專利名稱：乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種新型的乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染患者的主流治療方案是抗病毒長(zhǎng)期治療。HBV是一種突變率極高的病毒，自然突變率101°-11點(diǎn)突變/天，在長(zhǎng)期藥物治療特別是核苷類似物藥物如拉米夫定等選擇壓力下，HBV耐藥突變發(fā)生頻率高，臨床耐藥突變成為影響慢性乙肝治療效果的主要因素。拉米夫定是治療慢性乙肝最常用的核苷類似物藥物，但研究發(fā)現(xiàn)隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)患者發(fā)生病毒耐藥變異的比例增高，第1、2、3、4年分別為14%、38%、49%和66%，從而限 制其長(zhǎng)期應(yīng)用。部分病例在發(fā)生病毒耐藥變異后會(huì)出現(xiàn)病情加重，少數(shù)甚至發(fā)生肝功能失代償。因此用拉米夫定治療慢性HBV感染患者，要用多長(zhǎng)療程，何時(shí)發(fā)生耐藥、需要停換藥物，這是臨床醫(yī)生考慮的難點(diǎn)。替比夫定和拉米夫定的耐藥位點(diǎn)相同，95%以上對(duì)拉米夫定和替比夫定的耐藥突變都發(fā)生在rtL180M和rtM204V/I位點(diǎn)，，一小部分病人的耐藥突變發(fā)生在rtA181T/V位點(diǎn)，rtA181T/V位點(diǎn)與阿德福韋有交叉耐藥。阿德福韋酯是治療慢性乙肝最常見的核酸類似物藥物，其治療乙型肝炎病毒e抗原(HbeAg)陽(yáng)性患者的第1、2、3年耐藥發(fā)生率分別為0%、1. 6%和3. 1% ;治療HBeAg陰性患者的第1、2、3年耐藥發(fā)生率分別為0%、3. 0%和5. 9%-11%。雖然總的耐藥發(fā)生率較拉米夫定降低不少，但其耐藥發(fā)生后造成的危害同樣非常嚴(yán)重。目前已證實(shí)阿德福韋耐藥相關(guān)的變異主要包括rtA181V/T和rtN236T。
拉米夫定耐藥患者如加用阿德福韋治療，可降低對(duì)阿德福韋的耐藥率。因此，對(duì)拉米夫定耐藥患者，目前傾向于采用拉米夫定和阿德福韋聯(lián)合治療。值得注意的是，拉米夫定和阿德福韋聯(lián)合治療有可能選擇出對(duì)拉米夫定和阿德福韋同時(shí)耐藥的HBV毒株。拉米夫定耐藥(rtM2041)的患者換用阿德福韋治療，在出現(xiàn)阿德福韋耐藥(rtN236T )后加用拉米夫定，雖然出現(xiàn)了 HBV DNA的下降，但是同時(shí)出現(xiàn)了拉米夫定和阿德福韋聯(lián)合耐藥株(rtL180M+rtM204V+rtA181V)o1989年由Saiki等提出了反向斑點(diǎn)雜交(reverse dot blot, RDB)技術(shù),該技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一個(gè)實(shí)用性的改進(jìn)。Saiki及其同事在檢測(cè)HLA時(shí)提出了一個(gè)有效的改進(jìn)，該方法是將靶基因在PCR過程用放射性元素標(biāo)記，然后與尼龍膜雜交，從而檢測(cè)靶基因的突變情況。這一方法可將多個(gè)靶基因在同一條件下進(jìn)行檢測(cè)從而大大提高了檢測(cè)的效率。隨后，其它科學(xué)家證實(shí)了該方法可以區(qū)分單個(gè)堿基的突變，利用共價(jià)鍵的探針固定方法代替紫外交聯(lián)以及使用非放射性的生物素標(biāo)記引物的方法，RDB技術(shù)的穩(wěn)定性有了明顯的提高。目前Inogenetics的LiPA系列產(chǎn)品(通過CE認(rèn)證)均是基于上述的原理。從技術(shù)原理來(lái)說，RDB在本質(zhì)上也是DNA芯片(一般是中密度芯片)的一種，但它不同于一般所說的玻璃DNA芯片，其信號(hào)特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便易行，技術(shù)要求低，儀器設(shè)備投入小，檢測(cè)結(jié)果用肉眼就可直接判斷，而無(wú)需購(gòu)買昂貴的激光掃描儀，更符合中國(guó)目前的國(guó)情也更利于在基層醫(yī)院推廣。目前我國(guó)還沒有經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)正式批準(zhǔn)的能檢測(cè)常用藥物耐藥基因突變的產(chǎn)品。這種供求的矛盾在乙型肝炎高發(fā)的發(fā)展中國(guó)家尤為突出，一方面不明確的治療手段在長(zhǎng)期治療過程中給患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，另一方面也使得乙型肝炎的控制變得越來(lái)越難。所以，臨床迫切需要一種檢測(cè)HBV耐多藥突變基因型的手段，以便在指導(dǎo)合理用藥的同時(shí)對(duì)病程進(jìn)行預(yù)測(cè)，不斷提高診療的有效性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片，包括尼龍膜，所述尼龍膜上固定有探針，所述探針序列如下所示探針180L :NH2-5' -GTTTCTCYTGGCTCAGTT-3，；探針180M :NH2-5' -GTTTCTCATGGCTCAGTT-3，；探針204M :NH2-5' -GCTTTCAGTTATATGGATGATG-3’ ；探針204V :NH2-5' -GCTTTCAGTTATGTTGATGAT-3’ ；探針2041 :NH2-5' -GCTTTCAGTTATATTGATGATGT-3’ ；探針181A :NH2-5' -TGGCTCAGTTTACTAGTGC-3，；探針181V :NH2-5' -TGGTTCAGTTTACTAGTGC-3，；探針181T :NH2-5' -TGACTCAGTTTACTAGTGCC-3’ ；探針236N-1 :NH2-5' -TGGGTATACATTTRAACCCT-3，；探針236N-2 :NH2-5' -TGGGTATACATTTRAATCCT-3’探針236T :NH2-5' -GGTATACATTTRACCCCT-3，；探針CC :NH2-5，-CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-Biotin 3，;所述各探針5’端進(jìn)行了氨基標(biāo)記，所述探針CC的3’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)試劑盒，包括權(quán)利要求I所述的乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片，還包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括擴(kuò)增乙型肝炎病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示上游引物Fl :5' -GCAARATTCCTATGGGAGTG-3'；下游引物Rl :5' -CAACTYCCAATTACATATCC-3’ ；所述下游引物Rl的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。優(yōu)選的，上述試劑盒的探針CC的3’端進(jìn)行地高辛標(biāo)記，所述下游引物Rl的5’端
進(jìn)行地高辛標(biāo)記。優(yōu)選的，上述試劑盒的PCR反應(yīng)液還包括純水、10XPCR buffer,25mM MgCl2,20mM dNTP、Taq 酶、UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP。優(yōu)選的，上述試劑盒還包括雜交液，所述雜交液包括A液、B液、C液、D液、E液、F液。本發(fā)明的又一技術(shù)方案為提供一種乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)方法，該方法包括下述具體步驟a、將權(quán)利要求I所示的氨基標(biāo)記的探針依次固定在尼龍膜上，制成檢測(cè)膜條；
b、使用引物，進(jìn)行HBV DNA擴(kuò)增，所述引物為上游引物Fl 5' -GCAARATTCCTATGGGAGTG-3';下游引物 Rl :5' -CAACTYCCAATTACATATCC-3 ’，所述下游引物Rl的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；C、將擴(kuò)增產(chǎn)物與檢測(cè)膜條雜交，以顯色液顯色。本發(fā)明的有益效果為利用PCR-RDB方法，在具備了 PCR高靈敏度高特異性等優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV基因型的高通量多通道分析，有助于臨床病情評(píng)估，治療藥物的選擇和預(yù)后判斷。本發(fā)明具有很好的檢出率、特異性和靈敏度。特別是對(duì)HBV敏感野生菌株和耐藥突變菌株混合感染的檢測(cè)靈敏而準(zhǔn)確，更有利于慢性HBV感染抗病毒治療過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)控。且能夠在一次實(shí)驗(yàn)中既有效檢測(cè)HBV野生菌株，又檢測(cè)其拉米夫定和阿德福韋酯兩種耐藥突變，對(duì)于慢性HBV感染的臨床診療非常適用。


圖I :膜條探針排列順序圖；圖2 :膜條雜交結(jié)果顯色示意圖；圖3 :膜條雜交結(jié)果顯色示意圖；圖4 :膜條雜交結(jié)果顯色示意圖；圖5 :膜條雜交結(jié)果顯色示意圖；圖6 :本發(fā)明實(shí)施例2的PCR擴(kuò)增條件示意圖。
具體實(shí)施例方式為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說明。本發(fā)明是將高靈敏度的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)和反向點(diǎn)雜交技術(shù)相結(jié)合的基因及基因突變檢測(cè)技術(shù)。是將特異的探針分別固定到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，再將經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物(在PCR引物5’端預(yù)先進(jìn)行生物素標(biāo)記，使擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)標(biāo)記有生物素)與之雜交，這樣待檢樣本就會(huì)與具有同源序列的探針結(jié)合，經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的DNA樣本，由于待測(cè)的DNA樣本具有生物素類的標(biāo)記物，結(jié)合了待測(cè)DNA的探針點(diǎn)上就帶有生物素類的標(biāo)記物，再經(jīng)相應(yīng)的顯色反應(yīng)就能顯出雜交信號(hào)。生物素(Biotin):本發(fā)明生物素標(biāo)記，優(yōu)選地高辛標(biāo)記。以尼龍膜為載體的DNA芯片技術(shù)，采用的是微量點(diǎn)樣DNA微陣列技術(shù)。其主要的基本原理如下DNA探針為含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端帶有氨基標(biāo)記。經(jīng)活化處理的尼龍膜帶有負(fù)電荷基團(tuán)，可以與氨基形成共價(jià)結(jié)合。利用這種方法可將DNA探針按一定的排列規(guī)律永久的固定在尼龍膜的表面。其主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，技術(shù)要求低，并且探針不受探針分子大小種類的限制，能根據(jù)使用者的要求簡(jiǎn)便地制出符合目的的芯片。在此基礎(chǔ)上結(jié)合PCR技術(shù)對(duì)微量待測(cè)樣品進(jìn)行大量快速擴(kuò)增，擴(kuò)增后含有相應(yīng)標(biāo)記物的待測(cè)樣品與芯片上的探針進(jìn)行特異性雜交，此后對(duì)雜交信號(hào)強(qiáng)弱和有無(wú)進(jìn)行分析，即可判斷樣品中靶分子的數(shù)量和性質(zhì)。實(shí)施例I本發(fā)明試劑盒的組成一、膜條生產(chǎn)工藝
將尼龍膜經(jīng)EDC. HCl (1_ (3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)預(yù)處理30分鐘后激活表面羧基；同時(shí)，將5’端帶有氨基標(biāo)記的探針用緩沖液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛?，按陣列順序點(diǎn)加于尼龍膜相應(yīng)位置上，氨基與活化的羧基發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定的“-C0-NH-”共價(jià)鍵，從而將探針固定在尼龍膜表面，最后用0. IN的NaOH處理尼龍膜，封閉未結(jié)合探針的表面羧基，膜條制作完成，具體流程如下I、將膜條裁成適當(dāng)大小，用激光打印機(jī)打上2X6的格子，每格大小為4. 5 X 5. Omm ;2、配探針稀釋液(0. 5mol/L NaHC03, pH8. 4)；
3、將所有12條探針分別用探針稀釋液稀釋至5 u mol/L ； 4、配32%的EDC溶液等比例混合EDC和探針稀釋液；5、用八通道連續(xù)移液器取0. 6 y L稀釋好的探針點(diǎn)于尼龍膜相應(yīng)的格子上膜條自然晾干30min ；6、配制 0. lmol/L NaOH, 二次泡膜 5 分鐘；7、純水洗膜3次；8、膜條烘干 30min ；9、二次裁剪備用。二、請(qǐng)參閱圖1，圖I為膜條點(diǎn)陣基本尺寸，膜條探針排列順序(單位毫米)，每格大小為4. 5X5. Omm,所述探針的名稱及序列如表I。表I
權(quán)利要求
1.こ型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片，其特征在于，包括尼龍膜，所述尼龍膜上固定有探針，所述探針序列如下所示探針 180L :NH2-5’ -GTTTCTCYTGGCTCAGTT-3’ ;探針 180M :NH2-5’ -GTTTCTCATGGCTCAGTT-3’ ;探針 204M :NH2-5’ -GCTTTCAGTTATATGGATGATG-3’ ;探針 204V :NH2-5’ -GCTTTCAGTTATGTTGATGAT-3’ ;探針 2041 :NH2-5’ -GCTTTCAGTTATATTGATGATGT-3’ ;探針 18IA :NH2-5’ -TGGCTCAGTTTACTAGTGC-3’ ; 探針 18IV :NH2-5’ -TGGTTCAGTTTACTAGTGC-3’ ;探針 18IT :NH2-5’ -TGACTCAGTTTACTAGTGCC-3’ ;探針 236N-1 :NH2-5’ -TGGGTATACATTTRAACCCT-3’ ;探針 236N-2 :NH2-5’ -TGGGTATACATTTRAATCCT-3’探針 236T :NH2-5’ -GGTATACATTTRACCCCT-3’ ;探針 CC:NH2-5’ -CTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-Biotin-3’ ; 所述各探針5’端進(jìn)行了氨基標(biāo)記，所述探針CC的3’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
2.こ型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求I所述的こ型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片，還包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括擴(kuò)增こ型肝炎病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示上游引物 Fl :5’-GCAARATTCCTATGGGAGTG-3’ ； 下游引物 Rl :5，-CAACTYCCAATTACATATCC-3，； 所述下游引物Rl的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求2所述的こ型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征在干，所述探針CC的3’端進(jìn)行地高辛標(biāo)記，所述下游引物Rl的5’端進(jìn)行地高辛標(biāo)記。
4.如權(quán)利要求2所述的こ型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR 反應(yīng)液還包括純水、10XPCR buffer、20-30mMMgCl2，15-25mM dNTP、Taq 酶、UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP。
5.如權(quán)利要求2所述的こ型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括雜交液，所述雜交液包括A液、B液、C液、D液、E液、F液。
6.こ型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括下述具體步驟 a、將權(quán)利要求I所示的氨基標(biāo)記的探針依次固定在尼龍膜上，制成檢測(cè)膜條； b、使用引物，進(jìn)行HBVDNA擴(kuò)增，所述引物為上游引物Fl 5’ -GCAARATTCCTATGGGAGTG-3’ ；下游引物 Rl : 5’ -CAACTYCCAATTACATATCC-3，，所述下游引物Rl的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記； C、將擴(kuò)增產(chǎn)物與檢測(cè)膜條雜交，以顯色液顯色。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種新型的乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片、試劑盒及方法。本發(fā)明技術(shù)方案為提供一種乙型肝炎病毒耐多藥基因突變檢測(cè)芯片、試劑盒及方法，包括檢測(cè)探針和擴(kuò)增引物等。本發(fā)明具有很好的檢出率、特異性和靈敏度。特別是對(duì)HBV敏感野生菌株和耐藥突變菌株混合感染的檢測(cè)靈敏而準(zhǔn)確，更有利于慢性HBV感染抗病毒治療過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)控。且能夠在一次實(shí)驗(yàn)中既有效檢測(cè)HBV野生菌株，又檢測(cè)其拉米夫定和阿德福韋酯兩種耐藥突變，對(duì)于慢性HBV感染的臨床診療非常適用。
文檔編號(hào)C40B40/06GK102732640SQ20121017585
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者周曉強(qiáng), 姚銘鋒, 林希瑾, 秦偉, 胡守旺, 謝佐福 申請(qǐng)人:泰普生物科學(xué)(中國(guó))有限公司