方法，包括(a)將TGF-β1特異的受體結(jié)合到一種固體支持物上；(b)將此樣品加入此被支持的受體從而形成TGF-β1-受體復(fù)合物；(c)將一種結(jié)合了一種標(biāo)記物的TGF-β1特異的抗體結(jié)合到此復(fù)合物上；(d)使用該標(biāo)記物作為檢測標(biāo)記測定TGF-β1的量，從而確定此樣品中TGF-β1的濃度；和(e)將此TGF-β1濃度與健康人的比較。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中此TGF-β1特異的受體是TGF-β1 III型受體。
12.權(quán)利要求10的方法，其中此TGF-β1特異的抗體是一種通過用TGF-β1或其中的一個部分免疫一種哺乳動物所制備的抗體。
13.權(quán)利要求13的方法，其中此抗體是一種單克隆抗體或一種多克隆抗體。
14.權(quán)利要求13的方法，其中此單克隆抗體是用一種雜交瘤細(xì)胞系hTGF-46(KCTC 0460BP)生產(chǎn)的。
15.權(quán)利要求9或10的方法，其中此樣品中的TGF-β1的濃度是30pg/ml或更低。
16.權(quán)利要求10的方法，其中此標(biāo)記物是辣根過氧化物酶，生物素或熒光。
17.權(quán)利要求9或10的方法，其中此癌選自胃癌，肝癌，乳腺癌，肺癌，直腸結(jié)腸癌，前列腺癌和子宮頸癌。
18.權(quán)利要求9或10的方法，其中此體液是血漿或尿。
19.一種檢測癌的組合物，包括一種TGF-β1特異的受體和一種TGF-β1特異的抗體的。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中此TGF-β1特異的受體是TGF-β1III型受體。
21.一種雜交瘤細(xì)胞系，它是產(chǎn)生人TGF-β1特異的單克隆抗體的hTGF-46(KCTC 0460)。
22.一種由雜交瘤細(xì)胞系hTGF-46(KCTC 0460BP)產(chǎn)生的TGF-β1特異的單克隆抗體。
全文摘要
通過用一種TGF－β1特異的受體處理樣品從而在TGF－β1與此受體之間形成復(fù)合物并測量此復(fù)合物的量而定量一種樣品中的TGF－β1的量。
文檔編號C07K16/22GK1355882SQ00806081
公開日2002年6月26日 申請日期2000年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月9日
發(fā)明者陳承嫄, 申勛, 林昌基 申請人:韓美藥品工業(yè)株式會社