專利名稱：用于微生物分析的裝置的制作方法
用于微生物分析的裝置 本發(fā)明涉及一種用于對可能含有微生物的載體進(jìn)行微生物分析的裝置，以便檢測
是否存在那些微生物。 —種分析這樣的載體的方法由如下操作構(gòu)成在用所謂的熒光團(tuán)(flurogen)或 熒光團(tuán)標(biāo)記物標(biāo)記了微生物之后，通過分析那些微生物發(fā)出的熒光來檢測微生物的存在。
這些標(biāo)記物僅在它們事先被微生物中包含的化學(xué)酶激活時才具有發(fā)熒光的特性。
這些標(biāo)記物一般包括熒光團(tuán)基團(tuán)以及能夠隱蔽或防止熒光團(tuán)基團(tuán)的熒光顯示出 來的基團(tuán)。在微生物存在時，其酶的效果是使該第二基團(tuán)改性，從而可以檢測到第一基團(tuán)的 熒光。 于是，如圖7的光譜53和54所示，當(dāng)被這樣標(biāo)記的微生物受到適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光作用
時，熒光基團(tuán)可以以吸收光譜53吸收光能并以特征熒光發(fā)射光譜54釋放能量，其中所述光
譜53的頂點53'在波長A 2處，所述光譜54的頂點54'在波長A 3處，不同于入2。 為了觀察到具有這種標(biāo)記物的微生物發(fā)射的熒光，已知的用于微生物分析的裝置
(與顯微鏡一體，例如在美國申請US 2007/0153372中)包括為了借助熒光檢測由熒光試劑
標(biāo)記的微生物的存在而適于照明分析載體的照明裝置，和用于觀察對照明裝置發(fā)射的光響
應(yīng)的來自載體的光的窗口。 本發(fā)明涉及提供用于檢測熒光的裝置，相對于現(xiàn)有技術(shù)的裝置，具有更好的性能 并且更實用。 為此，提供一種用于載體的微生物分析的裝置，載體適于含有由熒光試劑標(biāo)記的
微生物，其包括為了通過熒光檢測所述標(biāo)記的微生物的存在而適于照明所述載體的照明設(shè)
備以及用于觀察響應(yīng)于由所述照明設(shè)備產(chǎn)生的激發(fā)光而由所述載體發(fā)射的光的窗口 ；其特
征在于所述照明設(shè)備包括兩個基板，每個基板上安裝至少一組光源，該組中的所述光源彼
此規(guī)則地間隔開從而形成照明所述載體的陣列，所述基板被固定到所述裝置的框架上，所
述框架中形成的開口的每邊上各有一個以便允許由所述載體發(fā)射的光透過所述觀察窗，所
述基板在所述裝置中用于接收所述載體的預(yù)定位置的方向上向彼此傾斜。 根據(jù)本發(fā)明的具有裝置的光源的兩個基板，相對彼此傾斜并朝著分析載體指向
(當(dāng)它被放置于裝置上時)，這使得有可能在被照明載體的整個表面上獲得對稱和均勻的
照明，因為光源產(chǎn)生的激發(fā)光從開口的兩邊都發(fā)射，其中提供開口是為了觀測響應(yīng)激發(fā)光
而發(fā)射的光。 那兩個基板每一個都具有以規(guī)則陣列排列的光源組，這個事實有助于在載體的整 個表面形成特別均勻的照明。 由此，這種結(jié)構(gòu)使得能夠照明比對于現(xiàn)有技術(shù)中與顯微鏡成為一體的裝置的更大 尺寸的載體，同時以這樣的對比度維持均勻照明，即能很容易地用肉眼或其它圖像傳感器 確定微生物的存在。 特別地，這使得當(dāng)保持在可以觀察到對光源產(chǎn)生的激發(fā)光響應(yīng)而發(fā)射的光的開口 的最佳和中央位置時照明例如微孔膜成為可能。 根據(jù)對于制造和使用來說由于簡化和方便而優(yōu)選的特征
3
_每個所述光源具有在以預(yù)定波長為中心的相同光譜；和/或
_所述光源是發(fā)光二極管。 根據(jù)其它優(yōu)選特征，每個所述基板相對于用于接收所述載體的所述預(yù)定位置傾斜 40° -50°的角度。 意外地，這證明了一個事實，即板相對于載體傾斜[40° -50° ]的值的范圍導(dǎo)致 對于微生物檢測中讀取便利性而言的最佳性能。 更特別的，在這個值的范圍中，屏蔽效應(yīng)現(xiàn)象(來自通過觀察窗的外部光線的散 射)和反射現(xiàn)象(來自分析載體上的光的反射)明顯被最小化。 換句話說，就對比度、均一性和明亮度而言，在這個值的范圍中得到最佳圖象繪 制。 根據(jù)另一個優(yōu)選特征，每個陣列中心和在所述裝置中用來接收所述載體的所述預(yù) 定位置之間的高度隨所述載體而變。 根據(jù)另一個優(yōu)選特征，每個所述陣列的中心位于距離用來接收所述載體的所述預(yù) 定位置39. 75mm-69. 75mm的高度處。 這證明了一個事實，假定特別是對試劑分析載體中理想的尺寸即這個高度范圍提 供了很好的平衡，使得在微生物簡易檢測讀取的對比度和便利性方面保持良好的性能的同 時，還獲得了緊湊裝置。
根據(jù)其它優(yōu)選特征-除了所述光源組，被指定為第一組，以外，每個基板上還安裝了另一組光源，被指 定為第二組，所述第二組的所述光源同樣彼此規(guī)則地間隔開，以形成用于照明所述載體的 第二陣列。-對于每個基板，所述第一和第二陣列的中心重合；
-所述第一和第二陣列在彼此內(nèi)部交錯；-對于每個基板，所述照明設(shè)備包括用于所述光源發(fā)射的光的漫射體。
-每個漫射體都是其上一個面被噴砂的玻璃板；
-所述觀察窗包括適于允許最長波長通過的濾波器；
-所述觀察窗包括多個濾波器；-所述濾波器屬于滑動地安裝在所述框架上的滑塊；-所述照明設(shè)備適于照明整個用于接收所述載體的所述預(yù)定位置；和/或
-所述分析載體是微孔薄膜。 參考附圖，從通過優(yōu)選但非限制性范例的方式給出的以下描述中將明了本發(fā)明的 特征和優(yōu)點，附圖中 _

圖1是根據(jù)本發(fā)明的裝置的圖示；-圖2是該裝置的透視圖，在其旁邊示出了裝置中用于分析的濾波器單元；
-圖3和4分別是從下方獲得的透視圖以及從該裝置的對稱正中平面截取的正截 面圖；-圖5是該裝置兩個印刷電路板之一的透視圖，其上固定了兩組發(fā)光二極管，每組 發(fā)光二極管都以預(yù)定波長發(fā)射光；-圖6是根據(jù)本發(fā)明的裝置的另一個實施例的透視-圖7示出了根據(jù)本發(fā)明的裝置的不同光學(xué)構(gòu)件的光譜圖以及該裝置用于標(biāo)記微生物的熒光團(tuán)試劑的光譜圖，沿x軸線為共同比例的波長，沿y軸線為共同比例的相對光強； 在借助圖7所示光譜圖詳述其工作模式之前，現(xiàn)在將借助圖1到5給出根據(jù)本發(fā)明的裝置的優(yōu)選實施例的描述。 圖1到5所示的裝置1包括外殼2、由兩個照明構(gòu)件4形成的照明設(shè)備3、滑動牽引器5和觀察窗口 7。 外殼是大致平行六面體形狀，具有上壁10和四個側(cè)壁11到14，故意沒有示出壁14的一部分，以便示出裝置的內(nèi)部。 在這里，觀察窗口 7由低通濾波器6構(gòu)成(即，其允許最低頻率，即最長的波長通過)，外殼2的上壁10中形成開口 9，以在其中接收濾波器6。 在下面將會看到，由壁10到14和30界定的該外殼2的內(nèi)部形成分析室，分析室與環(huán)境光隔離，其中容納要分析的載體。 這里，要分析的載體是屬于濾波器單元40的微孔濾膜41，這里是由Millipore。以Milliflex⑨為商標(biāo)出售的單元。這個膜41直徑為55mm，被濾波器單元的主體42所圍繞。 這里使用的膜41是纖維素酯，其孔徑尺寸適于維持期望檢測其存在的微生物，大
部分常常在0. 10和100微米之間。 牽引器5具有主體30、軸環(huán)31和握柄32。 在主體30中，形成柱形腔33，用于接收濾波器單元40。 現(xiàn)在將借助圖3到5描述照明設(shè)備3 。 這些設(shè)備3包括兩個獨立的照明構(gòu)件4。 每個構(gòu)件4包括梯形截面的底座20、其上設(shè)置有兩組27和28 二極管22和23的印刷電路板21 、覆蓋那些二極管的漫射體24以及在電路板21的邊緣和漫射體24邊緣之間的兩個黑屏26。 底座20固定于外殼2內(nèi)部的外殼壁10上，而電路板21固定到底座20遠(yuǎn)離靠著壁10設(shè)置的那些面的其傾斜面上，使得那些電路板沿著載體41的接收區(qū)域33的方向朝向彼此傾斜。 于是這樣提供了每個底座20，使得當(dāng)單元40處于裝置外殼33中時(圖1)，每個
板21相對于壁10和膜41所占據(jù)的預(yù)定位置具有45°的傾角A(圖1)。 電路板21的上邊緣25彼此相距100mm的距離，而那些邊緣25距壁1023mm的距離。 發(fā)光二極管22和23的頂點位于距漫射體24為15mm的距離處。 這里，這些漫射體24是由玻璃板制成的，玻璃板的一面(轉(zhuǎn)向二極管的面)經(jīng)噴
沙處理。 在每個印刷電路板上，如圖5所示，設(shè)置由十六個二極管22構(gòu)成的第一組二極管27以及由四個二極管23構(gòu)成的第二組二極管28。 二極管22彼此規(guī)則地間隔并設(shè)置成四個二極管一排等間距的四排，使得每個二極管22距與其直接相鄰的二極管22為16mm的距離。于是這一組27形成二極管陣列，使得在將其置于外殼2中其預(yù)定位置時能夠均勻地對膜41進(jìn)行照明，陣列的中心29位于距離該預(yù)定位置54. 75mm的高度H處(圖1)。 二極管23分布于在二極管22的陣列中心交錯的正方形的四個角中，每個二極管23位于距與其相鄰的兩個二極管23為32mm的距離處并處于正方形的中心處，在正方形的角部有四個二極管22(圖5)。這個陣列的中心與二極管22構(gòu)成的陣列中心29重合。
二極管22是來自LUMILED"公司以LXHL-PB01作為參考銷售的二極管，圖7中示出了其發(fā)射譜55，該高斯分布形式的光譜在470nm的波長A工處具有頂點55'，于是發(fā)射藍(lán)光。 二極管23是來自同一公司以參考LXHL-PD01銷售的二極管，圖中未示出其發(fā)射光譜，其發(fā)射光譜也是高斯分布形式，在625nm的波長處具有峰值，于是發(fā)射紅光。
對于25%的相對強度值而言，這些二極管具有140°的發(fā)射立體角，對于60%的相對強度值，具有90。的發(fā)射立體角。 二極管23具有基本為二極管22四倍的發(fā)射功率，從而它們的數(shù)量是二極管22的1/4。 交錯設(shè)置二極管22和23的陣列(即彼此嵌套)，從而在要照明的濾波器單元那里獲得可能最均勻的光，無論光是來自二極管22還是來自二極管23 。 每組二極管都產(chǎn)生以預(yù)定波長為中心的光譜，以便能夠激發(fā)不同預(yù)定類型的熒光團(tuán)。 每個電路板21上的導(dǎo)電跡線電連接到用于裝置的命令和控制單元(未示出)。
現(xiàn)在將簡要介紹要分析樣本的制備。 在實際檢測步驟之前，操作員通過單元40的膜41進(jìn)行過濾，以采集要分析的樣品(可能含有微生物)。 —旦微生物被過濾并保留在膜上，可以包括任選步驟，S卩，使與適當(dāng)生長培養(yǎng)基接
觸的微生物生長。生長培養(yǎng)基優(yōu)選為凝膠介質(zhì)，在過濾之后在其上沉積膜。該步驟是任選
的，使得能夠獲得最初過濾的每種微生物菌落，這增大了要檢測的細(xì)胞數(shù)量。 然后使膜及其包含的微生物與使微生物細(xì)胞壁可滲透的成分接觸，隨后將熒光團(tuán)
標(biāo)記物加入實現(xiàn)可滲透的成分中，以便進(jìn)入要檢測的微生物內(nèi)部。 現(xiàn)在將介紹基于根據(jù)本發(fā)明的裝置判斷如此制備的樣品上是否存在微生物的實施方式。 在第一階段中，拉出牽引器5，操作員在該牽引器的腔33中放入濾波器單元40(其可能被未示出的透明蓋板覆蓋以保護(hù)膜不受外部污染物影響)。然后推入牽引器5，直到軸環(huán)31抵靠壁13為止，使得膜41置于外殼2中其預(yù)定位置，以便被照明。
根據(jù)用于標(biāo)記微生物的熒光團(tuán)，操作員接下來選擇(例如通過圖中未示出的開關(guān))對應(yīng)的二極管22或23以將其導(dǎo)通(在圖示的范例中為二極管22)，以便均勻地照明膜41的整個表面，并以合適的波長激發(fā)用于進(jìn)行標(biāo)記的熒光團(tuán)。 漫射體24以及二極管在電路板21上的空間分布使得無論使用哪組二極管，都能夠?qū)δ?1的整個表面進(jìn)行特別均勻的照明。 由于電路板21置于接收濾波器6的開口 9的每個邊上，因此響應(yīng)于來自二極管的激發(fā)光而從濾波器單元40發(fā)射的光如圖1所示通過該濾波器，從而能夠用肉眼或經(jīng)由攝像機通過濾波器6觀察膜41的光響應(yīng)。 現(xiàn)在將描述利用圖7所示不同光譜圖在存在微生物的情況下獲得的光響應(yīng)。
在圖7中，光譜55是高斯形式的，對應(yīng)于激發(fā)光的光譜(這里為二極管22產(chǎn)生的光譜)，并具有一峰，其對應(yīng)于最大光強值的峰值55'處于等于470nm的波長A工處。
光譜53和54分別對應(yīng)于這里選擇用于標(biāo)記膜上存在的微生物的熒光團(tuán)的吸收光譜和發(fā)射光譜。 這里描述的熒光團(tuán)是5-6CFDA(羧基-熒光素-二 -醋酸鹽)。 吸收光譜53在大于A工的波長A 2處具有峰值53'，發(fā)射光譜54在大于A 2的波
長、處具有峰值54'。 在圖示的范例中，、等于492nm，、等于517nm，這里、和、之間的差小于入2和、之間的差。 有意識地選擇激發(fā)波長A工，使其小于A 2，使得光譜55的峰值55'相對于光譜53的峰值53'在光譜54的相對側(cè)上偏移。選擇這一偏移，以便使來自照明設(shè)備的光具有足夠高能量來激發(fā)熒光團(tuán)，而光不會與由熒光團(tuán)響應(yīng)于激發(fā)光而發(fā)射的光產(chǎn)生嚴(yán)重的寄生干擾。 光譜56是觀察窗口的濾波器6的光譜，選擇其截止頻率(這里大約為550nm)以使熒光團(tuán)發(fā)射的光(光譜54)基本通過，并阻擋更短波長的光，尤其是來自二極管22的在單元40上反射之后的光。 這一輸出濾波器(濾色鏡)有弱選擇性，以允許充分多的光返回用戶眼睛，給出大致明亮的景色，于是觀察起來讓人舒適，同時確保對比度水平適于用肉眼觀察。
當(dāng)來自照明設(shè)備3的激發(fā)光照射濾波器單元40的膜41時，使得具有被熒光團(tuán)標(biāo)記的微生物的該膜的每個位置以小尺寸(幾百微米)亮斑的形式變得可見，亮斑可以直接由濾波器6之外的肉眼觀察到。 角度A和高度H的值為無論用肉眼或通過攝像機讀取膜41上的亮斑提供了最佳表現(xiàn)。 這些值是通過以下操作確定的向控制膜施加黑色標(biāo)記和熒光黃標(biāo)記，并針對角度A和高度H的不同值尋找熒光頻帶亮度最大同時使黑色標(biāo)記上的寄生亮度最小的配置A、H。 這樣做已經(jīng)令人驚訝地證實，范圍[40° -50° ]的角度A給出了熒光標(biāo)記的最大光強度并且?guī)缀鯖]有對于黑色標(biāo)記的寄生光，從而對應(yīng)于閱讀舒適度方面的最佳值。
因此，為了相對于安裝裝置的間隙具有特定安全余量，從而在此選擇了平均值45° 。 至于高度值H，這是被照明對象尺寸的函數(shù)，已測試的不同配置表明，對于直徑為55mm的膜以及角度A的值范圍在40。到50°而言，在39. 75mm和69. 75mm的高度范圍上獲得了最佳結(jié)果。在此，類似地，在該范例中選擇的是平均值54. 75mm。 通過調(diào)節(jié)高度H，該裝置還適于照明除膜之外的其他類型樣品以及基本任何適于(無論是在表面上或是在體積中)包含微生物且希望通過熒光性檢測其存在的載體。
圖6中示出了該裝置的另一個實施例。
—般而言，將增加了 100的相同附圖標(biāo)記用于類似部分。
7
裝置101與裝置1具有相同特征，只是其缺少牽引器5 (例如這里，濾波器單元40直接放在例如臺上)，并且這里觀察窗口 107是由靠著外殼102的壁110設(shè)置的矩形形式滑塊108以及四個濾波器106到106"'形成的，每個濾波器都容納在滑塊108的對應(yīng)開口中。
每個光學(xué)濾波器都是低通濾波器，從而允許低頻(最長的波長)通過，其截止頻率與其他截止頻率不同。 滑塊108接合在該裝置的導(dǎo)軌(未示出)中，從而能夠?qū)⑺膫€濾波器106到106"'中任何選定的一個放置成與壁110的開口 109對準(zhǔn)。 于是，根據(jù)所選的熒光團(tuán)以及導(dǎo)通的二極管，能夠從四個可用濾波器中選擇具有最適合截止頻率的一個(例如，以獲得最佳對比度)。 在一個未示出的實施例中，濾波器6不是低通濾波器，而是帶通濾波器，其中通帶以波長人2為中心。 在另一個未示出的實施例中，印刷電路板21具有單個規(guī)則間隔二極管組，或者多于兩個的二極管組，每組二極管適于以不同波長照明載體41，每個二極管組陣列具有規(guī)則形狀，例如正方形，菱形，三角形，等等。 在另一個未示出的實施例中，二極管以任意其它類型的局部和單一光源，例如化學(xué)發(fā)光光斑代替，和/或印刷電路板由任意其它類型的可以支撐光源的基板例如玻璃或陶瓷板代替。 最后，要指出的是，也可以針對很多其他應(yīng)用按照不同版本生產(chǎn)這種照明系統(tǒng)，其他應(yīng)用例如是通過顯微鏡分析、生物芯片掃描、借助熒光的板的讀取、血細(xì)胞計數(shù)、透照器、PCR實時讀取，對于這些應(yīng)用的每一個，裝置的幾何構(gòu)型成為討論的應(yīng)用的特殊方案?；?1固定于其上的裝置框架未必是像圖示外殼2的外殼；例如它可以是圍繞顯微鏡光學(xué)裝置的箍狀物。 本發(fā)明不限于所述和圖示的實施例，而是涵蓋其任何變體。
8
權(quán)利要求
一種用于載體(41)的微生物分析的裝置，該載體適于含有由熒光試劑標(biāo)記的微生物，其包括為了通過熒光來檢測所述標(biāo)記的微生物的存在而適于照明所述載體(41)的照明設(shè)備(3)，以及用于觀察響應(yīng)于由所述照明設(shè)備(3)產(chǎn)生的激發(fā)光而由所述載體(41)發(fā)射的光的窗口(7；107)；其特征在于所述照明設(shè)備(3)包括兩個基板(21)，每個基板上安裝至少一組(27)光源(22)，該組(27)中的所述光源(22)彼此規(guī)則地間隔開從而形成照明所述載體(41)的陣列，所述基板(21)被固定到所述裝置的框架(2；102)上，在所述框架(2；102)中形成的開口(9；109)的每邊上各有一個，以便允許由所述載體(41)發(fā)射的光透過所述觀察窗(7；107)，所述基板(21)在所述裝置中用于接收所述載體(41)的預(yù)定位置的方向上向彼此傾斜。
2. 如權(quán)利要求l所述的裝置，其特征在于每個所述光源(22)具有以預(yù)定波長(A》為中心的相同的光譜(55)。
3. 如權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于所述光源是發(fā)光二極管(22)。
4. 如權(quán)利要求l-3任一項所述的裝置，其特征在于每個所述基板(21)相對于用于接收所述載體(41)的所述預(yù)定位置傾斜40。
-50°的角度(A)。
5. 如權(quán)利要求l-4任一項所述的裝置，其特征在于在每個陣列(27)的中心(29)和在所述裝置中用于接收所述載體(41)的所述預(yù)定位置之間的高度(H)隨所述載體(41)變化。
6. 如權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于每個所述陣列(27,28)的中心(29)位于距離用于接收所述載體(41)的所述預(yù)定位置39. 75mm-69. 75mm的高度(H)處。
7. 如權(quán)利要求l-6任一項所述的裝置，其特征在于除了被指定為第一組(27)的所述光源(22)的組(27)以外，在每個基板(21)上還有被指定為第二組的另一組(28)光源(23)，所述第二組的所述光源(23)也是彼此規(guī)則地間隔開以形成照明所述載體(41)的第二陣列。
8. 如權(quán)利要求7所述的裝置，其特征在于對于每個基板(21)，所述第一和第二陣列(27,28)的中心(29)重合。
9. 如權(quán)利要求8所述的裝置，其特征在于所述第一和第二陣列(27,28)在彼此內(nèi)部交錯。
10. 如權(quán)利要求l-9任一項所述的裝置，其特征在于對于每個基板(21)，所述照明設(shè)備(3)包括用于由所述光源(22,23)發(fā)射的光的漫射體(24)。
11. 如權(quán)利要求10所述的裝置，其特征在于每個漫射體(24)是其上一個面被噴砂的玻璃板。
12. 如權(quán)利要求l-ll任一項所述的裝置，其特征在于所述觀察窗(7 ;107)包括適于允許最長波長通過的濾波器(6 ;106)。
13. 如權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于所述觀察窗(107)包括多個濾波器(106，106'， 106"， 106"')。
14. 如權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于所述濾波器(106， 106， ，106"， 106"，)屬于滑動地安裝在所述框架(102)上的滑塊(108)。
15. 如權(quán)利要求l-14任一項所述的裝置，其特征在于所述照明設(shè)備(3)適于照明整個用于接收所述載體(41)的預(yù)定位置。
16. 如權(quán)利要求15所述的裝置，其特征在于所述分析載體是微孔薄膜(41)。
全文摘要
一種用于載體(41)的微生物分析的裝置，該載體適于含有由熒光試劑標(biāo)記的微生物，其包括具有兩個基板(21)的適于照明所述載體(41)的照明設(shè)備，每個基板上安裝至少一組光源(22)，該組中的所述光源(22)彼此規(guī)則地間隔開從而形成照明所述載體(41)的陣列，所述基板(21)被固定到所述裝置的框架上，所述框架上形成的開口(9)的每邊各有一個，所述基板(21)在所述裝置上用于接納所述載體(41)的預(yù)定位置的方向上向彼此傾斜。
文檔編號G02B7/00GK101724683SQ20091025307
公開日2010年6月9日 申請日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月23日
發(fā)明者G·魏茨, S·里博 申請人:米利波爾公司