本發(fā)明涉及一種納米纖維，具體涉及一種以家蠶絲素蛋白為原料制備的納米纖維及其制備方法。

背景技術(shù)：

天然家蠶絲素蛋白纖維因其優(yōu)異的抗拉強(qiáng)度及延展性能而倍受青睞，廣泛用于輕工業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域。再生家蠶絲素蛋白因其天然蛋白基材優(yōu)異的生物相容性、較低的免疫原性、低致敏性、溫和的水相加工環(huán)境等優(yōu)勢，人們對其在組織修復(fù)、藥物控釋、創(chuàng)面輔料以及美容領(lǐng)域的研究報(bào)道已屢見不鮮。然而，無論是再生絲素蛋白膜、多孔支架、凝膠等體系，都難以比擬天然絲素蛋白纖維優(yōu)異的物理機(jī)械性能。再生出的絲素蛋白體系往往都是微觀上的各向同性體系，難以滿足各向異性化細(xì)胞培養(yǎng)以及再生絲素蛋白基材加強(qiáng)的要求。

研究發(fā)現(xiàn)，天然家蠶絲素蛋白纖維優(yōu)異的物理機(jī)械性能不僅來自于高比例且沿纖維軸向排列的SilkⅡ型結(jié)晶結(jié)構(gòu)，也來自于纖維內(nèi)部由取向排列的Silk Ⅱ型結(jié)晶體以及無定型聚集態(tài)分子鏈構(gòu)成的原纖的取向排列。為此，人們寄以通過誘導(dǎo)再生絲素蛋白體系中的纖維化骨架結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)再生絲素蛋白凝膠、多孔支架以及膜等體系，或者通過三維各向異性排列的纖維骨架結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)神經(jīng)元、肌細(xì)胞、眼角膜細(xì)胞等的體外取向生長并最終用于體內(nèi)功能性組織修復(fù)。

目前，納米纖維的獲得方法主要有靜電紡、氣泡膜裂、熔噴等傳統(tǒng)工藝以及通過大分子的方法。中國發(fā)明專利“一種絲素蛋白納米纖維膜及其制備方法”（103341209A）及“一種制備功能性納米纖維的裝置”（105734697A） 等是通過常規(guī)或者膜裂靜電紡的方法制備納米中長纖維，需要消耗較高的能源以及專用的大型設(shè)備，生產(chǎn)成本較大，且制備的納米纖維沉積在二維平面，難以滿足三維使用的要求；中國發(fā)明專利“一種線型納米羥基磷灰石的制備方法”（102491298B）及“一種非晶絲素蛋白納米纖維溶液及其制備方法”（ 105968384A）等通過誘導(dǎo)培育自組裝的方法制備納米纖維，雖無需固定的大宗型設(shè)備，但制備得到的納米纖維長度短，達(dá)不到微米級別，難以滿足實(shí)際使用要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工藝簡短、條件溫和、生產(chǎn)成本低廉的自組裝家蠶絲素蛋白納米纖維及其制備方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是提供一種家蠶絲素蛋白納米纖維的制備方法，以家蠶蠶絲為原料，先進(jìn)行脫膠、干燥處理，獲得純絲素蛋白纖維，再進(jìn)行如下步驟：

（1）將純絲素蛋白纖維溶解于濃度為9.3M的溴化鋰溶解中，透析后得到家蠶絲素蛋白溶液，澆注于模具中，在溫度為20～25℃、濕度為45～65%的條件下，干燥成型為厚度0.5～5毫米的絲素蛋白膜；

（2）室溫條件下，將絲素蛋白膜置于乙醇中浸泡5～120分鐘，獲得再結(jié)晶的絲素蛋白膜；

（3）按比例1/100～1/10 w/v，將再結(jié)晶的絲素蛋白膜浸泡于溫度為25～50 ℃的緩沖液中，浸泡時(shí)間為0.5～2 h；再經(jīng)3000～10000轉(zhuǎn)/分鐘離心處理，分離獲得上清液；

（4）將獲得的上清液稀釋至0.1～10mg/ml，在恒溫水浴環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，得到濕態(tài)絲素蛋白納米纖維聚集物；

（5）將濕態(tài)絲素蛋白納米纖維聚集物進(jìn)行冷凍干燥處理，得到家蠶絲素蛋白納米纖維。

本發(fā)明技術(shù)方案中，所述的緩沖液為pH＝7.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸或磷酸鹽緩沖液，緩沖液濃度為0.01～1 M。

所述的恒溫水浴環(huán)境，溫度為25～50 ℃；培養(yǎng)時(shí)間為3～8 h。

本發(fā)明技術(shù)方案還包括按上述方法制備得到的一種家蠶絲素蛋白納米纖維，其直徑為20～500 nm，長度為1～100 μm。

本發(fā)明的原理是：由于親水性家蠶絲素蛋白于水相環(huán)境中，具有相比常規(guī)再生家蠶絲素蛋白更伸展的構(gòu)象，易于相互聚集的特性，以及膠體膠粒間的靜電排斥使其更趨于線性聚集的特點(diǎn)，因此親水絲素蛋白膠體體系具有溫和條件下較大的纖維化聚集動力，從而較快地 β-sheet化自聚集為具有較長長度的納米纖維。在本發(fā)明技術(shù)方案中，可通過調(diào)節(jié)絲素蛋白膜在乙醇中的浸泡預(yù)處理時(shí)間，控制納米纖維的直徑和長度；浸泡時(shí)間越長，親水性萃取物中親水性氨基酸比例越大，等濃度下的時(shí)間越短，所成纖維越細(xì)越短；反之則越粗越長。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

1、與現(xiàn)有的靜電紡、熔噴法以及氣泡膜裂法等工藝相比，本發(fā)明所述的親水性絲素蛋白溶液可于溫和的水相環(huán)境中生成直徑為20～500 nm，長度為1～100 μm納米纖維，能耗低、工藝簡短、無需特定大宗型設(shè)備，大大降低了生產(chǎn)成本。

2、與現(xiàn)有誘導(dǎo)性自組裝技術(shù)相比，本發(fā)明制備家蠶絲素蛋白納米纖維無需加入任何的添加劑便可自組裝得到較長尺寸的納米纖維，長度增長百倍以上，能夠滿足實(shí)際使用要求。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的絲素蛋白納米纖維凍干后的電鏡照片圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步闡述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種絲素蛋白納米纖維的制備方法，具體步驟如下：

（1）將脫膠干燥后的純絲素蛋白纖維用9.3M的溴化鋰溶解、透析后，獲得新鮮家蠶絲素蛋白溶液，澆注于聚苯乙烯模具中，溶液厚度為1毫米，于25℃，50%濕度環(huán)境下快速干燥成型。

（2）將快速干燥成型后的絲素蛋白膜室溫下于乙醇中浸泡30分鐘，獲得再結(jié)晶絲素蛋白膜。

（3）將再結(jié)晶處理后的絲素蛋白膜按1 / 30（w/v）比例浸泡于37 ℃,0.001M， pH=7.0的tris-鹽酸緩沖液中，浸泡時(shí)間為0.5h，然后以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心處理14 min，分離獲得上清液。

（4）將以上獲得的上清液稀釋至0.5mg/ml后，于恒溫水浴環(huán)境中培養(yǎng)3h，獲得濕態(tài)絲素蛋白納米纖維聚集物。

（5）將上述濕態(tài)絲素蛋白納米纖維聚集物冷凍干燥，獲得干態(tài)絲素蛋白納米纖維。

參見附圖1，它是本實(shí)施例制備得到的絲素蛋白納米纖維凍干后的電鏡照片圖。

實(shí)施例2

（1）將脫膠干燥后的純絲素蛋白纖維用9.3M的溴化鋰溶解并透析后，獲得新鮮家蠶絲素蛋白溶液，澆注于聚苯乙烯模具中，溶液厚度為3毫米，于25℃，60%濕度環(huán)境下快速干燥成型。

（2）將快速干燥成型后的絲素蛋白膜室溫下于乙醇中浸泡60分鐘，獲得再結(jié)晶絲素蛋白膜。

（3）將再結(jié)晶處理后的絲素蛋白膜按1/50（w/v）比例浸泡于37℃，0.01M,pH=7.0的磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，浸泡時(shí)間為1h，然后3000轉(zhuǎn)/分鐘離心17 min，分離獲得上清液。

（4）將以上獲得的上清液稀釋至0.25mg/ml后，于恒溫水浴環(huán)境中培養(yǎng)6h，獲得濕態(tài)絲素蛋白納米纖維聚集物。

（5）將上述濕態(tài)絲素蛋白納米纖維聚集物冷凍干燥，獲得干態(tài)絲素蛋白納米纖維。

實(shí)施例3

（1）將脫膠干燥后的純絲素蛋白纖維用9.3M的溴化鋰溶解并透析后，獲得新鮮家蠶絲素蛋白溶液，澆注于聚苯乙烯模具中，溶液厚度為2毫米，于23℃，55%濕度環(huán)境下快速干燥成型。

（2）將快速干燥成型后的絲素蛋白膜室溫下于乙醇中浸泡120分鐘，獲得再結(jié)晶絲素蛋白膜。

（3）將再結(jié)晶處理后的絲素蛋白膜按1/30（w/v）比例浸泡于37 ℃，0.05M ,pH=7.0的tris-鹽酸緩沖液中，浸泡時(shí)間為0.5h，然后7000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 min，分離獲得上清液。

（4）將以上獲得的上清液稀釋至0.75mg/ml后，于恒溫水浴環(huán)境中培養(yǎng)3h，獲得濕態(tài)絲素蛋白納米纖維聚集物。

（5）將上述濕態(tài)絲素蛋白納米纖維聚集物冷凍干燥，獲得干態(tài)絲素蛋白納米纖維。

實(shí)施例4

（1）將脫膠干燥后的純絲素蛋白纖維用9.3M的溴化鋰溶解并透析后，獲得新鮮家蠶絲素蛋白溶液，澆注于聚苯乙烯模具中，溶液厚度為1毫米，于22℃，50%濕度環(huán)境下快速干燥成型；（2）將快速干燥成型后的絲素蛋白膜室溫下于乙醇中浸泡90分鐘，獲得再結(jié)晶絲素蛋白膜。

（3）將再結(jié)晶處理后的絲素蛋白膜按1/100（w/v）比例浸泡于37 ℃,0.01M,pH=7.0的磷酸氫鉀-磷酸二氫鉀緩沖液中，浸泡時(shí)間為0.5h，然后4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15 min，分離獲得上清液。

（4）將以上獲得的上清液稀釋至0.25mg/ml后，于恒溫水浴環(huán)境中培養(yǎng)6h，獲得濕態(tài)絲素蛋白納米纖維聚集物。

（5）將上述濕態(tài)絲素蛋白納米纖維聚集物冷凍干燥，獲得干態(tài)絲素蛋白納米纖維。