專利名稱：一種稠油降解菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術領域，具體涉及一株降解稠油的細菌及其在 廢水生物處理和污染土壤環(huán)境修復中的應用。
背景技術：
原油主要由烷烴、芳烴、膠質(zhì)和浙青質(zhì)組成。稠油屬于原油的一種，其主要特點為 高膠質(zhì)浙青質(zhì)、高蠟含量及高粘度。隨著中質(zhì)原油和輕質(zhì)原油產(chǎn)量的逐漸減少，稠油開始被 人們帶來的水體及土壤污染的問題越來越嚴重，日益引起人們的重視。由于稠油具有高膠 質(zhì)浙青質(zhì)及高粘度的特點，和石油相比，在環(huán)境中更難去除，在環(huán)境中的存在時間會更長。目前，石油污染土壤治理技術的主要有三種物理法、化學法和生物法。由于生物 法與物理化學法相比具有成本低、無二次污染、處理效果好、操作簡單等優(yōu)點，生物修復特 別是微生物修復受到各國科學研究工作者的青睞。研究表明，能夠降解石油烴的微生物非 常多，包括細菌、真菌和放線菌在內(nèi)可達到100余屬，200多個種。細菌中能降解石油烴的主 要有無色桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、芽孢桿菌屬、微球菌屬、假單胞菌屬、分支桿菌屬等。目前，國內(nèi)外學者分離出了可以降解稠油的細菌和真菌。但是總的菌種較少，限于 假單胞菌、枯草芽孢桿菌、微桿菌屬、紅平紅球菌及鐮刀菌屬等。一方面，這些菌對稠油的降 解效果還有待提高。另一方面，在實際修復中，由于周圍環(huán)境的不穩(wěn)定性，尋找一種能真正 適應真實環(huán)境的高效降解菌是目前環(huán)境保護的熱點問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要針對上述現(xiàn)有稠油污染修復技術所面臨的難題，提供一種高效稠油降 解菌，及其主要在廢水生物處理和污染土壤環(huán)境修復中的應用。本發(fā)明所提供的一種稠油降解菌，它來源于廣州石化總廠污水處理廠曝氣池周 圍的泥水混合物中，經(jīng)人工富集培養(yǎng)、分離純化得到，該菌株是不動桿菌(Acinetobacter sp.)GS02，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCN0:M 2010172，保藏日期為 2010年7月8日。該菌的菌落為圓形、凸起光滑、邊緣整齊、灰白色，并且有粘性。電子顯微 鏡下觀察該菌的形態(tài)為無芽孢球桿菌。生物學特性為氧化酶陰性，接觸酶陽性，革蘭氏染 色為陰性，非發(fā)酵型，專性需氧，該菌可在好氧條件下降解稠油。菌株GS02的16srDNA的登 錄號為HM452380。上述菌株CCTCC M 2010172可以應用于廢水生物處理和污染土壤環(huán)境修復中，具 體操作步驟如下將所述菌株CCTCC M 2010172接種至含稠油0. 5-2. Og/L的無機鹽液體培養(yǎng)基中， 在150r/min、30°C的搖床中避光振蕩培養(yǎng)24h以上。所述無機鹽液體培養(yǎng)基是KH2P04 0. 5g，K2HP04 3H20 lg，NaCl 2g，22. 5g/L 的 MgS04 水溶液 3. OmL, 36. 4g/L 的 CaCl2 水溶液 1. 0ml, 0. 25g/L 的 FeCl3 水溶液 1. 0ml，微量 元素溶液1. 0ml，蒸餾水1L。其中，微量元素溶液組成:MnS04 H20 39. 9mg/L, ZnS04 H20
342. 8mg/L, (NH4) 6Mo7024 4H20 34. 7mg/L。優(yōu)選地，所述液體培養(yǎng)的溫度為25-35°C，pH值為6. 5 8. 0。優(yōu)選地，在所述無機鹽液體培養(yǎng)基中加入NaCl，調(diào)節(jié)NaCl濃度為4_8g/L。優(yōu)選地，所述振蕩培養(yǎng)的時間為72h。優(yōu)選地，所述液體培養(yǎng)的溫度為30°C。優(yōu)選地，所述液體培養(yǎng)的pH值為7. 2。優(yōu)選地，所述稠油的初始濃度為1. 5g/L，所述NaCl濃度為6g/L。所述菌株CCTCC M 2010172在廢水生物處理和污染土壤環(huán)境修復中的應用。該菌 能利用稠油作為唯一碳源和能源生長。在純培養(yǎng)條件下，該菌對稠油的降解率可達到45% 左右。該菌株在25-35°C下對稠油降解均有較好的效果，這個溫度與環(huán)境中的溫度接近，適 用于實際中的環(huán)境修復。在中性或者偏堿性的較寬PH值變化范圍中，對稠油的降解效果仍 保持在較高水平。在鹽濃度為6g/L時對稠油的降解效果達到最高值。另外，在稠油初始濃 度為0. 5-2. Og/L的范圍內(nèi)均可以較好的降解稠油。這將對該菌在含稠油的廢水生物處理 和污染土壤環(huán)境修復中起到重大作用。本發(fā)明的優(yōu)點是該菌株CCTCC M 2010172對稠油中的烷烴組分及難生物降解的姥 鮫烷及植烷都有很好的去除效果，與其它菌株相比，有高效的稠油去除率和很好的環(huán)境適 應能力；在純培養(yǎng)條件下，菌株對稠油的降解率可達到45%左右，比一般的稠油降解菌提 高了 15%左右。
圖1為Acinetobacter sp. GS02生長與稠油的降解曲線圖；圖2為菌株GS02降解稠油后殘余組分的GC-MS圖譜；圖3為不同初始稠油濃度下Acinetobacter sp. GS02對稠油的降解率及絕對降解量。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步具體詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術進行。實施例1菌株CCTCC M 2010172的篩選分離及其稠油降解性能現(xiàn)場采集廣州石化總廠受石油烴類污染的泥水混合物，采用以稠油為唯一碳源 的無機鹽液體培養(yǎng)基體系馴化稠油降解菌。無機鹽液體培養(yǎng)基KH2P040. 5g，K2HP04 3H20 lg，NaCl 2g，MgS04 水溶液(22. 5g/L) 3. OmL，CaCl2 水溶液(36. 4g/L) 1. 0ml，F(xiàn)eCl3 水溶液 (0.25g/L) 1.0ml，微量元素溶液1.0ml，蒸餾水1L。其中，微量元素溶液組成:MnS04 H20 39. 9mg/L, ZnS04 'H2042. 8mg/L，(NH4)6Mo7024 . 4H20 34. 7mg/L。稠油的初始濃度為 lg/L。經(jīng) 過若干代反復馴化，在固體培養(yǎng)基(NR)中劃線培養(yǎng)，得到多株純菌，將純菌涂布在稠油無 機鹽固體平板上，看是否出現(xiàn)嗜油斑來驗證其降解稠油的能力，最后得到一株稠油的高效 降解菌GS02，該菌經(jīng)16S rDNA鑒定為不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)。所述固體培養(yǎng)基 (NR)成分蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，瓊脂18g，蒸餾水1L，pH自然。稠油無機鹽固體培養(yǎng)基無機鹽液體培養(yǎng)基1000ml，瓊脂18g，稠油lg。將Acinetobacter sp. GS02接種至含稠油lg/L的上述無機鹽液體培養(yǎng)基中，在 150r/min、3(TC的搖床中避光振蕩培養(yǎng)，在第0、6、16、24、48、72、96、120h分別取樣測定培 養(yǎng)基中菌密度和稠油殘留率，實驗結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，GS02在24h左右達到穩(wěn)定 生長期，稠油降解率也隨著菌密度的增大而提高。GS02對稠油的降解率同樣在72h達到最 大值，為44. 8%。菌株在達到穩(wěn)定生長期后對稠油的降解速率變緩，這是由于細菌首先利用 稠油組分中的烷烴及小分子芳烴組分，當這些物質(zhì)大部分被分解后，細菌才利用膠質(zhì)和浙 青質(zhì)，但是這些物質(zhì)較難生物降解，因此造成后期的降解減緩。將經(jīng)過GS02降解后的稠油用正己烷溶解后進GC-MS分析，從圖2的飽和烴 離子碎片圖可以看到，空白中實驗所用稠油的正構(gòu)烷烴的碳數(shù)分布為nC9-nC35，主峰為 C17 (29. 78min)。經(jīng)過GS02和GS07降解后，碳數(shù)分布為nC9_nC17和nC23_nC35的烷烴數(shù)量明 顯降低。35min和40min左右出的峰分別是生物標志化合物[2°]姥鮫烷(Pr)和植烷(Ph)， 這兩種烷烴屬于異戊二烯烴，很難被生物降解。通過與空白樣相比，在降解后這兩種物質(zhì)的 峰變成優(yōu)勢峰，另外，在降解后姥鮫烷峰和植烷峰也有明顯降低，可以推斷出這兩株菌對稠 油中難降解的物質(zhì)也有很好的分解作用。本實例說明分離所得到的菌株CCTCC M 2010172可利用稠油作為唯一碳源和能源 進行生長繁殖，并且對稠油中難降解物質(zhì)具有較高降解能力。實施例2溫度對稠油降解作用的影響將已接種GS02的稠油無機鹽液體培養(yǎng)基分別放置于25、28、30、35和40°C的恒溫 搖床中培養(yǎng)6d后，測定溫度對稠油降解效果的影響。表 1_溫度(°c )降解率(％ )
2534. 5
2838. 7
3045. 7
3539. 5
4027. 4
由表1可以看出，降解菌GS02在25_35°C范圍內(nèi)對稠油都有一定的去除效果，在 30°C時降解效果最佳，為45.7%。在25-35°C較寬的溫度范圍內(nèi)降解效果變化不明顯。當溫 度達到40°C時，降解率有所降低，這是由于在高溫環(huán)境下，細菌細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)容易變性、 酶的活性受到抑制。由于環(huán)境中的溫度極少達到40°C，一般是在中低溫的范圍內(nèi)變動，因此 降解菌GS02適用于實際環(huán)境中的修復。本實例說明菌株GS02在中低較寬的溫度范圍內(nèi)均能較好的降解稠油，為其在不 同溫度環(huán)境中的應用提供了保證。實施例3
pH值對稠油降解作用的影響調(diào)節(jié)無機鹽液體培養(yǎng)基的pH值分別為6. 5,7. 0,7. 2,7. 5及8. 0，在稠油初始濃度 為lg/L的條件下，培養(yǎng)6d，測定pH值對稠油降解作用的影響。表2_PH降解率(％ )
6. 531. 5
7. 045. 7
7. 247. 6
7. 538. 3
8. 034. 9
如表2可以看出，pH值為7. 2時，降解菌GS02對稠油的降解作用最強，在6d的降 解率可達到47. 6%;pH為6. 5時的降解率較低，為31. 5%。pH值主要影響細菌酶的活性、細 胞質(zhì)膜的透性及穩(wěn)定性，從而影響到石油烴的降解速率在中性或偏堿性范圍內(nèi)降解菌GS02 對稠油都有較高的降解效果。本實施例說明降解菌GS02在中性和偏堿性較寬pH范圍內(nèi)均能較好降解稠油，使 其在不同pH環(huán)境中的應用成為可能。實施例4稠油初始濃度對菌GS02降解稠油的影響將GS02在稠油初始濃度分別為0. 5、1. 0、1. 5、2. 0和2. 5g/L的無機鹽液體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，6d后分別測稠油的降解率并且計算稠油的絕對降解量。如圖3可知，GS02對稠油的 降解率分別為46. 9%,45. 7%,30. 4%U9. 5%U5. 4%；對稠油的絕對降解量分別為0. 234、 0. 457,0. 456,0. 39,0. 385g/L。GS02對稠油的降解率隨培養(yǎng)基中初始稠油的濃度的升高而 降低，在0. 5g/L時的降解率最大。但是對稠油的絕對降解量隨初始稠油濃度的增多，出現(xiàn) 先增大后平穩(wěn)最后下降的趨勢，在初始稠油濃度1. 5g/L時最大絕對降解量達到0. 4g/L左 右，而后有所下滑。稠油濃度的提高一方面提高了微生物可降解組分的絕對量，從而使絕對 降解量有所提高，但是另一方面對細胞有毒害物質(zhì)的量也增加，使細菌的活性降低，造成高 初始稠油濃度時降解率和絕對降解量均有下降的趨勢，但與低濃度相比，GS02對稠油的絕 對降解量數(shù)值仍有增大。本實施例說明降解菌GS02在較大(0.5_2g/L)濃度范圍內(nèi)較好的降解稠油，為其 在稠油污染環(huán)境中的修復提供了保證。實施例5無機鹽初始濃度對菌GS02降解稠油的影響。用NaCl調(diào)節(jié)鹽度，分別配置了 2、4、6、8和10g/L五個鹽度值的降解用培養(yǎng)基進行 實驗。如表3所示，GS02對鹽的耐受能力較強且鹽濃度范圍較寬，在鹽濃度為4-6g/L時對 稠油有較好的降解效果，降解率達到30%以上。當營養(yǎng)鹽及溫度不是限制因子時，石油烴的 生物降解率隨鹽度的增大而減小。
表 3_鹽度(g/L)降解率(％ )
222. 9
433. 2
633. 8
829. 5
1022. 2
本實施例說明降解菌GS02在較大鹽度(4-8g/L)濃度范圍內(nèi)較好的降解稠油，為 其在稠油污染環(huán)境中的修復提供了保證，尤其是在鹽濃度為6g/L時對稠油的降解效果達 到最高值。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種稠油降解菌，其特征在于，該菌株是不動桿菌(Acinetobacter sp.)GS02，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NOM 2010172，保藏日期為2010年7月8日。
2.權(quán)利要求1所述的降解菌的應用，其特征在于，該菌株應用于廢水生物處理和污染 土壤環(huán)境修復中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的降解菌的應用，其特征在于，將所述菌株CCTCCM2010172接 種至含稠油0. 5-2. Og/L的無機鹽液體培養(yǎng)基中，在150r/min、3(TC的搖床中避光振蕩培養(yǎng) 24h以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的降解菌的應用，其特征在于，所述無機鹽液體培養(yǎng)基是KH2P040.5g，K2HP04 3H20 lg，NaCl 2g，22. 5g/L 的 MgS04 水溶液 3. OmL，36. 4g/L 的 CaCl2 水溶液1.0ml, 0. 25g/L的FeClyjC溶液1. 0ml，微量元素溶液1. 0ml，蒸餾水1L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的降解菌的應用，其特征在于，所述液體培養(yǎng)的溫度為 25-35°C，pH 值為 6. 5 8. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的降解菌的應用，其特征在于，在所述無機鹽液體培養(yǎng) 基中加入NaCl，調(diào)節(jié)NaCl濃度為4_8g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的降解菌的應用，其特征在于，所述振蕩培養(yǎng)的時間為72h。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的降解菌的應用，其特征在于，所述液體培養(yǎng)的溫度為30°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的降解菌的應用，其特征在于，所述液體培養(yǎng)的pH值為7.2。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的降解菌的應用，其特征在于，所述稠油的初始濃度為1.5g/ L，所述NaCl濃度為6g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株稠油降解菌及其應用，該菌株是不動桿菌(Acinetobacter sp.)GS02，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2010172，保藏日期為2010年7月8日。該菌的菌落為圓形、凸起光滑、邊緣整齊、灰白色，并且有粘性。電子顯微鏡下觀察該菌的形態(tài)為無芽孢球桿菌。生物學特性為氧化酶陰性，接觸酶陽性，革蘭氏染色為陰性，非發(fā)酵型，專性需氧。該菌株對稠油中的烷烴組分及難生物降解的姥鮫烷及植烷都有很好的去除效果，與其它菌株相比，有高效的稠油去除率和很好的環(huán)境適應能力。基于其上述特性，該菌在受稠油污染的水體及土壤的修復中具有很好的應用。
文檔編號A62D3/02GK101921722SQ20101024523
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者黨志, 盧桂寧, 易筱筠, 楊琛, 賈群超, 郭楚玲 申請人:華南理工大學