專利名稱：：表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子β2抗體膜的人工晶狀體及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于白內(nèi)障手術(shù)中替換眼內(nèi)晶狀體的人工晶狀體，尤其是一種能抑制術(shù)后并發(fā)的后發(fā)性白內(nèi)障的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體膜的人工晶狀體及其制造方法。技術(shù)背景后發(fā)性白內(nèi)障是白內(nèi)障囊外摘除術(shù)之后因殘留的晶狀體皮質(zhì)未完全吸收、遺留的部分繼發(fā)混濁而形成的并發(fā)癥，故又稱后囊膜混濁或繼發(fā)性白內(nèi)障；該眼疾將直接影響到患者的視力恢復(fù)。目前隨白內(nèi)障囊外摘除術(shù)的提高，后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生率已由早期的50%下降，但仍有14.118.8。/。的術(shù)后病人還需接受Nd-YAG激光術(shù)(即摻釹釔鋁石榴石激光后囊切開的手術(shù))來治療后發(fā)性白內(nèi)障；為此患者還需花上大筆的手術(shù)費(fèi)用，而且該手術(shù)還存在著視網(wǎng)膜脫離、黃斑囊樣水腫、眼內(nèi)壓升高等風(fēng)險(xiǎn)。因此，降低后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生率、提高白內(nèi)障囊外摘除的術(shù)后視覺效果已刻不容緩?，F(xiàn)有的研究表明，白內(nèi)障囊外摘除術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞所發(fā)生的上皮一間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和晶體纖維再生等是引起后發(fā)性白內(nèi)障的主要病理機(jī)制。因此目前已從該發(fā)生環(huán)節(jié)著手抑制后發(fā)性白內(nèi)障，其中包括研究抑制后發(fā)性白內(nèi)障的藥物種類、給藥方式等例如中國專利CN101036804A"納米氟尿嘧啶涂層人工晶體及其制備方法"和CN101053680A"防治后發(fā)障形成的具抗增殖藥涂層的人工晶體"，均以抗增殖的細(xì)胞毒藥物作為涂層布于人工晶狀體表面；中國專利CN200973766Y"防治后發(fā)性白內(nèi)障的人工晶狀體"和CN2531755Y"緩釋劑攜帶型人工晶體"，是在人工晶狀體赤道部外側(cè)或袢上固定藥物緩釋載體。它們雖能通過局部高濃度的藥物原位抑制殘留晶狀體上皮細(xì)胞的增殖而起到作用，且有體外試驗(yàn)的效果，但在體內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)它們還有以下的缺點(diǎn)1)涂于人工晶狀體表面的抗增殖的細(xì)胞毒藥物或藥物緩釋載體，它們對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞、虹膜、睫狀體上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜等眼內(nèi)其它組織有著潛在的毒副作用；此外，其它給藥方式還包括囊袋內(nèi)藥物灌洗、眼內(nèi)植入生物可降解性高分子藥物緩釋載體等，前者的缺點(diǎn)在于有效濃度維持的時(shí)間短且還容易對(duì)眼內(nèi)其它組織產(chǎn)生影響，而后者則易影響眼內(nèi)組織或干擾其它手術(shù)，且一旦出現(xiàn)毒副作用則需即時(shí)手術(shù)取出；2)藥物涂層在人工晶狀體表面的穩(wěn)定性比較差，因而使用不太可靠；3)它們的制造工藝比較復(fù)雜。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是要克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種能有效抑制白內(nèi)障術(shù)后并發(fā)的后發(fā)性白內(nèi)障、提高白內(nèi)障術(shù)后的視覺效果，且對(duì)人體，特別是角膜內(nèi)皮細(xì)胞、虹膜、睫狀體上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜等眼內(nèi)其他組織無毒副作用的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體膜的人工晶狀體及其制造方法；并還使它具有制造方法簡單合理、能工業(yè)化生產(chǎn)，且成本低、產(chǎn)品價(jià)格低廉等特點(diǎn)。本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體膜的人工晶狀體，其特征是在人工晶狀體的光學(xué)部和袢的表面上帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體膜。以使該人工晶狀體植入眼內(nèi)、進(jìn)入囊袋之后，其表面上的抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體膜即產(chǎn)生抑制后發(fā)性白內(nèi)障的作用，且既不對(duì)眼內(nèi)其它組織產(chǎn)生毒性作用，又能提高人工晶狀體的生物相容性，從而減少了白內(nèi)障術(shù)后并發(fā)癥，并有利于術(shù)后遠(yuǎn)期視力的恢復(fù)。上述的人工晶狀體的材料是聚甲基丙烯酸甲酯，或硅凝膠，或軟性疏水性的聚丙烯酸酯。本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體膜的人工晶狀體的制造方法，其特征是它包含以下的步驟1)將人工晶狀體清洗并干燥，再通過表面預(yù)處理使該人工晶狀體表面荷以正電或負(fù)電；2)將上述表面荷電的人工晶狀體浸入與其表面電荷相反的濃度為0.01-1000mg/mL的聚電解質(zhì)的水溶液中，吸附1-120分鐘，然后以去離子水漂洗并氮?dú)獯蹈?；再將該人工晶狀體浸入與此前聚電解質(zhì)所帶電荷相反的濃度為0.01-1000pg/mL的抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體的磷酸鹽緩沖溶液中，該磷酸鹽緩沖溶液為0.01-10mol/L、pH值為4-10，吸附1-120分鐘，然后用磷酸鹽緩沖溶液漂洗，氮?dú)獯蹈桑?)重復(fù)上述交替組裝步驟至少一次，即制得表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因了P2抗體膜的人工晶狀體；此后在室溫下真空干燥、密封包裝即可。本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子p2抗體膜的人工晶狀體的制造方法中，能使人工晶狀體表面荷以正電或負(fù)電的表面預(yù)處理方法是以下三種方法中的任意一種i)利用等離子體表面處理，改變通入的氣體種類在人工晶狀體表面引入功能基團(tuán)，氨基或羧基等，然后改變pH值使表面離子化而帶上電荷。ii)以直接吸附帶正電荷的聚乙烯基亞胺使表面帶正電荷。iii)將聚丙烯酸酯的人工晶狀體用堿溶液進(jìn)行表面水解，表面產(chǎn)生大量羧基而引入負(fù)電荷。本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體的制造方法中，所用的聚電解質(zhì)是與抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體帶相反電荷的聚電解質(zhì)，最好是天然聚電解質(zhì)或無細(xì)胞毒性的聚電解質(zhì)，當(dāng)抗體帶負(fù)電荷時(shí)，選用帶正電荷的聚電解質(zhì)聚烯丙基胺鹽酸鹽、殼聚糖、多聚賴氨酸、明膠；當(dāng)抗體帶正電荷時(shí)，則選用帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)聚苯乙烯磺酸鈉、海藻酸鈉、肝素、透明質(zhì)酸鈉。本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體膜的人工晶狀體的制造方法中，所用的抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體是一種等電點(diǎn)為6.8的免疫球蛋白，故高于等電點(diǎn)的pH值即可使它帶上負(fù)電，而低于等電點(diǎn)的pH值帶正電。如果組裝條件能與生理情況下的pH值及離子強(qiáng)度相類似，如選擇PH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液(以下簡稱PBS溶液)，則可保持組裝環(huán)境與人體環(huán)境的一致，從而能最好地維持其穩(wěn)定性和活性。本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體的制造方法，還可在表面預(yù)處理以使人工晶狀體表面荷以正電或負(fù)電之后和浸入與其表面電荷相反的濃度為0.01-1000mg/mL的聚電解質(zhì)的水溶液之前，還增加一道能提高該人工晶狀體表面電荷密度以增強(qiáng)后續(xù)的抗體的靜電層層自組裝吸附能力的步驟，該步驟是將表面荷以正電或負(fù)電的人工晶狀體交替浸入兩種電荷性質(zhì)相反的濃度均為0.01-1000mg/mL的強(qiáng)聚電解質(zhì)水溶液中，吸附時(shí)間均為1-120分鐘，吸附完成后均需用去離子水漂洗、氮?dú)獯蹈?，且交替重?fù)該步驟的次數(shù)至少一次；其中帶正電荷的強(qiáng)聚電解質(zhì)選用聚烯丙基胺鹽酸鹽(以下簡稱PAH)，或聚二甲基二烯丙基氯化銨(以下簡稱PDDA)，帶負(fù)電荷的強(qiáng)聚電解質(zhì)選用聚苯乙烯磺酸鈉(以下簡稱PSS)。從而在人工品狀體的表面形成電荷密度高的強(qiáng)聚電解質(zhì)的組裝底層。上述方法中的吸附時(shí)間長短是根據(jù)所用溶液的濃度大小進(jìn)行選擇，例如溶液的濃度大則取用的吸附時(shí)間可取低值，反之則吸附的時(shí)間長。另外，上述方法中對(duì)人工晶狀體表面組裝抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體和與之電荷相反的聚電解質(zhì)的先后次序可根據(jù)所采用的表面預(yù)處理方法、所備有的溶液等不同條件進(jìn)行選擇(例如PH=7.4的PBS溶液中的抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體帶負(fù)電，若人工晶狀體表面預(yù)處理后帶負(fù)電，則其后先吸附帶正電的聚電解質(zhì)，再吸附帶負(fù)電的抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體，若人工晶狀體表面預(yù)處理后帶正電，也可調(diào)換上述次序)，且不影響正、負(fù)電之間的吸引，從而確保在人工晶狀體表面層層組裝抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體膜的效果相同。實(shí)施例中所舉例子均先吸附聚電解質(zhì)，再吸附抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體，省略調(diào)換次序的例子。本發(fā)明的有益效果1)本發(fā)明的人工晶狀體在植入眼內(nèi)、進(jìn)入囊袋之后，其表面的抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體直接與轉(zhuǎn)化生長因子(32發(fā)生特異性相互作用而不影響眼內(nèi)其他組織，且耙向抑制晶狀體上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和囊膜皺縮，有效阻斷了后發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，從而抑制后發(fā)性白內(nèi)障而有利于術(shù)后遠(yuǎn)期視力的恢復(fù)；2)因組裝過程所用的組裝成分，包括所用的抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體在內(nèi)均為低毒性和免疫原性的天然聚電解質(zhì)或無細(xì)胞毒性的聚電解質(zhì)，故本發(fā)明的人工晶狀體對(duì)眼內(nèi)其他組織無毒副作用，并還具有良好的生物相容性，能協(xié)同抑制后發(fā)性白內(nèi)障；3)本發(fā)明通過科學(xué)可行的靜電層層自組裝的方法，以較弱的靜電作用即可使生物分子交替浸涂固定在人工晶狀體表面，實(shí)現(xiàn)了納米、亞微米尺寸的層狀結(jié)構(gòu)，其結(jié)果既不影響人工晶狀體本體特性，又實(shí)現(xiàn)了抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體在人工晶狀體表面牢固沉積，而且能維持抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體在干態(tài)下的活性和在醫(yī)用移植中的安全可靠性；4)本發(fā)明制造方法因所用溶劑均無毒性，故對(duì)環(huán)境友好，而且還因制造方法簡單合理，且還可通過調(diào)節(jié)組裝條件，例如改變聚電解質(zhì)的pH值、離了強(qiáng)度、濃度等簡單而有效地控制薄膜的細(xì)微結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)；另外，組裝分子的選擇范圍較廣，可以是合成型的聚電解質(zhì)，也可以是蛋白質(zhì)、多糖、DNA等荷電生物活性大分子等；5)通過試驗(yàn)證明，本發(fā)明的制造方法科學(xué)合理、切實(shí)可行，且其制造工藝較為簡單、所花費(fèi)的成本較低，因此能使本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子|32抗體膜的人工晶狀體成為一種價(jià)格低廉的工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品。圖1表示在軟性疏水性聚丙烯酸酯的人工晶狀體表面構(gòu)建(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體)2多層膜的靜電層層自組裝過程，即組裝了兩個(gè)雙層(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體)的本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體的示意圖；圖中僅在人工晶狀體的一個(gè)表面上表示出其組裝出的結(jié)構(gòu)，其余表面和袢上也具有同樣的組裝結(jié)構(gòu)；但為簡化和清晰起見，在其余表面和袢上未予以畫出。圖2是表示在軟性疏水性聚丙烯酸酯人工晶狀體表面構(gòu)建(PAH/PSS)2/(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體)多層膜的靜電層層自組裝過程，即組裝了兩個(gè)雙層(PAH/PSS)、一個(gè)雙層(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體)的本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體膜的人工晶狀休的示意圖；圖中僅在人工晶狀體的一個(gè)表面上表示出其組裝出的結(jié)構(gòu)，其余表面和袢上也具有同樣的組裝結(jié)構(gòu)；但為簡化和清晰起見，在其余表面和袢上未予以畫出。圖3是通過石英晶體微天平的頻率變化跟蹤人工晶狀體表面(PAH/PSS)3/(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體)3多層膜的靜電層層自組裝過程，即組裝了三個(gè)雙層(PAH/PSS)，三個(gè)雙層(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體)。圖4是以倒置相差顯微鏡的照片顯示培養(yǎng)24小時(shí)后離體巨噬細(xì)胞在人工晶狀體表面的粘附照片，其中(a)是現(xiàn)有的人工晶狀體，(b)是本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體。圖5是以倒置相差顯微鏡的照片顯示在轉(zhuǎn)化生長因子P2的誘導(dǎo)下，培養(yǎng)24小時(shí)后離體晶狀體上皮細(xì)胞在人工晶狀體表面的粘附，其中(c)是現(xiàn)有的人工晶狀體，(d)是本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因了(32抗體膜的人工晶狀體。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:本實(shí)施例表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體膜的人工晶狀體，是一種在人工晶狀體的光學(xué)部和袢的表面上帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子|52抗體膜的人工晶狀體。本實(shí)施例中的抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體是一種免疫球蛋白，它能通過免疫細(xì)胞生物學(xué)的途徑抑制后發(fā)性白內(nèi)障，因?yàn)橐鸷蟀l(fā)性白內(nèi)障的關(guān)鍵因子是轉(zhuǎn)化生長因子P2，故釆用抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體則能以其高度的特異性來抑制轉(zhuǎn)化生長因子|32的作用、抑制細(xì)胞外基質(zhì)沉積和纖維化，從而對(duì)以纖維化為主的后發(fā)性白內(nèi)障起到其他藥物所欠缺的靶向作用，并且該人源性的抗體不具有免疫原性和毒性。因此，本實(shí)施例表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體膜的人工晶狀體植入眼內(nèi)、進(jìn)入囊袋之后，其表面上的抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜即產(chǎn)生抑制后發(fā)性G內(nèi)障的作用，且它既不對(duì)眼內(nèi)其它組織產(chǎn)生毒性作用，又能提高人工晶狀體的生物相容性，從而減少了白內(nèi)障術(shù)后并發(fā)癥，并有利于術(shù)后遠(yuǎn)期視力的恢復(fù)。通過眾多試驗(yàn)證實(shí)，本實(shí)施例人工晶狀體是不宜通過物理吸附法或化學(xué)鍵合法制得，前者是抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體膜不能長期穩(wěn)固在人工晶狀體表面，而后者會(huì)使抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體的生物活性大幅下降、甚至喪失；但一種靜電層層自組裝的方法是可行的，該方法是利用蛋白質(zhì)在特定的pH條件下能帶電荷、具有聚電解質(zhì)的特性，并通過交替地使用帶正電荷、帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)，即可使抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體以一層、一層薄膜的形態(tài)沉積到人工晶狀體的表面；該人工晶狀體的表面因此而改性、能在使用過程中兼有安全靶向，并穩(wěn)定持久地抑制后發(fā)性白內(nèi)障的作用。本實(shí)施例表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體的制造方法包括以下的步驟取用人工晶狀體，其材料可取聚甲基丙烯酸甲酯、硅凝膠、軟性疏水性聚丙烯酸酯等中的一種，本實(shí)施例取用軟性疏水性聚丙烯酸酯為材料的人工晶狀體；先分別用無水乙醇、去離子水清洗后，再用超聲清洗儀清洗1-3分鐘，然后以去離子水漂洗后在60。C真空干燥24小時(shí)；接著將其放入低溫等離子體發(fā)生器中，發(fā)生器功率為60W，射頻為13.5kHz，其內(nèi)氣體是二氧化碳，氣體壓力維持在50-60Pa，以等離子體輝光放電處理25分鐘，然后取出該人工晶狀體、其表面已帶有羧基官能團(tuán)；再將其浸入0.01mol/L的氫氧化鈉溶液中15分鐘，使羧基轉(zhuǎn)化為羧基離子，去離子水漂洗，氮?dú)獯蹈?，獲得帶負(fù)電的人工晶狀體表面；接著將該表面帶負(fù)電的人工晶狀體浸入溶液濃度為5mg/mL的帶正電的多聚賴氨酸水溶液中60分鐘后，以去離子水漂洗，氮?dú)獯蹈?；此后再浸入溶液濃度?00pg/mL的帶負(fù)電的抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體的PBS溶液(PBS溶液濃度0.05mol/L，pH=7.4)中，吸附30分鐘，再用PBS溶液漂洗，氮?dú)獯蹈桑恢貜?fù)以上的交替步驟即可獲得表面帶有l(wèi)-20層抗轉(zhuǎn)化生長因子p2抗體的人工晶狀體；最后將它取出，并用去離子水清洗，氮?dú)獯蹈?，室溫下真空千燥密封包裝。本實(shí)施例的人工晶狀體的結(jié)構(gòu)和制法可從圖1中看到；該圖是本實(shí)施例人工晶狀體表面靜電層層自組裝過程的示意圖，它是以軟性疏水性聚丙烯酸酯的人工晶狀體為例，在表面構(gòu)建(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子l32抗體)2多層膜，亦即組裝了兩個(gè)雙層(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體)；圖中以l-4表示制造過程的4個(gè)步驟，a表示軟性疏水性聚丙烯酸酯人工晶狀體，b，c表示各個(gè)步驟中所用到的試劑，+表示正電荷，-表示負(fù)電荷，其中，l表示二氧化碳?xì)怏w等離子體處理后使人工晶狀體表面產(chǎn)生羧基而帶負(fù)電荷，2表示帶正電荷的多聚賴氨酸組裝到人工晶狀體表面，3表示在pH=7.4條件下帶負(fù)電荷的抗轉(zhuǎn)化生長因了P2抗體組裝到人工晶狀體表面，4表示在人工晶狀體表面再次交替組裝多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體，b表示帶正電荷的多聚賴氨酸，c表示在pl^7.4條件下帶負(fù)電荷的抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體。實(shí)施例2:本實(shí)施例所用的人工晶狀體為聚甲基丙烯酸甲酯或軟性疏水性聚丙烯酸酯材料中的一種，與實(shí)施例1中不同的是人工晶狀體表面預(yù)處理獲得負(fù)電荷的方法，其后組裝過程所用的試劑和方法也與實(shí)施例1相同，即為帶正電的多聚賴氨酸和帶負(fù)電的抗轉(zhuǎn)化生長因了P2抗體。與實(shí)施例1的表面預(yù)處理方法的不同之處在于在人工晶狀體按實(shí)施例1方法清洗并烘干后，將其浸入30。/。氫氧化鈉水溶液中80。C水解30分鐘后，其表面可產(chǎn)生大量羧基離子，該表面在水溶液條件下呈負(fù)電性。本實(shí)施例與實(shí)施例1的共同之處在于人工晶狀體表面經(jīng)表面預(yù)處理后均帶有負(fù)電荷，表1是此后在人工晶狀體表面選用不同于多聚賴氨酸的帶正電荷的其它聚電解質(zhì)(PAH，或殼聚糖，或明膠)和帶負(fù)電荷的抗轉(zhuǎn)化生長因子|32抗體進(jìn)行靜電層層自組裝的例子，每一例均能制造出本發(fā)明的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子|32抗體膜的人工晶狀體。表1中所用帶正電的聚電解質(zhì)是不同于實(shí)施例1和實(shí)施例2中所用的多聚賴氨酸的其它聚電解質(zhì)；表1中溶解抗轉(zhuǎn)化生長因子p2抗體所用的PBS溶液pH均高于6.8，在此條件下抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體帶負(fù)電。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例3:取用人工晶狀體，其材料可取聚甲基丙烯酸甲酯、硅凝膠、軟性疏水性聚丙烯酸酯等中的一種，如硅凝膠為材料的人工晶狀體，按實(shí)施例l方法清洗并烘干后，將其放入低溫等離子體發(fā)生器屮，發(fā)生器功率為60W，射頻為13.5kHz，其內(nèi)氣體是氨氣，氣體壓力維持在50-60Pa，以等離子體輝光放電處理25分鐘，然后取出該人工晶狀體，其表面帶有氨基官能團(tuán)；將其浸入濃度為lmol/L的鹽酸溶液中30分鐘，使氨基鹽酸化為氨離子，去離子水漂洗，氮?dú)獯蹈?，獲得帶正電荷的人工晶狀體表面；接著將上述表面帶正電的人工晶狀體浸入0.01mg/mL的帶負(fù)電的肝素水溶液中120分鐘，去離子水漂洗，氮?dú)獯蹈?此后浸入0.01|_ig/mL的帶正電的抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體的PBS溶液(0.05mol/L，pH=4)中，吸附120分鐘，用PBS溶液漂洗，氮?dú)獯蹈?；重?fù)以上步驟可獲得表面帶有l(wèi)-20層抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體的人工晶狀體。最后取出人工晶狀體用去離子水清洗，氮?dú)獯蹈桑覝叵抡婵崭稍锩芊獍b。實(shí)施例4:本實(shí)施例所用的人工晶狀體與實(shí)施例3中相同，與實(shí)施例3中不同的是人工晶狀體表面預(yù)處理獲得正電荷的方法，而其后的組裝過程所用的試劑和方法與實(shí)施例3中相同，均為帶負(fù)電的肝素和帶正電的抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體。本實(shí)施例中的表面預(yù)處理方法是將人工晶狀體浸入3mg/mL的帶正電的聚乙烯亞胺水溶液中15分鐘，去離子水漂洗，氮?dú)獯登Й@得聚乙烯亞胺物理吸附的的表面，該表面在水溶液條件下呈正電性。本實(shí)施例與實(shí)施例3的共同之處在于人工晶狀體表面經(jīng)表面預(yù)處理后均帶有正電荷，表2是此后在人工晶狀體表面選用不同于肝素的帶負(fù)電荷的其它聚電解質(zhì)(PSS、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸鈉)和帶正電荷的抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體進(jìn)行靜電層層自組裝的例子，每一例均能制造出本發(fā)明的表面帶有抗轉(zhuǎn)化牛長因子(32抗體膜的人工晶狀體。表2中所用帶負(fù)電的聚電解質(zhì)是不同于實(shí)施例3和實(shí)施例4中所用的肝素的其它聚電解質(zhì)；表2中溶解抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體所用的PBS溶液pH均低于6.8，在此條件下抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體帶正電。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例5:本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于在二氧化碳?xì)怏w等離子體處理使得人工晶狀體表面帶負(fù)電荷之后，浸入濃度為5mg/mL的帶正電荷的多聚賴氨酸的水溶液和500昭/mL帶負(fù)電的抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體的PBS溶液之前，還增加一道步驟，將表面帶負(fù)電荷的人工晶狀體浸到5mg/mL的帶正電的強(qiáng)電解質(zhì)PAH溶液中吸附15分鐘，用去離子水漂洗，氮?dú)獯蹈?，獲得帶正電荷的表面；然后將其浸到5mg/mL的強(qiáng)電解質(zhì)PSS水溶液中15分鐘，去離子水漂洗，氮?dú)獯蹈?，獲得帶負(fù)電荷的表面；重復(fù)以上步驟即可在人工晶狀體表面獲得2-6層PAH/PSS交替存在的底層。在人工晶狀體表面組裝了電荷密度高的強(qiáng)電解質(zhì)的底層后，有利于后續(xù)的抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體的組裝。本實(shí)施例的人工晶狀體的結(jié)構(gòu)和制法可從圖2中看到；該圖是本實(shí)施例人工晶狀體表面靜電層層自組裝過程的示意圖，它是以疏水性聚丙烯酸酯的人工晶狀體為例，在表面構(gòu)建(PAH/PSS)2/(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子p2抗體)多層膜，亦即組裝了兩個(gè)雙層(PAH/PSS)、一個(gè)雙層(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體)的本發(fā)明表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體的示意圖；圖2中以l'-6'表示制造過程的六個(gè)步驟，a表示軟性疏水性聚丙烯酸酯人工晶狀體，b-e表示各個(gè)步驟中所用到的試劑，+表示正電荷，-表示負(fù)電荷，其中，r表示二氧化碳等離子體處理后使人工晶狀體表面產(chǎn)生羧基而帶負(fù)電荷，2'表示帶正電的PAH組裝到人工晶狀體表面，3'表示帶負(fù)電的PSS組裝到人工晶狀體表面，4'表示在人工品狀體表面再次交替組裝PAH/PSS形成帶電荷密度高的底層以利于下一步抗體的組裝，5'表示帶止:電荷的多聚賴氨酸組裝到人工晶狀體表面，6'表示pf^7.4條件下帶負(fù)電荷的抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體組裝到人工晶狀體表面。b表示帶正電的多聚賴氨酸，c表示pH-7.4條件下帶負(fù)電的抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體，d表示帶正電的PAH，e表示帶負(fù)電的PSS。本實(shí)施例中的帶正電的強(qiáng)電解質(zhì)PAH可以換用不同濃度或換用其它帶正電的強(qiáng)電解質(zhì)，例如以表3中所示的帶正電的強(qiáng)電解質(zhì)PDDA，對(duì)表面預(yù)處理過的帶負(fù)電荷的人工晶狀體表面進(jìn)行組裝，以形成帶電密度高的底層的例子(表3中僅列出組裝該底層的有關(guān)參數(shù))；表3中的兩例均能制造出本發(fā)明的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體。本實(shí)施例中的帶正電的強(qiáng)電解質(zhì)PAH也可以換用表3以外的其它帶正電的強(qiáng)電解質(zhì)以對(duì)經(jīng)預(yù)處理過的帶負(fù)電荷的人工晶狀體表面進(jìn)行組裝而形成帶電密度高的底層。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本發(fā)明還對(duì)上述各實(shí)施例中制得的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體作了以下的測定1)用石英晶體微天平的頻率變化跟蹤人工晶狀體表面(PAH/PSS)3/(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子(32抗體)3靜電自組裝過程，如圖3所示它是以實(shí)施例5為例，組裝三個(gè)雙層(PAH/PSS)，三個(gè)雙層(多聚賴氨酸/抗轉(zhuǎn)化生長因子|32抗體)，圖中的橫坐標(biāo)表示組裝層數(shù)、縱坐標(biāo)表示頻率變化，其中奇數(shù)層中l(wèi)、3、5層表示PAH，7，9，ll層表示多聚賴氨酸，偶數(shù)層中2、4、6層表示PSS，8、10、12層表示抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體。其結(jié)果顯示多層膜組裝的頻率變化隨著組裝層數(shù)的增加呈線性增加，而頻率變化與重量變化呈正比，從而證明了(PAH/PSS)3/(多聚賴氨酸航轉(zhuǎn)化生長因子|32抗體)3多層膜的成功構(gòu)建，也就是用實(shí)施例5的步驟能制得本發(fā)明的人工晶狀體。2)以體外巨噬細(xì)胞粘附試驗(yàn)觀察本實(shí)施例表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體對(duì)巨噬細(xì)胞粘附行為的影響。用實(shí)施例l制得的人工晶狀體和未修飾的人工晶狀體均用環(huán)氧乙垸熏蒸的方法消毒后，將其平放在24孔培養(yǎng)板中，將巨噬細(xì)胞以1.0xl0"mL的密度接種于每個(gè)人工晶狀體表面，每孔30pL進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。分為兩組，每組三個(gè)人工晶狀體，一組為未修飾的人工晶狀體，另一組為多層膜修飾的人工晶狀體。培養(yǎng)24小時(shí)后用倒置相差顯微鏡對(duì)兩組人工晶狀體表面粘附的巨噬細(xì)胞進(jìn)行比較。其結(jié)果如圖4所示，其中圖4(a)為未修飾的人工晶狀體，圖4(b)為本實(shí)施例的人工晶狀體，前者表面粘附的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯少于后者，亦即本實(shí)施例的人工晶狀體大大減少了炎性細(xì)胞的粘附，提高了生物相容性。3)以體外晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)觀察表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子P2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞行為的影響。取實(shí)施例2制得的人工晶狀體和未修飾的人工晶狀體，且均用環(huán)氧乙烷熏蒸的方法消毒后，將其平放在24孔培養(yǎng)板中，將晶狀體上皮細(xì)胞以6.0xlO"mL的密度接種于每個(gè)人工晶狀體表面，每孔3(^L進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。分為兩組，每組三個(gè)人工晶狀體，一組為未修飾的人工晶狀體，另一組為本實(shí)施例中的人工晶狀體，兩組均在培養(yǎng)板中加入10ng/mL轉(zhuǎn)化生長因子p2，于24小時(shí)后用倒置相差顯微鏡觀察晶狀體上皮細(xì)胞。未修飾人工晶狀體表面的晶狀體上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長因子卩2的誘導(dǎo)下發(fā)生細(xì)胞間隙增加，移行明顯，變?yōu)槊黠@的長梭形，呈現(xiàn)向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢，如圖5(c)所示；本實(shí)施例的人工晶狀體正常培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞透亮，胞質(zhì)豐富，大多維持多角形的正常形態(tài)，未表現(xiàn)出纖維化的趨勢，移行不明顯，如圖5(d)所示；從上述上皮細(xì)胞說明，本實(shí)施例人工晶狀體能夠明顯抑制轉(zhuǎn)化生長因子(32所引起的上皮-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞移行等有害行為，維持晶狀體上皮細(xì)胞的正常形態(tài)和行為，從而抑制人工晶狀體植入后的囊膜皺縮，后發(fā)性白內(nèi)障等并發(fā)癥，提高術(shù)后遠(yuǎn)期視力。上述實(shí)施例中所使用的抗轉(zhuǎn)化生長因子|32抗體從英國的劍橋抗體技術(shù)公司購得。上述實(shí)施例中所用的其他試劑均可從國內(nèi)外化學(xué)試劑公司購得。離體巨噬細(xì)胞粘附試驗(yàn)中所用細(xì)胞為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，從6-8周齡的BALB/c小鼠腹腔提取，離體晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)中所用細(xì)胞為人晶狀體上皮細(xì)胞系HLEB-3，從日本購得。權(quán)利要求1.一種表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子β2抗體膜的人工晶狀體，其特征是在人工晶狀體光學(xué)部和袢的表面上帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子β2抗體膜。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體，其特征是:所說的人工晶狀體的材料是聚甲基丙烯酸甲酯、或硅凝膠、或軟性疏水性聚丙烯酸酯。3、一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體的制造方法，它包括以下的步驟1)將人工晶狀體清洗并干燥，再通過表面預(yù)處理方法使該人工晶狀體表面荷以正電或負(fù)電；2)將上述表面荷電的人工晶狀體浸入與其表面電荷相反的濃度為O.Ol-lOOOmg/mL的聚電解質(zhì)的水溶液中，吸附1-120分鐘，然后以去離子水漂洗并氮?dú)獯蹈桑辉賹⒃撊斯ぞ铙w浸入與此前聚電解質(zhì)所帶電荷相反的濃度為0.01-1000pg/mL的抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體的磷酸鹽緩沖溶液中，該磷酸鹽緩沖溶液為0.01-10mol/L、pH值為4-10，吸附1-120分鐘，然后用磷酸鹽緩沖溶液漂洗，氮?dú)獯蹈桑?)重復(fù)上述交替組裝步驟至少一次，即制得表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體；此后在室溫下真空干燥、密封包裝即可。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子|32抗體膜的人工晶狀體的制造方法，其特征是所說的使人工晶狀體表面荷以正電或負(fù)電的表面預(yù)處理方法是利用等離子體表面處理，改變通入的氣體種類在人工晶狀體表面引入功能基團(tuán)，然后改變pH值使表面離子化而帶上電荷。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體的制造方法，其特征是所說的使人工晶狀體表面荷以正電的表面預(yù)處理方法是直接吸附帶正電荷的聚乙烯基亞胺使表面帶正電荷。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體的制造方法，其特征是所說的使人工晶狀體表面荷以負(fù)電的表面預(yù)處理方法是將聚丙烯酸酯類人工晶狀體用堿溶液進(jìn)行表面水解，表面產(chǎn)生大量羧基而引入負(fù)電荷。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子P2抗體膜的人工晶狀體的制造方法，其特征是所說的聚電解質(zhì)是天然聚電解質(zhì)或無細(xì)胞毒性的聚電解質(zhì)，它包括帶正電荷的聚電解質(zhì)聚烯丙基胺鹽酸鹽、殼聚糖、多聚賴氨酸、明膠，以及帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)聚苯乙烯磺酸鈉、海藻酸鈉、肝素、透明質(zhì)酸鈉。8、根據(jù)權(quán)利要求3或4或5或6或7所述的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子卩2抗體膜的人工晶狀體的制造方法，其特征是它在人工晶狀體表面荷以正電或負(fù)電之后和浸入與其表面電荷相反的濃度為0.01-1000mg/mL聚電解質(zhì)的水溶液之前，還增加一道能提高該人工晶狀體表面電荷密度以增強(qiáng)后續(xù)的抗體的靜電層層自組裝吸附能力的步驟，該步驟是先將表面荷以正電或負(fù)電的人工晶狀體交替浸入兩種電荷性質(zhì)相反的濃度均為0.01-1000mg/mL的強(qiáng)聚電解質(zhì)水溶液中，吸附時(shí)間均為1-120分鐘，吸附完成后均需用去離子水漂洗，氮?dú)獯蹈?，且交替重?fù)該步驟的次數(shù)至少一次；其中帶正電荷的強(qiáng)聚電解質(zhì)選用聚烯丙基胺鹽酸鹽，或聚二甲基二烯丙基氯化銨；帶負(fù)電荷的強(qiáng)聚電解質(zhì)選用聚苯乙烯磺酸鈉。全文摘要一種能抑制白內(nèi)障術(shù)后并發(fā)的后發(fā)性白內(nèi)障的表面帶有抗轉(zhuǎn)化生長因子β2抗體膜的人工晶狀體及其制造方法。其制法將人工晶狀體清洗、干燥、經(jīng)表面預(yù)處理使其荷以正電或負(fù)電；然后浸入與其表面電荷相反的聚電解質(zhì)的水溶液中吸附、以去離子水漂洗并氮?dú)獯蹈?；再將它浸入與此前聚電解質(zhì)所帶電荷相反的抗轉(zhuǎn)化生長因子β2抗體的pH值為4-10磷酸鹽緩沖溶液中吸附，最后用磷酸鹽緩沖溶液漂洗、氮?dú)獯蹈?，并重?fù)上述的交替組裝步驟。本發(fā)明人工晶狀體具有靶向抑制晶狀體上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和囊膜皺縮，從而阻斷后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生，且生物相容性好；本發(fā)明制法科學(xué)、簡單，且能確?？罐D(zhuǎn)化生長因子β2抗體在干態(tài)下的活性和在醫(yī)用移植中的安全可靠性。文檔編號(hào)A61L27/40GK101269240SQ20081006151公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2008年4月30日優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日發(fā)明者克姚,瑤王申請(qǐng)人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院