專利名稱：體內(nèi)染色化合物及其用于鑒別發(fā)育不良組織的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的可以在人體內(nèi)局部應(yīng)用的生物染色化合物。
另一方面，本發(fā)明涉及用這類新化合物在體內(nèi)鑒別可疑的發(fā)育不良組織，即異常組織的方法。
另一方面和更進一步的方面，本發(fā)明涉及新化合物及其用于體內(nèi)診斷的方法，該方法特別適于檢測可疑的發(fā)育不良的口腔組織，尤其是癌癥和癌癥前期的組織。
通過下文對本發(fā)明的詳細描述和附圖，各種實施方案及操作對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
已知一種識別和指示可疑的發(fā)育不良組織的體內(nèi)診斷檢測法。該篩選檢測法用選擇性染色癌癥和癌癥前期組織的甲苯胺藍0(托洛氯銨)作體內(nèi)染色劑，該法在Mashberg的美國專利4,321,251和Tucci等人的美國專利5,372,801中有大致描述。用Mashberg的方法，一旦鑒別出可疑的發(fā)育異常的病變，即可以取常規(guī)的活體樣品進行組織學(xué)檢驗，以確定病變是否為惡性或者癌癥前期的。進行這種檢測的試劑盒含有預(yù)先混合的染料和數(shù)量及濃度適宜的清洗液。試劑盒由日拉公司(Zila，Inc.)取得許可，在若干個國家均可通過商業(yè)途徑獲得，商標是ORASCREEN和ORATEST。
發(fā)明簡述本人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可作為體內(nèi)生物染色劑、用于選擇性染色和指示發(fā)育不良組織的新化合物。這些化合物具有如下結(jié)構(gòu)式 其中X是氫，甲基或Y；Y是-NH-R或氫；R是甲基或 示例性地，這些化合物包括(I) (II) (III) (IV) (V) 和(VI) 制備方法的簡要說明本發(fā)明化合物的合成過程類似于(除以下注明之外)美國專利418,055中描述的制備甲苯胺藍0(“TB0”)的過程，該專利于1889年11月30日被授予Dandliker等人。Dandliker合成是三步氧化的一系列反應(yīng)(1)氧化N，N-二甲基-對-亞苯基二胺，如用重鉻酸鉀氧化，以形成2-氨基-5-二甲氨基苯硫代硫酸；(2)用鄰-甲苯胺與硫代硫酸縮合，以形成相應(yīng)的吲噠胺-硫代硫酸；(3)吲噠胺-硫代硫酸的閉環(huán)反應(yīng)，如在絡(luò)合劑的存在下，在沸騰溫度加熱30分鐘，以生成甲苯胺藍0。然后冷卻反應(yīng)混合物，鹽析出閉環(huán)的反應(yīng)絡(luò)合物。可以通過重復(fù)進行再溶解和再沉淀完成絡(luò)合物的純化。
本發(fā)明化合物的制備方法不同于Dandliker合成，體現(xiàn)在絡(luò)合劑在第三步氧化之前加入，優(yōu)選地在第一步氧化期間加入，以及用高壓液相色譜(HPLC)將本發(fā)明的新產(chǎn)物從沉淀復(fù)合體中分離出來。產(chǎn)物用于檢測上皮癌的簡要說明除了用新化合物中的每一種代替甲苯胺藍0之外，按照Mashberg的方法使用本發(fā)明的新化合物，以選擇性染色發(fā)育不良的上皮組織。因此，本發(fā)明也預(yù)期到一種在人體內(nèi)檢測發(fā)育不良之組織的方法，其包括將含有上述新產(chǎn)物之一或其混合的組合物用于人上皮組織的步驟。制備本發(fā)明產(chǎn)物的生產(chǎn)過程的詳細描述

圖1是描述本發(fā)明新化合物制備方法的流程圖用于合成的起始原料10是市售高純度的N，N-二甲基-對-亞苯基二胺。一次反應(yīng)混合物的形成在酸、硫酸鋁和試劑13如氯化鋅(確信試劑13能夠絡(luò)合中間體，并在后面的制備階段中用于絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)物組分)的存在下，優(yōu)選在低于10℃，特別優(yōu)選在低于5℃的溫度下，起始原料10的水溶液通過與適宜的氧化劑12，如重鉻酸鉀12反應(yīng)，被氧化成11。然后加入硫代硫酸離子源14，如硫代硫酸鈉，以形成含一次反應(yīng)混合物15，其含有第一個中間體2-氨基-5-二甲氨基苯基硫代硫酸。二次反應(yīng)混合物的形成優(yōu)選在不高于10℃的溫度下，首次反應(yīng)混合物15進一步與加入的氧化劑16如重鉻酸鉀，以及與鄰甲苯胺17反應(yīng)，在縮合反應(yīng)步驟18中形成第二個中間體，二次反應(yīng)混合物19中的縮合產(chǎn)物吲達胺硫代硫酸。三次反應(yīng)混合物的形成優(yōu)選地通過加入合適的氧化劑22如重鉻酸鉀，在不高于10℃的溫度下，二次反應(yīng)混合物19被進一步氧化成21。隨后加入硫酸銅、氯化鋅絡(luò)合劑、酸，并加熱至100℃以使吲達胺環(huán)有效封閉，形成三次反應(yīng)混合物24中的反應(yīng)終產(chǎn)物。此時從三次反應(yīng)混合物中分離并純化反應(yīng)產(chǎn)物。三次反應(yīng)產(chǎn)物的分離及純化例如，在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，通過用合適的絡(luò)合劑25如氯化鋅，與24絡(luò)合，從三次反應(yīng)混合物中沉淀出反應(yīng)產(chǎn)物，形成復(fù)合的氯化鋅雙鹽。從液相中過濾出沉淀物26，用氯化鈉溶液27洗滌。將清洗過的濾餅重新溶于嚴格定量的水29中(如用水過多，則影響反應(yīng)產(chǎn)物分離；如用水過少，則①反應(yīng)產(chǎn)物不能全部溶解，減少了產(chǎn)量，②降低了產(chǎn)物純度)，形成反應(yīng)產(chǎn)物的溶液30。再次過濾31以去除不溶的固體32a，棄不溶固體。在濾液32中加入氯化鋅，然后加入體積/濃度嚴格控制的氯化鈉溶液33(如用氯化鈉過少，不能鹽析出全部反應(yīng)產(chǎn)物，降低了產(chǎn)量；如用氯化鈉過多，雜質(zhì)會反應(yīng)產(chǎn)物一并析出，降低產(chǎn)物的純度)，再次沉淀出氯化鋅雙鹽。
通過過濾從混合物中分離出雙鹽產(chǎn)物，產(chǎn)生濾餅34，如虛線35所示?？梢远啻卧偃芙狻⑦^濾、再沉淀和再分離濾餅。以獲得理想純度和產(chǎn)量的雙鹽絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)物。然后將最終純化的濾餅絡(luò)合產(chǎn)物34溶于水，用HPLC分離出本發(fā)明的新化合物，敘述如下。
實施例提供下列實施例以說明本發(fā)明，實施例能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員制備本發(fā)明的新化合物，并用這些新化合物進行新的診斷實踐，這些內(nèi)容共同構(gòu)成本發(fā)明的各種實施例。實施例還向本領(lǐng)域技術(shù)人員揭示了目前已知的實現(xiàn)本發(fā)明的各種實施例的最好方式。實施例僅是說明性的，并不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為限。
實施例1制備方法本實施例描述了制備一批染色絡(luò)合物的確切過程以及用HPLC從絡(luò)合產(chǎn)物中分離本發(fā)明新化合物的方法。原料溶液的制備設(shè)備/供給A.Ohaus IP15KS 天平B.AnD HV150KAI 天平C.Fairbanks H90-5150 天平D.OHAUS WB25/1-20W 天平E.Cole Parmer(51201-30)和Thermolyne(S25535)加熱攪拌器F.取樣器材，如鋼匙、鼓式采樣器(drum samples)等G.Erlyenmeyer燒瓶、燒杯、玻璃瓶及其它適用的玻璃器皿H.產(chǎn)品溶液標簽安全性根據(jù)MSDS指南，操作化學(xué)物品時，應(yīng)著防護裝備，如手套、防護鏡、實驗服和防護面具。原料溶液的制備過程鹽酸溶液1364.2g(±5.5g)鹽酸加1364.2g(±5.5g)USP純水，攪拌至溶液澄清。
十六水硫酸鋁溶液1779.1g(±7.0g)十六水硫酸鋁加2548.9g(±10.0g)USP純水，攪拌至溶液澄清。
氯化鋅溶液7384.6g(±30.0g)氯化鋅加2786.7g(±11.0g)USP純水，攪拌至溶液澄清。
重鉻酸鉀溶液2101.9g(±8.0g)重鉻酸鉀加25203.8g(±100g)USP純水，攪拌至溶液澄清。
五水硫代硫酸鈉溶液1526.6g(±6.0g)五水硫代硫酸鈉加2043.6g(±8.0g)USP純水，攪拌至溶液澄清。
五水硫酸銅溶液509.7g(±2.0g)五水硫酸銅加1613.1g(±6.0g)USP純水，攪拌至溶液澄清。
硫酸溶液600.0g(±2.0g)硫酸加600.0g(±2.0g)USP純水，攪拌至溶液澄清。
氯化鈉溶液70.4kg(±250g)氯化鈉加234.4kg(±850g)USP純水，攪拌至溶液澄清。
合成合成設(shè)備和供給LFE控制板(3000)20加侖套層玻璃內(nèi)襯帶蓋純化罐(E71224)2個100加侖套層玻璃內(nèi)襯帶蓋純化罐(P1，PT-001)(P2，L-13621)FTS循環(huán)冷卻器(RC96C032)和500加侖低溫儲存罐(500CST)3個帶轉(zhuǎn)軸和葉輪的Caframo混合器(BDC-1850)(R1，18500961)(P1，18501148)(P2，18501173)Lightning混合器(L1U08)(201550)3個熱交換器(Gardner Machinery)(R1，01960763)(P1，01960764)(P2，08950727)3個12KW套層液體循環(huán)器(Watlow，BLC726C3S 20)3個循環(huán)泵(Sta-Rite，JBHD-62S，C48J2EC15)Masterflex數(shù)字蠕動泵(A94002806)Masterflex蠕動泵(L95003320)
Cole Parmer蠕動泵(B96002074)Neutsche濾器(70-2038，43421-1)2個布氏濾器(Z11，624-6，Z10，441-8)Siemens真空泵(F2BV2)60加侖套層玻璃內(nèi)襯帶蓋收集罐(86854，E164-1186)空氣壓縮機(DF412-2)(9502312538)流量控制器(3-5500)(69705069190)6個批量控制器(3-5600)(#1，69705069191，#2，69705069199，#3，69705069194，#4，69705058829，#5，69705058805′#6，69705069195)6個流量傳感器(#1，69704295165′#2，69704024995，#3′69704024994，#4.69704025027，#5.69612178606，#6，69703120990)4個隔膜泵(M1)4個電流抑制器(A301H)(#2，15557，#3，15561，#4，15558，#5，15559)4個空氣調(diào)節(jié)器(CFR10)4個電磁閥(與空氣調(diào)節(jié)器一并使用)4個低流量傳感器(FS-500)3個電磁閥(EASM5V16W20)空氣過濾器/調(diào)節(jié)器(T1R)PTFE/F06R113AC濾膜，聚丙烯(7211-1)濾膜，Whatman級 52PharMed管(-18，-82，-90)pH計；Hanna 9321(1303675) & Orion 620(001911)分光光度計20(3MU7202070)Fisher Scientific真空爐(9502-033)VWR 1370 FM鼓風(fēng)爐(1370FM)
塵/霧防毒面具(Dust/Mist R6spirator)Thomas Wiley實驗室研磨機(3375-E10)Patterson-Kelley攪拌器(Blendmaster，C416578)OMS TS4KD 天平OHAUS IP15KS 天平Mettler AG 104 天平AnD HV150KA1 天平Fairbanks H90-5150 天平OHAUS AS123 打印機OHAUS AS142 打印機AD-8121 多功能打印機Citizen iDP 3540 點陣打印機Hewlett Packard 高壓液相色譜儀(1050)超聲清潔器(8892-DTH，QCC9601 005C)K型熱電偶溫度記錄器(KTx，6292753，6355146)Erlenmeyer燒瓶(8L，6L，4L，1L)燒杯(8L，6L，500ml，250ml)大玻璃瓶(4L，10L，50L)HDPE鼓形圓桶(55加侖，100加侖)容量瓶(100ml)塑料漏斗Pastuer移液管及球形管和容量移液管(10ml，50ml)及球形管風(fēng)箱(25ml，50ml)稱量紙刮刀包裝材料(容器、蓋、標簽)原料溶液合成步驟1.
2-氨基-5-二甲胺基苯基硫代硫酸的合成·檢驗USP純水系統(tǒng)的完整性，在反應(yīng)器中加入稱重的USP級純水(28,000g±100.0g)，以190±10RPM速度攪拌。·加入N，N-二甲基-1，4-亞苯基二胺(5.128mol，720.0g±3.0g)，原料應(yīng)以粉劑加入(無塊狀物)。攪拌10分鐘(±5分鐘)?！ぜ尤臌}酸(6N，1136.9g±5.0g)。攪拌15分鐘(±5分鐘)?！び盟芰先友b置取反應(yīng)混合物樣品約10ml，檢測pH。在25℃±5℃，pH須為2.8-3.8。·加入十六水硫酸鋁溶液(4328.0g±21.0g)。攪拌10分鐘(±5分鐘)，速度為275±10RPM?！ぜ尤肼然\溶液(3641.5g±18.0g)。冷卻至4℃±1℃。·一旦溫度(PV1)至4±1℃，加入重鉻酸鉀溶液(6532.4g±32.0g)，作用20分鐘以上(±5分鐘)，加入完成后攪拌20分鐘(±5分鐘)。·維持溫度至少約10℃以下，加入五水硫代硫酸鈉溶液(3570.2g±18.0g)。在10℃攪拌該溶液30分鐘(±5分鐘)?！じ淖冊O(shè)定度至60℃。當(dāng)溫度(PV1)達到60℃±3℃時，可以攪拌反應(yīng)混合物5分鐘(±3分鐘)，改變LFE控制器設(shè)定度至10.0?！ひ坏囟冗_到13.0℃±2.0℃，檢測pH。在25℃±5℃，pH須為3.1-4.1。
合成步驟2.
硫代硫酸吲達胺的合成·稱取鄰甲苯胺(604.4g±2.5g)并在冰浴中冷卻至18℃±3℃。將鹽酸(6N，1230.7g±5.0g)緩緩加入鄰甲苯胺，從冰浴中取出鄰甲苯胺鹽酸，使溶液冷卻至38℃±3℃。將該溶液加入反應(yīng)混合物中，攪拌5分鐘(±3分鐘)?！ぜ尤胫劂t酸鉀溶液(6532.4g±32.0g)作用20分鐘(±5分鐘)以上。加入完成后攪拌10分鐘(±5分鐘)。·改變控制器的設(shè)定度(SP1)至60℃。一旦溫度達到60℃±3℃時，攪拌反應(yīng)混合物25分鐘(±5分鐘)。將會形成由綠色吲達胺組成的沉淀物。
合成步驟3.
氯化鋅雙鹽的合成·設(shè)定LFE控制器的設(shè)定度至7.0。一旦反應(yīng)混合物的溫度達到10.0℃±3℃，加入重鉻酸鉀溶液(6532.4g±32.0g)作用20分鐘(±5分鐘)以上。加入完成后攪拌20分鐘?！ぜ尤胫劂t酸鉀溶液(5225.9g±26.0g)作用20分鐘(±5分鐘)以上。加入完成后攪拌20分鐘(±5分鐘)?！ぜ尤肼然\溶液(3641.5g±18.0g)。350±10RPM，攪拌20分鐘(±5分鐘)?！ぜ尤胛逅蛩徙~(2122.8g±10.0g)。攪拌15分鐘(±5分鐘)?！じ淖兛刂破髟O(shè)定度(SP1)至100.0。一旦反應(yīng)混合物的溫度達到67.0℃±3℃，開始添加硫酸溶液，通過加入等分試樣調(diào)節(jié)至pH 2.9±0.3(500ml，250，125ml等)。每次添加和檢驗pH后，攪拌5至10分鐘?！ひ坏┓磻?yīng)混合物的溫度達到100.0℃±3℃，攪拌混合物35±5分鐘?！じ淖兛刂破髟O(shè)定度(SP1)至35.0。當(dāng)反應(yīng)混合物溫度達到70.0℃±3℃時，改變控制器的設(shè)定度(SP1)至2.5，在4小時內(nèi)將溫度冷卻至2.5℃，在2.5℃±2.0℃保持4-18小時。
純化步驟1·將反應(yīng)混合物通過合適的濾膜進行過濾(Whatman級52)。·反應(yīng)器清空后，稱取24.0kg±150.0g 30％NaCl溶液，并加入24.0kg±150.0g USP水。關(guān)閉反應(yīng)器底閥，將15％NaCl溶液加入反應(yīng)器。輕輕攪拌溶液。過濾完成時，在濾器中加入NaCl溶液以沖洗濾餅?！z查100加侖套層玻璃內(nèi)襯純化罐#1的狀況，確保罐清潔并配有高密度聚乙烯(HDPE)蓋、Caframo攪拌器、攪拌軸、攪拌葉輪和插入塑料熱電偶套管中的熱電偶探針。檢查底閥的關(guān)閉和出口封閉的情況?！しQ取190.0kg±1.0kg USP水，置于高密度聚乙烯(HDPE)容器內(nèi)，將水移至純化罐1中。以350 RPM轉(zhuǎn)速攪拌混合物。一旦NaCl沖洗濾餅進行完畢，邊攪拌邊將濾餅加入純化罐1中?！嚢杌旌衔?-4小時?！ぴO(shè)定純化罐1 LFE控制器至75.0(SP1)?！ぎ?dāng)混合物溫度(PV1)達到75.0℃±3℃時，改變控制器設(shè)定度至40.0?！ぴ?0℃、350 RPM攪拌混合物12-36小時?！と蛹s50ml(通過底閥)，用1.0ml移液管量取1.0ml樣品，在容量100ml的燒瓶中稀釋至100ml。然后用10.0ml移液管量取10.0ml該溶液，在容量100ml燒瓶中稀釋至100ml。用spectronic 20+測定樣品的光吸收，樣品的光吸收應(yīng)≥0.220。
純化步驟2·將混合物通過濾器中的濾膜進行過濾。將濾液收集到配衡(Tared)的HDPE加蓋容器中?！?00加侖玻璃內(nèi)襯套層純化罐2配備蓋、攪拌器、攪拌軸、已插入塑料熱電偶的套管中的葉輪和熱電偶探針。·利用下述公式，稱取與上述溶液等體積的30％NaCl溶液，置于潔凈的HDPE容器中。·M1(溶液體積)×116.91g(NaCl溶液重量)/100.0ml(NaCl溶液體積)＝g(NaCl溶液重量)·樣品≈10ml濾液，檢測pH。pH應(yīng)為3.0-4.0。將濾液轉(zhuǎn)移至純化罐2,350 RPM攪拌該溶液?！ぜ尤肼然\溶液(1636.3g±6.5g)·將NaCl溶液(稱重)轉(zhuǎn)移至純化罐2中?！ぴO(shè)置純化罐2 LFE控制器至75.0(SP1)?！ぎ?dāng)混合物溫度(PV1)達到75.0℃±3℃時，改變控制器設(shè)定度至5.0?！?小時內(nèi)冷卻至5℃，于5℃±4.0℃保持4-24小時。
加工i.過濾·在濾器中，將混合物通過稱重的過濾介質(zhì)(Whatman級52)進行過濾。稱取12kg±50g 30％氯化鈉溶液并用12kg±50g USP水稀釋。通過將溶液直接加入布氏漏斗，用15％氯化鈉溶液沖洗濾餅。過濾完畢后，小心移去含有產(chǎn)物的濾紙。ii.干燥·將純化的絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)物置于爐中，50.0℃±3.0℃干燥5±1小時?！墓娘L(fēng)爐中取出絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)物并置于真空爐中。于45.0℃±3.0℃，28”Hg±2”Hg干燥10±2小時。iii.研磨·在Thomas Wiley實驗室研磨機中安裝0.5mm篩。輸送槽接一個潔凈容器。研磨腔閥門務(wù)必關(guān)閉并閉鎖?！りP(guān)閉漏斗底部的滑動門，移開漏斗蓋，加入干燥的絡(luò)合產(chǎn)物。重蓋上漏斗蓋。開動磨粉機，輕輕打開滑動門。以足夠緩慢的速度將產(chǎn)物加入研磨腔，以不使研磨機減速或阻塞?！ぱ心ネ瓿珊?，從輸送槽小心取下容器。v.混合·將產(chǎn)物轉(zhuǎn)至Patterson-Kelly實驗室混合容器中，閉蓋。定時15分鐘±5分鐘。
用HPLC分離的過程本實施例描述了從上述經(jīng)干燥、研磨和混合而制得的絡(luò)合產(chǎn)物中，分離本發(fā)明新化合物的HPLC過程。A.儀器與設(shè)備1.HPLC層析過程a.HP1100 HPLC色譜系統(tǒng)b.HP1100二極管陣列(Diode-array)檢測器c.HP1100四元(Quaternary)HPLC泵2.餾分的收集和純化a.ISCO Foxy Jr.，10管道分步收集器b.Bǚchi，model R-124旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器c.Sep-pak筒(cartridge)，C18，Varian3.質(zhì)譜分析a.電子碰撞質(zhì)譜(EI-MS)1.質(zhì)譜儀VG分析ZAB 2-SE2.源溫200℃3.電壓70eV4.探針樣品固體探針5.探針溫度280℃b.液相色譜/質(zhì)譜(LC-MS)1.HP1100真空抽氣二元泵2.溶劑A水∶ACN(88∶12)v/v含0.1％TEA3.溶劑B水∶ACN(1∶1)v/v含0.1％TEA4.梯度在18分鐘內(nèi)，將溶劑B的濃度由0％提高至30％；27分鐘后提高至100％，維持3分鐘5.流速1.5ml/分鐘6.柱Water Symmetry C18柱(4.6mm×250mm，5μm)7.柱溫度40℃8.檢測器可變波長UV，290nm9.質(zhì)譜儀VG Bio-Q三倍四極質(zhì)譜儀10.操作模式正電子噴霧電離(+ESI)模式11.源溫80℃c.高速原子轟擊(FAB-MS)1.質(zhì)譜儀VG Analytical ZAB 2-SE2.樣品注入銫離子槍
3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)帶PDP 11/73的VH Analytical 11-250Jd.電子噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)1.質(zhì)譜儀VG Biotech Bio-Q四極分析儀2.操作模式負離子直接解離3.注入量50-75μl4.洗脫劑含0.1％FA的50％ACN水溶液5.流速10U μl/分鐘e.電子噴霧質(zhì)譜MS/MS(ESI-MS/MS)1.質(zhì)譜儀VG Quattro II Bio-Q三倍四極分析儀2.轟擊氣氬氣3.樣品等分試樣50-75μl4.洗脫劑50％ACN水溶液，含0.1％TFA5.流速10μl/分鐘f.高溶解質(zhì)譜(HR-MS)1.質(zhì)譜儀VG Analytical ZAB 2-SE2.樣品注入銫離子槍3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)帶有PDP 11/73的VH Analytical 11-250J4.核磁共振色譜(NMR)a.400MHz Varian Inova NMR5.X-衍射單晶分析a.Nonius CAD4,586型，自動單晶衍射器b.X-衍射銅管，聚焦良好(λ＝1.5418)c.隨機定位照相裝置，Polaroid，57-3型d.快速數(shù)據(jù)采集軟件
e.MOLEN數(shù)據(jù)翻譯軟件B.化學(xué)品、試劑和標準品1.化學(xué)品和試劑a.乙腈(ACN)，HPLC級b.甲醇(MeOH)，HPLC級c.氯仿(CHCI3)，HPLC級d.冰醋酸(GAA)，ACS級e.鹽酸(HCI)，ACS級f.Milli-Q水g.三乙胺(TEA)，HJPLC級h.乙酸銨，AR級i.固體氫氧化鈉(NaOH)，試劑級j.氮氣，零級k.氘化甲醇(d4-MeOH)l.氘化二甲基亞砜(d6-DMSO)m.重水(D2O)n.氘化鹽酸(DCI)o.四苯基硼酸鈉，試劑級初始準備HPLC系統(tǒng)2用于化合物的餾分收集初始餾分收集稀釋液-制備0.1M乙酸溶液，用NaOH調(diào)pH至6.1±0.1流動相A-88∶12 稀釋液∶ACN
流動相B-50∶50 稀釋液∶ACN樣品制備用水稀釋經(jīng)干燥、混合的絡(luò)合反應(yīng)物，制備濃度為15mg/ml的溶液。將30-40ml溶液放入10g C18SPE筒，用約20ml稀釋液洗滌，然后用約10ml水洗滌。用約10ml在MeOH中的0.01N HCI洗脫。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)潔凈的樣品至其干燥，樣品重新溶解于稀釋液中。
色譜系統(tǒng)帶有柱加熱裝置的AP 1100 HPLC系統(tǒng)備有7μm，30.0cm×7.8mm的C18柱，和合適的可在290nm檢測的紫外檢測器及二極管陣列(Diode-array)，設(shè)定流速5.0ml/分鐘，柱溫20℃。用下列梯度洗脫。
％移動相時間(分)A B0 802015604015.1 0 100250 10025.1 8020過程將900μl樣品溶液注入色譜系統(tǒng)，用多管道餾分收集器收集感興趣的峰。一旦收集到所有的餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)每一餾分以去除大部分乙腈，然后在C18SPE筒中進行濃縮，用水洗滌，用約10ml在MeOH中的0.01N HCI洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)洗脫液至干，留待進一步純化。
終末餾分收集流動相A-88∶12 0.1％ TEA∶ACN流動相B-50∶50 0.1％ TEA∶ACN樣品制備從初始餾分收集物中制備蒸干餾分的溶液，用流動相A洗脫。
色譜系統(tǒng)帶有柱加熱裝置的HP 1100 HPLC系統(tǒng)備有7μm，30.0cm×7.8mm C18柱，和合適的可在290nm檢測的紫外檢測器及二極管陣列(Diode-array)，設(shè)定流速設(shè)為5.0ml/分鐘，柱溫30℃。用下列梯度洗脫。
％移動相時間(分) A B0 73278 70.6 29.48.145559 455516 25.5 74.516.1 7327過程將200μl樣品溶液注入色譜體系，用多管道餾分收集器收集感興趣的峰。一旦收集到所有的餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)每一餾分以去除大部分乙腈，然后在C18SPE筒中進行濃縮，用水洗滌，用約10ml在MeOH中的0.01N HCI洗脫，在干燥的氮氣流中干燥餾分用于鑒定。
化合物IV的特征分離化合物IV用部分修改的(semi-reparative)HPLC進行分離。收集餾分，大部分乙腈被旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，用C18SPE筒進一步濃縮餾分，用水洗滌，用約5ml在MeOH中的0.01N HCI洗脫，在干燥的氮氣流中干燥餾分。部分物質(zhì)重新溶于流動相并注入HPLC系統(tǒng)以確定鎦分純度。注入的化合物IV的純度為95％，8.2mg用于NMR檢測。質(zhì)譜分析經(jīng)研磨、混合的絡(luò)合反應(yīng)物的初步LC-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明，化合物IV的分子量約75.3m/z。從LC-MS收集餾分，進行進一步的HR-MS的研究表明，化合物IV的質(zhì)量是375.1655m/z，分子式是C22H23N4S1。用正ESI-MS/MS檢測化合物IV 375m/z母離子的子體。碎片模式顯示從化合物IV分子離子中主要失去16amu和44amu，產(chǎn)生化合物IV之結(jié)構(gòu)。該化合物及其N-和N，N-二甲基衍生物，化合物V和VI是由母體化合物(TBO)與過量的起始物質(zhì)鄰二甲苯的二級反應(yīng)形成的。
化合物I的特征分離化合物I用部分修改的HPLC進行分離。收集餾分，大部分乙腈被旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，用C18SPE筒進一步濃縮餾分，用水洗滌，用約5ml在MeOH中的0.01N HCI洗脫，在干燥的氮氣流中干燥餾分。部分物質(zhì)重新溶于流動相并注入HPLC系統(tǒng)以確定餾分純度。注入的化合物I的純度為95％，18.9mg用于NMR檢測。質(zhì)譜分析經(jīng)干燥、混合的絡(luò)合反應(yīng)物初步的LC-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明，化合物I的分子量約284.1m/z。從LC-MS收集鎦分，進一步進行HR-MS研究表明，化合物I的分子量是284.1223m/z，分子式是C16H18N3S1。用正ESI-MS/MS檢測化合物I的284m/z母離子的子體。結(jié)構(gòu)和碎片模式表明，從分子離子中主要失去16amu、30amu和59amu，產(chǎn)生了化合物I的結(jié)構(gòu)?；衔颕及其N-和N，N-二甲基衍生物，化合物II和II是由一個甲基基團自由基從另一個脫甲基分子中清除(scavenging)脫離到相應(yīng)母體TBO異構(gòu)體上形成的。
用上述分離鑒定化合物VI和I的方法，進行化合物II、III、V和VI的分離和特征鑒定。
實施例2臨床檢測方案臨床檢測溶液的制備本實施例舉例說明實施例1的每個產(chǎn)物在鑒別口腔組織發(fā)育異常中的應(yīng)用。
將化合物I、懸鉤子香味劑(IFF Raspberry IC563457)、三水乙酸鈉緩沖液試劑和H2O2(30％ USP)防腐劑(見美國專利5,372,801)溶于純水(USP)、冰乙酸和SD 18乙醇以制備檢測液，其具有表A所示的組分
表A組分 重量％化合物I 1.00香味劑.20緩沖劑 2.45防腐劑.41乙酸 4.61乙醇 7.48水 83.85100.00制備1wt.％的乙酸/純水預(yù)清洗檢測液(Pre-rinse)和后清洗檢測液(Post-rinse)、安息香酸鈉防腐劑和懸鉤子香味劑。臨床方案患者戴圍兜以保護衣服，因預(yù)見有痰，故為患者提供10-oz.口杯一個?？诒軌蛟诟腥緩U物容器中處理，或者杯內(nèi)容物可直接傾入水槽排水溝中央，防止污染水槽。環(huán)境表面或可能被污染的物品應(yīng)覆蓋或從試驗區(qū)移開。
進行口腔癌的目視檢查，不使用任何可能引起軟組織切口或傷口的器械。在預(yù)染色的軟組織和牙齒表面做記號。
患者用約15ml預(yù)清洗液洗漱口腔約20秒并咳出，以去除多余唾液，提供穩(wěn)定的口腔環(huán)境。用額外的預(yù)清洗液重復(fù)該步驟。
患者再用水沖洗及漱口約20秒，咳出。
患者再用30ml檢測液沖洗及漱口1分鐘，咳出。
患者再用15ml后清洗液沖洗口腔約20秒，咳出。重復(fù)該步驟。
患者再用水沖洗及漱口20秒，咳出。重復(fù)此步驟。
然后用適宜的軟組織檢查技術(shù)進行口腔觀察，如有必要，包括進行退縮、平衡光照和放大檢查。記錄保持藍色染色的可疑病變的位置、大小、形態(tài)、顏色和表面特征。
為減少假陽性，病人于10-14日后返回，重復(fù)進行上述方案。這個期間為第一次檢查時出現(xiàn)的潰瘍、外傷或刺激性病因的治愈留有時間。第一次檢查的可疑部位在第二次檢查后仍為陽性染色的，認為是癌變或癌癥前期組織的跡象，做活體組織切片檢查以確定此結(jié)論。
早期紅細胞成形的病變?nèi)旧仕{色，常為點彩狀或斑狀。但舌背上不規(guī)則乳狀裂縫保持該染色是正常的，非陽性顯示。其它保持藍染色但不認為陽性的區(qū)域包括牙斑、每枚牙齒的牙齦緣、因染料從舌背上留存的染色劑轉(zhuǎn)移造成軟腭的彌散染色和易鑒別的潰瘍性損傷等。在所有的病例中，對于高度可疑、但本檢測未呈陽性染色的病變，必須進行活體組織切片檢查。
實施例3-7除了用化合物II，III，IV，V和VI代替化合物I之外，重復(fù)上述方案。獲得類似的結(jié)果。
對本發(fā)明的描述足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員理解和實施該發(fā)明，還鑒定出本發(fā)明目前最佳的實施方式。本人的權(quán)利要求如下。
權(quán)利要求
1.具有下列結(jié)構(gòu)的化合物 其中x是氫、甲基或Y；Y是-NH-R或氫；而且R是甲基或
2.具有下列結(jié)構(gòu)的化合物
3.具有下列結(jié)構(gòu)的化合物
4.具有下列結(jié)構(gòu)的化合物
5.具有下列結(jié)構(gòu)的化合物
6.具有下列結(jié)構(gòu)的化合物
7.具有下列結(jié)構(gòu)的化合物
8.一種改良的檢測發(fā)育不良組織的方法，其包括將選擇性染色發(fā)育不良組織的生物染色劑組合物用于上皮組織，改良方法包括使用具有權(quán)利要求1所示結(jié)構(gòu)式的化合物。
全文摘要
作為體內(nèi)染色劑用于檢測發(fā)育不良組織的化合物,其具有如式(A)所示的結(jié)構(gòu),其中X是氫,甲基或Y;Y是－NH－R或氫;R是甲基或式(B)。
文檔編號C07D279/36GK1345241SQ00805853
公開日2002年4月17日 申請日期2000年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月31日
發(fā)明者道格拉斯·伯克特 申請人:日拉公司