專利名稱：重組蜘蛛絲蛋白的制作方法
重組蜘蛛絲蛋白
本申請是國際申請?zhí)朠CT/EP2005/007968，國際申請日2005年7月21日，進入中國國家階段日期為2007年2月12日，中國申請?zhí)枮?00580027435. 4，發(fā)明名稱為“重組蜘蛛絲蛋白”的分案申請。
本發(fā)明涉及重組蜘蛛絲蛋白，核酸，編碼這些重組蜘蛛絲蛋白的核酸，以及適合于表達那些核酸的宿主。此外，本發(fā)明涉及聚集蜘蛛絲蛋白的方法和這些蛋白質在生物技術和/或藥物和其它工業(yè)領域中的應用，特別地在制備汽車部件(automotive parts)，在飛行器構建中，在加工紡織品和皮革制品，以及在制備和加工紙，化妝品，食物，電子裝置，藥物遞送等中的應用。
在本申請中，使用下列縮寫
NR-非重復性的；Apr，氨芐青霉素抗性基因；IPTG，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；GdmCl，氯化胍(guanidinium chloride) ；GdmSCN，異硫氰酸胍；SDS，十二烷基硫酸鈉； PAGE，聚丙烯酰胺凝膠電泳；Tris，三(羥甲基)氨基甲烷；⑶，圓二色性；r印-蛋白質，重復蛋白質；Da，道爾頓；cps，每秒計數(shù)；MRW，平均殘基重量；n. d.，不確定。
蜘蛛絲是顯示優(yōu)越物理性質的蛋白聚合物(1)。在不同類型的蜘蛛絲中，拖絲是被最集中研究的。拖絲的絲被圓網(wǎng)蜘蛛(orb weaving spiders)用于構建它們的網(wǎng)的框架和半徑并作為總是拖在后面的生命線。為這些目的，需要高的拉伸強度和彈性。這些性質的組合導致與大多數(shù)其它已知材料相比，更高的韌性(1;2)。拖絲的絲通常由兩種主要的蛋白組成，其主要結構具有共同的重復結構(3;4)。
可以包含多到60個氨基酸的單重復單位的變化被重復數(shù)次來表示拖絲的絲序列的最大部分。這些重復單位表示有限組的獨特的氨基酸基序。在所有的拖絲的絲重復單位中發(fā)現(xiàn)的一個基序是典型地6-9個丙氨酸殘基的區(qū)組。在絲線中，數(shù)種聚丙氨酸基序形成晶態(tài)的折疊堆積，產(chǎn)生拉伸強度(5 ；6)。
富含甘氨酸的基序諸如GGX或GPGXX采用柔性的螺旋狀結構，其連接晶態(tài)區(qū)域并給線提供彈性(7)。
此外，所有的被研究的拖絲的絲蛋白在它們的羧基端包含不顯示明顯的重復模式的區(qū)域(非重復的或NR-區(qū)域)。到目前為止，在最終的線中沒有功能與這些區(qū)域相關。
絲的體內裝配是引入注意的過程。蜘蛛的拖絲絲蛋白在所謂的主要的壺腹腺中以多到50% (w/v) (8)的濃度貯存。盡管已經(jīng)提出在主要的壺腹腺中關于這些蛋白質的“動態(tài)松散螺旋結構”(8)，更近的數(shù)據(jù)提示對于所述蛋白質的所謂A-區(qū)的隨機卷曲構象，其代表所述腺體的最大部分(9 ；10)。高度濃縮的蛋白質溶液形成絲粘稠物(紡絲溶液(spinning solution))，其顯示液態(tài)晶體的性質(11-13)。
線的裝配在粘稠物通過紡織導管的通道中開始，伴隨水、鈉和氯化物的提取(14 ； ㈤。同時，易溶離子鉀和磷酸鹽的濃度增加，PH從6.9降到6.3(14-16)。裝配最終由機械應力引發(fā)，其由線被推出蜘蛛的腹部而導致(17)。
出于一些目的，天然絲線不能直接使用，而必須溶解并且再裝配成其它形態(tài)，諸如薄膜、泡沫、球體、納米纖維、水凝膠等。
已經(jīng)關于絲的絲心蛋白進行了涉及由絲蛋白制備的薄膜的大部分研究，所述絲的絲心蛋白是衍生自家蠶家蠶蛾(Bombyx mori)的絲的主要蛋白質成分。絲的絲心蛋白薄膜可以從水溶液或包含六氟異丙醇(HFIP)、甲酸和三氟乙酸的溶液中鑄塑成。在溶液中，根據(jù)所用的溶劑，絲的絲心蛋白傾向于采取螺旋或隨機卷曲構象。當鑄塑成薄膜時，蛋白質維持可溶性狀態(tài)的構象或采取更多的富含β-折疊的構象。在大多數(shù)情形中，用甲醇處理薄膜導致折疊含量和結晶度的進一步增加。除了絲的絲心蛋白之外，還將其它的絲蛋白用于鑄塑成薄膜。Vol Irath及同事研究從提取自蜘蛛N印hi la senegalensis的主要壺腹腺的蛋白質制成的薄膜。當從水溶液中制備時，這樣鑄塑成的薄膜主要包含隨機卷曲構象的蛋白質。它們的結構在添加氯化鉀后改變成β-折疊。此外，使用HFIP作為溶劑，從蜘蛛 Nephila clavipes的拖絲的絲蛋白MaSpI來源的合成絲蛋白質制備薄膜。在溶液中，蛋白質采取α-螺旋結構，當被鑄塑成薄膜時，其改變?yōu)楦缓嗟摩?折疊的構象。
不幸的是，其氨基酸序列局限了從天然的絲的絲心蛋白產(chǎn)生功能性薄膜材料。由于包含硫醇、氨基或羧基基團的化學反應性氨基酸側鏈的低豐度(< 1. 5% )，絲的絲心蛋白的選擇性化學修飾僅可能是非常有限的。此外，在天然宿主中改變絲蛋白并因此改變薄膜的性質的遺傳修飾則很慢。
盡管蜘蛛絲蛋白的某些結構方面已經(jīng)清楚，但是關于個體絲蛋白和它們的主要結構元件對于裝配過程的貢獻則知道的很少。關于花園蜘蛛十字園蛛(Aranus diadematus) 的兩種主要的拖絲絲蛋白，ADF-3和ADF-4的競爭性研究揭示，盡管它們的氨基酸序列非常相似G)，它們顯示相當不同的溶解度和裝配特性盡管ADF-3甚至在高濃度仍是可溶的 (18)，ADF-4實際上是不可溶的，并且在特定條件下自裝配為絲狀結構(未公開的結果)。
科學和商業(yè)利益促進了蜘蛛絲的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的研究。由于蜘蛛的同種相殘，天然的蜘蛛絲生產(chǎn)是不切實際的，而人工生產(chǎn)在獲得足夠的蛋白質產(chǎn)量和出眾的線-裝配中遇到問題。細菌的表達產(chǎn)生低蛋白水平，這可能是由于細菌和蜘蛛的不同的密碼子選擇導致的。具有適應于表達宿主的密碼子選擇的合成基因導致更高的產(chǎn)量，但是其合成的蛋白質顯示與天然蜘蛛絲不同的性質。部分拖絲的絲cDNAs在哺乳動物細胞系中的表達確實產(chǎn)生了絲蛋白(例如ADF-3)，其可以以人工方式紡絲(spin)為“絲樣”的線，盡管在品質上仍舊很差。
W003060099涉及將生物絲蛋白紡絲為纖維的方法和裝置。該發(fā)明特別用于從水溶液中紡絲重組的絲蛋白，并增加纖維的強度和制品的實用性從而使這些纖維的商業(yè)生產(chǎn)和應用是可實踐的。其中，公開了在哺乳動物細胞，例如轉基因的山羊乳腺細胞中表達蜘蛛絲蛋白。
在細菌宿主中的真正的蜘蛛絲基因的表達-如上提及-是無效的04)，因為一些基因部分包含不能有效在細菌中翻譯的密碼子。此外，由于絲的重復性性質，通過PCR進行基因操作和擴增是困難的。為了研究蜘蛛絲蛋白的性質，使用具有適應于相應的表達宿主的密碼子選擇的合成DNA組件進行克隆策略。獲得編碼類似于蜘蛛絲的重復區(qū)的蛋白質的合成基因05- )。然而，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質的設計都不包含在所有的拖絲的絲中發(fā)現(xiàn)的羧基端NR-區(qū)。
因此，本發(fā)明的目的是提供具有提高的特性，如具體而言以高產(chǎn)量表達的提高的能力和提高的強度和柔性，即更好的質量的重組蜘蛛絲蛋白。CN 102532295 A
此外，本發(fā)明的目的是提供可以方便地在已經(jīng)了解的表達系統(tǒng)中表達的重組蜘蛛絲蛋白。本發(fā)明的另一個目的是提供用于聚集蜘蛛絲蛋白的改善的方法和由這些蛋白質形成線的方法。此外，本發(fā)明的目的是提供改善的紙、紡織品和皮革制品。另一個目的是提供新的蛋白質和基于蜘蛛絲蛋白的其它的材料諸如球體，納米纖維，水凝膠，線，泡沫，薄膜以用在生物技術、藥物、藥學和食品應用，化妝品，電子裝置中和用于其它的商業(yè)目的。
這些目的通過獨立權利要求的主題而得以實現(xiàn)。優(yōu)選的實施方案在從屬權利要求中提出。
提供包含合成的重復蜘蛛絲蛋白序列和/或真正的NR-(非重復性)區(qū)域或由其組成的重組蜘蛛絲蛋白的現(xiàn)有蛋白質改造方法揭示與真正的絲蛋白非常相似的蛋白質可以以高產(chǎn)量產(chǎn)生。具體而言，本文提供的可以容易地按比例放大的細菌表達系統(tǒng)和簡單便宜的純化方法，提供了以經(jīng)濟有效的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)蜘蛛絲樣蛋白的基礎。
已經(jīng)對蜘蛛絲蛋白主要就它們對于絲線的機械性質的貢獻進行了研究。然而，關于絲裝配的分子機制仍知道的很少。作為要表征該過程的第一個步驟，本發(fā)明人鑒定了決定蛋白質溶解性的花園蜘蛛(十字園蛛)的主要拖絲的絲蛋白ADF-3和ADF-4的一級結構元件。此外，研究了涉及介導天然線裝配的條件對蛋白質聚集的影響。使用新開發(fā)的克隆策略產(chǎn)生了編碼蜘蛛絲樣蛋白的基因，其基于合成DNA組件和PCR擴增的真正基因序列的組合。比較二級結構，合成的蛋白質的溶解度和聚集性質揭示單一的一級結構元件對蛋白質性質具有不同的影響。代表拖絲的絲蛋白的最大部分的重復區(qū)域決定合成蛋白質的溶解度，其在衍生自ADF-3和ADF-4的構建體之間非常不同。促進絲體內裝配的因素，諸如酸化和磷酸鹽濃度的增加通常減少絲蛋白的體外溶解度。引人注目的是，這種效果在包含ADF-3 或ADF-4的羧基端非重復性區(qū)域的被改造蛋白中出現(xiàn)，說明這些區(qū)域在起始蜘蛛絲蛋白的裝配中具有重要作用。
按照第一個方面，本發(fā)明涉及重組的蜘蛛絲蛋白，其包含
a) 一個或多個合成的重復性蜘蛛絲蛋白序列，和/或
b) 一個或多個真正的非重復性蜘蛛絲蛋白序列。
要了解的是，用于本文時，術語“合成的重復性序列”指不能天然發(fā)現(xiàn)的，然而，其衍生自在蜘蛛絲蛋白中天然存在的重復單位的重組蛋白質序列。如上所示，那些重復序列包含一個或多個包含多到60個氨基酸的單一重復單位。天然存在的重復單位包含有限組的獨特的氨基酸基序。那些重復單位特別將拉伸強度和彈性賦予可以在后來由蜘蛛絲蛋白形成的線。
下面將詳細解釋可能形成本發(fā)明的合成的重復序列的基礎的不同類型的重復單位。
可以與合成的重復序列一起存在，或可以單獨存在的本發(fā)明的重組蜘蛛絲蛋白的第二種組分包含一種或多種真正的非重復性蛋白質序列。這些非重復性序列在線的裝配中具有重要的功能作用。
要注意的是，在本發(fā)明中，還意欲僅包含合成的重復性序列的重組的蜘蛛絲蛋白。 盡管本發(fā)明的重組蛋白顯示兩種組分，即合成的重復序列以及真正的非重復序列，其具有更寬范圍的應用性并且可以以更高的量產(chǎn)生(見下面的實施例章節(jié))，可以將僅具有合成的重復序列的重組蜘蛛絲蛋白用于一些特定的應用。
這些應用是汽車和飛行器部件，表面涂層，以及傷口閉合系統(tǒng)和傷口敷料等?；驌Q言之，其中不需要蜘蛛絲蛋白的線結構的應用。
用于本文時，術語“真正的”意味著基本的核酸序列分離自它們的天然環(huán)境而在其序列本身中沒有進行實質上的改變。允許的僅有的改變是其中將真正的非重復性核酸序列進行修飾從而使所述序列在不改變編碼的氨基酸序列的情況下，在宿主中表達。優(yōu)選的序列是NR3(SEQ ID NO 10 ；衍生自 ADF-3)和NR4(SEQ ID NO :11 ；衍生自 ADF-4)。在兩個序列中，使用PCR誘變將很少在大腸桿菌(E.coli)中翻譯的密碼子AGA(Arg)突變?yōu)镃GT (Arg) 以進行更有效的翻譯。
優(yōu)選的鞭形蛋白的真正的非重復性序列是FlagN_NR(SEQ ID NOs :31和32)和 FlagC-NR(SEQ ID NOs :33和34)的氨基酸序列和核酸序列。
按照優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的重組蜘蛛絲蛋白通常衍生自蜘蛛主要壺腹腺的蜘蛛拖絲蛋白和/或鞭狀腺的蛋白。
按照另一個優(yōu)選的實施方案，真正的非重復性序列衍生自天然存在的蜘蛛絲蛋白的氨基端非重復性區(qū)域(鞭形蛋白)和/或羧基端非重復性區(qū)域(鞭形和拖絲蛋白)。下面將指出那些蛋白的優(yōu)選實例。
通常優(yōu)選選擇衍生自圓網(wǎng)蜘蛛(園蛛料(Araneidae)和Araneoids)的拖絲或鞭形蛋白的拖絲和/或鞭形序列。
更優(yōu)選地，所述拖絲蛋白和/或鞭形蛋白衍生自下列蜘蛛的一種或多種希氏尾園蟲朱(Arachnura higginsi)，Araneus circulissparsus，十字園蟲朱，Argiope picta，條帶園妹(B anded Garden Spider)(三帶_蟲朱(Argiope trifasciata))，Batik Golden Web Spider(Nephila antipodiana)，Beccari‘ s Tent Spider(Cyrtophora beccarii)， - ^ (Bird-dropping Spider) (Celaenia excavata), M S(B 1 ack-and-White Spiny Spider)(庫氏棘腹蛛(Gasteracantha kuhlii))，黑黃園蛛(Black-and-yellow Garden Spider) (Argiope aurantia)，流星錘蟲朱(Bolas Spider) (Ordgarius furcatus)，星 蟲朱—巨 _ 蟲朱(Bolas Spider -Magnificent Spider) (Ordgarius magnificus)， 棕色水手蛛(Brown Sailor Spider)(嗜水新園蛛(Neoscona nautica))，棕腿蛛 (Brown-Legged Spider) (Neoscona rufofemorata) ；Capped Black-Headed Spider (帆楚蟲朱(Zygiella calyptrata))，普通園蟲朱(Common Garden Spider) (Parawixia dehaani)，普通園蛛(Common Orb Weaver)(Neoscona oxancensis),蟹樣棘園蛛 (Crab-like Spiny Orb Weaver) (Gasteracantha cancriformis (elipsoides))， Curved Spiny Spider (Gasteracantha arcuata)，皿云斑蟲朱(Cyrtophora moluccensis)， Cyrtophora parnasia, Dolophones conifera, Dolophones turrigera, Doria ' s Spiny Spider(Gasteracantha doriae)，雙點棘蟲朱(Double-Spotted Spiny Spider) (Gasteracantha mammosa)，Double-Tailed Tent Spider(方格云斑蟲朱(Cyrtophora exanthematiea))，塞若尖腹蟲朱(Aculeperia ceropegia)， Eriophora pustulosa， Flat Anepsion(Anepsion depressium)， Four-spined Jewel Spider(Gasteracantha quadrispinosa)，花園圓網(wǎng)蟲朱(Garden Orb Web Spider)(Eriophora transmarina)， Giant Lichen Orbweaver (Araneus bicentenarius)，金色網(wǎng)蟲朱(Golden Web Spider) (Nephila maculata)，Hasselt ' s 棘蟲朱(Hasselt ' s Spiny Spider) (Gasteracanthahasseltn;, Tegenaria atrica, Heurodes turrita, Island Cyclosa ^piaer (島艾蟲朱 (Cyclosa insulana))，Jewel or Spiny Spider (Astracantna minaxハ腎形園蟲朱(Kidney Garden Spider)(而園蟲朱(Araneus mitif icus)), Laglaise ‘ s 園蟲朱(Laglaise ‘ s Garden Spider) (i^riovixia Iagiaiseiノ，Long-Bellied Cyclosa Spider (Cyclosa biiida)， Malabar Spider(Nephilengys malabarensis)， Multi-Coloured St Andrew ' s Cross Spider(多色金蛛(Argiope versicolor))，觀賞性樹干蛛(Ornamental Tree-Trunk Spider) ( ^fefe (Herennia ornatissima; ；, Oval St. Anarew s Cross Spiaer、女子月生i 蟲朱(Argiope aemula)), Red Tent Spider (單色石斑蟲朱(Cyrtophora unicolor))，Russian Tent Spiaer (Cyrtophora hirta)，Saint Andrew' s Cross Spider (諷氏金蟲朱(Argiope keyserlingi))，猩紅阿秋蛛(猩紅阿秋蛛(Acusilas coccineus))，銀色金蛛(Argiope argentataノ，Spinybacked Oroweaver (irasteracantha cancriformis)，斑點 |k|蟲朱(spotted Oroweaver) (Neoscona domici1iorum)，St. Andrews Cross (Argiope aetheria)， St. Andrew ' s Cross Spider (Argiope Keyserlingi)，Tree-Stump Spider (無麟波蟲朱 (Poltys illepidus))，Triangular Spider (Arkys clavatus), Triangular Spider (Arkys lancearius)，Two-spined Spider (Poecilopachys australasia)，絡新ヌ=I蟲朱屬(Nephila) 物禾中，例如 Nephila clavipes，Nephila senegalensis，Nephila madagascariensis 禾P更多(對于另外的蜘蛛物種，還見下)。最優(yōu)選的是，衍生自十字園蛛的拖絲蛋白和衍生自 Nephila clavipes 的鞭形蛋白。在本發(fā)明的背景下，應該清楚的是重組蜘蛛絲蛋白可以不僅包含來自ー個物種的蛋白質序列，還可以包含衍生自不同蜘蛛物種的序列。作為實例，ー個或多個合成的重復性蜘蛛絲蛋白序列可以衍生自ー個物種，ー個或多個真正的非重復性蜘蛛絲蛋白序列可以衍生自另ー個物種。作為另ー個實例，還可能是設計重組蜘蛛絲蛋白，其包含超過ー種類型的重復序列，其中不同的類型衍生自不同的物種。按照ー個優(yōu)選的實施方案，拖絲蛋白質是野生型ADF-3，ADF-4，MaSpI，MaSp II，鞭形蛋白是FLAG。術語ADF-3/-4用在由十字園蛛產(chǎn)生的MaSp蛋白質的背景下(十字園蛛絲心蛋白-3/_4)。兩種蛋白質ADF-3和-4屬于MaSp II類蛋白質(主要的壺腹狀spidroin II)。絲纖維具有類似于液態(tài)結晶聚合物的在弾性非晶形部分之間散布折疊的晶態(tài)區(qū)域。這兩個部分由被不同基因編碼的兩種不同的蛋白質類，MaSp I (主要的壺腹狀 spidroin I)和 MaSp II (主要的壺腹狀 spidroin II)代表。在另ー個實施方案中，提供的核酸序列是ADF-3 (SEQ ID NO 1)和/或ADF_4(SEQ ID NO 2)，或其變體。要注意的是，本發(fā)明意欲兩種不同種類的ADF-3和ADF-4編碼序列和蛋白質首先，已經(jīng)公開的ADF-3和ADF-4序列(本文野生型序列)和第二，由SEQ ID NO :1 (ADF-3) 和2 (ADF-4)編碼的其變體。所述野生型序列已經(jīng)公開并且在登記號U47855和U47856 (SEQ ID NO 8和9)下獲得?？梢栽诒景l(fā)明中使用(即，単獨的或組合以其它蛋白質)的另外的蜘蛛絲蛋白和它們的數(shù)據(jù)庫登記號是spidroin 2 [Araneus bicentenarius]gi|2911272
主要的壺腹狀腺體拖絲絲蛋白質-1 [大腹園蛛(Araneus ventricosus)]gi I 27228957主要的壺腹狀腺體拖絲絲蛋白質-2[大腹園蛛]gi 127228959 Il^spidroin 1 [Nephil a mBdagBscBriensis」gi11J562006主要的壺腹狀 spidroin 1 [Nephila senegalensis] gi 113562010spidroin 1 [Latrodectus geometricus] gi 113561998主要的壺腹狀spidroin 1 [三帶金蛛]gi 113561984主要的壺腹狀 spidroin 1 [Argiope aurantia] gi 113561976拖絲絲蛋白spidroin 2[棒絡新婦蛛(Nephila clavata)]gi 116974791主要的壺腹狀 spidroin 2[Nephila senegalensis]gi 113562012spidroin 2[Nephila madagascariensis]gi 113562008±Jg WmII^ spidroin 2 [Latrodectus geometricus] gi 113562002按照另一個優(yōu)選的實施方案，鞭形蛋白是SEQ ID NO :6 (Flag-N)和/或SEQ ID NO 7 (Flag-C)或其變體，其構成由本發(fā)明人衍生的新序列。本文可以使用已知的并且公開的鞭形序列，具體如下鞭形絲蛋白部分cds [N 印 hi la clavipes] gi | 2833646鞭形絲蛋白部分cds [N 印 hi la clavipes] gi | 2833648在一個優(yōu)選的實施方案中，重組的蜘蛛絲蛋白包含ー個或多個合成的重復性序列，其包含ー個或多個包含聚丙氨酸的共有序列。那些聚丙氨酸序列可以包含6-9個丙氨酸殘基。見，例如SEQ ID NO :1，包含幾個6個丙氨酸殘基的聚丙氨酸基序。優(yōu)選地，包含聚丙氨酸的共有序列衍生自ADF-3，并且具有SEQ ID NO 3或其變體的氨基酸序列(組件A)。組件A包含具有6個丙氨酸殘基的聚丙氨酸。衍生自ADF-4的包含另外的優(yōu)選的聚丙氨酸的共有序列是組件C (SEQ ID NO :5)，其包含8個丙氨酸殘基。按照另一個優(yōu)選的實施方案，在本發(fā)明的重組蜘蛛絲蛋白中，合成的重復序列衍生自ADF-3并且包含SEQ ID NO :4(組件Q)或其變體的氨基酸序列的一個或多個重復序列。更通常地，合成的重復序列還可以包含一般基序GGX或GPGXX，即富含甘氨酸的區(qū)域。如上提及，這些區(qū)域將給蛋白質提供柔性并且因此給形成自包含所述基序的重組蜘蛛絲蛋白的線提供柔性。要注意的是，本發(fā)明的合成性重復序列的具體組件還可以彼此組合，即組合A和Q 的組件(重復單位)，組合Q和C的組件等也包括在本發(fā)明中。盡管沒有局限被引入蜘蛛絲蛋白的組件的數(shù)量，優(yōu)選的是對每個重組蛋白使用許多合成的重復序列，所述數(shù)量優(yōu)選地在5-50個組件，更優(yōu)選地在10-40個和最優(yōu)選地在15-35個組件范圍內。所述合成的重復性序列優(yōu)選地包含ー個或多個(AQ)和/或(QAQ)作為重復単位。 甚至更優(yōu)選的是，所述合成的重復性序列是(AQ)12, (AQ)24, (QAQ)8或(QAQ) 16。只要合成的重復性序列衍生自ADF-4，其可以優(yōu)選地包含如上提及的SEQ ID N0 5(組件C)或其變體的氨基酸序列的一個或多個重復序列，其中總的合成的重復性序列是
し 16 ^ C32O本發(fā)明的完整重組蜘蛛絲蛋白的優(yōu)選實施方案是(QAQ) 8NR3, (QAQ) 16NR3，
10(AQ) 12NR3, (AQ)24NR3, C16NR4和C32NR4，即包含所述序列或由其組成的蛋白質。要注意的是，上述合成的重復性序列的構型(使用A，Q和C系統(tǒng))還應用于上述公開的所有其它的重復單位，例如，可以將所有的包含聚丙氨酸的序列作為A和/或C，并且可以將所有的富含甘氨酸的序列作為Q。衍生自鞭形序列的用于合成的重復性序列的新組件是組件K(SEQ ID NO :35和 36)，sp (SEQ ID NO 37 和 38)，X(SEQ ID NO 39 和 40)，和 Y(SEQ ID NO :41 和 42)所述合成的重復性序列還優(yōu)選地包含Y8，Y16，X8, X16, K8, K16或由其組成。此外，還可能的是，將衍生自ADF-3和ADF-4的那些序列和Flag組合在一個重組序列中。如上所釋，本文公開的氨基酸序列并不局限于在SEQ ID Nos中提供的確切序列。 本文指出的氨基酸序列還包含變體。因此，本發(fā)明的蛋白質的氨基酸序列還包含通過氨基酸插入、缺失和取代而不同于本文公開的序列的所有序列。優(yōu)選地，氨基酸“置換(substitution)，，是ー種氨基酸被具有類似結構和/或化學性質的另一種氨基酸取代，即保守性氨基酸取代的結果。氨基酸置換可以在涉及的殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性性質的類似性基礎上進行。例如，非極性(疏水)氨基酸包括，丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸；帶負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸?！安迦搿被颉叭笔А钡湫偷卦诩s1-5個氨基酸，優(yōu)選地約1，2或3個氨基酸范圍內。 氨基酸添加典型地不超過100，優(yōu)選地不超過80，更優(yōu)選地不超過50，最優(yōu)選地不超過20個氨基酸，其添加在本發(fā)明的蛋白質上和/或插入其中。注意到本發(fā)明僅意欲那些添加，其不會對本文公開的蛋白質需要的性質具有不利影響。通過使用重組DNA技術系統(tǒng)進行蛋白質中的氨基酸的插入、缺失或置換并評估得到的重組變體的活性來實驗性地確定容許的變化。這不需要本領域技術人員進行超出常規(guī)的實驗。按照第二個方面，本發(fā)明涉及編碼如上公開的重組蜘蛛絲蛋白的核酸序列。編碼優(yōu)選的蛋白質的優(yōu)選序列是 SEQ ID NO 12 (ADF-3)，13 (ADF-4)，14 (NR3)，15 (NR4)， 16(FLAG-NT)，17(FLAG-CT)，32(FlagN-NR)，34(FlagC-NR)。本發(fā)明還包括那些核酸的變體。將這些變體每個被限定為與SEQ ID NO =12-17, 32和34的序列比較，具有ー個或多個取代，插入和/或缺失，在所述變體在適度嚴格條件下與包含SEQ ID NO :12-17，32和34的序列的核酸雜交的條件下，或在所述變體包含由于遺傳密碼子的簡并性所造成的核酸變化的條件下，其編碼與SEQ ID NO 12-17，32和34的核酸序列相同或功能上等價的氨基酸。術語“核酸序列”指這些核苷酸的雜聚物或這些核苷酸的序列。術語“核酸”和“多核苷酸”在本文交互地使用來指核苷酸的雜聚物。雜交的嚴格性，用于本文吋，指這樣的條件，在所述條件下，所述多核苷酸雙鏈體是穩(wěn)定的。如本領域那些技術人員已知的，雙鏈體的穩(wěn)定性是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)(見，例如 Sambrook et al. , Molecular Cloning :ALaboratory Manual 2nd Ed. (ColdSpring Harbor Laboratory，(1989))。用于雜交的嚴格性水平可以容易地由本領域那些技術人員來改變。用于本文吋，短語“適度嚴格條件”指這樣的條件，其容許DNA結合于互補核酸，所述互補核酸與所述DNA具有約60%的同一性，優(yōu)選地約75%的同一性，更優(yōu)選地約85%的同一性；其中與所述DNA大于約90%的同一性是尤其優(yōu)選的。優(yōu)選地，適度嚴格條件是這樣的條件，其等價于在50%甲酰胺，5x Denhart' s溶液，5x SSPE，0. 2% SDS中于42°C進行雜交，隨后在0. SSPE,0. 2% SDS，于65°C進行洗滌。按照第三個方面，提供包含上述提及的核酸的載體。優(yōu)選地，提供包含所述核酸的表達載體。該表達載體優(yōu)選地包含一個或多個調節(jié)序列。術語“表達載體”通常指從 DNA(RNA)序列表達多肽/蛋白質的質?；蚴删w或病毒或載體。表達載體可以包含轉錄單位，其包含(1)遺傳元件或在基因表達中具有調節(jié)作用的元件，例如啟動子或增強子，(2) 被轉錄成mRNA并翻譯成蛋白質的結構或編碼序列，和C3)適合的轉錄起始和終止序列的組合。傾向于用在酵母或真核生物表達系統(tǒng)中的結構單位優(yōu)選地包括能夠使宿主細胞胞外分泌翻譯的蛋白質的前導序列。備選地，當在無前導或轉運序列的情況下表達重組蛋白吋，其可以包括氨基端甲硫氨酸殘基。隨后該殘基可以或可以不從表達的重組蛋白上裂解來提供最終的產(chǎn)物。按照優(yōu)選的實施方案，所述載體是質?；虿《据d體，其優(yōu)選地是桿狀病毒載體系統(tǒng)或痘苗病毒載體系統(tǒng)。還可以在本發(fā)明中使用另外的病毒載體系統(tǒng)。根據(jù)不同的情況， 可能需要對載體進行修飾。另外的病毒載體的實例是腺病毒和所有的負鏈RNA-病毒，例如狂犬病毒，麻疹病毒，RSV，等。按照優(yōu)選的實施方案，所述載體是如在圖6中或在SEQ ID NO :55中所顯示的克隆載體pAZL，或如上定義的其變體。該載體顯示下列性質和優(yōu)勢1.高擴增(比其它克隆載體更高)2.容許合成基因的受控的和連續(xù)的構建(已知沒有其它的載體提供這種能力)。本發(fā)明的第四個方面包含宿主，其已經(jīng)用如上定義的載體進行了轉化。所述宿主可以是原核生物細胞。在這種情況下，優(yōu)選大腸桿菌(E. coli)或枯草芽孢桿囷(Bacillus subtilise。此外，宿主可以是真核細胞，優(yōu)選地哺乳動物細胞，植物細胞，酵母細胞或昆蟲細胞。所述哺乳動物細胞優(yōu)選地是CHO，COS, HeLa, 293T，HEH或BHK細胞。還優(yōu)選使用酵母細胞作為宿主細胞，其優(yōu)選地是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂埴酵母(Schizosaccharomyces pombe)，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris),白色念珠菌(Candida albicans)或多形漢森酵母(Hansenula poiymorpna)。作為昆蟲細胞，可以優(yōu)選使用鱗翅目(I^pidoptera)昆蟲細胞，更優(yōu)選使用來自 Spodoptera frugiperda和來自粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的細胞。最優(yōu)選地，所述昆蟲細胞是Sf9，Sf21或高效(high five)細胞。昆蟲細胞表達系統(tǒng)，例如相對于細菌系統(tǒng)的一個優(yōu)勢在于這樣的事實，即產(chǎn)生的蛋白質被糖基化，由此作為微生物降解的靶標。這種性質例如在藥物領域，只要絲蛋白質傾向于其中需要生物降解的體內應用，可能是重要的。該性質可以特別應用在縫線材料和傷ロ閉合和覆蓋系統(tǒng)中。當宿主是植物細胞吋，植物細胞優(yōu)選地來自煙草、馬鈴薯、玉米和西紅柿。按照第五個方面，提供聚集蜘蛛絲蛋白的方法，其包括下列步驟a)制備包含如上定義的非取向的(imoriented)蜘蛛絲蛋白的蛋白質溶液；b)使在a)中制備的溶液暴露于聚集引發(fā)物；和c)回收沉淀的蜘蛛絲蛋白。優(yōu)選地，通過用本文公開的載體或核酸轉化如上定義的適合的宿主，并且在適合的條件下表達所述蜘蛛絲基因來產(chǎn)生用在步驟a)中的蜘蛛絲蛋白。所述聚集引發(fā)物優(yōu)選地選自優(yōu)選地到約1的PH的酸化，磷酸鉀和優(yōu)選地旋轉所述蛋白質溶液并應用切應カ的機械應力。引發(fā)步驟證實是對于進行本發(fā)明的方法所必需的。本發(fā)明人令人驚奇地顯示，特別地，上述提及的引發(fā)因素増加了蜘蛛絲蛋白的聚集，這特別地從エ業(yè)觀點來看極為理想的。與此有關的參考見下面的“結果”章節(jié)，其中這些引發(fā)因子對本發(fā)明的重組蜘蛛絲蛋白的影響被解釋如下每種引發(fā)因素的影響可以在本發(fā)明的不同的重組蜘蛛絲蛋白之間變化，然而可以被視為一般概念的是，那些引發(fā)因素在體外顯示對所有的包含本發(fā)明的成分，即重復和/或非重復的區(qū)域的重組蛋白的意料外的高度影響。此外，其可以衍生自本文提供的結果，即不僅単一的引發(fā)因素，而旦那些因素的組合可以導致本發(fā)明的聚集蜘蛛絲蛋白的最佳方式。然而，應該注意的是該方法不局限于本發(fā)明的蜘蛛絲蛋白質，其還可以用于無論是天然存在還是合成的所有的其它可獲得的蜘蛛絲蛋白。所述方法還優(yōu)選地包含通過適合的方法將在步驟a)中制備或在c)中回收的所述蛋白紡絲為絲，納米纖維和線的步驟。為此目的，可以使用本身為本領域已知的紡絲方法。例如，蜘蛛絲蛋白的粘稠物溶液通過吐絲器擠壓形成生物絲。得到的生物絲可以被牽引或伸長。只要分子的晶體和非晶形排列存在于生物絲中，牽引或伸長將施加足以使分子定向使它們更加平行于絲壁的切應力并增加生物絲的拉伸強度和韌性。粘稠物溶液可以包含衍生自ー種或多種蜘蛛物種的本發(fā)明的重組絲蛋白和/或真正的絲蛋白，或衍生自不同產(chǎn)絲種屬的絲蛋白，例如衍生自蜘蛛和B. mori的絲蛋白的混合物。在大多數(shù)優(yōu)選的實施方案中，所述的絲蛋白是來自N. clavipes或A. diadematus的拖絲的絲和/或鞭形的絲，尤其是蛋白MaSpI，MaSpII, ADF-3，和ADF-4和Flag。在備選實施方案中，粘稠物溶液包含絲蛋白和ー種或多種合成聚合物或天然或合成生物絲蛋白的混合物。優(yōu)選地，粘稠物溶液是至少1 %，5 %，，10 %，15 %重量/體積(w/v)絲蛋白。更優(yōu)選地，所述粘稠物溶液是多到20 %，25 %，30 %，35 %，40 %，45 %，或50 % w/v的絲蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，粘稠物溶液包含基本純的蜘蛛絲蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，粘稠物具有約6. 9的pH。所謂“粘稠物溶液”指包含絲蛋白的任何液體混合物，并且易于擠壓來形成生物絲或薄膜鑄塑。除了蛋白質單體之外，粘稠物溶液還可以包含更高級的團聚體，其包括，例如 ニ聚體，三聚體和四聚體。通常，粘稠物溶液是pH 4. 0-12. 0的水溶液并具有少于40%的有機或離液序列高的試劑(w/v)。優(yōu)選地，所述粘稠物溶液不包含任何有機溶劑或離液序列高的試劑，但是可以包括添加劑來增加溶液的防腐性、穩(wěn)定性或可使用性。至干“絲”，是指不確定長度的纖維，范圍從納米等級和極微的長度到一英里或更長的長度。絲(silk)是天然的絲，同時尼龍和聚酯作為合成絲的實例。關于怎樣紡織(spin)蜘蛛絲蛋白纖維的另外的信息可以見于 W003060099 (Karatzas et al.)，其公開于2003年7月M日，將其并入本文作為參考。此外，本發(fā)明的蜘蛛絲蛋白可以作為薄膜等進行提供，即作為對于其不需要紡絲步驟的蜘蛛絲蛋白產(chǎn)物進行提供。關于制備薄膜的方法的更詳細的描述參考實施例章節(jié)。另外，本發(fā)明的方法可以優(yōu)選地在步驟a)和/或c)中包括純化方法，所述方法包括使被表達的蜘蛛絲蛋白暴露于在60-90，優(yōu)選地在70-80°C的熱變性，隨后添加 600-1400mM，優(yōu)選地 800-1200mM 的硫酸銨。如已經(jīng)在上面解釋，本文定義的蛋白質/線可以用在生物技術和/或藥物的領域中，優(yōu)選地用于制備傷ロ閉合或覆蓋系統(tǒng)，用在神經(jīng)外科手術或眼科外科手術的縫線材料中。此外，蛋白質/線可以優(yōu)選地用于制備替代材料，優(yōu)選地人造軟骨或腱材料。另外，本發(fā)明的線/纖維可以用于制備醫(yī)學裝置諸如醫(yī)學粘附帯，皮膚移植物，替代的韌帶，和外科手術網(wǎng)眼；和用于制備廣泛范圍的エ業(yè)和商業(yè)產(chǎn)品諸如衣服織物，防弾衣村里，容器織物，包或錢包帯，纜，繩，粘附性結合材料，非粘附性結合材料，皮帶材料，汽車覆蓋物和部件，飛行器構建材料，抗風化材料，柔性分割材料，運動設備；和事實上需要高拉伸強度和弾性特性的纖維或織物的幾乎任何應用中。本發(fā)明還意欲以其它形式存在的穩(wěn)定的纖維產(chǎn)品，諸如干的噴霧涂層，珠子樣顆粒的適應性和應用，或在與其它的組合物的混合物中的應用。要清楚地注意到本發(fā)明的蜘蛛絲蛋白的最優(yōu)選的應用是制備和加工衣服織物 (紡織品)和皮革，汽車覆蓋物和部件，飛行器構建材料以及制備和加工紙。本發(fā)明的重組蜘蛛絲蛋白可以添加到纖維素和角蛋白和膠原蛋白產(chǎn)物，并且因此，本發(fā)明還涉及包含纖維素和/或角蛋白和/或膠原蛋白和蜘蛛絲蛋白的紙或皮膚護理和頭發(fā)護理產(chǎn)品。其中結合了本發(fā)明的蛋白的紙和皮膚護理和頭發(fā)護理產(chǎn)品顯示改善的特性，具體而言提高的拉伸強度或抗撕裂強度。此外，還可以將本發(fā)明的重組蜘蛛絲蛋白用作紡織品和皮革制品的涂層，由此賦予被涂布的產(chǎn)品以穩(wěn)定性和耐久性。絲蛋白特別顯示對于涂布皮革制品的應用性，并且因此，鞣革及其對環(huán)境的負作用可以避免或至少減少。除非另外指出，本文所用的所有的技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員公知的具有相同的含義。將所有的出版物，專利申請，專利，和本文提及的其它的參考文獻全部內容并入本文作為參考。如有沖突，本說明書，包括定義將進行控制。此外，所述材料，方法和實施例僅是舉例說明性的，而不傾向于限制?，F(xiàn)在，本發(fā)明還通過實施例和附圖進行舉例說明，所述附圖顯示如下

圖1構建合成的蜘蛛絲基因的克隆策略。(A)克隆盒包含組件多聚化所需要的限制酶切位點(BsgI和BseRI)和切除組合的基因所需要的限制酶切位點(Ncol，BamHI, Hindlll)。在基因構建過程中，間隔區(qū)域被組件和組件多聚體所替代。(B)通過連接兩個適合的質粒片段來實現(xiàn)兩個組件的定點連接。重新構建載體的氨芐青霉素抗性基因(AF)。
(C)將連接兩個組件所需要的核苷酸限定在每個組件的第一個密碼子中。(D)組件多聚體象單ー組件ー樣連接，導致了合成基因的受控制的裝配。(E)被設計的絲組件的氨基酸序列衍生自拖絲的絲蛋白ADF-3和ADF-4。圖2蜘蛛絲蛋白的分析。(A)在用抗-T7-標記抗體進行蛋白質印跡后檢測重組絲蛋白的T7-標記。⑶將蛋白質進行SDS-PAGE，隨后進行銀染。由于(AQ)12和(QAQ)8的弱染色，圖像的對比度通過電子儀器被増加。(C)分別用^Onm(直線)或(虛線)的激發(fā)波長顯示純化的C16NR4的熒光發(fā)射光譜。圖3蜘蛛絲蛋白的ニ級結構和溫度轉變。(A)在20°C記錄r印-蛋白質(直線)， r印NR-蛋白質(虛線)和NR-蛋白質(長虛線)的CD-光譜。(B)當將合成的絲蛋白加熱到90°C (直線)，隨后冷卻到20°C (虛線)吋，在220nm測量可溶性蜘蛛絲蛋白的平均殘基重量(MRW)的橢圓度。圖4合成的蜘蛛絲蛋白的聚集。在緩沖液中，在存在300mM NaCl或300mM KCl的情況下，在PH 1的情況下，或在存在300mM磷酸鉀的情況下，溫育1小時后，確定蛋白質的聚集。衍生自ADF-3的蛋白質的棒條淺灰色；衍生自ADF-4的蛋白質的棒條深灰色。圖5構建合成的鞭形蜘蛛絲基因的克隆策略(見，圖1)。將單一組件連接于同型-多聚體(a)以及異型-多聚體(b)。(c)顯示衍生自N^hila clavipes的鞭形絲蛋白 (Flag)的被設計的鞭形絲組件的氨基酸序列。圖6顯示載體pAZL的限制性酶切圖譜。圖7 蜘蛛絲蛋白的裝配形式。㈧通過掃描電鏡(SEM)觀察的由C16形成的球體。 (B)通過原子力顯微鏡觀察的由C16NR4形成的納米纖維(高度信息)。(C，D)通過SEM研究由(AQ)24NR3形成的微纖維(C)。對于切割纖維井隨后觀察截面，使用聚焦的Ca+離子束
(D)。⑶產(chǎn)生自(AQ)24NR3溶液的泡沫。(F)產(chǎn)生自C16NR4溶液的泡沫。(G)由C16NR4納米纖維形成的交聯(lián)的凝膠。圖8 合成絲蛋白(AQ)24NR3和C16的CD-光譜，所述合成絲蛋白(AQ)24NR3和C16 溶解在6M硫氰酸胍，隨后針對5mM磷酸鉀pH 8. 0進行透析(直線)或溶解在HFIP中(虛線)。圖9 從在HFIP中的2% w/v C16溶液中鑄塑的C16薄膜。圖10 制備自(AQ)MNR3和C16的蛋白質薄膜的CD-光譜。薄膜直接在単色(plain) 石英玻璃上，從在HFIP中的蛋白質溶液中進行鑄塑，并通過CD-光譜學進行分析(虛線)。 隨后用IM的磷酸鉀來處理薄膜并再次進行分析。由于在確定薄膜的厚度上的誤差，不能確
疋 L Q MRW0圖11 從HFIP溶液中鑄塑并用磷酸鉀處理的C16薄膜的修飾。㈧當使用EDC來活化(+) C16的羧基基團時，僅發(fā)生熒光素(黃色)的有效偶聯(lián)。與此相対，在沒有EDC激活的情況下(_)，僅有少量熒光素結合于薄膜。(B)使用X-Gal作為底物，檢測偶聯(lián)的β -半乳糖苷酶的活性。藍色沉淀物的發(fā)生指示僅在用EDC活化的薄膜上具有酶活性(+)，而未活化的薄膜僅顯示殘余的酶活性(_)。圖12 =C16納米纖維的AFM圖像。圖13 =C16納米纖維制備的水凝膠。
圖14 交聯(lián)的和非交聯(lián)的水凝膠在10mg/ml濃度上的應カ/張カ表現(xiàn)。圖15 對于在20mg/ml濃度的交聯(lián)的和非交聯(lián)的纖維網(wǎng)絡的取決于恢復模量 (G')和損失模量(G")的頻率。圖16 對于交聯(lián)的和非交聯(lián)的水凝膠，取決于在0.5Hz頻率上的恢復模量的濃度。 兩種網(wǎng)絡具有與濃度的平方[c]2成比例的恢復模量。
實施例實驗方法材料.如果沒有另外指出，化學品獲自Merck KGaA(Darmstadt，德國)。如前所述 (19)進行DNA的操作和修飾。限制性酶獲自New England Biolabs (Beverly，MA，USA)，連接酶犾曰 Promega Biosciences Inc. (San Luis Obispo, CA, USA) 用來目 Qiagen (Hilden, 德國)的試劑盒來進行DNA純化。合成的寡核苷酸獲自MWG Biotech AG^bersbergJiI 國)。所有的克隆步驟在來自Novagen (Madison，WI, USA)的大腸桿菌菌株DHlOB中進行。克隆載體pAZL的構建。通過使兩個合成的寡核苷酸CCl (GATCGAGGAGGATCCATGGG ACGAATTCACGGCTAATGAAAGCTTACTGCAC)(SEQ ID NO 18)和 CC2 (AGCTGTGCAGTAAGCTTTCATTA GCCGTGAATTCGTCCCATGGATCCTCCTC) (SEQ ID NO 19)退火來產(chǎn)生具有黏性末端的克隆盒，所述黏性末端互補于由BgIII和HindIII產(chǎn)生的那些。通過將50pmol/μ 1 (每種)寡核苷酸溶液的溫度以0. I0C /s的微量從95°C減少到20°C來完成退火。錯配的雙鏈在70°C變性， 隨后減少到20°C。在重復20°C -70°C -20°C循環(huán)10次后，以65°C的變性溫度進行另外的循環(huán)。將得到的克隆盒與用BgIII和HindIII消化的pFastbacl載體Qnvitrogen, Carlskid， California, USA)進行連接。在此克隆步驟后，兩個限制性酶識別序列被破壞。將得到的新的克隆載體稱為PAZL。將絲組件和NR-區(qū)域克隆到pAZL載體中。在考慮細菌密碼子選擇的情況下，將衍生自拖絲的絲蛋白ADF-3和ADF-4的三個氨基酸組件(圖1E)回譯為DNA序列。如上所述，來合成相應的互補DNA寡核苷酸Al (TCCGTACGGCCCAGGTGCTAGCGCCGCAGCGGCAG CGGCTGGTGGCTACGGTCCGGGCTCTGGCCAGCAGGG) (SEQ ID NO 20)和 A2(CTGCTGGCCAGAGCC CGGACCGTAGCCACCAGCCGCTGCCGCTGCGGCGCTAGCACCTGGGCCGTACGGACC)(SEQ ID NO 21), Ql (TCCGGGCCAGCAGGGCCCGGGTCAACAGGGTCCTGGCCAGCAAGGTCCGGGCCAGCAGGG) (SEQ ID NO :2 和 Q2 (CTGCTGGCCCGGAC CTTGCTGGCCAGGACCCTGTTGACCCGGGCCCTGCTGGCCCGGACC)(SEQ ID NO 23)，Cl(TTCTAGCGCGGCTGCAGCCGCGGCAGCTGCGTCCGGCCCGGGTGGCTACGGTCCGGAAAACCAGGG TCCATCTGGCCCGGGTGGCTACGGTCCTGGCGGTCCGGG)(SEQ ID NO 24)和 C2 (CGGACCGCCAGGACCGT AGCCACCCGGGCCAGATGGACCCTGGTTTTCCGGACCGTAGCCACCCGGGCCGGACGCAGCTGCCGCGGCTGCAGCC GCGCTAGAACC) (SEQ ID NO 25)并對其進行退火，將其與用BsgI和BseRI消化的pAZL載體連接。使用下列引物通過PCR擴增蜘蛛絲基因adf-3 (gi 11263286)和adf-4 (gi 11263288) (獲自 Prof. Gosline, Vancouver, Canada)的 NR-區(qū)域NR3f(GAAAAACCATGGGTGCGGCTTCTGCAGCTGTATCTG)(SEQ ID NO :26)，NR3r0145](GAAAAGAAGCTTTCATTAGCCAGCAAGGGCTTGAGCTACAGATTG)(SEQ ID NO 27),
0146]NR4f
0147](GAAAAACCATGGGAGCATATGGCCCATCTCCTTC)(SEQ ID NO :28)禾ロ
0148]NR4r
0149](GAAAAGAAGCTTTCATTAGCCTGAAAGAGCTTGGCTAATCATTTG)(SEQ ID NO :29)。
0150]對于Flag序列，可以使用下列引物和盒
0151]PCR-引物:
0152]FLAG-N-chr-有義(SEQ ID NO 43)
0153]5’ -GAAAAACCATGGGCGAAAGCAGCGGAGGCGAT-3，
0154]FLAG-N-chr-反(SEQ ID NO 44)
0155]5’ -GAAAAGAAGCTTTCATTAGCCTGGGCTGTATGGTCC-3，
0156]FLAG-C-chr-反義(SEQ ID NO 45)
0157]5’ -GAAAAACCATGGGTGCTTATTATCCTAGCTCGC-3，
0158]FLAG-C-chr-反(SEQ ID NO 46)
0159]5’ -GAAAAGAAGCTTTCATTAGCCATAAGCGAACATTCTTCCTAC-3’組件 Y- (GPGGX) _ds (SEQ ID NO 47)5' -TCCGGGCGGTGCGGGCCCAGGTGGCTATGGTCCGGGCGGTTCTGGGCCGGGTGGCTACGGTCCTGGCGGTTCCGGCCCGGGTGGCTACGG -3，組件Y- (GPGGX) _cs (SEQ ID NO 48)5 ’ -GTAGCCACCCGGGCCGGAACCGCCAGGACCGTAGCCACCCGGCCCAGAACCGCCCGGACCATAGCC ACCTGGGCCCGCACCGCCCGGACC-3’組件sp-(間隔區(qū))-ds (SEQ ID NO 49)5’ -TGGCACCACCATCATTGAAGATCTGGACATCACTATTGATGGTGCGGACGGCCCGATCACGATCTC TGAAGAGCTGACCATCGG-3’組件sp-(間隔區(qū))-cs (SEQ ID NO 50)5’ -GATGGTCAGCTCTTCAGAGATCGTGATCGGGCCGTCCGCACCATCAATAGTGATGTCCAGATCTTC AATGATGGTGGTGCCACC-3’組件K- (GPGGAGGPY) -ds (SEQ ID NO 51)5 ’ -TCCGGGCGGTGCTGGCGGTCCGTACGGCCCTGGTGGCGCAGGTGGGCCATATGGTCCGGGCGGTGC GGGCGGTCCGTACGG-3，組件K- (GPGGAGGPY) -cs (SEQ ID NO 52)5 ’ -GTACGGACCGCCCGCACCGCCCGGACCATATGGCCCACCTGCGCCACCAGGGCCGTACGGACCGCC AGCACCGCCCGGACC-3'組件X- (GGX) -ds (SEQIDN0 53)5’ -TGGCGCTGGTGGCGCCGGTGGCGCAGGTGGCTCTGGCGGTGCGGGCGGTTCCGG-3’組件X- (GGX) -cs (SEQ ID NO 54)5’ -GGAACCGCCCGCACCGCCAGAGCCACCTGCGCCACCGGCGCCACCAGCGCCACC-3’在用NcoI和HindIII消化后，連接PCR產(chǎn)物和pAZL載體。克隆合成的組件和PCR產(chǎn)物導致取代克隆的盒間隔區(qū)，保持其元件的排列。對于更有效的翻譯，使用PCR誘變(19) 將NR3和NR4中的極少在大腸桿菌中翻譯的密碼子AGA (精氨酸)突變?yōu)镃GT (精氨酸)。合成的蜘蛛絲基因的構建。連接兩個基因片段，例如單組件，組件多聚體或NR-區(qū)域代表克隆策略的基本步驟。為此目的，將包含指定得到5'-端基因片段的pAZL載體用 BsaI和BsgI消化，同時分別用BseRI和BsaI消化包含3'-端基因片段的載體(圖1B)。 適合的質粒片段的連接產(chǎn)生了兩個基因片段的連接并導致促進鑒定正確的構建體的PAZL 載體的氨芐青霉素抗性基因(Ap1O的重構。對于基因構建，首先將單ー組件連接從而產(chǎn)生重復單位(圖ID+圖5)。這些被逐漸多聚化并任選地連接以NR-區(qū)域。最終，用BamHI和HindIII將合成的基因構建體以及NR-區(qū)從pAZL載體上切除下來，并連接以以同樣方式消化的細菌表達載體 pET2la (Novagen)，提供 T7-標記(MASMTGGQQMGR) (SEQ ID NO 30)編碼序列 QO)。通過DNA 測序來證實所有的構建體的忠實性?；虮磉_。所有的絲基因在大腸桿菌菌株BLR[DE3] (Novagen)中進行表達。將細胞于37°C在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到OD6tltl = 0. 5。在用ImM IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)誘導前，分別對于(AQ)12, (AQ) 12NR3, (QAQ)8,和(QAQ) 8NR3，將細胞變化到30°C，對于 C16，C16NR4，NR3和NR4，將細胞變化到25°C。備選地，使用復合培養(yǎng)基Ql)和補料分批技術 (22)，將細胞在發(fā)酵罐中培養(yǎng)到OD6tltl = 40-50。此外，在用ImM IPTG誘導前，分別將細胞變化到 25°C或 300C ο 在誘導 3-4 小時后，收集表達(AQ)12 (AQ) 12NR3，(QAQ)8, (QAQ) 8NR3，Q6 禾ロ C16NR4的細胞，而在誘導后16小時收集表達NR3和NR4的細胞。蛋白質純化。將細胞用包含20mM N_(2_羥乙基)哌嗪-N' _(2_乙磺酸)(HEPES) pH 7. 5，IOOmM NaCl,0. 2mg/ml 溶菌酶(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的 5ml/g 的緩沖液重懸，并在4°C溫育30分鐘。使用HD/UW2200/KE76超聲發(fā)生器(Bandelin，Berlin, 德國)通過聲波振蕩裂解細胞，并通過用0. lmg/ml脫氧核糖核酸酶I (Roche，Mannheim，德國)和3mM的MgCl2在4 °C溫育細胞裂解物60分鐘來消化基因組DNA。于50，000 X g和4°C 沉淀不可溶的細胞片段30分鐘。通過在80°C熱變性20分鐘，來將包含(AQ)12 (AQ) 12NR3， (QAQ)8, (QAQ)8NR3, C16和C16NR4的裂解物的可溶性大腸桿菌蛋白質沉淀下來，而將包含NR3 和NR4的裂解物加熱到70°C達相同的時間長度。通過在50，OOOXg的30分鐘的沉淀來去除沉淀的蛋白質。將在熱變性過程中仍舊可溶的絲蛋白用20%硫酸銨(SOOmM) ((AQ)12, (AQ) 12NR3, (QAQ)8, (QAQ) 8NR3, Q6 和 C16NR4)或 30%硫酸銨(1200mM) (NR3 和 NR4)，于室溫進行沉淀，并在10，OOOXg離心10分鐘進行收集。用包含與用于沉淀時相同的濃度的硫酸銨的溶液來漂洗(AQ)12, (AQ)12NR3, (QAQ)8, (QAQ)8NR3，NR3和NR4的沉淀物并將其溶解在 6M的氯化胍(GdmCl)中。與此相反，用8M尿素來洗滌C16和C16NR4，并將其溶解在6M硫氰酸胍(GdmSCN)中。針對IOmM NH4HCO3來透析所有的蛋白質。通過在50，000Xg沉淀30分鐘來去除在透析過程中形成的沉淀物并將余下的可溶性絲蛋白凍干。在分析前，將凍干的蛋白質溶解在6M GdmSCN中，隨后進行針對適合的緩沖液的透析。通過在125，000X g沉淀 30分鐘去除團聚體。使用計算的消光系數(shù)(表1) (23)，在Icm通徑長的比色杯中于276nm 通過光度法確定蛋白質的濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE ；對于> 20kDa的蛋白質，10% Tris-甘氨酸凝膠，對于< 20kDa的蛋白質，10-20% Tris-麥黃酮(Tricine)凝膠(Invitrogen))，隨后在聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore, Billerica,MA，USA)上進行印跡法并使用小鼠抗-T7單克隆抗體(N0Vagen，l 10，000)作為ー抗，使用杭-小鼠IgG過氧化物酶綴合物(Sigma-Aldrich，l 5，000)作為ニ抗來證實鑒定的蛋白質。使用來自 Amersham Biosciences (Piscataway, NJ, USA)的 ECLplus 蛋白質印跡檢測試劑盒觀察過氧化物酶的活性。熒光.在FluoroMax 分光熒光計(Jobin Yvon Inc, Edison, NJ, USA)上記錄熒光光譜。在室溫，使用在IOmM Tris (羥甲基)氨基甲烷CTris)/HCl (pH 8.0)中的lOOyg/ml 蛋白質濃度來記錄光譜。整合時間是ls，步長(st印size)是0. 5nm，帶寬分別是5nm(激發(fā))和5nm (發(fā)射)。ニ級結構分析.使用裝備了溫度控制裝置(Jasco International Co. Ltd., Tokyo,日本)的Jasco 715分光偏振儀來獲得Far-UV園二色性(⑶)光譜。于20°C，在 0. Icm通徑長的石英比色杯中，以在5mM Tris/HCl(pH 8. 0)中的150μ g/ml蛋白質濃度記錄所有的光譜。掃描速度是20nm/min，步長是0.2nm，整合時間設定為ls，帶寬是lnm。將四次掃描平均，并用緩沖液校正。在220nm，以1°C /分的加熱/冷卻變化來分析熱轉化。溶解度測定.為了確定可溶性蛋白質的最大濃度，使用10，OOODa分子量的截留值的聚醚砜膜 (Vivascience AG, Hannover，德國)通過超濾作用來濃縮在IOmM Tris/HCl pH 8. O中的 lmg/ml ( = 0. 1% (w/v))溶液。以不同的間隔，從溶液中取出樣品直到蛋白質開始沉淀。在 IOmM Tris pH 8. 0中稀釋樣品來通過光度法來確定蛋白質濃度。聚集測定.將所有的樣品在IOmM Tris/HCl pH 8. 0中調節(jié)到lmg/ml。為了測試離子對絲蛋白聚集的影響，將鹽添加到300mM的最終濃度。通過將HCl添加到IOOmM的最終濃度(PH = 1)來研究酸化的作用。將所有的樣品在室溫溫育1小吋。將蛋白質沉淀物通過在125，OOOXg沉降25分鐘，從所有的樣品中去除，通過光度法確定剩余的可溶性蛋白的量。由于可溶性和聚集的蛋白質的總量必須等于開始的可溶性蛋白的量，可以通過將可溶性蛋白的量從開始使用的蛋白質的量中扣除來計算聚集的蛋白質的百分比。結果設計絲樣蛋白的克隆策略.真正的蜘蛛絲基因在細菌宿主中的表達是不充分的 (24)，因為ー些基因部分包含在細菌中不能有效翻譯的密碼子。此外，由于絲的重復性質， 通過PCR進行基因操作和擴增的是困難的。為了研究蜘蛛絲蛋白的性質，使用具有適應于相應的表達宿主的密碼子選擇的合成的DNA組件來應用克隆策略。獲得編碼與蜘蛛絲的重復區(qū)域相似的蛋白質的合成基因05- )。重要的是，這些蛋白質設計中沒有ー個包括在所有的拖絲的絲中發(fā)現(xiàn)的羧基端的NR-區(qū)。發(fā)明人開發(fā)了容許不同的合成DNA組件以及真正的基因片段的受控制的組合的連續(xù)的克隆策略09)。設計包含克隆盒和限制性酶識別位點BseRI和BsgI的克隆載體 pAZL(圖1A)，所述克隆盒具有間隔區(qū)，其充當合成基因的占位符。因為這些酶的識別和裂解位點是8 (BseRI)或12 (BsgI)核苷酸間隔(apart)，翻譯起始和終止密碼子以及切除組裝的基因所需要的另外的限制酶切位點可以在位置上鄰近于間隔區(qū)。在第一個克隆步驟中，pAZL的間隔區(qū)被合成的DNA組件所取代(見下面的組件設計)。隨后，可以以定點的方式連接兩個組件(見材料和方法以及圖1B)。將通過用BsgI
19和BseRI裂解產(chǎn)生的互補的3'單鏈延伸GG (有義)和CC (反義)用于連接兩個組件(圖 1C)。因此，將連接兩個組件所需要的DNA序列限制到甘氨酸密碼子(GGX)。甘氨酸天然在蜘蛛絲蛋白中是豐富的( 30% )，因此，可以在不需要捜索限制性核酸內切酶識別位點的情況下設計組件，其在翻譯后，匹配真正的氨基酸序列。因為在克隆和多聚化后，克隆盒元件的排列保持不變，可以構建多種組件的組合(圖1D)。合成的蜘蛛絲的設計、合成和純化.發(fā)明人選擇來自園蛛十字園蛛的拖絲的絲蛋白ADF-3和ADF-4(3)作為合成構建體的模板。部分確定的ADF-3的一級結構主要由重復單位組成，其都包含包括聚丙氨酸基序的共有序列。通過改變基序GPGQQ的數(shù)量來確定個體重復單位的長度。為了模擬ADF-3的重復序列，我們設計了兩個組件。ー個組件，被稱為 A，來自包含聚丙氨酸的共有序列(圖1E)。第二個組件被稱為Q，包含GPGQQ基序的四個重復序列。為了研究不同長度的重復單位，將ー個或兩個Q組件組合以ー個A組件以獲得 (AQ)或(QAQ)。將這些重復單位多聚化以產(chǎn)生用于編碼重復蛋白質(r印-蛋白質)(AQ)12 和(QAQ)8的合成基因。ADF-4的重復部分通常由僅顯示輕微變化的単一保守的重復單位組成。發(fā)明人將這些變化組合并設計ー個被稱為C的共有組件(圖1 ，發(fā)明人將所述共有組件多聚化以獲得rep-蛋白C16。選擇在所有的合成基因中的組件重復序列的數(shù)量來編碼具有類似分子量 ( 50kDa)的蛋白質。ADF-3和ADF-4在它們的羧基端都顯示同源的NR-區(qū)，其分別包含IM和109個氨基酸。通過PCR來擴增編碼這些區(qū)域的基因序列，并通過定點誘變(見材料和方法)將對于細菌的表達存在問題的密碼子改變?yōu)楦m合的密碼子。因此，所有的所用合成基因可以組合以適合的真正的NR-區(qū)，產(chǎn)生編碼r印NR-蛋白質(AQ)12NR3，(QAQ)8NR3和C16NR4的基因。另外，NR3和NR4可以單獨表達。細菌合成后，絲蛋白通過加熱步驟隨后進行硫酸銨沉淀來進行純化。通過使用針對連接于所有的絲蛋白的氨基端末端的T7肽標記序列的抗體，通過免疫印跡法證實蛋白質的鑒定(圖2A)。盡管所有的rep-蛋白質和所有的repNR-蛋白質具有類似的分子量(表 1)，當進行SDS-PAGE吋，它們顯示不同的遷移速度。這種效果可能是因為十二烷基硫酸鹽由于不同的氨基酸組成，與蛋白質異常結合，使蛋白質凈電荷變化而導致的。除了全長蛋白質，免疫印跡法顯示在制備repNR-蛋白質中具有低分子量的痕量蛋白質的存在?？筎7-標記抗體與這些蛋白質的結合將它們鑒定為缺乏它們的羧基端末端部分的絲蛋白質。通過 SDS-PAGE和銀染分析每種純化的蛋白質，在所有的蛋白質制備物中沒有檢測到另外的蛋白質(圖2B)。另外通過測量熒光發(fā)射來確定蛋白質純度。280nm波長的入射光導致酪氨酸和色氨酸的激發(fā)和熒光發(fā)射，而的光專門激發(fā)后者。因為所設計的蜘蛛絲蛋白中沒有ー種包含色氨酸，在用295nm激發(fā)后熒光發(fā)射指示污染了大腸桿菌的蛋白質，其平均包含1. 5%的色氨酸(30)。所有的絲蛋白制備物的熒光測量掲示與酪氨酸的光譜類似的發(fā)射光譜，其在絲蛋白中大量存在。與此相反，檢測不到色氨酸熒光，顯示蛋白質制備物的高純度(在圖2B中顯示對于C16NR4的數(shù)據(jù))。在錐形瓶中進行的合成絲蛋白的細菌生產(chǎn)，對于所有的構建體產(chǎn)生了類似的蛋白質產(chǎn)量。個體制備物的產(chǎn)量在每升培養(yǎng)基10到30mg純化的蛋白質的范圍內。應用細胞發(fā)酵以研究高質量蛋白質合成的可能性。因此，(QAQ)8NR3和C16NR4的產(chǎn)量可以分別増加到140 和 360mg/l。R印NR-蛋白質由較差結構的重復區(qū)域和高度結構的非重復結構域組成。通過⑶ 光譜學研究ニ級結構。Rep-蛋白質掲示對于內部無結構蛋白質的典型的光譜。與此相対， NR-蛋白質掲示指示高ニ級結構含量的光譜。這些區(qū)域似乎獨立代表折疊的蛋白質結構域。 repNR-蛋白質的光譜大致相應于按照它們在repNR-蛋白質中的分配加載的rep-和NR-光譜的組合。盡管在相互連接后，不能排除在r印-區(qū)域或NR-結構域中的微小結構變化，可能的是，repNR-蛋白質由大部分顯示隨機卷曲結構的區(qū)域和羧基端折疊蛋白質結構域組成。 令人驚奇的是，r印NR-蛋白質的光譜類似于獲自直接提取自蜘蛛(N印hila clavipes)的主要壺腹狀絲粘稠物的光譜(9)。在熱和化學變性后的絲蛋白質再折疊在加熱后，通過CD-光譜學研究結構變化， 沒有觀察到在20°C和90°C之間的對于r印-蛋白質的協(xié)同溫度變化(31 ;32)(圖3)。因為 r印NR-蛋白質至少是部分結構化的，應該在升高的溫度上可檢測到結構化區(qū)域的熱伸展。 因此，觀察到協(xié)同的溫度轉變。溫度轉變的中點分別是67°C ((QAQ)8NR3)，66°C ((AQ)12NR3) 和72°C (C16NR4),(圖;3B和表1)。此外，所有的溫度轉變可以徹底逆轉。加熱后的結構變化的可逆性解釋了在蛋白質純化過程中應用加熱步驟后的可溶性絲蛋白的高度恢復。因為 Tris的良好光譜性質和不會促進絲蛋白質聚集的能力，將Tris用于緩沖通過CD光譜學研究的所有溶液。由于Tris緩沖溶液的強烈的溫度依賴性，預期樣品的pH在從20°C加熱到 90°C后，從pH 8變化到pH 6(19)。然而，在pH 8的磷酸緩沖液中的絲蛋白的溫度轉變，顯示溫度與PK-值不相關，掲示盡管它們可能由于蛋白質聚集(見下)不可完全逆轉，但具有相同的中點溫度(數(shù)據(jù)未顯示)。這指示絲蛋白的溫度轉變沒有被溫度誘導的在Tris-緩沖溶液中的PH的變化所影響。通過在針對6M GuaHCl透析，和通過針對Tris緩沖液透析復性后測量在Tris緩沖液中的repNR-蛋白質的園二色性來研究化學變性和復性對ニ級結構的影響。開始和再折疊的蛋白質的相同的光譜指示化學變性是可逆的(數(shù)據(jù)未顯示)。通過它們的重復序列來確定絲蛋白的溶解度.為了獲得在粘稠物中的高蛋白質濃度，絲蛋白必須是高度可溶的。我們測試了其中rep和!·印NR-蛋白質仍舊可溶的最大濃度，來確定決定溶解度的一級結構元件?？梢酝ㄟ^超濾到超過30% w/v來濃縮包含組件A 和Q的所有蛋白質，而在不管是否存在NR-結構域的情況下不形成可見的團聚體。與此相對，可以分別僅將包含組件C的蛋白質濃縮到8% w/v (C16)和9% w/v(C16NR4)(表1)。兩種蛋白質在進一步濃縮后形成凝膠樣固體(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，絲蛋白的溶解度僅通過它們的重復序列來確定并且不被NR-結構域所影響。不依賴它們的ー級結構，鉀不促進合成的絲蛋白的聚集PH，離子，諸如鉀和磷酸鹽以及機械應カ涉及天然絲裝配。在本文，我們意欲研究這些因子怎樣促進合成絲蛋白的裝配。因為我們不能起始真正的裝配過程，其需要如在液體結晶粘稠物中發(fā)現(xiàn)的涉及的蛋白質的預先定向(33)，我們進行以不顯示取向順序的蛋白質溶液開始的聚集測定。當在緩沖液中溫育吋，測試的rep-，repNR-和NR-蛋白質沒有一種顯示明顯的聚集(< 5% )，顯示所有的蛋白質在測試條件下本質上是可溶的(圖 4)。為了研究添加離子是否通過離子強度的増加導致聚集，用氯化鈉來溫育蛋白質。然而， 沒有觀察到任何聚集。與鈉相反，已經(jīng)報道了鉀特異性地促進絲的聚集(34)。但是，氯化鉀還顯示對合成的絲蛋白的溶解度沒有任何影響(圖4)。
根據(jù)它們的ー級結構，酸化和磷酸鹽的添加促進了 r印-蛋白質的聚集在蜘蛛絲裝配的過程中的酸化的精確功能尚未被確定。但是，似乎可能的是，帶負電荷的基團(例如，磷?；鶊F)被質子化，由此減少蜘蛛絲蛋白的凈電荷和排斥。因為合成的絲蛋白不包含顯示在紡絲過程中觀察到的PH-變化范圍內的pKA-值的化學基團，發(fā)明人的目的是通過將所有的末端和側鏈羧基基團進行質子化來模擬這種效果。僅顯示末端羧基基團的(QAQ)8和 (AQ)12,在pH 1顯示無聚集(<5% )和弱的聚集(18%)。有趣的是，對C16'的16個谷氨酸殘基的質子化也僅導致了弱的聚集(8% )(圖4)。已經(jīng)描述了在紡絲過程中將磷酸鹽添加到粘稠物中沒有導致(QAQ)8的聚集和C16的弱的沉淀(12% )。與此相反，在用磷酸鉀處理后，(AQ)12顯示聚集的傾向增加(47%)。使用磷酸鈉獲得類似的結果，提示所述效果特異性地由磷酸鹽離子所導致(數(shù)據(jù)未顯示)。NR-結構域增強對促進聚集的因子的反應為了研究NR-結構域的影響，測試了在低pH和在用磷酸鹽處理后的RpNR-蛋白質和NR-蛋白質的聚集。(QAQ)8NR3和(AQ) 12NR3,以及NR3的酸化導致了弱的聚集(10%, 15%和13%)，其在由相應的rep-蛋白質所展示的范圍內。有趣的是，盡管NR4-結構域在 PH 1沒有沉淀(0%)，C16NR4在pH 1顯示了強烈的聚集(70%)。因此，在酸化后沒有明顯聚集的重復的C16和NR4-結構域的組合，導致蛋白質對于這種聚集促進因子高度敏感。對于添加磷酸鹽獲得的了類似的結果。盡管NR3和NR4在存在磷酸鹽的情況下，都未顯示聚集(1%和0% )，將NR-結構域添加到重復區(qū)域中導致了與r印-蛋白質相比，r印NR-蛋白質的增加的聚集((QAQ)8NR3 57%, (AQ) 12NR3 81%, C16NR4 80% ) 使用使DNA組件連續(xù)和受控裝配的克隆策略，構建了編碼蜘蛛絲樣蛋白質的合成基因。蛋白質的設計產(chǎn)生了重復單位和天然存在的NR-區(qū)域的不同組合，以系統(tǒng)性測試這些單一一級結構元件的性質。由CD-光譜學進行的結構分析掲示了重復區(qū)域在它們的可溶狀態(tài)時大部分是無結構的，顯示了與其它內部伸展蛋白質共有的性質(31;32)。關于主要壺腹狀成分的最大的部分已經(jīng)提出了相同的構象狀態(tài)(10)，其中重復性蛋白質序列占優(yōu)勢。與此相反，發(fā)現(xiàn)NR-區(qū)域獨立地代表折疊蛋白質結構域，其在熱變性以及用離液序列高的試劑處理后采取它們的構象。因為它們與重復區(qū)域比較相對較小的大小，在r印NR-蛋白質中對總的結構性質的影響很小。在顯示數(shù)百kDa的重復區(qū)域的天然蜘蛛絲中，可以預期NR-區(qū)域的結構貢獻甚至更小，解釋了關于它們在研究主要壺腹狀成分中存在的證據(jù)缺失。因為repNR-蛋白質的熱和化學變性的可逆性以及在該研究中顯示的CD數(shù)據(jù)和獲自天然絲粘稠物的CD數(shù)據(jù)的類似性，可以設想甚至在純化和樣品制備的過程中用熱和離液序列高的試劑處理后，所有的在水溶液中的被研究的蜘蛛絲成分以與在粘稠物中的天然絲蛋白相當?shù)臉嬒鬆顟B(tài)存在。按照Uversky等，可以基于它們的凈電荷和平均親水性來預期蛋白質的內部伸展。將蛋白質的凈電荷用于計算“邊界”親水性。如果蛋白質的平均親水性低干“邊界”值， 預期蛋白質是內部伸展的(35;36)。按照存在的結果，預期重復序列(QAQ)8和(AQ)12.內部伸展的(表1)。蛋白質的內部伸展意味著氨基酸殘基與周圍溶劑的相互作用，比與相同的或其它多肽鏈的氨基酸的相互作用更為有利。因此，(QAQ)8和(AQ) 12甚至在高濃度也是可溶的。與此相反，C16顯示稍高于邊界值的親水性。盡管仍然掲示了內部伸展的蛋白質的性質，多肽鏈之間的相互作用在高濃度變得更為有利，導致了蛋白質的聚集并導致了與(QAQ)8和(AQ) 12比較更低的溶解度(表1)。因為重復序列組成蜘蛛絲蛋白的最大部分，它們可能決定許多蛋白質的性質。因此，repNR-蛋白質的溶解度并未與r印-蛋白質的溶解度明顯不同。(QAQ)8和(AQ)12的溶解度和計算的親水性與真正的ADF-3的值良好相關(表1)。盡管C16并不具有ADF-4的高度固有不溶性，Q6和ADF-4都顯示了更低的溶解度。這種差異可以通過ADF-4與Q6比較的更高親水性和更低的凈電荷來解釋。與重復區(qū)域相反，NR-結構域僅占蜘蛛絲蛋白的小部分。兩種NR-結構域顯示富含α -螺旋的結構。由于在ADF-3和ADF-4的NR-結構域之間的高度相似性(81 %相似性和67%同一性)，可以設想兩者可能履行相關的功能。當在用已知體內誘導絲蛋白的裝配的因子處理后，研究絲蛋白的聚集時，獲得了關于NR-結構域的功能的進ー步的信息。預期由絲蛋白的羧基基團的質子化減少負電荷主要影響包含C組件的蛋白質。因此，不包含天冬氨酸或谷氨酸，由組件A和Q組成的蛋白質顯示弱聚集。C16甚至在其16個負電荷中和后仍舊保持大部分的可溶性。引人注目的是，不顯示對其酸化的任何反應的NR4-結構域，和弱聚集的Cni的組合導致了蛋白質對質子化的高度敏感。因此，對于有效聚集，需要重復區(qū)域的電荷減少和NR-結構域的存在。當將磷酸鹽加入蛋白質溶液中時，獲得了類似的結果。 已知，磷酸鹽象其它的易溶離子ー樣增加水的表面張力，促進疏水相互作用(37)。對于蜘蛛絲蛋白而言，可能的是，添加磷酸鹽促進了在疏水的聚丙氨酸基序之間的相互作用，導致蛋白質的聚集。因此，(AQ)12的聚集比(QAQ)8的聚集要高，所述(QAQ)8包含的聚丙氨酸基序少于(AQ)12包含的聚丙氨酸基序的三分之一。C16顯示最長和最高數(shù)目的聚丙氨酸基序， 然而在磷酸鹽處理后沒有顯示最強的聚集。關于這種意外的結果的可能的解釋是帶負電荷的谷氨酸側鏈和磷酸鹽離子的排斥導致了它們從周圍的溶劑中排出，并弱化它們的易溶效果。甚至即使兩種NR-結構域并未對磷酸鹽的添加作出反應，它們向rep-蛋白質的加入強烈增加了磷酸鹽的敏感性。盡管給出的數(shù)據(jù)對于得到最終結論是不充分的，似乎NR-結構域可能作為對聚集促進因子的敏感性的非特異性增強物發(fā)揮功能。對于有效聚集，它們的存在與重復區(qū)域對這些因子的反應的能力一祥重要。這種提高的機制可能包括在絲蛋白的寡聚狀態(tài)中的變化。已發(fā)現(xiàn)NR-結構域形成 ニ硫鍵連接的ニ聚體(38)。另外的寡聚化可能導致起始聚集所需要的多肽序列的増加的局部濃度，其由促進分子內相互作用形成的溶劑條件輔助。將合成的重復序列與真正的NR-區(qū)域組合起來的目前的蛋白質改造方法，顯示可以以高產(chǎn)量產(chǎn)生與真正的絲蛋白十分相似的蛋白質?？梢砸子诎幢壤糯蟮募毦磉_系統(tǒng)以及簡單廉價的純化方法提供了以經(jīng)濟有效的エ業(yè)規(guī)模生產(chǎn)蜘蛛絲樣蛋白的基礎?；谀壳暗难芯?，可以進一歩研究蜘蛛絲裝配的分子機制，其將提供從重組蛋白中人工紡絲絲線和獲得生物技術和醫(yī)學應用的新材料所需要的知識。蜘蛛絲衍生的蛋白質的裝配進行下列實驗來證實衍生自蜘蛛絲序列ADF-3 (SEQ ID NO 1)或ADF-4 (SEQ ID NO :2)的蛋白質可被裝配成形態(tài)上獨特的形式。如在Biochemistry 2004 Vol. 43pp. 13604-11362中所述，在水溶液中構建、產(chǎn)生和制備蛋白質(AQ)24NR3和C16NR4。 如果沒有另外提及，蛋白質溶液包含IOmM Tris-(羥甲基)-氨基甲烷(Tris)pH 8.0。1.球 1
通過將0. 8M的硫酸銨加入0. 2% (w/v)的C16溶液來產(chǎn)生顯示直徑范圍在0. 5到 2ym之間(圖7a)的蛋白質球體。2.納米纖維通過將1 % (w/v) C16NR4溶液在室溫溫育2周來形成顯示直徑在0. 7和4nm之間 (圖7b)的納米纖維。3.微纖維為了形成微纖維，將5-10 μ 1的25% (w/v)的基于(AQ)24NR3溶液緩慢注射到0. 5M 的磷酸鉀PH 8. 0中，形成穩(wěn)定的蛋白質溶液液滴。在溫育1分鐘后，使用鑷子將蛋白質液滴從溶液中去除。在空氣中再溫育1分鐘后，使用第二組鑷子可以將蛋白質纖維從蛋白質液滴中以約2cm/s的速率進行抽提。所述纖維顯示具有4μπι的直徑的圓形截面(圖7c， d)。4.泡沫將蛋白質泡沫(圖7e, f)產(chǎn)生自包含2. 5mM的過ニ硫酸銨(APS)，100 μ M的 tris(2,2' - ニ吡啶基)ニ氯釕(II) (Rubpy)和 10% (w/v)的(AQ)24NR3 或 2% (w/v)的 C16NR4的溶液。所述蛋白質溶液用空氣發(fā)泡。為了穩(wěn)定得到的泡沫結構，將蛋白質通過暴露于來自鎢燈的可見光達1分鐘來進行交聯(lián)(Protocol =PNAS 1999 Vol. 96pp. 6020-6024)。 隨后在95°C對泡沫進行干燥。5.凝膠在(w/v)濃度的C16NR4納米纖維顯示凝膠樣的外觀，其可容易地通過攪拌或剪切而被破壞。為了改善凝膠的機械性質，容許APS和Rubpy通過擴散進入凝膠來產(chǎn)生IOmM APS_100yM Rubpy的終濃度。在光誘導交聯(lián)后(見，節(jié)4)，可以獲得在尺寸上穩(wěn)定的凝膠(圖7g)。6.薄膜6. 1蜘蛛絲蛋白的可溶性狀態(tài)為了鑄塑薄膜，發(fā)明人使用兩種合成的絲蛋白，(AQ)24NR3和C16，其衍生自來自園蛛十字園蛛的拖絲的絲蛋白ADF-3和ADF-4(還見上面的進ー步解釋)。他們基于以前的觀察，即ADF-3和ADF-4及其衍生物顯示顯著不同的關于溶解度和裝配的表現(xiàn)，選擇了這兩種不同的蛋白質。可以通過將凍干的蛋白質溶解在6M硫氰酸胍中井隨后通過針對低鹽緩沖液諸如5mM磷酸鉀pH 8.0進行透析來去除所述鹽以制備兩種蛋白質的水溶液。還可以將凍干的蛋白質直接溶解在HFIP中。測量蛋白質溶液的園二色性(CD)掲示兩種溶劑對ニ級結構的不同影響。在水溶液中，兩種蛋白質顯示在低于200nm的波長上具有單ー最小值的CD-光譜，其指示主要的隨機卷曲蛋白質(圖8)。與此相反，在HFIP中的兩種蛋白質的光譜顯示在201-202nm的ー個最小值和另ー個最小值((AQ)24NRIB)或在220nm的肩值 (shoulder) (C16)，其顯示增加的α -螺旋含量(圖8)。6. 2薄膜形成在聚苯乙烯表面(或在用于⑶測量的石英玻璃上)從包含2% w/v蛋白質的HFIP 溶液中鑄塑薄膜。在蒸發(fā)溶劑后，(AQ)24NR3和Q6都形成可以易于從所述表面剝離的透明薄膜(圖9和未顯示的數(shù)據(jù))。假定溶劑完全蒸發(fā)并且蛋白質薄膜的密度與報道的蜘蛛拖絲的絲的1. 3g/cm3的值相同，計算薄膜的厚度在0. 5到1. 5μπι的范圍內。制備自任ー蛋白質的鑄態(tài)(as cast)(新鮮制備)的薄膜在與水接觸后溶解。因為不可溶于水是對于蛋白質薄膜的大部分應用而言的先決條件，發(fā)明人尋找處理方法來使薄膜不可溶。已知磷酸鉀誘導所用的絲蛋白的化學穩(wěn)定結構的聚集和形成。因此，用IM磷酸鉀處理(溫育)鑄態(tài)的薄膜導致薄膜轉化為不可溶于水的狀態(tài)。6. 3 ニ級結構為了研究蛋白質薄膜的結構性質，通過CD光譜學來研究它們的ニ級結構。鑄態(tài)的薄膜顯示在208nm和220nm具有兩個最小值的光譜，指示高α -螺旋含量(圖10)。在用 IM的磷酸鉀處理后，薄膜顯示在218nm具有単一最小值的光譜，其對于富含β -折疊的結構是典型的。因此，從水溶性向水不溶性的轉變伴隨蛋白質ニ級結構從α-螺旋向β-折疊的轉化。6. 4化學穩(wěn)定性為了測試化學穩(wěn)定性，使薄膜與8Μ尿素，6Μ鹽酸胍和6Μ硫氰酸胍接觸(表2)。兩種蛋白質的鑄態(tài)的薄膜和(AQ)24NR3的處理的薄膜在這些變性劑中是可溶的。與此相反，可以將C16的處理的薄膜僅溶解在硫氰酸胍中。C16薄膜的這種顯著的化學穩(wěn)定性與重組產(chǎn)生的和裝配的ADF-4的化學穩(wěn)定性以及天然拖絲的絲的化學穩(wěn)定性相同。以前的研究使裝配的結構的裝配性質和穩(wěn)定性與絲蛋白的氨基酸序列直接相關。因此，可以推斷，蜘蛛絲薄膜的性質可以通過操作相應的絲基因改變絲蛋白的一級結構來直接進行改變。6. 5薄膜修飾蛋白質薄膜的許多應用需要在薄膜表面上的特異性官能度的存在。為了證實我們的蜘蛛絲蛋白薄膜可以用小有機分子以及生物大分子如蛋白質進行修飾，將生色團熒光素和酶半乳糖苷酶以化學方法偶聯(lián)于處理的C16薄膜。通過使用1-乙基-3-(3-ニ甲基氨基丙基)碳ニ亞胺(EDC)來活化表面接觸的C16的羧基基團實現(xiàn)偶聯(lián)(對于反應的細節(jié)， 見下面指出的補充材料)。接著，將薄膜與乙ニ胺一起溫育，導致酰胺的形成。隨后，將乙 ニ胺的余下的游離氨基基團與異硫氰酸熒光素偶聯(lián)，導致熒光素通過形成穩(wěn)定的硫脲衍生物而有效共價結合(圖11A)。類似地，β -半乳糖苷酶與EDC-激活的C16薄膜一起溫育導致在Q6的羧基基團和半乳糖苷酶的伯胺(例如，來自賴氨酸殘基)之間的酰胺鍵的形成，其可以在酶的表面進行。在重復洗滌這些修飾的薄膜后，可以使用5-溴-4-氯-3-吲哚基- β -D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)作為底物來檢測β -半乳糖苷酶的活性(圖11Β)。6. 6 結論在本文，可以證實蛋白質薄膜可以從合成的蜘蛛絲蛋白獲得?？梢杂昧姿徕浱幚黹_始可以溶于水的薄膜，從而得到對于許多應用而言非常需要的水不溶性。制備自兩種不同的合成蜘蛛絲蛋白的薄膜的化學穩(wěn)定性的比較提示薄膜的性質基于蛋白質的ー級結構。 因此，產(chǎn)生形成顯示特異性質的薄膜的絲蛋白是可能的。因為可以將不同的功能分子共價連接于薄膜的表面，在未來可以實現(xiàn)大量技術或醫(yī)學應用。6. 7補充的材料和結果蛋白質溶液的制備如前所述進行蛋白質的產(chǎn)生和純化。為了獲得(AQ)24NR3和C16的水溶液，將凍干的蛋白質以10mg/ml的濃度溶解在6M硫氰酸胍中井隨后針對5mM磷酸鉀8. O進行透析。通過在15，OOOXg沉淀10分鐘來去除團聚體。使用對于(AQ)24NR3的739501^( ^的計算消光系數(shù)和對于C16的464001^(3!^1的計算消光系數(shù)，在276nm，在Icm通徑長的比色杯中以光度法測定蛋白質濃度。備選地，將凍干的絲蛋白直接溶解在六氟異丙醇(HFIP)中。
ニ級結構分析薄膜修飾1.熒光素與C16薄膜表面的偶聯(lián)通過將每孔15 μ 1的在HFIP中的20mg/ml C16分散在24-孔板的底部制備薄膜。 在蒸發(fā)HFIP后，將薄膜與IM磷酸鉀一起溫育5分鐘。用水漂洗后，通過與IOOmM 2_(N_嗎啉代)乙磺酸(MES)pH 5.0, IOOmM 1_乙基-3-(3-ニ甲基氨基丙基)碳ニ亞胺(EDC)和 20mM N-羥基硫代-琥珀酰亞胺(NHS) —起溫育15分鐘來活化羧基基團。隨后，加入乙ニ 胺以產(chǎn)生500mM的最終濃度。溫育2小時后，用水徹底漂洗薄膜。最終，將薄膜與在IOOmM 碳酸鈉PH 9. 0中的lmg/ml的異硫氰酸熒光素一起溫育1小吋，隨后用水漂洗并進行風干。2. β -半乳糖苷酶與C16薄膜表面的偶聯(lián)如上所述制備薄膜并進行活化。用EDC/NHS溫育15分鐘后，用水漂洗薄膜井隨后與包含 100 μ g/ml 的 β -半乳糖苷酶，4mM KH2PO4,16mMNa2HP04,115mM NaCl (PBS)的溶液一起溫育2小吋。用PBS徹底漂洗后，在薄膜表面上測試酶活性。β -半乳糖苷酶測定將β-半乳糖苷酶偶聯(lián)的薄膜在室溫，與包含IOOmM磷酸鈉pH 7.0，10mM氯化鉀，ImM硫酸鎂，50mM巰基乙醇和ang/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-吡喃半乳糖苷 (X-Gal)的溶液一起溫育16小吋。7.另外的水凝膠ADF-4的重復部分通常由僅顯示微小變化的単一保守重復單位組成。發(fā)明人組合這些變化并且設計被稱為C的ー個共有組件(GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP) (SEQ ID NO :5)，其被多聚化以獲得r印-蛋白質C16，這將得到分子量為48kDa的蛋白質。在大腸桿菌菌株BLR[DE3] (Novagen)中表達C16絲基因。將細胞于37°C在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到0D_ = 0.5。在用ImM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導前，將細胞改變到25°C。誘導3-4小時后，收集細胞。如在Huemmerich et alQO)中所述純化Q6蛋白。用8M尿素洗滌C16的沉淀， 并將其溶解在6M的異硫氰酸胍(GdmSCN)中，之后針對IOmMNH4HCO3進行透析。通過在 50，OOOXg沉淀30分鐘來去除在透析過程中形成的沉淀物，并將余下的可溶性絲蛋白凍干。在分析前，將凍干的蛋白質溶解在6M GdmSCN中，隨后針對IOmM Tris/HCl進行透析。 通過在125，000 Xg沉淀30分鐘來去除團聚體。使用計算消光系數(shù)，在276nm，在Icm通徑長的比色杯中，以光度法測定蛋白質濃度G0)。在添加10 % w/v的甲醇后，在5和30mg/ml之間的濃度將C16自裝配為納米纖維(圖12)。引人注意的是，在所用的濃度，納米纖維導致表示水凝膠的纖維網(wǎng)絡的形成。C16 水凝膠可以容易地通過攪拌或剪切被破壞。為了提高凝膠的機械性質，使用過ニ硫酸銨 (APS)和Triバ2，2' - ニ吡啶基)ニ氯釕(II) (Rubpy)通過擴散進入凝膠以產(chǎn)生IOmM APS 和ΙΟΟμΜ Rubpy的最終濃度。為了獲得在大小上穩(wěn)定的凝膠，通過暴露于來自鎢燈的可見光達1分鐘來交聯(lián)蛋白質(IV)(圖13)。使用具有25mm Plate-Plate幾何形狀的Physica MCR301來進行交聯(lián)和非交聯(lián)水凝膠的動態(tài)流變測量。通過首先將約2mm的上板移動到樣品表面上面來設定上板和樣品碟之間的間隙。上板降低地非常緩慢(5 μ m/s)，同時檢測正交カ并在0. IN的限度正交カ終止。在發(fā)現(xiàn)樣品具有的足夠間隙大小后，在0. 5Hz和的變形上剪切樣品直到正交力平衡于恒定值。在室溫，通過將不變的應力應用于樣品進行動態(tài)流變測量。在蛋白質濃度的范圍在5到30mg/ml的樣品上進行流變測量。干燥的水凝膠的AFM圖像顯示納米纖維的直徑是約3nm，并且似乎是半柔韌的，其中相關長度與它們的長度在相同的數(shù)量級上(圖12)。許多納米纖維還似乎具有分枝結構。 從AFM圖像，不能確定分枝樣結構是在每個聚合物纖維中的物理分枝還是納米纖維集束的
η果。類似于大多數(shù)濃縮的聚合物網(wǎng)絡，重組Q6蜘蛛絲蛋白的水凝膠顯示了粘弾性性狀。當將應カ應用到粘弾性C16絲網(wǎng)絡吋，張カ隨時間緩慢變化并且與應用的應カ成比例。 圖14顯示在10mg/ml的濃度，交聯(lián)的和非交聯(lián)的水凝膠的應力/張カ表現(xiàn)。非交聯(lián)的Q6絲水凝膠具有38 的起始剪切模量。然而，當應カ增加吋，非交聯(lián)的水凝膠顯示相應于應力的更高的變性，并且在20%的張カ后，反應成為相對線性的。當應カ增加吋，網(wǎng)絡繼續(xù)變形直到達到90 %的張力，其中非交聯(lián)的水凝膠破裂并且流動。不象非交聯(lián)的纖維網(wǎng)絡，交聯(lián)的網(wǎng)絡顯示對于所有張カ的線性粘弾性反應，具有820Pa的高得多的剪切模量，并且在30% 的更低張力破裂。在20mg/ml的聚合物濃度上的非交聯(lián)纖維網(wǎng)絡的動態(tài)粘彈性測量掲示儲存模量 (G’)和損失模量(G”)在高ω和低ω范圍上都非常依賴于振動頻率(ω)(圖15)。網(wǎng)絡顯示低頻的粘性表現(xiàn)和在具有0.49Hz的重疊的中度頻率的弾性表現(xiàn)。觀察到的水凝膠的表現(xiàn)類似于對于纏結的聚合物網(wǎng)絡所預期的并且與對于液態(tài)結晶溶液或粘性流體所預期的不相似。非交聯(lián)的C16絲水凝膠還顯示動態(tài)粘弾性表現(xiàn)，其與在化學交聯(lián)的水凝膠中觀察到的十分不同(圖15)。與非交聯(lián)的纖維網(wǎng)絡的表現(xiàn)不同，除了在測試的最高頻率，交聯(lián)的纖維網(wǎng)絡的儲存模量幾乎在所有的頻率上是恒定的。與在非交聯(lián)的網(wǎng)絡中觀察到的相比， 交聯(lián)的C16絲水凝膠還顯示更高的儲存和更低的損失模量。如預期，對于所有測試的濃度，交聯(lián)的水凝膠的儲存模量高于非交聯(lián)的網(wǎng)絡的儲存模量(圖16)。但是，意外的是，交聯(lián)的和非交聯(lián)的網(wǎng)絡的儲存模量隨濃度[c]増加，并具有[c]2相關性。在交聯(lián)的線性半柔性生物高分子網(wǎng)絡的情形中，其中相關長度大于網(wǎng)眼大小，預期聚合物網(wǎng)絡的儲存模量具有[c]的相關性，其接近于交聯(lián)的Q6絲水凝膠的[c]的相關性。在纏結但是非交聯(lián)的線性半柔性生物高分子網(wǎng)絡的情形中，預期儲存模量具有低得多的[c]的濃度相關性。已經(jīng)顯示這樣的相關性對于其它的生物高分子諸如F-肌動蛋白是有效的，但是并未描述非交聯(lián)的絲水凝膠的相關性。如果在AFM圖像中觀察到的分枝樣結構是在聚合物網(wǎng)絡中的真正的物理分枝，可以解釋這種矛盾。預期分枝的半柔性聚合物網(wǎng)絡的儲存模量顯示在對于所預期的交聯(lián)的和非交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡之間的濃度相關性。AFM圖像和流變數(shù)據(jù)與從分枝的半柔性聚合物網(wǎng)絡的模型所知的一致。然而，水凝膠的儲存模量縮放表現(xiàn)不能在對于線性半柔性聚合物網(wǎng)絡的最廣泛接受(excepted)的模型的框架中進行解釋。表 1合成的絲構建體和真正的蜘蛛絲蛋白ADF-3和ADF-4的選擇的性質
權利要求
1.重組蜘蛛絲蛋白，其包括a)一個或多個合成的重復性蜘蛛絲蛋白序列，其中所述合成的重復性序列包括5-50 個重復單位，并且其中(i)所述重復單位由氨基酸序列SEQID NO :3(組件A)組成，(ii)所述重復單位由氨基酸序列SEQID NO :4(組件Q)組成，(iii)所述重復單位由氨基酸序列SEQID NO :5(組件C)組成，(iv)所述重復單位由氨基酸序列SEQID N0:3(組件A)組成并且與由氨基酸序列SEQ ID N0:4(組件Q)組成的重復單位組合，或(ν)所述重復單位由氨基酸序列SEQ ID Ν0:4(組件Q)組成并且與由氨基酸序列SEQ ID Ν0:3(組件Α)組成的重復單位組合和與由氨基酸序列SEQ ID Ν0:4(組件Q)組成的重復單位組合，和還任選地包括b)一個或多個真正的非重復性蜘蛛絲蛋白序列，其中(i)所述非重復性蜘蛛絲蛋白序列由氨基酸序列SEQID N0:10(NR3)組成，或(ii)所述非重復性蜘蛛絲蛋白序列由氨基酸序列SEQID N0:11(NR4)組成。
2.權利要求1的重組蜘蛛絲蛋白，其中編碼所述真正的非重復序列的核酸序列被修飾從而使所述序列適應于在宿主中表達。
3.權利要求2的重組蜘蛛絲蛋白，其中所述核酸序列是編碼氨基酸序列SEQID NO 10 (NR3)的SEQ ID NO 14 (NR3)，或所述核酸序列是編碼氨基酸序列SEQ ID NO :11(NR4)的 SEQ ID NO :15(NR4)。
4.權利要求1的重組蜘蛛絲蛋白，其中所述合成的重復序列是(AQ)12,(AQ)24, (QAQ)8 或 OlAQ) m
5.權利要求1-3的重組蜘蛛絲蛋白，其中完整的重組蜘蛛絲蛋白包括式(QAQ)8NR3， (QAQ) 16NR3，(AQ) 12NR3，(AQ) 24NR3，C16NR4 或 C32NR4，(QAQ) 8，(QAQ) 16，(AQ) 12，(AQ) 24，C16 或 C32， 其中A代表氨基酸序列SEQ ID NO 3, Q代表氨基酸序列SEQ ID NO :4，C代表氨基酸序列 SEQ ID NO 5, NR3代表氨基酸序列SEQ ID NO :10，NR4代表氨基酸序列SEQ ID NO :11。
6.核酸序列，其編碼權利要求1-5的一項或多項的重組蜘蛛絲蛋白。
7.載體，其包括權利要求6的核酸序列。
8.權利要求7的載體，其通過將權利要求6的核酸序列克隆至圖6的克隆載體而獲得。
9.權利要求8的載體，其中圖6的克隆載體如SEQID NO 55所示。
10.權利要求7的載體，其還包括一個或多個調節(jié)序列，其中所述載體是表達載體。
11.權利要求7-10的載體，其是質粒載體或病毒載體。
12.權利要求11的載體，其中所述病毒載體是桿狀病毒系統(tǒng)或痘苗病毒載體系統(tǒng)。
13.非人宿主，其已經(jīng)用權利要求7-12中任一項的載體進行轉化。
14.權利要求13的宿主，其是原核細胞。
15.權利要求14的宿主，其是大腸桿菌(E.coli)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ο
16.權利要求13的宿主，其是真核細胞。
17.權利要求16的宿主，其是哺乳動物細胞，植物細胞，酵母細胞或昆蟲細胞。
18.權利要求17的宿主，其中所述哺乳動物細胞是010，0)5，《61^，2931\冊!1或冊1(細胞。
19.權利要求17的宿主，其中所述酵母細胞是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，巴斯德畢赤酵母 (Pichiapastoris)，白色念珠菌(Candida albicans)或多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)。
20.權利要求17的宿主，其中所述昆蟲細胞選自鱗翅目(L印idoptera)昆蟲細胞。
21.權利要求20的宿主，其中所述鱗翅目昆蟲細胞來自Spodopterafrugiperda或來自粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。
22.權利要求21的宿主，其中所述昆蟲細胞是Sf9，Sf21或highfive細胞。
23.權利要求17的宿主，其中所述植物細胞來自煙草、馬鈴薯、玉米，豌豆和西紅柿。
24.蜘蛛絲蛋白聚集的方法，其包括下列步驟a)制備包含權利要求1-5的一項或多項中所定義的非取向的蜘蛛絲蛋白的蛋白質溶液；b)使在a)中制備的溶液暴露于聚集引發(fā)物；和c)回收沉淀的蜘蛛絲蛋白。
25.權利要求M的方法，其中在步驟a)中所用的蜘蛛絲蛋白通過用權利要求7-12的載體或權利要求6的核酸轉化權利要求13到23的一項或多項的適合的宿主，并在適合的條件下表達所述蜘蛛絲蛋白來產(chǎn)生。
26.權利要求M-25的方法，其中所述聚集引發(fā)物選自優(yōu)選地到約1的pH的酸化，磷酸鉀和優(yōu)選地旋轉所述蛋白質溶液并應用剪切力的機械應力。
27.權利要求對力6的方法，其還包括將在步驟a)中提供的或在步驟c)中回收的所述蛋白質通過適合的方法紡絲為絲，納米纖維和線或形成薄膜的步驟。
28.權利要求1-5中定義的蛋白質或權利要求27中定義的線用于制備傷口閉合或覆蓋系統(tǒng)，縫線材料或替代材料的應用。
29.權利要求觀的應用，其中所述縫線材料傾向于用在神經(jīng)外科手術或眼科外科手術中。
30.權利要求觀的應用，其中所述替代材料是人工軟骨或腱材料。
31.權利要求1-5中定義的蛋白質或權利要求27中定義的線用于在制備汽車和飛行器部件中的應用。
32.傷口閉合或覆蓋系統(tǒng)，縫線材料，替代材料，汽車部件或用在飛行器構建中的部件， 其包括權利要求1-5中定義的蛋白質或其可以通過權利要求M46的方法獲得或其包括權利要求27中定義的線。
33.權利要求32的替代材料，其是人工軟骨或腱材料，
34.紙產(chǎn)品，其包括權利要求1-5的一項或多項的重組蜘蛛絲蛋白。
35.紡織品或皮革制品，其包括權利要求1-5的一項或多項的重組蜘蛛絲蛋白。
36.權利要求35的紡織品或皮革制品，其中所述重組蜘蛛絲蛋白以涂層的形式存在。
37.凝膠或泡沫，其包括權利要求1-5的一項或多項的蛋白質或由其組成。
38.權利要求37 的凝膠，其包括基于(QAQ)8NR3，(QAQ) 16NR3，(AQ)12NR3，(AQ)24NR3,C16NR4，C32NR4，(QAQ)8, (QAQ)16, (AQ)12, (AQ)24, C16 或 C32 的蛋白質或由其組成，并且其中 A 代表氨基酸序列SEQ ID NO 3, Q代表氨基酸序列SEQ ID NO :4，C代表氨基酸序列SEQ ID NO 5, NR3代表氨基酸序列SEQ ID NO :10，和NR4代表氨基酸序列SEQ ID NO :11。
39.用于植入物和斯滕特固定模的涂層，其包括權利要求1-5的一項或多項的蛋白質或由其組成。
40.球體，珠子，線或纖維，其包括權利要求1-5中定義的蛋白質或權利要求27中定義的線和另外的不是蜘蛛來源的纖維。
41.權利要求40的球體，珠子，線或纖維，其中所述不是蜘蛛來源的纖維是植物來源的纖維或合成纖維。
42.薄膜，其包括權利要求1-5的一項或多項的蛋白質或基于(QAQ)8NR3，(QAQ)16NR3， (AQ) 12NR3, (AQ)24NR3，C16NR4，C32NR4，(QAQ)8, (QAQ)16, (AQ)12, (AQ)24, Q6 或 C32 的蛋白質，或由其組成，并且其中A代表氨基酸序列SEQ ID NO 3, Q代表氨基酸序列SEQ ID NO :4，C代表氨基酸序列SEQ ID NO 5, NR3代表氨基酸序列SEQ ID NO :10，和NR4代表氨基酸序列 SEQ ID NO :11。
43.權利要求42的薄膜，其包括基于(AQ)24NR3或C16的蛋白質或由其組成。
44.權利要求42-43的薄膜，其中所述薄膜表面用有機小分子和/或生物大分子進行修飾。
45.權利要求44的薄膜，其中所述有機小分子和/或生物大分子是蛋白質、熒光素或 β-半乳糖苷酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組蜘蛛絲蛋白，編碼這些重組蜘蛛絲蛋白的核酸，以及適合于表達那些核酸的宿主。另外，本發(fā)明涉及聚集蜘蛛絲蛋白的方法和將所述蛋白質用在生物技術和/或藥物領域和其它工業(yè)領域，特別是在制備汽車部件，在飛行器構建，在加工紡織品和皮革，以及在制備和加工紙等中的應用。
文檔編號C12N15/63GK102532295SQ20111038440
公開日2012年7月4日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權日2004年7月22日
發(fā)明者C·阿克朔特, D·許梅里希, T·沙伊貝爾 申請人:Am絲綢有限責任公司