專利名稱：一種用于皮膚護(hù)理的被修飾酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及被修飾酶、包含所說(shuō)的被修飾酶和已知用于皮膚護(hù)理組合物中的諸成分的皮膚護(hù)理組合物、包含本發(fā)明的皮膚護(hù)理組合物的皮膚護(hù)理產(chǎn)品以及所說(shuō)的被修飾酶用于提高酶的穩(wěn)定性和/或降低酶的致敏能力的用途。
背景技術(shù)：
自古人就喜歡洗澡和淋浴。這到目前還沒(méi)有變化。對(duì)于今天的大多數(shù)人，洗澡和淋浴是用于保持良好身體衛(wèi)生并獲得令人愉快的氣味的日常生活一部分。某些人也把在早晨進(jìn)行一次清爽的淋浴或洗澡作為重要而必需的精神體驗(yàn)，沒(méi)有這項(xiàng)內(nèi)容，這些人就無(wú)法清醒。
在消費(fèi)市場(chǎng)上可以發(fā)現(xiàn)許多用于身體護(hù)理和保持良好身體衛(wèi)生的產(chǎn)品，例如用于清潔和濕潤(rùn)身體所有部分的產(chǎn)品。一些這樣的產(chǎn)品包含作為有效成分的被修飾酶。
用于皮膚護(hù)理的酶長(zhǎng)期以來(lái)，已經(jīng)知道，以蔬菜和水果(如黃瓜、番茄、胡蘿卜、香蕉等)形式的酶處理皮膚具有有益的潛在作用。
然而，在20世紀(jì)70年代之前，尚未將酶引入商業(yè)皮膚護(hù)理產(chǎn)品，部分是因?yàn)殛P(guān)于酶的知識(shí)有限，而且還因?yàn)槿藗冋J(rèn)為酶的穩(wěn)定性不能令人滿意，并在皮膚護(hù)理產(chǎn)品中具有一些不利的性質(zhì)。例如，人們發(fā)現(xiàn)纖維素酶可以改變包含羧甲基纖維素的洗劑和乳膏的粘度；脂酶會(huì)導(dǎo)致包含脂肪酸酯的乳膏發(fā)生變化；發(fā)現(xiàn)蛋白酶會(huì)使蛋白質(zhì)成分破壞并造成粘度降低。
此外，在那時(shí)，酶的高成本也阻礙了酶在這種個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中的應(yīng)用。
人的皮膚人的皮膚是由幾層組成的。最上層(表皮)含有纖維狀蛋白質(zhì)角蛋白，其功能是充當(dāng)隔離環(huán)境的保護(hù)層。表皮的外層是由位于其下方的粒層中的細(xì)胞有組織地死亡而形成的。粒層中釋放出許多酶，它們將死細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)化成角蛋白。
真皮通過(guò)基膜與表皮連接，并通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)將皮膚與身體其余部分連接起來(lái)。真皮具有血管、神經(jīng)纖維和淋巴管，并包含主要是由膠原纖維以及有限量的彈性蛋白和網(wǎng)硬蛋白纖維組成的纖維狀網(wǎng)絡(luò)。
用于個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的被修飾酶如上所述，某些酶的穩(wěn)定性不能令人滿意，而且在某種條件下(取決于接觸的方式)可能會(huì)引起免疫應(yīng)答，通常是IgG和/或IgE應(yīng)答。
今天一般都認(rèn)識(shí)到，當(dāng)多肽(如酶)與聚合分子偶聯(lián)時(shí)，多肽的穩(wěn)定性會(huì)得到提高，免疫應(yīng)答會(huì)減少。
用于連接多肽和聚合分子的技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的。
最適合的商業(yè)技術(shù)之一早在20世紀(jì)70年代早期就已描述(美國(guó)專利no.4,179,337)。所說(shuō)的專利涉及非免疫原性多肽，如與聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇偶聯(lián)的酶和肽激素。其中至少15％的多肽生理活性得到保持。
英國(guó)專利no.1,183,257(Crook等)描述了通過(guò)三嗪環(huán)將酶與多糖連接的化學(xué)。
另外，用于維持酶-聚合物結(jié)合物之酶促活性的技術(shù)在本領(lǐng)域也是已知的。
WO 93/15189(Veronese等)涉及一種通過(guò)將蛋白水解酶連接到大分子化的抑制劑上來(lái)保持經(jīng)聚乙二醇修飾的蛋白水解酶活性的方法。該結(jié)合物旨在于醫(yī)療應(yīng)用。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將多肽連接到聚合分子上通常會(huì)降低多肽活性或干擾多肽與其底物相互作用。EP 183 503(Beecham Group PLC)公開(kāi)了上述概念的一種發(fā)展，即提供了結(jié)合物，所述結(jié)合物含有借助于可逆的連接基團(tuán)而連接到至少一種水溶性聚合物上的藥學(xué)上有用的蛋白質(zhì)。
EP471,125(Kanebo)公開(kāi)了包含通過(guò)三嗪環(huán)偶聯(lián)到多糖上以提高耐熱性和保存穩(wěn)定性的親本蛋白酶(芽孢桿菌蛋白酶Esperase)的皮膚護(hù)理產(chǎn)品。所利用的偶聯(lián)技術(shù)在上述的英國(guó)專利no.1,183,257(Crook等)中有描述。
JP 3083908描述了一種皮膚化妝品材料，該材料中含有來(lái)自豚鼠肝臟的、用一種或多種水溶性物質(zhì)(如PEG、淀粉、纖維素等)修飾過(guò)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。這種修飾是通過(guò)激活聚合分子并將其偶聯(lián)到所說(shuō)的酶上而進(jìn)行的。據(jù)稱該組合物對(duì)皮膚比較溫和。
基于現(xiàn)有技術(shù)的一般知識(shí)概述用于將一種或多種聚合分子偶聯(lián)到多肽分子上的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。而且，已經(jīng)知道這種修飾過(guò)的酶-聚合物結(jié)合物的免疫應(yīng)答降低，穩(wěn)定性提高。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供適合于在皮膚護(hù)理產(chǎn)品中使用的改進(jìn)的被修飾酶結(jié)合物。
本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用具有適合于皮膚護(hù)理的活性的被修飾酶時(shí)，對(duì)酶和聚合物分子必須有一定的要求，以獲得提高的穩(wěn)定性和降低的致敏能力，而同時(shí)仍保持了顯著的殘留酶促活性。
本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)與酶表面偶聯(lián)的聚合分子的數(shù)目與重量必須與酶的重量和/或表面積平衡。而且，偶聯(lián)聚合分子的位置也很重要。
本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種被修飾酶，其中分子量為1-35kDa的4-70個(gè)聚合分子被共價(jià)偶聯(lián)到分子量為15-100kDa的親本酶的表面。
在親本酶分子量為15-35kDa的情況下，4-20個(gè)共價(jià)偶聯(lián)的聚合分子應(yīng)該共價(jià)偶聯(lián)到所說(shuō)的親本酶的表面上。
如果親本酶的分子量在35-60kDa的范圍內(nèi)，則將7-40(優(yōu)選地10-30)個(gè)聚合分子偶聯(lián)到所說(shuō)的親本酶的表面上。
同樣地，如果親本酶具有60-80kDa的分子量，則將10-50(優(yōu)選地13-40)個(gè)聚合分子偶聯(lián)到所說(shuō)的親本酶的表面上。
將15-70(優(yōu)選地18-60)個(gè)聚合分子偶聯(lián)到具有80-100kDa分子量的親本酶的表面上。
通常，聚合分子被偶聯(lián)到酶表面上的氨基(-NH2)和N末端氨基上，然而，聚合分子也可以偶聯(lián)到酶鏈中處于表面的氨基酸的羧基(-COOH)上。
優(yōu)選的連接基團(tuán)是賴氨酸殘基和位于N末端的氨基。
羧酸連接基團(tuán)可以是天冬氨酸或谷氨酸的羧酸基和C末端的COOH基團(tuán)。
在本申請(qǐng)中，“連接基團(tuán)”的數(shù)目是多肽鏈中賴氨酸殘基的氨基數(shù)加上N末端氨基的數(shù)目。
本發(fā)明的親本酶可以是水解酶，包括蛋白酶(尤其是枯草桿菌蛋白酶)、或脂酶，或氧化還原酶(包括漆酶和超氧化物歧化酶)。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及包含本發(fā)明的被修飾酶以及用于皮膚護(hù)理產(chǎn)品的成分的皮膚護(hù)理組合物。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及包含本發(fā)明皮膚護(hù)理組合物的皮膚護(hù)理產(chǎn)品。
與相應(yīng)的皮膚護(hù)理產(chǎn)品(包含親本酶)比較，本發(fā)明皮膚護(hù)理產(chǎn)品的穩(wěn)定性有所提高，致敏能力有所降低。
術(shù)語(yǔ)“致敏能力降低”在本發(fā)明的上下文中是指“變應(yīng)原性降低”，這指在吸入本發(fā)明的被修飾酶時(shí)，產(chǎn)生的、可導(dǎo)致變應(yīng)性狀態(tài)的IgE(在人類中，在特定的動(dòng)物中是具有類似效果的分子)的量比相應(yīng)的親本酶降低。
在本發(fā)明的上下文中，“皮膚護(hù)理產(chǎn)品”包括所有的用于身體皮膚清潔、護(hù)理和/或美化的個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品以及其它產(chǎn)品，如頭發(fā)護(hù)理產(chǎn)品，這些產(chǎn)品在使用期間可能會(huì)與皮膚或呼吸系統(tǒng)接觸。本發(fā)明也包括用于動(dòng)物的相應(yīng)產(chǎn)品。
按照本發(fā)明所涉及的皮膚護(hù)理產(chǎn)品的特定例子是肥皂、化妝品、護(hù)膚膏、護(hù)膚凝膠、護(hù)膚奶、潔膚洗液、清潔霜、清潔露、潔膚奶、冷霜、冷制皂、化妝基料(make-up base)、清潔乳、面膜、含鋅化妝水、T區(qū)精華素(T zone essence)、潤(rùn)手香脂、香粉(essencepowder)、增白粉、皂粉、塊皂、透明皂、唇膏、口紅、營(yíng)養(yǎng)素、粉底霜、搽臉?lè)邸⒀塾胺?、粉底、指甲油清潔劑、生發(fā)油、美發(fā)液、發(fā)乳、發(fā)用凝膠、滋發(fā)劑、頭發(fā)定形制品、染發(fā)劑、頭發(fā)著色劑、頭皮滋潤(rùn)劑(scalp treatment)、香波、香膏、護(hù)發(fā)素、發(fā)膠、曬黑油(sun oil)、防曬品、剃須泡沫與凝膠、剃須膏、嬰兒油、粉刺護(hù)理制品、止汗劑、驅(qū)蟲(chóng)劑、祛臭劑等。
變應(yīng)原性評(píng)價(jià)可以通過(guò)吸入檢驗(yàn)，并比較氣管內(nèi)施用親本酶的效果與施用本發(fā)明相應(yīng)的被修飾酶的效果來(lái)評(píng)價(jià)變應(yīng)原性。
現(xiàn)有幾種用于酶變應(yīng)原性評(píng)價(jià)的體內(nèi)動(dòng)物模型。某些這樣的模型為人類中的危險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供了合適的依據(jù)。適合的模型包括豚鼠模型和小鼠模型。這些模型設(shè)法將呼吸性變應(yīng)原表示為以前致敏的動(dòng)物中所誘導(dǎo)的刺激反應(yīng)的函數(shù)。按照這些模擬，將所宣稱的變應(yīng)原通過(guò)氣管內(nèi)引入動(dòng)物。
豚鼠的一個(gè)適合品系(Dunkin Hartley品系)不會(huì)因變應(yīng)性應(yīng)答而產(chǎn)生IgE抗體，這一點(diǎn)與人類不同。然而，它們產(chǎn)生另一種類型的抗體IgG1A與IgG1B(參見(jiàn)，例如，Prentφ，ATLA，19，P.8-14，1991)，這些抗體造成了對(duì)所吸入的多肽(包括酶)產(chǎn)生變應(yīng)原性應(yīng)答。因此，當(dāng)使用Dunkin Hartley動(dòng)物模型時(shí)，IgG1A和IgG1B的相對(duì)量可以表示變應(yīng)原性水平。
適合于氣管內(nèi)接觸多肽和酶的大鼠品系是Brown Norway品系。Brown Norway大鼠產(chǎn)生IgE作為變應(yīng)性應(yīng)答。
BALB/C小鼠品系適合于確定由皮下注射引起的IgE應(yīng)答。
在豚鼠和小鼠中評(píng)價(jià)呼吸性變應(yīng)原的更多細(xì)節(jié)由Kimber等(1996)，基礎(chǔ)與應(yīng)用毒理學(xué)，33，P.1-10描述。
其它動(dòng)物(如大鼠，兔子等)也可以用于類似研究中。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1顯示了在用修飾的PD498-SPEG、未修飾的PD498與甘氨酸-SPEG15,000免疫之后，BALB/C小鼠中特異性的抗PD498 IgE應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)。
圖2顯示了氣管內(nèi)施用修飾的PD498-SPEG和未修飾的PD498的Dunkin Hartley豚鼠的IgG1水平。
圖3顯示了Dunkin Hartley豚鼠IT劑量應(yīng)答研究中3μg、30μg和300μg修飾的PD498-SPEG 5000引起的IgG1水平(■3.0μg；▲30μg；300μg)。由于0.3μg的劑量不產(chǎn)生應(yīng)答，故省略了0.3μg劑量曲線。
圖4顯示了Dunkin Hartley豚鼠IT劑量應(yīng)答研究中0.3μg、3.0μg和30μg未修飾的親本PD498引起的IgG1水平(■0.3μg；▲3.0μg；30μg)。
發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提供適合于皮膚護(hù)理的被修飾酶。
如上所述，已經(jīng)知道，將聚合分子與酶偶聯(lián)，可以提高多肽(包括酶)的穩(wěn)定性并降低其致敏能力。當(dāng)將聚合分子與酶偶聯(lián)時(shí)，出現(xiàn)的一個(gè)問(wèn)題是酶促活性的喪失。
按照上述的EP 471,125(Kanebo)，將芽孢桿菌蛋白酶Esperase(可由Novo Nordisk A/S提供)通過(guò)三嗪環(huán)與40kDa葡聚糖(實(shí)施例1)及50kDa支鏈淀粉(實(shí)施例2)結(jié)合。
所說(shuō)的芽孢桿菌蛋白酶(即Esperase)具有3個(gè)可及氨基(-NH2)連接基團(tuán)，聚合分子(在這種情況下是多糖)可以偶聯(lián)在其上。這幾個(gè)連接基團(tuán)是兩個(gè)氨基(即在3D結(jié)構(gòu)表面上的兩個(gè)賴氨酸殘基)和一個(gè)N末端氨基。當(dāng)將不超過(guò)3個(gè)聚合分子偶聯(lián)到所說(shuō)的蛋白酶上時(shí)(修飾率為68％-71％，通過(guò)TNBS方法(Haynes等，(1967)，生物化學(xué)，6，P.641)測(cè)定)，據(jù)稱所保持的剩余酶促活性在45％(參見(jiàn)實(shí)施例4)-67％(參見(jiàn)實(shí)施例3)之間。
本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用具有適合于皮膚護(hù)理之活性的被修飾酶時(shí)，對(duì)酶和聚合物分子必須有一定的要求，以獲得提高的穩(wěn)定性和降低的致敏能力，而同時(shí)仍保持了顯著的剩余酶促活性。本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)與酶表面偶聯(lián)的聚合分子的數(shù)目與重量必須與酶的重量和/或表面積平衡。而且，偶聯(lián)聚合分子的位置(表面上)也很重要。
聚合分子數(shù)目與酶重量本發(fā)明基于下列一般原則酶的表面積和/或重量越大，就必須有越多的聚合分子偶聯(lián)在酶的表面上，以獲得提高的穩(wěn)定性、顯著的剩余酶促活性和/或降低的致敏能力。
如果僅僅極少聚合分子偶聯(lián)到具有大表面積的大酶上，那么所說(shuō)的極少聚合分子不能遮蔽(即隱藏/覆蓋)酶表面上的表位，而這種表位會(huì)造成導(dǎo)致抗體(尤其是IgE抗體)形成的免疫應(yīng)答。
上述EP 471,125(Kanebo)描述了極少(即最多達(dá)3)大(即40和50kDa)聚合分子偶聯(lián)到具有大約28kDa分子量的微生物蛋白酶Esperase表面的情況。
本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種適合于皮膚護(hù)理的被修飾酶，該酶具有分子量為1-35kDa的4-70個(gè)聚合分子共價(jià)偶聯(lián)到分子量為15-100kDa的親本酶的表面。
按照本發(fā)明，將具有15-35kDa分子量(這對(duì)許多微生物酶比較典型)的酶(如源于芽孢桿菌的細(xì)菌蛋白酶)與4-20個(gè)聚合分子共價(jià)偶聯(lián)。
換句話說(shuō)，被修飾酶可以具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、1 3、14、15、16、17、18、19或20個(gè)共價(jià)偶聯(lián)于親本酶3D結(jié)構(gòu)表面(包括N末端氨基)的聚合分子。
按照本發(fā)明，酶的重量和/或表面積、偶聯(lián)的聚合分子的數(shù)目以及聚合物的重量之間的優(yōu)選比例如表1所示。
表1
按照本發(fā)明，聚合分子的分子量可以是1-35kDa。然而，如果聚合分子更小和/或更少，則酶表面的表位可能不能被充分遮蔽，從而導(dǎo)致免疫應(yīng)答。按照本發(fā)明，聚合分子優(yōu)選的分子量是4-25kDa，尤其是6-25kDa，如8-20kDa。
論及的所有聚合物分子量均是平均分子量。
偶聯(lián)的聚合分子的位置實(shí)際上，所有離子化基團(tuán)(如賴氨酸殘基的氨基)均位于多肽分子的表面(參見(jiàn)例如Thomas E.Creighton，(1993)，“蛋白質(zhì)”，W.H.Freeman和Company，紐約)。因此，在酶的表面上容易達(dá)到的連接基團(tuán)(即氨基)數(shù)目通常等于酶一級(jí)結(jié)構(gòu)中的賴氨酸殘基加N-末端氨基的數(shù)目。
當(dāng)選擇欲進(jìn)行結(jié)合以用于皮膚護(hù)理組合物與產(chǎn)品的親本酶時(shí)，優(yōu)選地使用具有表1中所示連接基團(tuán)數(shù)目的酶。
致敏能力與保持的殘余酶促活性相比于其它蛋白質(zhì)與多肽來(lái)說(shuō)，尤其是對(duì)于酶，由于酶的活性和底物與酶結(jié)構(gòu)裂縫中的活性位點(diǎn)之間的相互作用有關(guān)，因此在減少免疫系統(tǒng)對(duì)酶的應(yīng)答和保持顯著的殘余酶促活性之間有些沖突。
按照本發(fā)明，“顯著”保持的殘余活性指保持了酶活性的20％、30％或40％以上，更好是50％、60％或70％以上，還要更好是70％或80％，高達(dá)80％-90％，甚至是高達(dá)100％。
不受任何理論的限制，被修飾酶的酶促活性損失可能是由于大/重聚合分子空間阻礙底物到達(dá)酶的催化裂縫而阻礙底物達(dá)到活性位點(diǎn)所造成的結(jié)果。也有可能(至少部分上)是因?yàn)槊傅?D結(jié)構(gòu)發(fā)生了不利的結(jié)構(gòu)變化。當(dāng)將極少的大/重聚合分子偶聯(lián)到酶表面時(shí)，有可能會(huì)在酶分子的不同部分引起不均勻的相互作用。這可能會(huì)導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)局部偏離其正常構(gòu)型，這在大多數(shù)情況下會(huì)導(dǎo)致酶促活性損失。
在EP 471,125(Kanebo)中描述的修飾蛋白酶具有極少(即最多達(dá)3個(gè)聚合分子)重/大聚合分子(即40和50kDa多糖)偶聯(lián)到酶表面的氨基上。觀察到的酶促活性損失(即45％-67％殘余酶促活性)可能是因?yàn)樵诿副砻娌煌糠稚系牟痪鶆蛳嗷プ饔?，引起酶結(jié)構(gòu)偏離其正常的親本狀態(tài)構(gòu)型。而且，酶表面上所偶聯(lián)的大/重聚合分子還可能會(huì)阻止底物到達(dá)酶的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致所保持的酶促活性降低。
人們確信，當(dāng)將更多的更小/輕聚合分子偶聯(lián)到酶的表面上時(shí)，聚合分子的不利影響就較不明顯，因?yàn)閷?duì)酶結(jié)構(gòu)具有影響的力在酶表面上的更大區(qū)域中更平衡/均一地分布。這樣，聚合分子對(duì)活性損失的影響就較不明顯。
因而，優(yōu)選是將具有相對(duì)低分子量(即1-35kDa)的更多聚合分子(即大于4)偶聯(lián)到酶的表面上(在酶具有15-35kDa的分子量的情況下)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合分子廣泛分布于除鄰近活性位點(diǎn)的區(qū)域之外的酶表面上。在本發(fā)明的上下文中，“廣泛分布于”是指其所處的位置能使得偶聯(lián)到酶連接基團(tuán)的聚合分子遮蔽酶表面的不同部分(優(yōu)選地是除活性位點(diǎn)外的整個(gè)表面或接近于整個(gè)表面)，以確保所說(shuō)的可識(shí)別的有關(guān)表位受到遮蔽，由此不被免疫系統(tǒng)的抗體識(shí)別。人們相信酶和抗體之間相互作用的表面積大約為5002(26×19)(參見(jiàn)Sheriff等，(1987)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，84卷，p.8075)。
優(yōu)選地，酶上的兩個(gè)或多個(gè)連接基團(tuán)應(yīng)不相互靠近，因?yàn)檫B接基團(tuán)相互鄰近很可能會(huì)導(dǎo)致僅能偶聯(lián)一個(gè)聚合分子。
為了確保酶促活性的損失最小，優(yōu)選地不將聚合分子偶聯(lián)到活性位點(diǎn)的近距離范圍內(nèi)。這一距離取決于聚合分子的大小。因?yàn)椴幌Ｍ淮缶酆戏肿幼璧K到達(dá)活性位點(diǎn)，這樣，聚合分子越龐大，所偶聯(lián)的聚合分子離活性位點(diǎn)的距離就應(yīng)越遠(yuǎn)。
通?？磥?lái)以距離酶的活性位點(diǎn)5、優(yōu)選地10的范圍內(nèi)沒(méi)有聚合分子偶聯(lián)到所說(shuō)的酶上為佳。
而且，按照本發(fā)明，在可由免疫系統(tǒng)識(shí)別的已知表位或接近于可由免疫系統(tǒng)識(shí)別的已知表位或接近于所說(shuō)的表位偶聯(lián)了聚合分子的酶也被視為很有好處。如果表位的位置是未知的，則將許多聚合分子偶聯(lián)到酶表面可及的連接基團(tuán)上是頗為有利的。優(yōu)選的是所說(shuō)的連接基團(tuán)以離活性位點(diǎn)適合的距離廣泛分布于酶的表面。按照本發(fā)明，優(yōu)選的是符合上述有關(guān)偶聯(lián)聚合分子在酶表面分布要求的被修飾酶。尤其優(yōu)選沒(méi)有或只有極少數(shù)聚合分子(即0-2)偶聯(lián)到距離酶的活性位點(diǎn)0-5范圍內(nèi)、優(yōu)選地0-10范圍內(nèi)的酶。
聚合分子偶聯(lián)到酶上的聚合分子可以是任何適合的聚合分子，包括天然和合成的同聚物[如多元醇(即poly-OH)、多胺(即poly-NH2)以及多羧酸(即poly-COOH)]以及雜聚物，即包含一種或多種不同偶聯(lián)基團(tuán)(如羥基與胺基)的聚合物。
適合的聚合分子的例子包括選自含有下述各類分子的組中的聚合分子聚亞烷基氧化物(PAO)，如聚亞烷基二醇(FAG)，包括聚乙二醇(PEG)，甲氧基聚乙二醇(mPEG)以及聚丙二醇、PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸鹽、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚D，L-氨基酸、乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物、苯乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖、肝素、同源的白蛋白、纖維素，包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧乙基纖維素以及羥丙基纖維素，聚氨基葡糖的水解產(chǎn)物、淀粉(如羥乙基淀粉和羥丙基淀粉)、糖原、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠、支鏈淀粉、菊粉、合成生物聚合膠、角叉菜膠(carrageenan)、果膠、藻酸水解產(chǎn)物和生物聚合物。
優(yōu)選的聚合分子是無(wú)毒性的聚合分子，如(m)聚乙二醇((m)PEG)，還要求這些分子共價(jià)偶聯(lián)到酶表面連接基團(tuán)上的化學(xué)方法相對(duì)比較簡(jiǎn)單。
一般看來(lái)，聚亞烷基氧化物(PAO)(如聚乙烯氧化物，如PEG，特別是mPEG)是優(yōu)選的聚合分子，因?yàn)檫@些聚合分子與多糖(如葡聚糖、支鏈淀粉等)相比，它們所具有的能交聯(lián)的活性基團(tuán)很少。
按照本發(fā)明，盡管可以使用所有上述的聚合分子，但優(yōu)選地使用甲氧基聚乙二醇(mPEG)。這是因?yàn)檫@樣的事實(shí)甲氧基乙二醇僅具有一個(gè)可與酶連接的活性末端。因而，交聯(lián)的可能性相對(duì)較不明顯。而且，這將使產(chǎn)物更均一，聚合分子與酶的反應(yīng)更容易控制。
聚合物的活化如果將與酶偶聯(lián)的聚合分子沒(méi)有活性，就必須使用適合方法使其活化。聚合分子可通過(guò)接頭與酶偶聯(lián)。適合的接頭對(duì)熟練技術(shù)人員是熟知的。
用于活化聚合分子以及用于連接蛋白質(zhì)的方法和化學(xué)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。一般用于活化不溶性聚合物的方法包括用下列化合物活化官能團(tuán)溴化氰、高碘酸、戊二醛、biepoxides、環(huán)氧氯丙烷、二乙烯基砜、碳二亞胺、磺酰基鹵化物、三氯三嗪等(參見(jiàn)R.F.Taylor，(1991)，“蛋白質(zhì)固定，基礎(chǔ)和應(yīng)用”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“蛋白質(zhì)結(jié)合和交聯(lián)的化學(xué)”，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，“固定的親和性配體技術(shù)”，學(xué)院出版社，N.Y.)。其中一些方法涉及不溶性聚合物的活化，但是也適用于可溶性聚合物(如高碘酸，三氯三嗪、磺酰基鹵化物、二乙烯基砜、碳二亞胺等)的活化。在選擇活化與結(jié)合化學(xué)方法中必須考慮聚合物上的官能團(tuán)氨基、羥基、巰基、羧基、醛或硫氫基以及蛋白質(zhì)上選定的連接基團(tuán)，活化與結(jié)合化學(xué)通常包括i)聚合物的活化，ii)結(jié)合，iii)剩余活性基團(tuán)的封閉。
下面簡(jiǎn)要描述許多適合的聚合物活化方法。然而，應(yīng)該理解也可以使用其它方法。
將聚合分子偶聯(lián)到酶的游離酸基團(tuán)上可以借助于二酰亞胺和，例如氨基-PEG或肼基-PEG(Pollak等，(1976)，J.Amr.Chem.Soc.，98，289-291)或重氮基乙酸酯/酰胺(Wong等，(1992)，“蛋白質(zhì)結(jié)合和交聯(lián)化學(xué)”，CRC出版社)進(jìn)行。
將聚合分子偶聯(lián)到羥基通常是非常困難的，因?yàn)檫@必須在水中進(jìn)行。而通常水解反應(yīng)比與羥基的反應(yīng)更占優(yōu)勢(shì)。
將聚合分子偶聯(lián)到游離硫氫基可以用特定基團(tuán)(如馬來(lái)酰亞胺或正吡啶基二硫化物)達(dá)到。乙烯基砜(美國(guó)專利no.5,414,135，(1995)，Snow等)對(duì)于硫氫基也有偏好，但是不象提到的其它化合物那樣有選擇性。
可以通過(guò)包含兩個(gè)鄰近羰基的基團(tuán)靶向多肽鏈中的可及精氨酸殘基。
涉及將親電子性地活化的PEG偶聯(lián)到賴氨酸的氨基上的技術(shù)也有用。醇的許多常規(guī)離去基團(tuán)形成胺鍵。例如，可以使用烷基磺酸鹽，如tresylates(Nilsson等，(1984)，酶學(xué)方法，104卷，JacobyW.B.編，學(xué)院出版社Orlando，P.56-66；Nilsson等，(1987)，酶學(xué)方法，135卷，Mosbach K.編，學(xué)院出版社Orlando，P.65-79；Scouten等，(1987)，酶學(xué)方法，135卷，Mosbach K.編，學(xué)院出版社Orlando，P.79-84；Crossland等，(1971)，J.Amr.Chem.Soc.1971，93，pp.4217-4219)、甲磺酸鹽(Harris，1985，同上；Harris等，(1984)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22，pp 341-352)、芳基磺酸鹽(如甲苯磺酸鹽)以及對(duì)硝基苯磺酸鹽。
有機(jī)磺酰氯(例如Tresyl氯化物)可有效地將許多聚合物(例如PEG)中的羥基轉(zhuǎn)化成良好的離去基團(tuán)(磺酸鹽)，當(dāng)與多肽中的親核基團(tuán)(如氨基)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，該離去基團(tuán)使得可以在聚合物和多肽之間形成穩(wěn)定的鍵。除了要有高的結(jié)合產(chǎn)率之外，反應(yīng)條件通常還要求比較溫和(中性或微堿性pH值，以避免變性和活性極少或沒(méi)有破壞)，并且滿足多肽需要的非破壞性條件。
甲苯磺酸鹽比甲磺酸鹽反應(yīng)性更強(qiáng)，而且更不穩(wěn)定地分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky，(1995)，生物結(jié)合物化學(xué)，6，150-165)。環(huán)氧化合物也可以用于產(chǎn)生胺鍵，但是活性比上述基團(tuán)弱得多。
用碳酰氯將PEG轉(zhuǎn)化成氯甲酸酯將產(chǎn)生與賴氨酸的氨基甲酸酯鍵。這一轉(zhuǎn)變可以多種變化形式進(jìn)行，如用N-羥基琥珀酰亞胺(美國(guó)專利no.5,122,614，(1992)；Zalipsky等，(1992)，生物技術(shù)應(yīng)用和生物化學(xué)，15，P.100-114；Monfardini等，(1995)，生物結(jié)合物化學(xué)，6,62-69)、用咪唑(Allen等，(1991)，Carbohydr.Res.，213，pp 309-319)、用對(duì)硝基苯酚、DMAP(EP 632 082 A1，(1993)，Looze，Y.)等替代氯。通常通過(guò)使氯甲酸酯與所需的離去基團(tuán)反應(yīng)來(lái)制備衍生物。所有這些基團(tuán)均產(chǎn)生與肽的氨基甲酸酯鍵。
此外，可以分別使用異氰酸鹽和異硫氰酸鹽來(lái)產(chǎn)生尿素和硫脲。
使用如上所述的相同的離去基團(tuán)和環(huán)狀亞胺thrones，可以從PEG酸(美國(guó)專利no.5,349,001，(1994)，Greenwald等)獲得酰胺。這些化合物的反應(yīng)活性十分高，但是可能會(huì)使水解變快。
也可以使用從與琥珀酸酐反應(yīng)制備的PEG琥珀酸酯。由此所形成的酯基使結(jié)合物對(duì)水解更加敏感得多(美國(guó)專利no.5,122,614，(1992)，Zalipsky)。這一基團(tuán)可以用N-羥基琥珀酰亞胺活化。
此外，可以引入一個(gè)特殊的接頭。最古老的是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物化學(xué)雜志，252,3578-3581；美國(guó)專利no.4,179,337，(1979)，Dayis等；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24,375-378)。
將PEG偶聯(lián)到芳香族胺上，隨后重氮化，將產(chǎn)生非?；钴S的重氮鹽，其在原位可與肽反應(yīng)。通過(guò)使PEG的吖內(nèi)酯衍生物(美國(guó)專利no.5,321,095，(1994)，Greenwald，R.B.)反應(yīng)，因此引入又一個(gè)酰胺鍵，也可以形成酰胺鍵。
由于一些肽不包含許多賴氨酸，因此，將多于一個(gè)PEG連接到相同的賴氨酸上有可能是有利的。這可以通過(guò)例如使用1，3-二氨基-2-丙醇進(jìn)行。
也可以將PEG通過(guò)氨基甲酸酯鍵連接到酶的氨基上(WO95/11924，Greenwald等)。賴氨酸殘基也可以用作主鏈。
親本酶上述的本發(fā)明結(jié)合物可以使用本領(lǐng)域中已知的任何適合技術(shù)基于所選擇的親本酶制備。
術(shù)語(yǔ)“親本”酶是指任何未偶聯(lián)的酶(即要修飾的酶)。該酶優(yōu)選地可以是微生物來(lái)源的，如細(xì)菌、絲狀真菌或酵母來(lái)源的。
親本酶可以是天然存在的(或野生型)酶或其變體。
評(píng)價(jià)/選擇適合的親本酶酶的三維結(jié)構(gòu)在評(píng)價(jià)/選擇要修飾的適合親本酶方面有些用處。三維結(jié)構(gòu)可以是X-射線結(jié)構(gòu)、核磁共振結(jié)構(gòu)或建立的模型結(jié)構(gòu)。Brookhaven數(shù)據(jù)庫(kù)可以作為X-射線和核磁共振結(jié)構(gòu)的來(lái)源。
如果與所說(shuō)的酶有至少30％序列等同的一種或多種同源酶的一個(gè)或多個(gè)3D結(jié)構(gòu)已知，則可由本領(lǐng)域熟練人員建立模型結(jié)構(gòu)。有幾個(gè)軟件包，如Biosym的“Homo1ogy95.0”軟件包，可以用來(lái)構(gòu)建模型結(jié)構(gòu)。
構(gòu)建模型結(jié)構(gòu)所需要的典型工作是對(duì)存在3D結(jié)構(gòu)的同源序列進(jìn)行序列對(duì)比、確定結(jié)構(gòu)保守區(qū)域(SCR)、確定SCR的等同序列、在結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索結(jié)構(gòu)片段/環(huán)以取代變異區(qū)、確定這些區(qū)域的等同序列、通過(guò)能量最低化使結(jié)構(gòu)精確化。已知相對(duì)于已知的3D結(jié)構(gòu)含有大插入物(≥3個(gè)殘基)的區(qū)域相當(dāng)難以模擬，必須小心地預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)。
獲得所說(shuō)酶的3D-結(jié)構(gòu)或基于與已知結(jié)構(gòu)的同源性建立的結(jié)構(gòu)模型后，這種結(jié)構(gòu)即是確定合適親本酶(當(dāng)修飾時(shí)，這些酶變應(yīng)原性降低，充分保持殘余酶促活性)的必要先決條件。
用于皮膚護(hù)理產(chǎn)品的優(yōu)選的酶是在皮膚護(hù)理產(chǎn)品中使用的pH值范圍內(nèi)有顯著酶促活性的那些酶。
酶活性親本酶可以具有已知用于皮膚護(hù)理的任何活性。所涉及的酶包括氧化還原酶(E.C.1，“酶命名法，(1992)，學(xué)院出版公司)，如漆酶和超氧化物歧化酶(SOD)；水解酶E.C.3，包括蛋白酶，特別是枯草桿菌蛋白酶，以及脂解酶；轉(zhuǎn)移酶，(E.C.2)，如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG酶)；異構(gòu)酶(E.C.5)，如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)。
水解酶蛋白水解酶所涉及的蛋白水解酶包括選自下列組的、具有上述性質(zhì)(即連接基團(tuán)的數(shù)目，連接基團(tuán)的位置等)的酶酸性天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶，或金屬蛋白酶。
具有適合數(shù)目偶聯(lián)基團(tuán)的合適親本蛋白酶的特定例子示于表2中表2
枯草桿菌蛋白酶PD498具有29kDa的分子量，并示于SEQ IDNO.2中。PD498在其表面上具有12個(gè)賴氨酸基團(tuán)可用于連接，還有一個(gè)N末端氨基。如上所述，優(yōu)選的酶中，賴氨酸廣泛分布于酶表面。PD498中沒(méi)有任何一個(gè)賴氨酸殘基位于距離活性位點(diǎn)0～10的范圍內(nèi)，這使得PD498特別適合于處理成修飾形式。此外，諸賴氨酸殘基在該酶的表面上廣泛分布(即遠(yuǎn)離活性位點(diǎn))。
枯草桿菌蛋白酶DY具有27kDa的分子量，在其表面上有12個(gè)氨基(即賴氨酸殘基)，還有一個(gè)N末端氨基(參見(jiàn)SEQ ID NO.3)。
親本蛋白酶Lion Y具有46kDa的分子量，在其表面上有14個(gè)氨基(即賴氨酸殘基)，還有一個(gè)N末端氨基(參見(jiàn)SEQ ID NO.4)。
中性金屬蛋白酶嗜熱菌蛋白酶具有34kDa的分子量，并在其表面上有11個(gè)氨基(即賴氨酸殘基)，還有一個(gè)N末端氨基(參見(jiàn)SEQ IDNO.5)。
脂解酶所涉及的脂解酶包括柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)脂酶(如在EP 258 068和EP 305 216中描述的那一種)，Humicolainsolens、Rhizomucor miehei脂酶(如EP 238 023所述)，犁頭酶脂解酶(WO 96/13578)，假絲酵母屬脂酶(如C.antarctica脂酶，例如在EP 214 761中描述的C.antarctica脂酶A或B)，假單胞菌屬脂酶(例如產(chǎn)堿假單胞菌、類產(chǎn)堿假單胞菌脂酶，如EP 218 272中所述；洋蔥假單孢菌脂酶，如EP 331 376中所述；WO95/14783中所公開(kāi)的假單孢菌脂酶)，芽孢桿菌脂酶(例如枯草芽孢桿菌脂酶(Dartois等，(1993)Biochemica et Biophysica acta，1131，253-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌脂酶(JP 64/744992)和短小芽孢桿菌脂酶(WO 91/16422))。其它類型的脂解酶包括角質(zhì)酶，例如在WO88/09367中描述的源自門多薩假單胞菌的角質(zhì)酶，或源自Fusariumsolani pisi的角質(zhì)酶(如在WO 90/09446中所述)。
氧化還原酶漆酶所涉及的漆酶包括在Novo Nordisk的WO 96/00290與WO95/33836中所公開(kāi)的漆酶。
轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶適合的轉(zhuǎn)移酶包括在WO 96/06931(Novo Nordisk A/S)和WO96/22366(Novo Nordisk A/S)中所公開(kāi)的任何轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
異構(gòu)酶蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶適合的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶包括在WO 95/01425(Novo NordiskA/S)中描述的那些PDI，但并不限于此。
適于皮膚護(hù)理的酶活性本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及包含本發(fā)明的被修飾酶和已知用于皮膚護(hù)理組合物的諸成分的皮膚護(hù)理組合物。
已知許多酶活性可用于皮膚護(hù)理組合物。
蛋白酶蛋白酶是潔膚產(chǎn)品中的有效成分。蛋白酶能除去皮膚死亡角質(zhì)細(xì)胞的上層，由此使皮膚看上去更有光澤、更為清新。而且，蛋白酶也能提高皮膚的光滑性。
蛋白酶可用于化妝用品、盆浴和淋浴產(chǎn)品，包括香波、調(diào)理劑、洗劑、乳膏、肥皂塊、香皂以及液態(tài)肥皂。
脂酶脂酶可作為潔膚產(chǎn)品和抗痤瘡產(chǎn)品中的有效成分用于化妝品用途中，以除去過(guò)多的皮膚脂類，也可作為皮膚護(hù)理有效成分用于盆浴和淋浴產(chǎn)品(如乳膏和洗劑)中。
脂酶也可以用于頭發(fā)清潔產(chǎn)品(例如香波)中，以有效地從頭發(fā)表面除去皮脂和其它脂肪物質(zhì)。
氧化還原酶用于個(gè)人護(hù)理用途的最常用的氧化還原酶是與底物(如葡萄糖)一起能確保產(chǎn)生H2O2的氧化酶(通常是葡糖氧化酶)，然后H2O2可起始過(guò)氧化物酶(通常是乳過(guò)氧化物酶)對(duì)例如SCN-或I-的氧化，形成抗微生物試劑(SCNO-或I2)。已知這一酶促?gòu)?fù)合物天然存在于例如乳汁和唾液中。
商業(yè)上，過(guò)氧化物酶在口腔護(hù)理產(chǎn)品(漱口液、牙粉、口香糖)中一直用作抗微生物體系，在這些產(chǎn)品中，它也可以與淀粉葡糖苷酶結(jié)合使用，以產(chǎn)生葡萄糖。已知這些體系也用于化妝品產(chǎn)品中，以利于保存。
氧化還原酶另一個(gè)應(yīng)用是使用氧化酶、過(guò)氧化物酶和漆酶進(jìn)行氧化性染發(fā)(參見(jiàn)例如Novo Nordisk的WO 96/00290或WO95/33836)。
已知在皮膚(和頭發(fā))表面形成的自由基與皮膚的老化過(guò)程(頭發(fā)的損壞)相關(guān)。
自由基會(huì)激活能導(dǎo)致脂膜、膠原以及細(xì)胞破壞的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
自由基清除劑(如超氧化物歧化酶)在化妝品中的應(yīng)用是眾所周知的(R.L.Goldemberg，DCI，Nov.93，P.48-52)。
蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)也是一種氧化還原酶。它可以用于燙發(fā)(使頭發(fā)中的二硫鍵還原和再氧化)和修復(fù)受損頭發(fā)(其中損傷主要是原有二硫鍵發(fā)生了還原)。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶用于皮膚、頭發(fā)或指甲的皮膚護(hù)理組合物包含(a)氨基功能活性成分，(b)催化活性成分與皮膚、頭發(fā)或指甲交聯(lián)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，以及(c)在美國(guó)專利NO.5,490,980中已知的載體。
適合用于哺乳動(dòng)物皮膚、頭發(fā)或指甲的化妝品組合物包含(a)量足以在所說(shuō)的皮膚、頭發(fā)或指甲上形成保護(hù)層的至少一種角質(zhì)細(xì)胞(corneocyte)包膜蛋白；(b)量足以使得在角質(zhì)細(xì)胞包膜蛋白和所說(shuō)皮膚、頭發(fā)或指甲角質(zhì)層中的外部暴露的角質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)之間形成共價(jià)鍵的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；(c)量足以激活轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的鈣離子；以及(d)化妝上可接受的載體，其中所說(shuō)的組合物包含具有兩相的乳化劑，其中所說(shuō)的角質(zhì)細(xì)胞包膜蛋白質(zhì)包含在該兩相中的一相內(nèi)，而轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包含在另一相內(nèi)(參見(jiàn)美國(guó)專利NO.5,525,336)。
JP 3083908描述了一種皮膚化妝品材料，其中含有用水溶性物質(zhì)修飾過(guò)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。該修飾物質(zhì)是例如聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙烯醇、葡萄糖、蔗糖、海藻酸、羧甲基纖維素、淀粉以及羥丙基纖維素中的一種或多種。這種修飾是通過(guò)例如導(dǎo)入活性基團(tuán)并與酶鍵合完成的。這樣提供了一種對(duì)皮膚比較溫和、隨時(shí)間褪色和變味的程度較小、并具有良好的醫(yī)治粗糙皮膚、保濕性以及美化調(diào)理皮膚效果的物質(zhì)。
本發(fā)明的皮膚護(hù)理產(chǎn)品本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及包含本發(fā)明皮膚護(hù)理組合物的皮膚護(hù)理產(chǎn)品。術(shù)語(yǔ)“皮膚護(hù)理產(chǎn)品”如上定義。
本發(fā)明的皮膚護(hù)理產(chǎn)品可以包含有效量的本發(fā)明的被修飾酶。本領(lǐng)域熟練人員所知的這種有效量常占最終皮膚護(hù)理產(chǎn)品的0-5％。
所涉及的本發(fā)明皮膚護(hù)理產(chǎn)品包括但不限于下列產(chǎn)品肥皂、化妝品、護(hù)膚膏、護(hù)膚凝膠、護(hù)膚奶、潔膚洗液、清潔霜、清潔露、潔膚奶、冷霜、冷制皂、化妝基料、清潔乳、面膜、含鋅化妝水、T區(qū)精華素、潤(rùn)手香脂、香粉、增白粉、皂粉、塊皂、透明皂、唇膏、口紅、營(yíng)養(yǎng)素、粉底霜、搽臉?lè)?、眼影粉、粉底、指甲油清潔劑、生發(fā)油、美發(fā)液、發(fā)乳、發(fā)用凝膠、滋發(fā)劑、頭發(fā)定形制品、染發(fā)劑、頭發(fā)著色劑、頭皮滋潤(rùn)劑(scalp treatment)、香波、香膏、護(hù)發(fā)素、發(fā)膠、曬黑油(sur oil)、防曬品、剃須泡沫與凝膠、剃須膏、嬰兒油、粉刺護(hù)理制品、止汗劑、驅(qū)蟲(chóng)劑、祛臭劑等。
常規(guī)皮膚護(hù)理產(chǎn)品配方術(shù)語(yǔ)“用于皮膚護(hù)理產(chǎn)品的成分”是指包括已知用于皮膚護(hù)理產(chǎn)品配方中的所有有效成分。這種成分的例子可參見(jiàn)“化妝品和化妝用品”(由Wilfried Umbach編輯，由Ellis Horwood有限公司出版，英國(guó)，(1991))以及“消費(fèi)品中的表面活性劑”(由J.Falbe編輯，由Spring-Verlag出版，(1987))。
下面非窮盡性地列出了一些指導(dǎo)性配方。這些配方概述了本發(fā)明所涉及的重要皮膚護(hù)理產(chǎn)品配方。
香皂成分 例子％表面活性劑 肥皂(鈉鹽) 83-87螯合劑 乙二胺四乙酸鹽 0.1-0.3稠度調(diào)節(jié)劑 氯化鈉 大約0.5染料 ＜0.1光學(xué)增白劑 ＜0.1抗氧化劑 2，6-雙(1，1-二甲基乙基)-4-甲 0.1-0.3基苯酚(BHT)增白劑 二氧化鈦0.1-0.3香料 1.0-2.0酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差額合成洗滌劑成分例子 ％表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽30-50月桂基磺基琥珀酸鹽1-12加脂劑 脂肪醇10-20成形劑 甘油的單/二硬脂酰酯 0-10填料淀粉 0-10活性劑 水楊酸0-1染料 ＜0.2香料 0-2酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差額泡沫浴和淋浴成分 例子％泡沫浴 ％淋浴表面活性劑月桂基醚硫酸鹽 10-20 10-12椰油酰胺丙基二甲基甜菜堿2-4 2-4乙氧基化脂肪酸 0.5-2 -加脂劑脂肪醇 0.5-3乙氧基化脂肪醇 0.5-5 0-4酶蛋白酶/脂酶 0-5 0-5成分 例子％泡沫浴 ％淋浴泡沫穩(wěn)定劑脂肪酸鏈烷醇酰胺0.2-2 0-4調(diào)理劑季銨化羥丙基纖維素 - 0-0.5增稠劑氯化鈉 0-3 0-3珠光劑乙二醇硬脂酸酯 0-2 -活性劑蔬菜提取物 0-1 0-1防腐劑5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷 0.1 0.1染料 0.1-0.2 0.1香料 0.3-3 0.3-2酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水分 差額 差額護(hù)膚膏(油包水型和水包油型)成分 例子 ％油包水型/水包油型乳化劑 脫水山梨醇倍半油酸酯 3-5 -硬脂酸鋁 1-2 -三乙醇胺硬脂酸 - 1-2十六烷醇/十八烷醇聚乙二醇 - 1-3醚脂肪衍生 棕櫚酸異丙酯 1-5 0-3物十六烷醇/十八烷醇 - 0-22-辛基十二烷醇 2-103-7硬脂酸/棕櫚酸 - 0-3辛酸/癸酸甘油三酯 5-10-甘油硬脂酸酯 - 0-5濕潤(rùn)劑 甘油 1-5 1-5山梨糖醇 1-5 1-5聚(羥基羧酸) 0.5-2 -丙二醇 - 0-3穩(wěn)定劑 硫酸鎂 0-0.8 -防腐劑 對(duì)羥基苯甲酸酯 0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂酶0-5 0-5水分 差額差額用于濕潤(rùn)皮膚的爽身水(水包油型)和皮膚洗劑成分例子 ％爽身水％皮膚洗劑乳化劑 十六烷醇/十八烷醇聚乙二醇1-3 -醚脫水山梨醇單月桂酸酯 0.5-1 -硬脂酸鈉 - 1-2月桂基硫酸鈉 - 0.5-2脂肪衍生2-辛基十二烷醇 1-3 0-5物石蠟油(paraflin oils)- 20-25蜂蠟 0.5-1 -硬脂酸異辛酯 3-7 -棕櫚酸異丙酯 - 2-5濕潤(rùn)劑 甘油 3-5 5-10山梨糖醇 - 0-5增稠劑 聚丙烯酸酯 0-0.3 0-1甲基羥丙基纖維素 0-0.3 0-0.5防腐劑 對(duì)羥基苯甲酸酯 0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水分 差額差額潤(rùn)面露成分 例子 ％表面活性劑 月桂基硫酸鎂 0.2-0.5加脂劑 己二酸二正丁基酯 1-2增溶劑 蓖麻油聚乙二醇醚 0.1-1清潔和清爽組分 乙醇 0-15濕潤(rùn)劑 甘油 0-5山梨醇0-5防腐劑 對(duì)羥基苯甲酸酯0.2-0.4收斂劑 蔬菜提取物 1-5抗刺激劑泛酰醇 0-1尿囊素 0-0.2蔬菜提取物 0.5-3酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差額洗發(fā)香波成分例子 ％表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽 12-16椰油脂肪酸酰氨丙基二甲 2-5基甜菜堿脂肪酸聚乙二醇酯 0-2增泡劑 脂肪酸乙醇酰胺 0.5-2.5調(diào)理劑 季銨化羥乙基纖維素 0.4-1蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物 0.2-1加脂劑 乙氧基化的羊毛脂醇 0.2-1添加劑 去頭屑劑 0-1防腐劑 5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷 0.1-0.3珠光劑 乙二醇硬脂酸酯 0-2染料 ＜0.1pH調(diào)節(jié)劑酸/堿0.1-1香料 0.3-0.5酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差額護(hù)發(fā)素和頭發(fā)調(diào)理劑成分 例子 ％護(hù)發(fā)素 ％頭發(fā)調(diào)理劑表面活性 脂肪醇聚乙二醇醚 0.1-0.2 1.5-2.5劑十六烷基三甲基銨氯化物 0.5-1-二甲基芐基硬脂基銨氯化 -0.5-1物加脂劑 甘油的單/二鯨蠟酸/硬脂 0.5-1.5 1.5-2.5酸酯稠度調(diào)節(jié) 脂肪醇 1-2.52.5-3.5劑增稠劑 甲基羥丙基纖維素 0.3-0.6 0.4-0.8調(diào)理劑 季銨化羥乙基纖維素 0.1-0.3 0.3-0.4防腐劑 對(duì)羥基苯甲酸酯 0.1-0.3 0.1-0.3染料 ＜0.1＜0.1pH調(diào)節(jié)劑 酸/堿0.1-10.1-1香料 0.2-0.5 0.2-0.5酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水分 差額 差額染發(fā)劑成分 例子 ％組分1堿性染發(fā)膏表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽1-4乙氧基化的蓖麻油 1-2稠度調(diào)節(jié)劑 脂肪醇8-10還原劑 亞硫酸鈉 0.8-1.2緩沖液 氯化銨0.5-1螯合劑 1-羥基乙烷-1，1-二膦酸0.1-0.2堿性劑 氨1.2-2氧化染料 顯色劑(Developing agent) 1
偶聯(lián)劑 1酶 漆酶 0-5水分 差額組分II過(guò)氧化氫分散物表面活性劑 月桂基硫酸鹽 0.5-1氧化劑 過(guò)氧化氫 6-9穩(wěn)定劑 1-羥基乙烷-1，1-二膦酸 1-1.5增稠劑 聚丙烯酸酯 3-5酶 漆酶 0-5水分 差額剃須膏成分例子 ％肥皂棕櫚酸/硬脂酸30-40氫氧化鉀 5-7氫氧化鈉 1-2脂肪組分椰子油 5-10聚乙二醇 0-2穩(wěn)定劑 四硼酸鈉 0-0.5硅酸鈉 0-0.5山梨醇 0-3酶 蛋白酶 0-5水分 差額剃須液成分例子 ％消毒劑 乙醇 40-80加脂劑 己二酸二正丁基酯 1-2增溶劑 乙氧基化的蓖麻油 0.5-1收斂劑蔬菜提取物 1-10抗刺激劑 泛酰醇 0-0.5蔬菜提取物穩(wěn)定劑甘油 0-5山梨醇 0-5丙二醇 0-3酶蛋白酶 0-5水 差額發(fā)油成分 例子 ％稠度調(diào)節(jié)劑脂肪醇 4-5乙氧基化的羊毛脂醇 3-6礦物脂凡士林 45-52支鏈?zhǔn)?10-18抗氧化劑 2，6-雙(1，1-二甲基乙基)-0.5-14-甲基苯酚(BHT)香料 0.2-0.4染料 0.1酶脂酶 0-5潤(rùn)膚劑甘油 差額定型水成分 例子 ％溶劑 異丙醇 12-20成膜組分 乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯 2-3.5酯共聚物軟化劑乙烯基吡咯烷酮/二甲基氨 0.2-1基乙基異丁烯酸酯調(diào)理劑 蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物 0.2-0.5抗靜電劑 十六烷基三甲基銨氯化物 0.1-0.5乳化劑 乙氧基化的蓖麻油0.1-0.5香料 0.1-0.2染料 ＜0.1酶 脂酶0-5水分 差額本發(fā)明的最后一個(gè)方面涉及本發(fā)明的被修飾酶的用途，使用皮膚護(hù)理產(chǎn)品時(shí)，通過(guò)降低IgE應(yīng)答而降低了皮膚護(hù)理產(chǎn)品的致敏能力。
材料和方法材料酶PD498WO 93/24623中所示的枯草桿菌蛋白酶類型的蛋白酶。PD498的序列在SEQ ID NO.1和2中顯示。
枯草桿菌蛋白酶DY分離自芽孢桿菌變種的、示于SEQ ID NO4的枯草桿菌蛋白酶類型蛋白酶(Detzel等(1993)，生物物理學(xué)檔案，302卷，2，P.499-502)。
ELISA試劑辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗大鼠Ig(Dako，DK，P162，#031；稀釋度1∶1000)。
小鼠抗大鼠IgE(Serotec MCA193；稀釋度1∶200)。
大鼠抗小鼠IgE(Serotec MCA419；稀釋度1∶100)。
生物素標(biāo)記的小鼠抗大鼠IgG1單克隆抗體(Zymed03-9140；稀釋度1∶1000)生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgGl單克隆抗體(Serotec MCA336B；稀釋度1∶1000)鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶(Kirkegard和Perry 14-30-00；稀釋度1∶1000)。
溶液終止溶液(DMG緩沖液)硼酸鈉，硼砂(Sigma)3，3-二甲基戊二酸(Sigma)CaCl2(Sigma)Tresyl氯化物(2，2，2-三氟乙磺酰氯)(Fluka)吐溫20聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯(Merck目錄號(hào)822184)1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)(Fluka)N-羥基琥珀酰亞胺(Fluka art.56480)碳酰氯(Fluka art.79380)乳糖(Merck 7656)PMSF(苯基甲基磺酰氟)Sigma琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-酰基對(duì)硝基苯胺(Suc-AAPF-pNP)Sigma NO.S-7388，分子量624.6g/摩爾。
著色底物OPD鄰苯二胺，(Kementec目錄號(hào)4260)試驗(yàn)動(dòng)物Brown Norway大鼠(得自Charles River，DE)Brown Norway大鼠(BN)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)稱得體重為大于250克，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)得大約為450克。
Dunkin Hartley豚鼠，(得自Charles River，Wiga GmbhSulzfeld 1，Sandhofer Weg，DE)。
雄Dunkin Hartley(為Parainfluenza 3，E.cuniculi，Kpneumonia和P multocida的血清陰性)。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)稱得體重為350-450克雌BALB/C小鼠(大約20g)(購(gòu)自Bomholdtgaard，Ry，DK)裝備XCEL II(Novex)ELISA讀數(shù)儀(UVmax，Molecular Devices)HPLC(Waters)PFLC(Pharmacia)Superdex-75柱，Mono-Q，Mono S(購(gòu)自Pharmacia，SW.)SLT購(gòu)自SLT LabInstruments的Fotometer。
大小排阻層析儀(Spherogel TSK-G2000 SW)。
大小排阻層析儀(Superdex 200，Pharmacia，SW)Amicon小槽方法BALB/C小鼠的免疫通過(guò)皮下注射分別含有25μl PD498、PD498-SPEG 5,000和甘氨酸-SPEG-15,000的50μl 0.9％(重量/體積)NaCl溶液，對(duì)雌性Balb/C小鼠(20克)進(jìn)行免疫。每一批的蛋白質(zhì)量通過(guò)NanoOrange蛋白質(zhì)定量試驗(yàn)(Molecular Probes Europe N-6666)測(cè)定。免疫每?jī)芍苓M(jìn)行一次，共進(jìn)行三個(gè)月。在免疫后一周時(shí)，從眼睛收集血液樣品(200μl)。通過(guò)血液凝固和離心獲得血清。
確定BALB/C小鼠中IgGl抗體相對(duì)濃度的ELISA方法1)用包被緩沖液中的1μg蛋白質(zhì)/ml包被ELIAS板，在4℃下溫育過(guò)夜，或在室溫下溫育至少3小時(shí)。50μl/孔。輕微搖動(dòng)。
2)倒空板，并用封閉緩沖液在室溫下封閉至少1/2小時(shí)。200μl/孔。輕微搖動(dòng)。以洗滌緩沖液洗滌板3次。
3)將抗原與在稀釋緩沖液中的1/2稀釋度血清溫育。諸溶液在制備后立即添加到孔中。留一些孔僅用稀釋緩沖液處理(空白)。在室溫下溫育至少1小時(shí)。50μl/孔。輕微搖動(dòng)。在洗滌緩沖液中洗滌板3次。
4)在稀釋緩沖液中稀釋生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgGl單克隆抗體或生物素標(biāo)記的小鼠抗大鼠IgGl單克隆抗體。在室溫下溫育至少1小時(shí)。50μl/孔。輕微搖動(dòng)。在洗滌緩沖液中洗滌板3次。
5)在稀釋緩沖液中稀釋鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶。在室溫下溫育至少1小時(shí)。50μl/孔。輕微搖動(dòng)。在洗滌緩沖液中洗滌板3次。
6)在底物緩沖液中混合0.6mg ODP/ml+0.4μl H2O2/ml。制備該溶液后立即使用。溫育10分鐘。50μl/孔。
7)終止反應(yīng)加入終止溶液。50μl/孔。
8)在492nm對(duì)平板讀數(shù)，以620nm的讀數(shù)作為參照。數(shù)據(jù)用Lotus軟件計(jì)算并顯示。
確定BALB/C小鼠中IgE抗體相對(duì)濃度的ELISA方法使用三層夾心ELISA(three layer sandwish ELISA)確定特異性IgE血清抗體的相對(duì)濃度。
1)用10μg大鼠抗小鼠IgE或小鼠抗大鼠IgE/ml緩沖液1包被ELISA板。
50μl/孔。在4℃下溫育過(guò)夜。
2)倒空板并以封閉緩沖液在室溫下封閉至少1/2小時(shí)。
200μl/孔。輕微搖動(dòng)。用洗滌緩沖液洗滌板3次。
3)與小鼠/大鼠血清一起溫育，從未稀釋的血清開(kāi)始，并以2倍稀釋度連續(xù)稀釋。留一些孔僅用緩沖液4處理(空白)。50μl/孔。在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動(dòng)。在洗滌緩沖液中洗滌板3次。
4)在稀釋緩沖液中將酶稀釋成適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度。50μl/孔。
在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動(dòng)。在洗滌緩沖液中洗滌板3次。
5)用稀釋緩沖液稀釋特異性多克隆抗酶抗血清血清(pIg)以用于檢測(cè)結(jié)合抗體。50μl/孔。在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動(dòng)。在洗滌緩沖液中洗滌板3次。
6)用稀釋緩沖液稀釋辣根過(guò)氧化酶結(jié)合的抗pIg抗體。50μl/孔。在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動(dòng)。用洗滌緩沖液洗滌板3次。
7)于底物緩沖液中混合0.6mg ODP/ml+0.4μl H2O2/ml。制備好該溶液后立即使用。溫育10分鐘。50μl/孔。
8)終止反應(yīng)加入終止溶液。50μl/孔。
9)在492nm對(duì)平板讀數(shù)，以620nm的讀數(shù)作為參照。數(shù)據(jù)用Lotus軟件計(jì)算并顯示。
用于測(cè)定IgGl陽(yáng)性豚鼠的ELISA方法用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)中的兔抗PD498 1∶8000包被ELISA微量滴定板，并在4℃下溫育過(guò)夜。第二天，用2％BSA封閉各板1小時(shí)，并用PBS吐溫20洗滌各板3次。
將1μg/ml PD498加入至各板中，溫育1小時(shí)，再用PBS吐溫20洗滌板3次。
將所有豚鼠血清樣品與對(duì)照加到具有2μl血清和98μl PBS的ELISA板上，溫育1小時(shí)，并以PBS吐溫20洗滌板3次。
然后將山羊抗豚鼠IgG1(PBS緩沖液中的1∶4000稀釋度(NordicImmunology 44-682))加到板上，溫育1小時(shí)，并用PBS吐溫20洗滌各板。
加入堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗山羊1∶8000(Sigma A4187)，溫育1小時(shí)，用PBS吐溫20洗滌板兩次，用二乙醇胺胺緩沖液洗滌板1次。
在37℃下，使用對(duì)硝基苯基磷酸酯對(duì)標(biāo)記的堿性磷酸酶顯色30分鐘，或者直到顯示出適當(dāng)?shù)念伾?br> 使用終止介質(zhì)(包含EDTA的K2HPO4/HaH3緩沖液(pH 10))終止反應(yīng)，并使用ELISA讀數(shù)儀讀取OD 405/650的數(shù)值。
在所有ELISA板上均包括雙盲樣本。
陽(yáng)性和陰性血清值計(jì)算為平均盲值加2倍的標(biāo)準(zhǔn)差。這樣達(dá)到的準(zhǔn)確度為95％。
大鼠的氣管內(nèi)(IT)刺激使用具有2英寸長(zhǎng)度金屬探頭的一次性注射器進(jìn)行氣管內(nèi)施用分子。這一探頭插入進(jìn)大鼠的氣管中大約在會(huì)厭下1cm，放置0.1ml的分子溶液。刺激動(dòng)物4次，最后一次刺激至放血之間間隔5天。
試驗(yàn)動(dòng)物是每組10只的Brown Norway大鼠(BN)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)重量大于250克，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)重量大約450克。
豚鼠的氣管內(nèi)(IT)刺激使用具有2英寸長(zhǎng)度金屬探頭的一次性注射器進(jìn)行氣管內(nèi)施用分子。這一探頭插入進(jìn)豚鼠的氣管中大約在會(huì)厭下1cm，放置0.1ml的分子溶液。一周刺激動(dòng)物一次，連續(xù)刺激10周。
ELISA IgE試驗(yàn)系統(tǒng)(用于Brown Norway大鼠)使用三層夾心ELISA確定特異性抗體的相對(duì)濃度。
使用免疫分子作為包被抗原(10μg/ml于中性磷酸鹽緩沖液中，50μl/孔)，于4℃下溫育過(guò)夜。所有殘留于孔表面的結(jié)合點(diǎn)用磷酸鹽緩沖液中的2％脫脂奶粉(200μl/孔)在室溫(RT)封閉至少30分鐘。用8-通道取液器，按50μl/孔，將欲用該抗原進(jìn)行測(cè)試的所有血清的10倍稀釋度及隨后的3倍連續(xù)稀釋度加至平板中。各稀釋是在含有0.5％脫脂奶粉和0.05％吐溫20的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行的，于室溫下在攪拌平臺(tái)上溫育2小時(shí)?！笆聚櫋狈肿邮巧锼仵；男∈罂勾笫驣gE(50μl/孔)，在具有0.5％脫脂奶粉和0.05％吐溫20的磷酸鹽緩沖液中稀釋2000倍，于RT下在攪拌平臺(tái)上溫育2小時(shí)。對(duì)照(空白對(duì)照)的操作相同，但沒(méi)有大鼠血清。將稀釋2000倍的鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶50μl/孔在攪拌平臺(tái)上溫育1小時(shí)。50μl/孔的顯色底物是每10ml檸檬酸鹽緩沖液(pH5.2)中的OPD(6mg)和H2O2(4μl 30％的溶液)。按100μl/孔加入2N H2SO4以終止反應(yīng)。利用SLT讀取486nm處的值，使用620nm處的值作為參照。數(shù)據(jù)用Lotus軟件計(jì)算和顯示。
測(cè)定分子量使用4-20％梯度的SDS聚丙烯酰胺凝膠(Novex)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的電泳分離。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染檢測(cè)。相對(duì)于Novex的Mark-12寬范圍分子量標(biāo)準(zhǔn)的遷移率測(cè)量分子量。
蛋白酶活性用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa分析蛋白酶切割肽和對(duì)硝基苯胺之間的鍵，產(chǎn)生在405nm吸收的可見(jiàn)黃色。
緩沖液例如Britton和Robinson緩沖液pH8.3底物將100mg suc-AAPF-pNa溶解在1ml二甲基亞砜(DMSO)中。將100μl的這種溶液用Britton和Robinson緩沖液稀釋成10ml。
分析混合底物和蛋白酶溶液，在405nm下監(jiān)測(cè)作為時(shí)間和ABS405nm/min的函數(shù)的吸光度。應(yīng)該控制溫度(在20-50之間，取決于蛋白酶)。這測(cè)量的是樣品中的蛋白酶活性。
實(shí)施例實(shí)施例1用N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化mPEG 15,000
將mPEG 15,000懸浮在甲苯中(4ml/g mPEG)，在正常壓力下蒸餾除去20％以共沸干燥反應(yīng)物。當(dāng)溶液冷卻到30℃時(shí)，加入二氯甲烷(1ml/g干燥mPEG)，并加入甲苯中的碳酰氯(1.93M 5摩爾/摩爾mPEG)，混合物在室溫下攪動(dòng)過(guò)夜。混合物蒸發(fā)至干燥，所得的目的產(chǎn)物為蠟狀塊。
在蒸發(fā)之后，添加二氯甲烷和甲苯(1∶2，3ml/g干燥mPEG)以重新溶解白色固體。以固體形式加入N-羥基琥珀酰亞胺(2摩爾/摩爾mPEG)，然后加入三乙胺(1.1摩爾/摩爾mPEG)。將混合物攪動(dòng)3小時(shí)?；旌衔镒畛醪⒉磺辶?，然后變得清亮，最后形成小沉淀。將混合物蒸發(fā)至干燥，在乙酸乙酯(10ml)中重結(jié)晶，熱過(guò)濾以除去鹽和不溶性的微量物質(zhì)。放置清亮液體，使其在室溫下緩慢冷卻16小時(shí)，然后在冰箱中過(guò)夜。濾出白色沉淀，以一些冷乙酸乙酯洗滌，并進(jìn)行干燥，得到98％(w/w)的產(chǎn)物。核磁共振表明有80-90％被活化和5o/oo(w/w)HNEt3Cl。mPEG 15,000(CDCl3)的1H-NMR為δ1.42t(I＝4.8 CH3iHNEt3Cl)，2.84s(I＝3.7琥珀酰亞胺)，3.10dq(I＝3.4 CH2iHNEt3Cl)，3.38s(I＝2.7 CH3iOMe)，3.40*dd(I＝4.5o/oo，13C satellite)，3.64bs(I＝1364主峰)，3.89*dd(I＝4.8o/oo13C satellite)，4.47dd(I＝1.8，PEG中的CH2)。于22℃下在干燥器中存儲(chǔ)4個(gè)月后未見(jiàn)變化。
實(shí)施例2用N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化mPEG 5,000用N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化mPEG 5,000如實(shí)施例1所述進(jìn)行。
實(shí)施例3PD498蛋白酶與活化的mPEG 5,000的結(jié)合在20ml的終體積內(nèi)，于50mM硼酸鈉(pH10)中，將200mg PD498與1.8g用N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化的mPEG 5,000(按照實(shí)施例2制備)一起溫育。通過(guò)磁性攪拌，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間是1小時(shí)。通過(guò)添加DMG緩沖液至終濃度為5mM戊二酸二甲酯、1mM CaCl2和50mM硼酸鹽(pH5.0)來(lái)終止反應(yīng)。
所得衍生物的分子量大約是100kDa，相當(dāng)于每摩爾PD498連接了大約13摩爾mPEG。
與親本酶比較，被修飾酶對(duì)肽底物(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-?；鶎?duì)硝基苯胺)的剩余活性接近100％。
實(shí)施例4枯草桿菌蛋白酶DY蛋白酶和活化的mPEG 5,000的結(jié)合使用與實(shí)施例3中所述相同的方法，將枯草桿菌蛋白酶DY蛋白酶與經(jīng)N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化的mPEG 5,000進(jìn)行結(jié)合。
實(shí)施例5BALB/C小鼠皮下(SC)追蹤使用如上述實(shí)施例描述所制備的修飾的PD498-SPEG 5,000、未修飾的親本PD498和甘氨酸-SPEG 15,000皮下刺激BALB/C小鼠。
免疫小鼠的血清在特異性的IgE ELISA(如上所述)中進(jìn)行檢測(cè)，以分析諸分子是否能活化免疫應(yīng)答系統(tǒng)，引起特異性IgE應(yīng)答(參見(jiàn)圖1)。
兩周一次共四次的免疫接種足以引發(fā)對(duì)PD498的IgE應(yīng)答。
兩周一次的免疫方案持續(xù)3個(gè)月。在研究的最后，進(jìn)行了七次免疫。如圖1所示，經(jīng)未修飾的親本PD498免疫的BALB/C小鼠中，抗PD498 IgE水平在第5次免疫之前均增加，然后維持相當(dāng)穩(wěn)定的水平。相對(duì)而言，在用修飾的PD498-SPEG 5,000免疫過(guò)的小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到特異性IgE應(yīng)答。
實(shí)施例6豚鼠中PD498-SPEG 5,000的變應(yīng)原性氣管內(nèi)追蹤通過(guò)氣管內(nèi)施藥，用1.0μg純化的PD498和1.0μg修飾的PD498-SPEG 5,000刺激Dunkin Hartley豚鼠。
用特異性的IgG1 ELISA(如上所述)檢測(cè)追蹤期間經(jīng)免疫的Dunkin Hartley豚鼠的血清，以分析該分子是否能活化免疫應(yīng)答系統(tǒng)，引起指示為變應(yīng)性應(yīng)答的特異性IgG1應(yīng)答(參見(jiàn)圖2)。測(cè)定水平是1∶50。
圖2顯示了在10周的追蹤期間Dunkin Hartley豚鼠的IgG1水平。從圖中可以看出，在相當(dāng)于第7周的第7號(hào)穿刺抽液(Tap-7)之前，檢測(cè)不到修飾的PD498的IgG1水平。用修飾的PD498連續(xù)刺激后，IgG1水平?jīng)]有明顯的提高。
實(shí)施例7豚鼠中劑量-反應(yīng)的氣管內(nèi)追蹤(IT)在豚鼠中通過(guò)氣管內(nèi)追蹤檢測(cè)修飾的PD498-SPEG 5,000的潛在變應(yīng)性應(yīng)答。豚鼠一周刺激一次，連續(xù)10周。
在第一次氣管內(nèi)刺激之前，使用如上所述用于豚鼠的ELISA，對(duì)從每只Dunkin Hartley豚鼠收集的血樣進(jìn)行血液檢測(cè)。這樣做是為了確保在ELISA中沒(méi)有血清的非特異性結(jié)合。
10只一組的豚鼠用0.3微克、3微克、30微克、300微克的下列物質(zhì)進(jìn)行氣管內(nèi)刺激■親本PD498，和■修飾的PD498-SPEG 5,000。
下列溶液用于盲檢■0.9％NaCl(用于親本PD498的盲檢)，■在0.9％NaCl中的300微克PEG 5,000(相當(dāng)于PD498-SPEG5,000中的PEG量)(用于修飾的PD498-SPEG的盲檢)。
在IgG1 ELISA(如上所述)中檢驗(yàn)所有試驗(yàn)豚鼠的血清。圖3中給出了修飾的PD498-SPEG 5,000的氣管內(nèi)追蹤結(jié)果。圖4中給出了未修飾的親本PD498的追蹤結(jié)果。
通過(guò)比較圖3和圖4可以看出與用親本酶氣管內(nèi)刺激的豚鼠相比，用修飾的酶氣管內(nèi)刺激豚鼠引起的應(yīng)答有所降低。
按照前面公開(kāi)的內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)明顯的是，實(shí)施本發(fā)明時(shí)，在不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)或范圍的情況下可以有許多變更和修改。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)按照下列權(quán)利要求定義的內(nèi)容理解。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsveard(E)國(guó)家丹麥(F)郵區(qū)代碼(ZIP)DK-2880(G)電話45 4444 8888(H)傳真45 4449 3256(ii)發(fā)明名稱用于皮膚護(hù)理的被修飾酶(iii)序列數(shù)4(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPO)(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度840個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來(lái)源(B)菌株芽孢桿菌PD498，NCIMB No.40484(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..840(xi)序列描述SEQ ID NO1TGG TCA CCG AAT GAC CCT TAC TAT TCT GCT TAC CAG TAT GGA CCA CAA 48Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15AAC ACC TCA ACC CCT GCT GCC TGG GAT GTA ACC CGT GGA AGC AGC ACT 96Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30CAA ACG GTG GCG GTC CTT GAT TCC GGA GTG GAT TAT AAC CAC CCT GAT144Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45CTT GCA AGA AAA GTA ATA AAA GGG TAC GAC TTT ATC GAC AGG GAC AAT192Lau Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60AAC CCA ATG GAT CTT AAC GGA CAT GGT ACC CAT GTT GCC GGT ACT GTT240Asn Pro Met Asp Lau Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80GCT GCT GAT ACG AAC AAT GGA ATT GGC GTA GCC GGT ATG GCA CCA GAT288Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95ACG AAG ATC CTT GCC GTA CGG GTC CTT GAT GCC AAT GGA AGT GGC TCA336Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110CTT GAC AGC ATT GCC TCA GGT ATC CGC TAT GCT GCT GAT CAA GGG GCA384Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125AAG GTA CTC AAC CTC TCC CTT GGT TGC GAA TGC AAC TCC ACA ACT CTT432Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140AAG AGT GCC GTC GAC TAT GCA TGG AAC AAA GGA GCT GTA GTC GTT GCT480Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160GCT GCA GGG AAT GAC AAT GTA TCC CGT ACA TTC CAA CCA GCT TCT TAC528Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175CCT AAT GCC ATT GCA GTA GGT GCC ATT GAC TCC AAT GAT CGA AAA GCA576Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190TCA TTC TCC AAT TAC GGA ACG TGG GTG GAT GTC ACT GCT CCA GGT GTG624Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205AAC ATA GCA TCA ACC GTT CCG AAT AAT GGC TAC TCC TAC ATG TCT GGT672Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220ACG TCC ATG GCA TCC CCT CAC GTG GCC GGT TTG GCT GCT TTG TTG GCA720Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240AGT CAA GGT AAG AAT AAC GTA CAA ATC CGC CAG GCC ATT GAG CAA ACC768Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255GCC GAT AAG ATC TCT GGC ACT GGA ACA AAC TTC AAG TAT GGT AAA ATC816Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270AAC TCA AAC AAA GCT GTA AGA TAC840Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr275 280(2)關(guān)于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度280個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr275 280(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度274個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來(lái)源(B)菌株芽孢桿菌變種(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val1 5 10 15Gln Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Gly Ile Ile Asp20 25 30Thr Gly Ile Ala (Ala/Ser) Ser His Thr Asp Leu Lys Val Val Gly Gly Ala3540 45Ser Phe Val Ser Gly Glu Ser Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly50 55 60Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val65 70 75 80Leu Gly Val Ala Pro Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asn85 90 95Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Ala Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp100 105 110Ala Thr Gln Asn Gly Leu Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro115 120 125Ser Gly Ser Thr Ala Leu Lys Gln Ala Val Asp Lys Ala Tyr Ala Ser130 135 140Gly Ile Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Serl45 150 155 160Gln Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val165 170 175Gly Ala Val Asp Ser Asn Lys Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly180 185 190(Ala/Ser) Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Val Ser Val Tyr Ser Thr Tyr195 200 205Pro Ser Asn Thr Tyr Thr Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro210 215 220His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Tyr Pro Thr Leu225 230 235 240Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Asn Leu245 250 255Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala260 265 270Ala Gln(2)關(guān)于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度433個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來(lái)源(B)菌株芽孢桿菌Y種(xi)序列描述SEQ ID NO4Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn1 5 10 15Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Leu Val Ala Val Ala Asp Thr Gly20 25 30Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly35 40 45Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Ser Asp50 55 60Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala65 70 75 80Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile85 90 95Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr100 105 110Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser115 120 125Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val130 135 140Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly145 150 155 160Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys165 170 175Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly
180 185 190Ser Ile Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly195 200 205Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr210 215 220Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp225 230 235 240Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala245 250 255Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile260 265 270Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu275 280 285Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asp Gln290 295 300Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val305 310 315 320Asn Glu Ala Thr Ala Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe325 330 335Gln Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp340 345 350Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Tyr Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp355 360 365Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe370 375 380Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn385 390 395 400Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Ile Ile Glu Val Gln405 410 415Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val420 425 430His(2)關(guān)于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度316個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來(lái)源(B)菌株Bacillus Thermoproteolyticus(xi)序列描述SEQ ID NO5Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp1 5 10 15Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp20 25 30Asn Thr Arg Gly Asp Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr35 40 45Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala50 55 60Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr65 70 75 80Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn85 90 95Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn100 105 110Ala Phe Trp Asn Gly Ser Glu Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln115 120 125Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu130 135 140Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu145 150 155 160Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val165 170 175Glu Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val180 185 190Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro195 200 205Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr210 215 220Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala225 230 235 240Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val245 250 255Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr260 265 270Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala275 280 285Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala290 295 300Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys305 310 31權(quán)利要求
1.一種被修飾酶，其特征在于，其上有分子量為1-35kDa的4-70個(gè)聚合分子共價(jià)偶聯(lián)到分子量為15-100kDa的親本酶的表面。
2.按照權(quán)利要求1的被修飾酶，其特征在于，有4-20個(gè)聚合分子共價(jià)偶聯(lián)到分子量為15-35kDa的所述酶的表面上。
3.按照權(quán)利要求2中任何一項(xiàng)的被修飾酶，其中有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、1 5、16、17、18、19或20個(gè)聚合分子，優(yōu)選地13-18個(gè)聚合分子，共價(jià)偶聯(lián)到親本酶3-D結(jié)構(gòu)的表面上。
4.按照權(quán)利要求1的被修飾酶，其中有7-40個(gè)、優(yōu)選地10-30個(gè)聚合分子偶聯(lián)到分子量為35-60kDa的所述親本酶的表面上。
5.按照權(quán)利要求1的被修飾酶，其中有10-50個(gè)、優(yōu)選地13-40個(gè)聚合分子偶聯(lián)到分子量為60-80kDa的所述親本酶的表面上。
6.按照權(quán)利要求1的被修飾酶，其中有15-70個(gè)、優(yōu)選地18-60個(gè)聚合分子偶聯(lián)到分子量為80-100kDa的所述親本酶的表面上。
7.按照權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的被修飾酶，其中所述聚合分子的分子量為1-35kDa，如4-25kDa，優(yōu)選地6-25kDa，尤其是8-20kDa。
8.按照權(quán)利要求1-7的被修飾酶，其中所述聚合分子選自包含天然或合成同聚物和異聚物的組。
9.按照權(quán)利要求8的被修飾酶，其中所述聚合物分子選自包含合成聚合分子的組，所述合成聚合分子包括分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸、聚(乙烯吡咯烷酮)以及聚D，L-氨基酸。
10.按照權(quán)利要求8的被修飾酶，其中所述聚合分子選自包含天然存在的聚合分子的組，所述天然存在的聚合分子包括葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖；纖維素，如甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素)；以及聚氨基葡糖的水解產(chǎn)物；淀粉，如羥乙基淀粉、羥丙基淀粉；糖原，瓊脂糖，瓜爾膠，菊粉，支鏈淀粉，合成生物聚合膠，角叉菜膠，果膠以及藻酸。
11.按照權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的被修飾酶，其中所述酶偶聯(lián)到已活化的聚合物上下列基團(tuán)中的一種或多種上氨基、羥基、巰基、羧基、醛基或硫氫基。
12.按照權(quán)利要求1-11中任何一項(xiàng)的被修飾酶，其中所述聚合分子通過(guò)接頭(如三嗪環(huán))偶聯(lián)到所述酶上。
13.按照權(quán)利要求1-12中任何一項(xiàng)的被修飾酶，其中所述酶是微生物來(lái)源的，如細(xì)菌、絲狀真菌或酵母來(lái)源的。
14.按照權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的被修飾酶，其中所述酶是一種水解酶，包括蛋白酶(如枯草桿菌蛋白酶)和脂酶。
15.按照權(quán)利要求14的被修飾酶，其中所述親本蛋白酶選自包括PD498、Savinase、蛋白酶K、蛋白酶R、Thermitase、枯草桿菌蛋白酶DY、Lion Y、Alcalase、蛋白酶T和JA16的組。
16.按照權(quán)利要求16的被修飾酶，其中所述酶是SEQ ID NO.1所示的PD498，或SEQ ID NO.3所示的枯草桿菌蛋白酶類型的蛋白酶枯草桿菌蛋白酶DY，或SEQ ID N0.4所示的Lion Y。
17.按照權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的被修飾酶，其中所述酶是一種氧化還原酶，包括漆酶和超氧化物歧化酶。
18.按照權(quán)利要求1-17中任何一項(xiàng)的被修飾酶，其中所述聚合分子通過(guò)位于酶表面上的氨基(-NH2)偶聯(lián)到所述酶上。
19.按照權(quán)利要求18的被修飾酶，其中所述聚合分子通過(guò)N-末端氨基或位于酶表面上的賴氨酸殘基偶聯(lián)到所述酶上。
20.按照權(quán)利要求1-19的被修飾酶，其中所述聚合分子偶聯(lián)到所述酶上距離酶活性位點(diǎn)大于5、優(yōu)選地大于10的位置。
21.一種皮膚護(hù)理組合物，其中包含按照權(quán)利要求1-20中任何一項(xiàng)的被修飾酶以及已知用于皮膚護(hù)理產(chǎn)品的諸多成分。
22.一種皮膚護(hù)理產(chǎn)品，其中包含按照權(quán)利要求21的皮膚護(hù)理組合物，所述護(hù)理產(chǎn)品選自下組肥皂、化妝品、護(hù)膚膏、護(hù)膚凝膠、護(hù)膚奶、潔膚洗液、清潔霜、清潔露、潔膚奶、冷霜、冷制皂、化妝基料、清潔乳、面膜、含鋅化妝水、T區(qū)精華素、潤(rùn)手香脂、香粉、增白粉、皂粉、塊皂、透明皂、唇膏、口紅、營(yíng)養(yǎng)素、粉底霜、化妝底粉、眼影粉、粉底、指甲油清潔劑、生發(fā)油、美發(fā)液、發(fā)乳、發(fā)用凝膠、滋發(fā)劑、頭發(fā)定形制品、染發(fā)劑、頭發(fā)著色劑、頭皮滋潤(rùn)劑、香波、香膏、護(hù)發(fā)素、發(fā)膠、曬黑油、防曬品、剃須泡沫與凝膠、剃須膏、嬰兒油、粉刺護(hù)理制品、止汗劑、驅(qū)蟲(chóng)劑、祛臭劑等。
23.按照權(quán)利要求1-20中任何一項(xiàng)的被修飾酶用于降低皮膚護(hù)理產(chǎn)品致敏能力的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及適用于皮膚護(hù)理的被修飾酶,其上有分子量為1－35kDa的4－70個(gè)聚合分子共價(jià)偶聯(lián)到分子量為15－100kDa的親本酶表面上。本發(fā)明還涉及包含這種被修飾酶的皮膚護(hù)理組合物和產(chǎn)品,最后還涉及所述被修飾酶用于降低皮膚護(hù)理產(chǎn)品致敏能力的用途。
文檔編號(hào)A61Q5/10GK1253585SQ9880176
公開(kāi)日2000年5月17日 申請(qǐng)日期1998年1月12日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月10日
發(fā)明者A·A·奧爾森, A·普倫特 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司