專(zhuān)利名稱(chēng)：確定對(duì)生物樣本成像的成像裝置的焦點(diǎn)位置的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及對(duì)生物樣本進(jìn)行成像，具體地講，涉及對(duì)生物樣本圖像的聚
焦o
背景技術(shù)：
對(duì)生物樣本表面拍攝多個(gè)圖像的自動(dòng)顯微鏡檢查系統(tǒng)通常需要成像系統(tǒng)針對(duì)每 個(gè)成像視場(chǎng)重新聚焦。重新聚焦是必須的，因?yàn)樵谟行У姆糯蟊堵氏?，這種系統(tǒng)所需的 聚焦精確度可以小到1微米，并且將樣本保持器的機(jī)械公差保持為該尺寸實(shí)際上是不可 能的。為了對(duì)靜止地停留在諸如題為 “Container for Holding Biologic Fluid forAnalysis” 的美國(guó)專(zhuān)利No.6,723,290中公開(kāi)的分析腔室內(nèi)的即使很小的生物樣本進(jìn)行完整地成像，必 須拍攝超過(guò)一百個(gè)單獨(dú)的圖像，并且必須在合理的時(shí)間內(nèi)執(zhí)行該操作，因此，必須盡可 能快地對(duì)每個(gè)圖像視場(chǎng)進(jìn)行重新聚焦。傳統(tǒng)的自動(dòng)聚焦技術(shù)通常使用圖像本身的特征來(lái)獲得適當(dāng)?shù)慕裹c(diǎn)，或者可以使 用獨(dú)立于圖像捕獲裝置的裝置(諸如干涉儀等)來(lái)測(cè)量并保持物鏡與被攝對(duì)象之間的設(shè)定 距離。在第一種情況下，通常需要使用圖像捕獲裝置花費(fèi)幾個(gè)圖像捕獲周期來(lái)計(jì)算最佳 的焦點(diǎn)位置。這種多次圖像處理是耗時(shí)的并且因此是不期望的。在第二種情況下，獨(dú)立 的裝置通常增加了成像系統(tǒng)的復(fù)雜度并且是相當(dāng)昂貴的。與之相比，本發(fā)明提供了一種 廉價(jià)的確保精度穩(wěn)定的快速聚焦的裝置，其可以用于各種成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)中，并且其僅依 賴(lài)于成像系統(tǒng)本身。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，提供一種用于對(duì)成像裝置進(jìn)行聚焦的方法和設(shè)備，該成像裝置適 于對(duì)生物樣本進(jìn)行成像，該樣本具有折射率。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種用于對(duì)成像裝置進(jìn)行聚焦的方法，該方法包括 以下步驟1)在生物樣本的視場(chǎng)內(nèi)布置小透鏡，該小透鏡具有高度并且具有折射率，該 折射率不同于樣本的折射率；2)其中成像裝置和樣本中的一個(gè)或兩個(gè)是可相對(duì)定位的， 以使得成像裝置的焦點(diǎn)位置可以沿小透鏡的高度而移動(dòng)；3)以一個(gè)或多個(gè)預(yù)定波長(zhǎng)的光 通過(guò)使用透光度來(lái)對(duì)包括多個(gè)小透鏡的樣本的至少一部分進(jìn)行成像；4)確定樣本對(duì)這些 波長(zhǎng)的光的平均光透射強(qiáng)度；5)確定每個(gè)小透鏡區(qū)域?qū)@些波長(zhǎng)的光的平均光透射強(qiáng) 度；以及6)使用樣本的平均光透射強(qiáng)度和小透鏡區(qū)域的平均光透射強(qiáng)度來(lái)確定成像裝置 的焦點(diǎn)位置。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于對(duì)生物樣本進(jìn)行成像的設(shè)備。該設(shè)備包 括腔室、多個(gè)小透鏡、視場(chǎng)照明器、析像器、定位器、以及可編程分析器。所述腔室形成于第一平板和第二平板之間，所述平板是透明的。所述腔室可用于靜止地保持樣本。 所述多個(gè)小透鏡置于腔室內(nèi)。每個(gè)小透鏡具有高度和折射率，該折射率不同于樣本的折 射率。視場(chǎng)照明器可用于選擇性地照射至少一個(gè)樣本視場(chǎng)。析像器可用于將穿過(guò)樣本視 場(chǎng)和小透鏡的光的圖像轉(zhuǎn)化為電子數(shù)據(jù)形式。定位器可用于選擇性地改變包含小透鏡的 腔室、視場(chǎng)照明器、以及析像器中的一個(gè)或多個(gè)的相對(duì)位置，以沿小透鏡的高度選擇性 地改變?cè)O(shè)備的焦點(diǎn)位置?？删幊谭治銎鬟m于與視場(chǎng)照明器和析像器相配合來(lái)以一個(gè)或多 個(gè)預(yù)定波長(zhǎng)的光通過(guò)使用透光度來(lái)至少對(duì)樣本視場(chǎng)和多個(gè)小透鏡進(jìn)行成像。該分析器還 適于1)確定樣本視場(chǎng)對(duì)這些波長(zhǎng)的光的典型光透射強(qiáng)度；2)確定小透鏡的至少一個(gè)區(qū) 域?qū)@些波長(zhǎng)的光的典型光透射強(qiáng)度；以及3)使用樣本視場(chǎng)的典型光透射強(qiáng)度和小透鏡 區(qū)域的典型光透射強(qiáng)度來(lái)確定設(shè)備的焦點(diǎn)位置。本發(fā)明的方法和設(shè)備相對(duì)于現(xiàn)有生物樣本成像和分析技術(shù)來(lái)說(shuō)呈現(xiàn)出許多優(yōu) 點(diǎn)。例如，本發(fā)明提供了廉價(jià)的確保精度穩(wěn)定的生物樣本的快速聚焦的裝置，其可以用 于各種成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)中，并且其僅依賴(lài)于成像系統(tǒng)本身。典型地，本發(fā)明還可以根據(jù)單 個(gè)圖像來(lái)確定成像系統(tǒng)是否完美曝光，如果不是，則本發(fā)明通常還可以確定要使樣本圖 像完美聚焦所需的精確的移動(dòng)量。本發(fā)明還提供了一種成像方法和設(shè)備，其對(duì)實(shí)際的曝 光或圖像光強(qiáng)度不敏感，從而提供了一種具有更強(qiáng)的魯棒性的方法和設(shè)備。根據(jù)以下所提供的詳細(xì)描述(包括附圖)，本發(fā)明的方法及其相關(guān)優(yōu)點(diǎn)將變得更 加顯而易見(jiàn)。


圖1是可以與本發(fā)明的方法一起使用的分析裝置的示意圖。圖2是分析腔室實(shí)施例的示意性平面圖。圖3是分析腔室的示意性截面圖。圖4是分析腔室實(shí)施例的示意性平面圖。圖5是置于圖4所示容器的腔室內(nèi)的生物流體樣本的示意性放大圖。圖6是小透鏡光透射圖案的圖解示圖。圖7是示出了小透鏡光透射圖案的分區(qū)的圖解示圖。圖8是提供了根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟的方框圖。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)在，參考圖1至圖5，本發(fā)明提供了一種用于對(duì)分析裝置進(jìn)行聚焦的方法和設(shè) 備，該裝置可用于對(duì)生物樣本進(jìn)行成像。下文將分析裝置稱(chēng)為“成像裝置”。本發(fā)明可 用于對(duì)成像裝置進(jìn)行聚焦，所述成像裝置可用于分析各種不同類(lèi)型的生物樣本，包括液 體樣本、組織樣本、涂片等。本發(fā)明對(duì)可用于分析液體生物樣本(例如，基本上未稀釋 的抗凝全血樣本)的成像裝置進(jìn)行聚焦尤其有用，但不限于此。在此使用的術(shù)語(yǔ)“基本 上未稀釋的”表示根本未被稀釋的樣本或者未被故意稀釋的樣本，但是為了進(jìn)行分析， 可以對(duì)樣本添加一些試劑，例如抗凝血?jiǎng)?、染色劑等。由于生物樣?諸如全血)的圖像屬性是非?？勺兊?，因此，沒(méi)有可用于能夠確 定成像裝置是否是焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的單個(gè)圖像的單獨(dú)的度量(metric)。為了克服該問(wèn)題，現(xiàn)有成像裝置通常利用迭代的聚焦處理，其需要多個(gè)圖像(至少兩個(gè)，通常更多)來(lái)確定相對(duì) 于樣本的最佳焦點(diǎn)位置；例如，該裝置將尋找提供最高對(duì)比度、最銳利邊緣等的聚焦深 度。與之相比，本發(fā)明可以根據(jù)單個(gè)圖像來(lái)確定成像系統(tǒng)是否完美曝光，如果不是，則 本發(fā)明通?？梢源_定要使樣本圖像完美聚焦所需的精確的移動(dòng)量。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述方法包括以下步驟1)相對(duì)于生物樣本11的視場(chǎng)定 位小透鏡10，其中成像裝置12和樣本11中的一個(gè)或多個(gè)是可相對(duì)定位的，以使得成像裝 置12的焦點(diǎn)位置可以沿小透鏡10的高度14而移動(dòng)；2)以一個(gè)或多個(gè)預(yù)定波長(zhǎng)的光通過(guò) 使用透光度來(lái)對(duì)生物樣本11的包含多個(gè)小透鏡10的至少一部分進(jìn)行成像；3)確定樣本 11對(duì)這些波長(zhǎng)的光的平均光透射強(qiáng)度；4)確定小透鏡10的區(qū)域?qū)@些波長(zhǎng)的光的平均光 透射強(qiáng)度；以及5)使用樣本11的平均光透射強(qiáng)度和小透鏡10的區(qū)域的平均光透射強(qiáng)度 來(lái)確定成像裝置12的焦點(diǎn)位置。小透鏡10具有高度14、折射率、規(guī)則形狀、以及特征光透射圖案。小透鏡10 的高度14平行于調(diào)節(jié)焦點(diǎn)位置所沿的軸，例如通常被稱(chēng)為成像裝置12的“Z”軸。小 透鏡10的折射率不同于樣本11的折射率。每個(gè)小透鏡10具有相同的規(guī)則形狀，該形狀 通常為對(duì)稱(chēng)的(例如，球狀的)。小透鏡10的特征光透射圖案為幾個(gè)因素的函數(shù)，這些因素包括小透鏡10的折射 率。小透鏡10用來(lái)使透過(guò)樣本11的光彎曲，遠(yuǎn)離圖像路徑，從而使得小透鏡10的至少 一些部分看起來(lái)比背景暗。透過(guò)小透鏡10的每個(gè)部分的光的相對(duì)強(qiáng)度(即，光透射強(qiáng) 度)還為小透鏡10的形狀和成像裝置12的焦點(diǎn)位置的函數(shù)。如果所有的小透鏡10均具 有規(guī)則的并且優(yōu)選地為對(duì)稱(chēng)的形狀，則光透射強(qiáng)度關(guān)于小透鏡10的幾何形狀的可變性則 可以基本消除，并且相對(duì)光透射強(qiáng)度和焦點(diǎn)位置之間的關(guān)系可用來(lái)確定成像裝置12的精 確的焦點(diǎn)位置。小透鏡10的特征光透射圖案在相同類(lèi)型的小透鏡10中是可重復(fù)并且一致的，并 且可以被描述為參考。光透射圖案可以通過(guò)使用一個(gè)或多個(gè)不同波長(zhǎng)的光來(lái)產(chǎn)生，只要 這些波長(zhǎng)的光不被小透鏡10明顯地吸收。光透射圖案可以按照通過(guò)小透鏡10的相對(duì)光透 射強(qiáng)度來(lái)描述，所述的相對(duì)光透射強(qiáng)度為沿小透鏡10的高度14的焦點(diǎn)位置的函數(shù)。術(shù) 語(yǔ)“相對(duì)”被用來(lái)描述小透鏡10的不同區(qū)域相對(duì)于彼此(例如，中心區(qū)域相對(duì)于外部區(qū) 域)的光透射強(qiáng)度、以及相對(duì)于與小透鏡10 —起布置的樣本11的平均光透射強(qiáng)度的光透 射強(qiáng)度。圖6和圖7示出了特征光透射圖案的圖示的一個(gè)示例。該圖示為所述圖案的一 個(gè)示例，但是本發(fā)明不限于此。所述圖案可以采取描述相對(duì)光透射曲線(xiàn)的數(shù)學(xué)表達(dá)式的 形式，或者可以以數(shù)據(jù)表的形式等。小透鏡10的可接受類(lèi)型的示例是球狀珠，其可以與樣本11密切地混合。如下 文所詳述，當(dāng)與使用薄分析腔室17布置的生物流體樣本11 (例如，基本未稀釋的抗凝全 血)混合時(shí)，由聚合物材料制成的球狀珠很好地起到小透鏡10的作用，其中，用于進(jìn)行 研究的光(investigating light)可以透過(guò)薄分析腔室17。這種球體可以由聚苯乙烯制成， 并且在商業(yè)上可以從 Thermo Scientific of Fremont, California, U.S.A.目錄編號(hào)為 4204A 獲得4微米(4 μ m)直徑的這種球體。小透鏡10不限于球形或者任意特定材料或大小， 只要可透過(guò)的光量足以用于進(jìn)行本發(fā)明的聚焦處理。成像裝置12包括物鏡18、腔室保持裝置20、樣本照明器22、析像器24、以及可編程分析器26。物鏡18和腔室保持裝置20中的一個(gè)或兩個(gè)是可朝向彼此移動(dòng)并且可 遠(yuǎn)離彼此移動(dòng)的，以改變相對(duì)焦點(diǎn)位置。樣本照明器22被定位成通過(guò)使一個(gè)或多個(gè)預(yù)定 波長(zhǎng)的光透過(guò)樣本11來(lái)照射樣本11。透過(guò)腔室17的光被析像器24捕獲并且被處理為圖 像。以容許基于基本單位來(lái)確定圖像內(nèi)捕獲的光透射強(qiáng)度的方式產(chǎn)生該圖像。術(shù)語(yǔ)“基 本單位”是指能夠分辨樣本11的圖像的增量單位；例如，“像素”通常被定義為在特 定成像系統(tǒng)內(nèi)能夠單獨(dú)處理的最小圖元。但是，本發(fā)明不限于使用任意特定的成像裝置 12。在可替換實(shí)施例中，成像裝置12可以包括與裝置12相關(guān)的旨在多次使用的腔室， 而不是通過(guò)腔室保持裝置位于成像裝置12內(nèi)的一次性的、獨(dú)立的腔室。圖1示出了可適用于與本發(fā)明的方法一起使用的生物樣本成像裝置12的示例， 該裝置12包括樣本照明器22、析像器24、以及可編程分析器26。樣本照明器22包括光 源，其選擇性地產(chǎn)生不被布置在靜止地保持樣本11以進(jìn)行測(cè)試的腔室17內(nèi)的樣本11或 小透鏡10明顯地吸收的一個(gè)或多個(gè)波長(zhǎng)的光。成像裝置12通常包括用于控制(例如， 放大、濾波等)光的光學(xué)器件。樣本照明器22產(chǎn)生透過(guò)樣本11的預(yù)定波長(zhǎng)(或者隨后 限于預(yù)定波長(zhǎng)的波長(zhǎng)光譜)的光。例如通過(guò)將光源定位在腔室17的一側(cè)、引導(dǎo)光通過(guò)腔 室17、然后使用析像器24捕獲光來(lái)測(cè)量小透鏡10和樣本11的光透射強(qiáng)度?？山邮艿?析像器24的示例是電耦合器件(CCD)類(lèi)型的圖像傳感器，其將穿過(guò)樣本11的光的圖像 轉(zhuǎn)換成為電子數(shù)據(jù)形式?；パa(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(“CMOS”)類(lèi)型的圖像傳感器是另 一種可以使用的圖像傳感器的示例。本發(fā)明不限于這些示例中的任意一個(gè)?？删幊谭治?器26包括中央處理單元(CPU)并且連接至樣本照明器22和析像器26。CPU適于(即， 被編程為)選擇性地執(zhí)行進(jìn)行本發(fā)明方法所必需的功能。應(yīng)當(dāng)注意，可以使用硬件、軟 件、固件或者其結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)可編程分析器26的功能。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠?qū)μ?理單元進(jìn)行編程以執(zhí)行在此所述的功能，而不需要進(jìn)行過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。題目為“Apparatus forAnalyzing Biologic Fluids"且于 2005 年 3 月 15 日發(fā)布的美國(guó)專(zhuān)利 No.6,866,823 公開(kāi)了 這種成像裝置12，該美國(guó)專(zhuān)利內(nèi)容以引文方式整體并入本文。可用于分析裝置內(nèi)的分析腔室17由彼此相互隔開(kāi)的第一平板28和第二平板30 限定。平板28、30均足夠透明，以允許預(yù)定波長(zhǎng)的光有足以對(duì)樣本11執(zhí)行包括如下所 述的聚焦方法的分析的光量通過(guò)。本發(fā)明的方法可以利用具有上述特征的各種不同類(lèi)型 的分析腔室，因此不限于任意特定類(lèi)型的分析腔室17。圖2和圖3示出了一個(gè)可接受的腔室17的示例，該腔室17包括第一平板28、 第二平板30、以及至少三個(gè)布置在平板28和平板30之間的隔離物32。隔離物32使平 板28、30彼此間隔開(kāi)。在平板之間延伸的隔離物32的尺寸在此被稱(chēng)為隔離物32的高 度34。隔離物32的高度34通常不精確地彼此相等(例如，存在制造公差)，但是處于 商業(yè)上可接受的用于類(lèi)似分析設(shè)備中的分隔裝置的公差內(nèi)。球狀珠是可接受隔離物32 的一個(gè)示例。這個(gè)可接受的分析腔室17的示例在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.2007/0243117、 2007/0087442、以及2008年4月2日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No.61/041,783和2008年 10月31日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No.61/110,341中詳細(xì)地進(jìn)行了描述，這些文獻(xiàn)在此 以引用方式整體并入本文。在一些實(shí)施例中，隔離物32和小透鏡10是同一個(gè)；例如，球狀珠具有分隔腔室 17的平板所能接受的大小，并且具有使其作為小透鏡10所能接受的光學(xué)屬性。在一些應(yīng)用中，將球狀珠既用作隔離物32又用作小透鏡10是有利的。由于在一些實(shí)施例中球狀 珠用作隔離物(例如，與內(nèi)表面接觸或緊鄰)，因此在球體與平板的任一內(nèi)表面之間布置 任意可觀(guān)量的樣本11的材料是不可能的。由于不存在任意可觀(guān)量的樣本11的材料，從 而減小或消除了樣本材料對(duì)球體的任意光透射分析的干擾的可能性。但是，隔離物32或 小透鏡10中的任意一個(gè)不必須用作另一個(gè)；例如，隔離物32可以獨(dú)立于小透鏡10并與 小透鏡10—起使用。另一個(gè)可接受的腔室17的示例布置在如圖4所示的一次性容器中。腔室17形成 在第一平板和第二平板之間。第一平板和第二平板都是透明的，以允許光穿過(guò)腔室17。 該腔室17的實(shí)施例在美國(guó)專(zhuān)利No.6,723,290中更詳?shù)剡M(jìn)行了描述，該專(zhuān)利以引用方式整 體并入本文。圖2至圖4所示的分析腔室17表示可接受的用于本發(fā)明方法的腔室。在兩個(gè)實(shí) 例中，腔室17的典型大小為保持約0.2至1.0 μ 1的樣本11，但是腔室17不限于任何特定 的體積容量，并且該容量可以適應(yīng)分析應(yīng)用而改變。這些腔室17可用于將樣本11靜止 地保持在腔室17內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“靜止”用來(lái)描述樣本11被滴落在腔室17內(nèi)以進(jìn)行分析， 并且在分析過(guò)程中該樣本11不會(huì)故意移動(dòng)。就血液樣本內(nèi)存在運(yùn)動(dòng)的程度來(lái)說(shuō)，血液樣 本的組成成分的布朗運(yùn)動(dòng)占主導(dǎo)，該運(yùn)動(dòng)不會(huì)破壞本發(fā)明的設(shè)備的使用。但是，本發(fā)明 的方法不限于這些特定的腔室17的實(shí)施例。示例以下是根據(jù)本發(fā)明方法的對(duì)成像裝置12進(jìn)行聚焦的說(shuō)明性示例。圖8提供了根 據(jù)本發(fā)明的方法方面的方框圖。但是，本發(fā)明不限于該示例。生物流體樣本11 (例如，基本上未稀釋的抗凝全血)被滴落在腔室17內(nèi)。多個(gè) 小透鏡10以使得他們與樣本11中的分析期間所需的最佳焦點(diǎn)的點(diǎn)保持固定距離的方式相 對(duì)于樣本11定位。小透鏡10的數(shù)量可以根據(jù)應(yīng)用而改變，但是應(yīng)該足夠，以使得在每 個(gè)視場(chǎng)中都具有足夠數(shù)量的小透鏡10來(lái)準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法(例如，小透鏡10的數(shù) 量大到足以使得可以計(jì)算出統(tǒng)計(jì)上可接受的平均光透射強(qiáng)度值，等等)。小透鏡10可以 任意地分布或者以一種圖案分布。如果小透鏡10布置在樣本11的焦平面內(nèi)(包括緊密 地置于樣本11本身內(nèi)，諸如在上述及圖2-5中所示的腔室17中的情況下)，則所述方法 變得容易。但是，所述方法不要求小透鏡10置于樣本的焦平面內(nèi)。小透鏡10的焦平面 與樣本11的焦平面之間可以有偏移；例如，小透鏡10與樣本11的焦平面可以不同，其 中每個(gè)焦平面使用不同波長(zhǎng)的光來(lái)照射。如果小透鏡10與感興趣的樣本部分物理上不是 共平面的，則兩個(gè)焦平面之間也可以有偏移。在焦平面位置偏移的情況下，一旦確定了 小透鏡10的焦點(diǎn)調(diào)節(jié)距離，則將其與小透鏡10和樣本11之間的焦平面偏移(其為已知 或者是可確定的)相加，以獲得適當(dāng)?shù)慕裹c(diǎn)位置。以不被小透鏡10或樣本11明顯吸收的一個(gè)或多個(gè)波長(zhǎng)的光照射小透鏡10和樣 本11。作為示例，在約620nm或更大的波長(zhǎng)產(chǎn)生的光將不會(huì)被基本上未稀釋的全血樣本 11或由聚苯乙烯組成的4微米(4 μ m)的球面小透鏡10明顯地吸收?？梢允褂闷渌ㄩL(zhǎng) 的光來(lái)進(jìn)行可替換的分析，并且本發(fā)明不限于使用任意特定波長(zhǎng)的光。使用諸如CCD或 CMOS攝像機(jī)之類(lèi)的數(shù)字析像器24來(lái)捕獲光透射強(qiáng)度的圖像?；诨締挝粊?lái)為被成像 樣本11確定樣本11的光透射強(qiáng)度，并且確定樣本11的平均光透射強(qiáng)度值。盡管不需要為樣本11的整個(gè)面積確定光透射強(qiáng)度值，但是這是優(yōu)選的，因?yàn)檫@么做通常會(huì)提供對(duì)樣 本的更全面的分析并且伴隨著準(zhǔn)確性的提高。使用傳統(tǒng)的圖像處理技術(shù)來(lái)分析數(shù)字圖像 以定位小透鏡10，小透鏡10在圖像內(nèi)呈現(xiàn)為暗物體(darkobject)。根據(jù)成像裝置12的焦 平面最初被定位的位置，小透鏡10的中心相對(duì)于小透鏡10的其他部分可能看起來(lái)較亮。 圖5示出了呈現(xiàn)圓形的球面小透鏡10，其中心區(qū)域顏色較亮。為了便于進(jìn)行圖像分析，可以對(duì)圖像進(jìn)行分割，并且然后，僅選擇其相對(duì)平均 光透射值低于預(yù)定截?cái)嘀?例如，0.90)的那些目標(biāo)進(jìn)行分析。例如，圖7示出了被分 割以限定具有不同區(qū)域特征的不同強(qiáng)度象限(例如，非峰值的低(off-peak low)、目標(biāo)范 圍、非峰值的高(off-peakhigh))的特征光透射強(qiáng)度圖案。也可以使用可替換的和/或另 外的截?cái)鄿?zhǔn)則(cutoffcriteria)來(lái)減小所需的分析量；例如，與小透鏡10的面積大致對(duì)應(yīng) 的面積?？梢酝ㄟ^(guò)試錯(cuò)法(trial and error)來(lái)選擇這些截?cái)嘀?，以增大分析的?zhǔn)確性和速 度。然后，進(jìn)一步對(duì)所選目標(biāo)進(jìn)行集中分析，以確定目標(biāo)上特定點(diǎn)的光透射強(qiáng)度值，所 述目標(biāo)為小透鏡10。如上所示，光透射強(qiáng)度是在圖像內(nèi)基于基本單元(例如，每個(gè)像素) 確定的。因此，小透鏡10的圖像由某一數(shù)量的像素表示，這取決于小透鏡10的大小以 及成像裝置12的放大因子(例如，使用每像素0.5微米的放大倍率成像的直徑為4微米 (4ym)的球面小透鏡10將具有約由8個(gè)像素表示的直徑)。對(duì)每個(gè)點(diǎn)處的光透射強(qiáng)度值 取平均。小透鏡10的物理一致性以及對(duì)光透射強(qiáng)度值取平均增大了光透射強(qiáng)度值的可靠 性?，F(xiàn)有的成像裝置12的焦點(diǎn)位置可以使用小透鏡10的預(yù)定的特征光透射圖案、小 透鏡10的圖像內(nèi)至少一個(gè)區(qū)域的平均光透射強(qiáng)度值、以及樣本11的平均光透射強(qiáng)度值來(lái)確定。小透鏡10的預(yù)定的特征光透射強(qiáng)度圖案對(duì)于給定類(lèi)型的小透鏡10而言是可重復(fù) 并且一致的。存儲(chǔ)在成像裝置12內(nèi)的圖案是小透鏡10的不同區(qū)域相互之間以及相對(duì)于 樣本11的平均光透射強(qiáng)度的相對(duì)光透射強(qiáng)度值的函數(shù)。例如，圖6和圖7所示的圖案是 4微米(4μιη)直徑小透鏡的圖案的圖示。每幅圖的縱軸表示小透鏡10內(nèi)感興趣區(qū)域相 對(duì)于樣本11的平均光透射強(qiáng)度的平均強(qiáng)度。每幅圖的橫軸表示相對(duì)焦點(diǎn)位置。圖6和圖7所示的特征光透射強(qiáng)度圖案包括表示具有高強(qiáng)度值的小透鏡區(qū)域的平 均值的第一數(shù)據(jù)線(xiàn)36、表示具有低強(qiáng)度值的小透鏡區(qū)域的平均值的第二數(shù)據(jù)線(xiàn)38、表示 小透鏡10的所有區(qū)域的平均強(qiáng)度值的第三數(shù)據(jù)線(xiàn)40、表示與小透鏡10相鄰但是處于小透 鏡10外部的區(qū)域的平均值的第四數(shù)據(jù)線(xiàn)42、以及表示小透鏡的中心區(qū)域的平均強(qiáng)度值的 第五數(shù)據(jù)線(xiàn)44，所有的線(xiàn)都被表示為焦點(diǎn)位置的函數(shù)。這些數(shù)據(jù)線(xiàn)彼此之間相對(duì)的位置 是小透鏡的可重復(fù)、一致的特征。由于這些數(shù)據(jù)線(xiàn)是作為相對(duì)光透射強(qiáng)度(例如，相對(duì) 于彼此以及相對(duì)于樣本11的平均強(qiáng)度)的函數(shù)而創(chuàng)建的，因此本發(fā)明的方法對(duì)實(shí)際曝光 或者圖像光強(qiáng)度不敏感，并且只要能夠獲得足夠信號(hào)來(lái)進(jìn)行分析即可。特別注意的是小透鏡中心處的光透射強(qiáng)度值，其循環(huán)往復(fù)地從最大變?yōu)樽钚。?即，“S”型曲線(xiàn)。對(duì)于球面小透鏡10的中心區(qū)域來(lái)說(shuō)，最大到最小的強(qiáng)度值發(fā)生在對(duì) 應(yīng)于兩個(gè)小透鏡直徑的焦點(diǎn)距離內(nèi)；例如，對(duì)于4微米(4 μ m)直徑的小透鏡來(lái)說(shuō)，從波 峰到波谷的強(qiáng)度范圍約為8微米(8 μ m)。該曲線(xiàn)是高度可再現(xiàn)的，并且該曲線(xiàn)中點(diǎn)的相 對(duì)光透射強(qiáng)度被用作最佳焦點(diǎn)位置的目標(biāo)值。對(duì)于中心區(qū)域來(lái)說(shuō)，“S”型曲線(xiàn)的中點(diǎn)被用作目標(biāo)值，這是因?yàn)槠涮幱谇€(xiàn)的相對(duì)線(xiàn)性、斜率恒定的部分，這提供了期望的焦點(diǎn) 位置靈敏度。為小透鏡10的中心區(qū)域收集的數(shù)據(jù)還比其他區(qū)域具有更高的可靠度。在 圖6和圖7所示的圖案中，中心區(qū)域的“S”型曲線(xiàn)的中點(diǎn)與Y軸上約0.75的值對(duì)準(zhǔn)； 即，相對(duì)而言，中心區(qū)域的平均光透射強(qiáng)度值約為樣本11的平均光透射強(qiáng)度值的四分之 三(.75)的位置。與“S”曲線(xiàn)的中點(diǎn)相關(guān)(即，在.75的交點(diǎn)處)的焦點(diǎn)位置值表示已 經(jīng)確定了的提供成像裝置12相對(duì)于小透鏡10的期望焦點(diǎn)的目標(biāo)焦點(diǎn)位置。對(duì)成像裝置12的現(xiàn)有焦點(diǎn)位置的確定是通過(guò)以下方式進(jìn)行的，S卩，在特征圖案 內(nèi)的曲線(xiàn)(例如，中心區(qū)域曲線(xiàn)等)上對(duì)相對(duì)于樣本11的平均強(qiáng)度值的小透鏡10內(nèi)的至 少一個(gè)區(qū)域的平均強(qiáng)度值(即，Y軸的值)進(jìn)行定位并且找到對(duì)應(yīng)的現(xiàn)有焦點(diǎn)位置的值。 現(xiàn)有焦點(diǎn)位置與目標(biāo)焦點(diǎn)位置(即，最佳焦點(diǎn)的位置)的偏移表示使成像裝置12處于最 佳焦點(diǎn)位置所必需的調(diào)節(jié)。在小透鏡特征圖案的某些部分，曲線(xiàn)可以在多于一個(gè)點(diǎn)處與從y軸延伸的水平 線(xiàn)相交。在這種情況下，可能有多于一個(gè)現(xiàn)有焦點(diǎn)位置與相對(duì)強(qiáng)度值相關(guān)。為了確定正 確的現(xiàn)有焦點(diǎn)位置，確定來(lái)自特征圖案的另一數(shù)據(jù)點(diǎn)。該數(shù)據(jù)可以從現(xiàn)有圖像或隨后的 圖像中采集。例如，來(lái)自小透鏡10的高值區(qū)域(high value region)的平均強(qiáng)度值除以平 均樣本強(qiáng)度值(即，y軸值)可以被標(biāo)繪在圖案內(nèi)的高值曲線(xiàn)(highvaluecurve)上。一旦 確定了高值曲線(xiàn)上的位置，則可以根據(jù)χ軸來(lái)確定相關(guān)的現(xiàn)有焦點(diǎn)位置值。從該高值曲 線(xiàn)確定的現(xiàn)有焦點(diǎn)位置值與從中心區(qū)域曲線(xiàn)確定的焦點(diǎn)位置之一一致，從而將焦點(diǎn)位置 之一確認(rèn)為正確的現(xiàn)有焦點(diǎn)位置。根據(jù)需要，可以相對(duì)于圖案內(nèi)的另一曲線(xiàn)執(zhí)行相同的 處理以提供另一確認(rèn)數(shù)據(jù)。一旦確認(rèn)了現(xiàn)有焦點(diǎn)位置，則可以確定現(xiàn)有焦點(diǎn)位置與目標(biāo) 焦點(diǎn)位置之間的偏移，該偏移表示使成像裝置12處于目標(biāo)焦點(diǎn)位置所必需的調(diào)節(jié)。應(yīng)該注意，可以使用特征圖案內(nèi)繪制的任意曲線(xiàn)來(lái)確定正確的現(xiàn)有焦點(diǎn)位置 (從而確定與最佳焦點(diǎn)的偏移)。但是，如上所述，對(duì)于靈敏度和可靠性來(lái)說(shuō)，使用中心 區(qū)域曲線(xiàn)更有利。因此，通過(guò)對(duì)用來(lái)確定現(xiàn)有焦點(diǎn)位置的數(shù)據(jù)點(diǎn)中的至少一個(gè)使用中心 區(qū)域曲線(xiàn)可以增強(qiáng)處理的準(zhǔn)確性。在一些實(shí)例中，為特征圖案確定的相對(duì)強(qiáng)度值可能與y軸上多個(gè)焦點(diǎn)位置相關(guān) 的曲線(xiàn)部分(例如，基本上水平的段)對(duì)準(zhǔn)。在這種情況下，執(zhí)行上述方法并選擇可能 的現(xiàn)有焦點(diǎn)位置之一。然后，使用新的圖像以及到焦點(diǎn)位置所進(jìn)行的調(diào)節(jié)(如果需要) 重復(fù)該方法。如果分析裝置的成像部分的原始焦點(diǎn)位置還很遠(yuǎn)，使得根據(jù)該位置確定的強(qiáng)度 值產(chǎn)生位于小透鏡特征圖案外部的數(shù)據(jù)，則可以首先通過(guò)諸如最大對(duì)比度之類(lèi)的傳統(tǒng)技 術(shù)使分析裝置的成像部分處于焦點(diǎn)附近。盡管已經(jīng)關(guān)于詳細(xì)實(shí)施例描述并示出了本發(fā)明，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理 解的是，在不脫離本發(fā)明的思想和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的改變。例 如，上述在詳細(xì)描述部分內(nèi)以圖示形式描述了小透鏡10的特征光透射強(qiáng)度圖案。該圖案 不限于圖示表示，而可以采用描述相對(duì)光透射曲線(xiàn)的數(shù)學(xué)表達(dá)式的形式，或者可以以數(shù) 據(jù)表的形式等。作為另一示例，以上詳細(xì)描述的實(shí)施例是按照置于獨(dú)立腔室17內(nèi)的生物 樣本11來(lái)討論本發(fā)明的。在替換實(shí)施例中，成像裝置12可以包含樣本處理硬件。作為 另一示例，特征光透射圖案按照平均光透射值來(lái)描述。在替換實(shí)施例中，可以使用來(lái)自單個(gè)小透鏡10的數(shù)據(jù)或者可以通過(guò)平均值以外的統(tǒng)計(jì)信息來(lái)獲得有用信息。
權(quán)利要求
1.一種用于確定適于對(duì)具有折射率的生物樣本進(jìn)行成像的成像裝置的焦點(diǎn)位置的方 法，該方法包括以下步驟相對(duì)于生物樣本的視場(chǎng)來(lái)布置小透鏡，以使得小透鏡相對(duì)于樣本的位置實(shí)質(zhì)上是固 定的，小透鏡具有高度并且具有不同于樣本折射率的折射率；其中成像裝置和小透鏡中的一個(gè)或兩個(gè)是可相對(duì)定位的，以使得成像裝置的焦點(diǎn)位 置能夠沿小透鏡的高度移動(dòng)；以一個(gè)或多個(gè)預(yù)定波長(zhǎng)的光通過(guò)使用透光度來(lái)至少對(duì)樣本視場(chǎng)和多個(gè)小透鏡進(jìn)行成像；確定樣本視場(chǎng)對(duì)這些波長(zhǎng)的光的典型光透射強(qiáng)度； 確定小透鏡的至少一個(gè)區(qū)域?qū)@些波長(zhǎng)的光的典型光透射強(qiáng)度；以及 使用樣本視場(chǎng)的典型光透射強(qiáng)度和小透鏡區(qū)域的典型光透射強(qiáng)度來(lái)確定成像裝置的 焦點(diǎn)位置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中確定焦點(diǎn)位置的步驟還包括使用小透鏡的特征光 透射強(qiáng)度圖案。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中小透鏡的特征光透射強(qiáng)度圖案是通過(guò)圖示的方法 表示的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中小透鏡的特征光透射強(qiáng)度圖案是通過(guò)數(shù)學(xué)的方法 表示的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中小透鏡的特征光透射強(qiáng)度圖案置于查找表內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中樣本視場(chǎng)的典型光透射強(qiáng)度是平均光透射強(qiáng)度， 并且小透鏡的至少一個(gè)區(qū)域的典型光透射強(qiáng)度是小透鏡的至少一個(gè)區(qū)域的平均光透射強(qiáng)度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中小透鏡被布置在生物樣本的視場(chǎng)內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中小透鏡被布置在樣本內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中小透鏡的特征光透射強(qiáng)度圖案表示作為成像裝置 相對(duì)于小透鏡的焦點(diǎn)位置的函數(shù)的相對(duì)于樣本的光透射強(qiáng)度值的小透鏡的至少一個(gè)區(qū)域 的光透射強(qiáng)度值。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中小透鏡的特征光透射強(qiáng)度圖案表示作為成像裝 置相對(duì)于小透鏡的焦點(diǎn)位置的函數(shù)的相對(duì)于樣本的平均光透射強(qiáng)度值的小透鏡的至少一 個(gè)區(qū)域的平均光透射強(qiáng)度值。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，還包括確定所確定的成像裝置的焦點(diǎn)位置與成像裝 置的目標(biāo)焦點(diǎn)位置之間的偏移的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所有小透鏡實(shí)質(zhì)上為相同的形狀。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中小透鏡為球面的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中小透鏡的至少一個(gè)區(qū)域?yàn)樾⊥哥R的中心區(qū)域。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，還包括步驟使用所確定的小透鏡的中心區(qū)域的光透射強(qiáng)度來(lái)確定目標(biāo)焦點(diǎn)位置；以及 確定所確定的成像裝置的焦點(diǎn)位置與成像裝置的目標(biāo)焦點(diǎn)位置之間的偏移。
16.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中確定小透鏡的至少一個(gè)區(qū)域的典型光透射強(qiáng)度的步驟包括確定小透鏡的第一區(qū)域和小透鏡的第二區(qū)域?qū)λ霾ㄩL(zhǎng)的光的典型光透射強(qiáng) 度；以及其中確定成像裝置的焦點(diǎn)位置的步驟使用樣本視場(chǎng)的典型光透射強(qiáng)度以及小透鏡的 第一區(qū)域和小透鏡的第二區(qū)域的典型光透射強(qiáng)度。
17.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中使用一個(gè)或多個(gè)預(yù)定波長(zhǎng)的光來(lái)執(zhí)行成像步 驟，所述一個(gè)或多個(gè)預(yù)定波長(zhǎng)的光基本上不被樣本和小透鏡吸收。
18.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在成像步驟中基本上對(duì)整個(gè)視場(chǎng)進(jìn)行成像，并 且樣本視場(chǎng)的典型光透射強(qiáng)度是基本上整個(gè)樣本對(duì)這些波長(zhǎng)的光的平均光透射強(qiáng)度。
19.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中小透鏡和樣本置于相同的焦平面中。
20.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中小透鏡在第一焦平面中，而樣本在不同于第 一焦平面的第二焦平面中，該方法還包括確定第一焦平面和第二焦平面之間的偏移的步 馬聚ο
21.一種用于對(duì)具有折射率的生物樣本進(jìn)行成像的設(shè)備，包括腔室，形成在第一平板和第二平板之間，這兩個(gè)平板是透明的，并且該腔室用于靜 止地保持樣本；多個(gè)小透鏡，置于腔室內(nèi)，這些小透鏡具有高度并且具有不同于樣本折射率的折射率；視場(chǎng)照明器，用于選擇性地至少對(duì)樣本視場(chǎng)和小透鏡進(jìn)行照射；析像器，用于將穿過(guò)樣本視場(chǎng)和小透鏡的光的圖像轉(zhuǎn)化成電子數(shù)據(jù)形式；定位器，用于選擇性地改變包含小透鏡的腔室、視場(chǎng)照明器、以及析像器中的一個(gè) 或多個(gè)的相對(duì)位置，以沿小透鏡的高度選擇性地改變?cè)O(shè)備的焦點(diǎn)位置；以及可編程分析器，適于與視場(chǎng)照明器和析像器相配合來(lái)以一個(gè)或多個(gè)預(yù)定波長(zhǎng)的光通 過(guò)使用透光度來(lái)至少對(duì)樣本視場(chǎng)和多個(gè)小透鏡進(jìn)行成像，并且確定樣本視場(chǎng)對(duì)這些波長(zhǎng) 的光的典型光透射強(qiáng)度，確定小透鏡的至少一個(gè)區(qū)域?qū)@些波長(zhǎng)的光的典型透射強(qiáng)度， 以及使用樣本視場(chǎng)的典型光透射強(qiáng)度和小透鏡區(qū)域的典型光透射強(qiáng)度來(lái)確定設(shè)備的焦點(diǎn) 位置。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的設(shè)備，其中小透鏡的特征光透射強(qiáng)度圖案存儲(chǔ)于可編程分 析器內(nèi)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的設(shè)備，其中小透鏡的特征光透射強(qiáng)度圖案被存儲(chǔ)為數(shù)學(xué)表 達(dá)式。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的設(shè)備，其中所有小透鏡實(shí)質(zhì)上為相同的形狀。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的設(shè)備，其中小透鏡為球面的。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的設(shè)備，其中第一平板具有內(nèi)表面，并且第二平板具有內(nèi)表 面，并且基本上所有的小透鏡都與兩個(gè)內(nèi)表面接觸。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的設(shè)備，其中視場(chǎng)照明器用于以基本上不被樣本和小透鏡吸 收的一個(gè)或多個(gè)波長(zhǎng)的光照射樣本和小透鏡。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的設(shè)備，其中小透鏡和樣本置于同一焦平面內(nèi)。
29.一種用于靜止地保持具有折射率的生物樣本的腔室，包括第一平板；第二平板，兩個(gè)平板都是透明的；以及多個(gè)小透鏡，置于腔室內(nèi)，這些小透鏡具有高度并且具有不同于樣本折射率的折射率。
全文摘要
提供一種用于聚焦對(duì)生物樣本進(jìn)行成像的裝置的方法和設(shè)備。公開(kāi)的方法方面包括步驟1)在生物樣本的視場(chǎng)內(nèi)布置小透鏡，該小透鏡具有高度并且具有折射率，該折射率不同于樣本的折射率，其中成像裝置和樣本中的一個(gè)或兩個(gè)是可相對(duì)定位的，以使得成像裝置的焦點(diǎn)位置可以沿小透鏡的高度移動(dòng)；2)以一個(gè)或多個(gè)預(yù)定波長(zhǎng)的光通過(guò)使用透光度來(lái)對(duì)包括多個(gè)小透鏡的樣本的至少一部分進(jìn)行成像；3)確定樣本對(duì)這些波長(zhǎng)的光的平均光透射強(qiáng)度；4)確定每個(gè)小透鏡區(qū)域?qū)@些波長(zhǎng)的光的平均光透射強(qiáng)度；以及5)使用樣本的平均光透射強(qiáng)度和小透鏡區(qū)域的平均光透射強(qiáng)度來(lái)確定成像裝置的焦點(diǎn)位置。
文檔編號(hào)G02B21/24GK102016686SQ200980116148
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月21日
發(fā)明者尼滕·V·拉爾普里亞, 斯蒂芬·C·沃德洛, 達(dá)瑞恩·W·溫弗里希特 申請(qǐng)人:艾博特健康公司