專利名稱：突變體α－淀粉酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[2]本發(fā)明涉及在其中引入突變的α-淀粉酶，所述突變提供了改變的性能特征，例如改變的穩(wěn)定性特征和/或改變的活性特征。進一步，本發(fā)明涉及截短型α-淀粉酶。
背景技術(shù)：
[3]α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)主要是隨機地水解淀粉中的內(nèi)部α-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生較小分子量的麥芽糖糊精。α-淀粉酶具有相當大的工業(yè)價值，其被用于淀粉加工的初始階段(液化)、被用于生產(chǎn)乙醇、在去污劑基質(zhì)中作為清潔劑以及在紡織工業(yè)中用于淀粉脫漿。α-淀粉酶由很多種微生物產(chǎn)生，包括芽孢桿菌屬(Bacillus)和曲霉屬(Aspergillus)，最具工業(yè)價值的淀粉酶從細菌來源產(chǎn)生，例如地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。近年來，由于它們在工業(yè)操作條件下的熱穩(wěn)定性和性能，工業(yè)用途中優(yōu)選的酶是那些來自地衣芽孢桿菌的酶。通常地，淀粉到果糖的加工由四個步驟組成顆粒狀淀粉的液化、液化的淀粉糖化成右旋糖，純化以及異構(gòu)化成果糖。淀粉液化過程的目的是將淀粉聚合物顆粒的濃縮懸浮液轉(zhuǎn)化成低黏度的可溶短鏈糊精溶液。為了用標準設(shè)備方便地處理以及為了有效轉(zhuǎn)化成葡萄糖或其它糖，這個步驟是必要的。為了液化顆粒淀粉，必需通過提高顆粒淀粉的溫度到約72℃以上來膠凝化顆粒。加熱過程立即破壞不溶性淀粉顆粒，產(chǎn)生水溶性淀粉溶液。然后，溶解后的淀粉溶液被α-淀粉酶(EC3.2.1.1)液化。常用的酶液化過程包括通過加入氫氧化鈣、氫氧化鈉和碳酸鈉調(diào)節(jié)顆粒淀粉漿體的pH到6.0和6.5之間——來自地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶的最優(yōu)pH。加入氫氧化鈣的優(yōu)勢在于還提供了鈣離子，所述鈣離子已知可以穩(wěn)定α-淀粉酶以防止失活。加入α-淀粉酶之后，懸浮液被泵入通過蒸汽噴嘴，從而即刻升高溫度到80-115℃之間。淀粉立即被膠凝化，并且由于存在α-淀粉酶，通過α(1-4)糖苷鍵的隨機水解，淀粉被解聚化成易于被泵吸的流體物料。在所述液化過程的第二種變化中，α-淀粉酶被加入淀粉懸浮液，所述懸浮液被維持在80-100℃的溫度，以部分水解淀粉顆粒，并且部分水解的淀粉懸浮液在超過大約105℃的溫度通過噴嘴被泵入，以徹底膠凝化任何殘留的顆粒結(jié)構(gòu)。冷卻膠凝化的淀粉之后，可以第二次加入α-淀粉酶以進一步水解淀粉。該過程的第三種變化被稱為干磨法。在干磨中，整個谷粒被磨碎并且與水和/或酒糟(thin stillage)組合。胚芽可選地通過浮選分離法或等價的技術(shù)去除。使用α-淀粉酶，液化所得到的混合物，其含有淀粉、纖維、蛋白和其它谷物成分。當使用干磨法時，現(xiàn)有技術(shù)中的一般性實踐中是在較低的溫度下進行酶促液化。通常地，在將淀粉轉(zhuǎn)化成可溶性糊精中低溫液化據(jù)信比高溫液化具有更低的效率。通常地，膠凝化之后，淀粉溶液在存在α-淀粉酶的情況下被維持在高溫直到獲得8-20的DE，通常是1-3小時的時間。葡萄糖當量(DE)是測量總還原糖濃度的行業(yè)標準，計算為基于干重的D-葡萄糖。未水解的顆粒淀粉的DE幾乎為零，而D-葡萄糖的DE被定義為100?？梢员３趾?淀粉酶的淀粉溶液的最高溫度取決于獲得所述酶的微生物來源和α-淀粉酶分子的分子結(jié)構(gòu)。淀粉液化芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌野生型菌株產(chǎn)生的α-淀粉酶通常在不超過約90℃的溫度使用，這是由于高于該溫度會引起非常迅速的熱失活，而地衣芽孢桿菌野生型菌株產(chǎn)生的α-淀粉酶可以在可高達約110℃的溫度使用。已知淀粉和鈣離子的存在可以穩(wěn)定α-淀粉酶，以防止失活。液化之后，用葡糖淀粉酶將經(jīng)加工的淀粉糖化為葡萄糖。當在糖化混合物中存在殘留的淀粉時，本方法便出現(xiàn)問題，所述殘留淀粉的存在是由于淀粉的不完全液化例如淀粉酶的低效直鏈淀粉水解引起的。殘留的淀粉對于葡糖淀粉酶水解作用是高度耐受的。這表示，產(chǎn)量將有損失并且會干擾下游的糖漿過濾。此外，為了穩(wěn)定性，已知許多α-淀粉酶要求加入鈣離子。這進一步提高了液化的成本。在美國專利6,093,562中，親本α-淀粉酶的變體，在所述變體中親本α-淀粉酶的至少一個氨基酸殘基被缺失，具有α-淀粉酶活性和提高的熱穩(wěn)定性。可從嗜熱脂肪芽孢桿菌獲得的親本α-淀粉酶的一種被描述在例如J.Bacteriol.166(1986)pp.635-643中。在Suzuki，et al.，J.Biol.Chem.264(32)，第18933-18938頁(1989)中，描述了在區(qū)域176-178(相應(yīng)于嗜熱脂肪芽孢桿菌SEQ ID.NO3的殘基179-181)和區(qū)域266-269(相應(yīng)于嗜熱脂肪芽孢桿菌SEQ ID.NO3的殘基269-272)具有氨基酸改變的α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性。多位研究人員已經(jīng)使用重組DNA技術(shù)進行了研究，研究哪些殘基對于淀粉酶的催化活性是重要的和/或研究修飾在各種淀粉酶和糖基化酶的活性位點之中的某些氨基酸的效應(yīng)(Vihinen et al.，J.Biochem.，Vol.107，pp.267-272(1990)；Holm etal.，Protein Engineering，Vol.3，pp.181-191(1990)；Takase et al.，Biochemica etBiophvsica Acta，Vol.1120，pp.281-288(1992)；Matsui et al.，F(xiàn)EBS Letters，Vol.310.pp.216-218(1992)；Matsui et al.，Biochemistry，Vol.33，pp.451-458(1992)；Sogaardet al.，J.Biol.Chem.，Vol.268，pp.22480-22484(1993)；Sogaard et al.，CarbohydratePolymers，Vol.21，pp.137-146(1993)；Svensson，Plant Mol.Biol.，Vol.25，pp.141-157(1994)；Svensson et al.，J.Biotech.，Vol.29，pp.1-37(1993))。研究人員還研究了哪些殘基對于熱穩(wěn)定性是重要的(Suzuki et al.，J.Biol.Chem.Vol.264，pp.18933-18938(1989)；Watanabe et al.，Eur.J.Biochem.，Vol.226，pp.277-283(1994))；并且一個研究組已經(jīng)使用了這類方法，以在地衣芽孢桿菌淀粉酶的各個組氨酸殘基處引入突變，其基本原理是，與其它類似芽孢桿菌屬淀粉酶相比時，已知相對熱穩(wěn)定的地衣芽孢桿菌淀粉酶具有過量的組氨酸，因此，這提示，取代組氨酸可以改變酶的熱穩(wěn)定性。該工作導(dǎo)致鑒定出在位置+133的組氨酸殘基處和位置+209的丙氨酸殘基處的穩(wěn)定性突變(Declerck et al.，J.Biol.Chem.，Vol.265，pp.15481-15488(1990)；FR 2 665 178-A1；Jovet et al.，Bio/Technology，Vol.10，pp.1579-1583(1992))。盡管現(xiàn)有技術(shù)中有所進展，但對于在工業(yè)液化過程中更有效且允許在比目前實踐中更低的pH下具有活性的α-淀粉酶，尚存在需求。此外，對于具有使其在去污劑使用條件下更為有效的特征的改善的淀粉酶，存在需求。由于穩(wěn)定性問題，在許多條件下例如與去污劑相關(guān)的高堿度和氧化劑(漂白劑)水平或它們的操作溫度下，商業(yè)上可得的淀粉酶是不可接受的，所以，對于在此類條件下具有改變的和優(yōu)選提高的性能特征的淀粉酶，存在需求。
發(fā)明概述[16]本發(fā)明的一個目的是提供具有改變的性能特征的α-淀粉酶。本發(fā)明進一步的目的是提供在高溫下具有改善的穩(wěn)定性的α-淀粉酶。因此，本發(fā)明提供了嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶前體的變體，其包括在如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的位置R179和G180中的一個或多個位置處的缺失，和/或在與氨基酸序列SEQ ID NO3具有至少90％同一性的α-淀粉酶的相應(yīng)位置上的缺失。在本發(fā)明的另一個實施方案中，前體嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的變體包括在如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的位置R179和G180處的缺失，和/或在與氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少90％同一性的α-淀粉酶的相應(yīng)位置上的缺失。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了編碼所述變體α-淀粉酶的DNA。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了包括上述DNA的表達載體。在另一個實施方案中，提供了用上述表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞是芽孢桿菌屬某種。在另一個實施方案中，芽孢桿菌屬種選自枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。本發(fā)明的另一方面提供了包括上述變體α-淀粉酶的去污劑組合物。本發(fā)明的另一方面提供了包括上述變體α-淀粉酶的淀粉液化組合物。本發(fā)明的另一方面提供了液化淀粉的方法，包括步驟將淀粉漿體與包括上述缺失的變體α-淀粉酶接觸、將所述漿體的溫度升高到60℃和80℃之間，以及保持所述漿體的黏度在200.0Ncm以下。本發(fā)明的另一方面提供了液化淀粉的方法，包括步驟將淀粉漿體與包括上述缺失的變體α-淀粉酶接觸、將所述漿體的溫度升高到85℃和100℃之間，以及在二次液化開始的60分鐘內(nèi)提供至少8.00的平均DE級數(shù)(progression)。在這個方面的一個實施方案中，α-淀粉酶將被截短。在一些實施方案中，截短型α-淀粉酶包括序列SEQ ID NO16(如

圖14所示)或與該序列具有至少97％的序列同一性的序列。在一個實施方案中，表達構(gòu)建物包括編碼截短型α-淀粉酶的DNA序列。在一個實施方案中，載體包括編碼截短型α-淀粉酶的DNA序列。在一個實施方案中，組合物包括截短型α-淀粉酶。在一個實施方案中，包括截短型α-淀粉酶的組合物被用在液化淀粉的方法中，所述方法包括步驟將淀粉漿體與包括上述缺失的截短型α-淀粉酶接觸、將所述漿體的溫度升高到60℃到80℃，以及保持所述漿體的黏度在200.0Ncm以下。本發(fā)明的另一方面提供了液化淀粉的方法，包括步驟將淀粉漿體與包括上述缺失的截短型α-淀粉酶接觸、將所述漿體的溫度升高到85℃和100℃之間，以及在二次液化開始的60分鐘內(nèi)提供至少8.00的平均DE級數(shù)。
附圖簡述[20]圖1描述了來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶的基因的DNA序列(SEQ IDNO1)。圖2描述了嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶氨基酸序列的前體形式(pro-form)(SEQ ID NO2)。信號序列加下劃線并且是粗體。圖3描述了來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的成熟α-淀粉酶的氨基酸序列(SEQ IDNO3)。氨基酸殘基R179和G180加下劃線并且是粗體。圖4描述了變體α-淀粉酶(VAA)的氨基酸序列(SEQ IDNO 4)。圖5描述了四種芽孢桿菌屬α-淀粉酶的一級結(jié)構(gòu)的比對。本發(fā)明的變體α-淀粉酶(VAA)。地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(Am-Lich)(SEQ ID NO5)由Gray et al.，J.Bacteriology，Vol.166，pp.635-643(1986)描述；淀粉液化芽孢桿菌α-淀粉酶(Am-Amylo)(SEQ ID NO6)由Takkinen et al.，J.Biol.Chem.，Vol.258，pp.1007-1013(1983)描述；嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(Am-Stearo)(SEQ ID NO7)由Gray et al.，J.Bacteriology，Vol.166，pp.635-643(1986)描述。圖6a和圖6b描述了帶有地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(LAT)的信號肽的融合蛋白質(zhì)。LAT信號肽是粗體并且加下劃線。圖7描繪了質(zhì)粒pHPLT。圖8描繪了質(zhì)粒pHPLT-VAAc1。圖9描述了37℃在淀粉板(HI-瓊脂/新霉素/0.2％淀粉)上生長16小時之后，在碘染色之后由耐新霉素轉(zhuǎn)化子分泌的變體α-淀粉酶形成的暈圈。圖10描述了質(zhì)粒pICatH-VAAc1(Ori2)，其中ori PE 194(ts)是指來自質(zhì)粒pICatH的復(fù)制原點。圖11的圖表描述了野生型或天然嗜熱脂肪芽孢桿菌(2 A-10u/gm或0.28kg/MT干固體)(-■-)和本發(fā)明的變體α-淀粉酶(-◆-)的漿體的DE進展隨時間的變化。圖12的圖表以粘度(Ncm)隨時間(min)的變化描述了嗜熱脂肪芽孢桿菌變體(-◆-)、本發(fā)明的變體α-淀粉酶(-▲-)和變體地衣芽孢桿菌(-x-)(4 A-10u/gm或0.56kg/MT干固體)的漿體黏度進展。圖13描繪了通過質(zhì)譜儀測量的實施例1中產(chǎn)生的α-淀粉酶的完整分子量測量。表觀分子量與截短型α-淀粉酶的預(yù)測氨基酸序列相匹配，例如SEQ ID NO3的氨基酸殘基1-484。圖14描述了截短型α-淀粉酶(tAA)的氨基酸序列(SEQ ID NO16)的肽作圖(peptide mapping)結(jié)果。
發(fā)明詳述A.定義[34]本文中所指的所有的專利和出版物，包括這些專利和出版物中所公開的所有序列，都被確切地引入作為參考。除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學術(shù)語具有和本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同的含義(例如參見Singleton et al.，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，2d Ed.，John Wiley and Sons，New York；和Hale and Marham，The HarperCollins Dictionary of Biology，Harper Perennial，NY，兩者都為技術(shù)人員提供了本文所使用的術(shù)語的一般性釋義)。盡管與本文所述的那些方法和材料類似或等價的任何方法和材料可以被用于本發(fā)明的實踐或測試中，還是描述了優(yōu)選的方法和材料。數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)。如本文中和所附權(quán)利要求中所使用，單數(shù)“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)引用，除非上下文另外明確指出。因此，例如，引用一個“宿主細胞”包括多個此類宿主細胞。除非另外指出，以5′到3′方向從左到右書寫核酸；以氨基端到羧基端的方向從左到右書寫氨基酸序列。本文中提供的標題不是對本發(fā)明的各個方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?，而是整體上參考說明書對其進行理解。因此，下面緊接著被定義的術(shù)語從整體上參考說明書被更完整地定義。術(shù)語“α-淀粉酶(例如E.C.類別3.2.1.1)”指催化α-1，4-糖苷鍵水解的酶。這些酶還被描述為那些在含1，4-α連接的D-葡萄糖單元的多糖中實施1，4-α-D-糖苷鍵的外切型或內(nèi)切型水解作用的酶。用于描述這些酶的另一個術(shù)語是“糖原酶”。示例性酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。如本文所使用，“重組α-淀粉酶”是指這樣的α-淀粉酶，其中編碼天然產(chǎn)生的α-淀粉酶的DNA序列被修飾以產(chǎn)生突變體DNA序列，所述突變體DNA序列相比天然產(chǎn)生的α-淀粉酶編碼α-淀粉酶序列中的一個或多個氨基酸的取代、插入或缺失。術(shù)語“重組表達的α-淀粉酶”和“重組產(chǎn)生的α-淀粉酶”是指成熟的α-淀粉酶蛋白質(zhì)序列，其是在宿主細胞中從異源多核苷酸的表達中產(chǎn)生。例如，術(shù)語“r-α-淀粉酶”是指α-淀粉酶(例如，SEQ ID NO3或16)在已導(dǎo)入編碼該α-淀粉酶的多核苷酸的宿主中被表達和產(chǎn)生。r-AA的成熟蛋白序列不包括信號序列。當在有關(guān)細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體中使用時，術(shù)語“重組”指所述細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白質(zhì)或通過改變天然核酸或蛋白質(zhì)而被修飾，或者是指細胞來自于經(jīng)如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達未在天然(非重組)形式的細胞中發(fā)現(xiàn)的基因或者表達天然基因，所述天然基因以其它方式被不正常表達、過低表達或完全不表達。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可被相互交換使用。在本文中，常規(guī)的氨基酸殘基單字碼或三字碼被使用。“信號序列”是指連接在蛋白質(zhì)N端部分的氨基酸序列，其促進蛋白質(zhì)的成熟形式分泌到細胞外。信號肽的定義是功能性的定義。胞外蛋白的成熟形式缺乏該信號肽，所述信號肽在分泌過程中已經(jīng)被切除。如本文中所使用，“前體α-淀粉酶”是指α-淀粉酶，其中DNA序列是編碼天然發(fā)生的α-淀粉酶的序列或者起始DNA序列尚未如本申請所述被修飾。因此前體蛋白酶可以包括已知的野生型氨基酸序列或修飾的氨基酸序列，但不是本文描述的修飾，例如除了本文描述的缺失外還有其他改變的野生型序列。如本文中所使用，術(shù)語“野生型”或“天然α-淀粉酶”是指α-淀粉酶，其中DNA序列是編碼天然發(fā)生的α-淀粉酶的序列或者起始DNA序列尚未被修飾。如本文中所使用，術(shù)語淀粉酶的“前體(pro)”形式是指具有可操作地連接到該蛋白質(zhì)氨基端的額外的氨基酸/核苷酸序列和/或可操作地連接到該前體序列氨基端的信號序列的淀粉酶形式。如本文中所使用，術(shù)語“變體α-淀粉酶”(VAA)是指α-淀粉酶，其中編碼前體α-淀粉酶的DNA序列被修飾，產(chǎn)生編碼與前體α-淀粉酶氨基酸序列不同的氨基酸序列的突變DNA序列。例如，變體α-淀粉酶可以包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID.NO.3的殘基位置179和/或180的缺失。術(shù)語“截短型α-淀粉酶”是指α-淀粉酶并且包括這樣的多肽，所述多肽具有氨基酸序列，其包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的至少65％或包括與SEQ IDNO16(如圖14所示)具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中SBD的部分已被去除，例如被去除、缺失或類似地處理。術(shù)語“淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)”是指優(yōu)先與淀粉(多糖)底物結(jié)合的氨基酸序列。術(shù)語“接頭”是指通常具有3到40個氨基酸殘基的短氨基酸序列，其將含淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和含催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列共價結(jié)合。術(shù)語“催化結(jié)構(gòu)域”是指多肽的結(jié)構(gòu)區(qū)域，其與SBD不同并且包含用于底物水解的活性位點。如本文中所使用，氨基酸的“缺失”是指前體α-淀粉酶的氨基酸序列的修飾，該修飾導(dǎo)致前體淀粉酶的氨基酸位點的刪除，但優(yōu)選是指使用遺傳工程方法突變編碼前體α-淀粉酶的核酸，從而刪除被表達的蛋白質(zhì)中的各個殘基。一段連續(xù)的氨基酸殘基的缺失，以氨基酸殘基30-33為例，被表示為(30-33)*。特定氨基酸殘基的缺失，以位點179的氨基酸的缺失為例，被表示為Arg179*或R179*。如本文中所使用，術(shù)語“衍生自”是指前體α-淀粉酶的來源，其編碼前體α-淀粉酶。因此，衍生自某來源的α-淀粉酶包括那些從具體來源微生物分離出的α-淀粉酶。此外，衍生自某來源的α-淀粉酶包括那些由來源生物體的DNA編碼或表達的α-淀粉酶。如本文中所使用，在兩個核酸或兩個多肽的上下文中，術(shù)語“基本上類似的”或“基本上同一的”通常是指多核苷酸或多肽包括與參考(即，野生型)序列相比具有至少75％序列同一性，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，仍然更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選97％，有時多至98％和99％序列同一性的序列?？梢允褂靡阎某绦蚶鏐LAST、ALIGN和CLUSTAL，采用標準參數(shù)，測定序列同一性(參見例如Altschul，et al.，J.Mol.Biol.215403-410；Henikoff et al.，Proc.Natl.AcadSci.USA 8910915；Karin et al.，Proc.Natl Acad.Sci USA 905873；以及Higgins et al.，Gene 73237-244)。通過國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)，可以公開獲得用于進行BLAST分析的軟件。如本文中所使用，術(shù)語“核酸序列同一性百分比(％)”、“核苷酸同一性百分比(％)”、“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“序列同一性百分比(％)”是指候選序列中與被比序列中的核酸、核苷酸或氨基酸殘基相同的核酸、核苷酸或氨基酸殘基的百分比。多核苷酸或多肽具有與另一個序列某一百分比(例如，80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性是指，當被比對時，在比較這兩個序列中該百分比的堿基或氨基酸殘基是相同的。使用本領(lǐng)域已知的任何合適的軟件程序，例如那些在Current Protocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.(eds)1987，附錄30，7.7.18部分)中描述的軟件程序，可以確定該比對和同源性或同一性百分比。優(yōu)選的程序包括GCC Pileup程序、FASTA(Pearson et al.(1988)Proc.Natl，Acad.Sci USA852444-2448)以及BLAST(BLAST Manual，Altschul et al.，Natl.Cent.Biotechnol.Inf.，Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，MD，and Altschul et al.，(1997)NAR253389-3402)。另一個優(yōu)選的比對程序是ALIGH Plus(Scientific and EducationalSoftware，PA)，優(yōu)選使用默認參數(shù)。發(fā)現(xiàn)有用的另一個序列軟件程序是在SequenceSoftware Package Version 6.0(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)中可得到的TFASTA數(shù)據(jù)搜索程序。如本文總所使用，“對應(yīng)于”，是指在第一蛋白質(zhì)或肽中所列出的位置上的殘基，或者與第二蛋白質(zhì)或肽中所列出的殘基等價的殘基。等價的列出殘基可以通過使用上述的同源性程度程序比對候選序列而被確定?！拜d體”是指多核苷酸序列，其被設(shè)計以將核酸引入到一個或多個細胞類型中。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、序列盒及其類似載體。如本文中所使用，術(shù)語“表達載體”是指在細胞中可以被復(fù)制并且可以攜帶新基因或DNA片段到細胞中的任何核酸。因此該術(shù)語是指被設(shè)計用于在不同宿主細胞間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建物。表達載體是指能夠在外來細胞中整合和表達異源DNA片段的載體。因此，本文中所使用的“表達載體”是指DNA構(gòu)建物，其含有可操作地連接到適合的調(diào)控序列的DNA序列，所述調(diào)控序列能夠影響該DNA在合適的宿主中的表達。這樣的調(diào)控序列可以包括影響轉(zhuǎn)錄的啟動子、用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄的可選的操縱子序列、編碼mRNA上的合適的核糖體結(jié)合位點的序列、增強子以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止和翻譯終止的序列。如本文中所使用，術(shù)語“質(zhì)?！笔侵副挥米骺寺≥d體的環(huán)狀雙鏈(ds)DNA構(gòu)建物，并且其在許多細菌和一些真核生物中形成染色體外自我復(fù)制的遺傳元件。在一些實施方案中，質(zhì)粒被整合進宿主細胞的基因組中?！皢幼印笔钦{(diào)節(jié)序列，其參與結(jié)合RNA聚合酶以起始基因的轉(zhuǎn)錄。啟動子可以是誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子。用于本發(fā)明的優(yōu)選啟動子是里氏木霉(Trichoderma reesei)cbhl，其是誘導(dǎo)型啟動子。“處于轉(zhuǎn)錄調(diào)控下”是本領(lǐng)域中被充分理解的術(shù)語，其是指多核苷酸序列——通常是DNA序列的轉(zhuǎn)錄，取決于其被可操作地連接到有助于轉(zhuǎn)錄起始或促進轉(zhuǎn)錄的元件。“處于翻譯調(diào)控下”是本領(lǐng)域中本充分理解的術(shù)語，其是指發(fā)生在mRNA形成之后的調(diào)節(jié)過程。術(shù)語“衍生”包括術(shù)語“起源于”、“獲自”、“可獲自”以及“分離自”。術(shù)語“可操作地連接”是指并列關(guān)系，其中多種元件被排列，使得它們功能性相關(guān)。例如，如果啟動子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，該啟動子被可操作地連接到該序列。術(shù)語“選擇性標記”是指能夠在宿主中表達的基因，其使得可以方便選擇那些含被導(dǎo)入的核酸或載體的宿主。選擇性標記的例子包括但不限于抗微生物劑(例如潮霉素、博來霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細胞代謝優(yōu)勢例如營養(yǎng)優(yōu)勢的基因。如本文中所使用，術(shù)語“回收”、“分離”和“純化”是指核酸或氨基酸(或其它成分)從與其天然結(jié)合的至少一種組分上被除去。如本文中所使用，術(shù)語“宿主菌株”或“宿主細胞”是指含編碼本發(fā)明的α-淀粉酶的DNA的表達載體或DNA構(gòu)建物的合適的宿主。如本文中所使用，關(guān)于細胞所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)基因的”是指細胞含有非天然(例如異源的)核酸序列，所述核酸序列整合進所述細胞的基因組或作為可以被維持多代的附加體質(zhì)粒。如本文中所述，術(shù)語“熱穩(wěn)定的”淀粉酶是指在相同的熱條件下與前體淀粉酶相比具有更大量的酶活性的淀粉酶。例如，在給定的溫度下，通常是在測量活性的操作溫度下，熱穩(wěn)定的淀粉酶具有比前體酶增加的變體酶活性水平。術(shù)語“接觸”是指放置各個酶使之足夠接近于各個底物，從而使得酶可以將底物轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認識到，酶和各個底物的混合溶液可以實現(xiàn)接觸。關(guān)于多核苷酸或蛋白質(zhì)的術(shù)語“異源的”，是指多核苷酸或蛋白質(zhì)在宿主細胞中不是天然發(fā)生的。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)。該術(shù)語意欲包括由天然發(fā)生的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質(zhì)。關(guān)于多核苷酸或蛋白質(zhì)的術(shù)語“內(nèi)源的”，是指在宿主細胞中天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質(zhì)。如本文中所使用，“黏度降低”淀粉酶是指當達到膠凝化溫度時，例如將漿體溫度升高到60℃至90℃，使?jié){體黏度最小化的淀粉酶。例如，黏度降低淀粉酶將漿體黏度保持在特定值以下，例如低于190.0Ncm、低于200.0Ncm、低于220Ncm?！癗cm”單元是指使用粘度計時作為扭矩測量的流體黏度的量度。如本文中所使用，術(shù)語淀粉酶活性是指淀粉水解的速率，如碘染色能力的降低速率所反映的，其由分光光度法測定。細菌α-淀粉酶活性的一個單位是在特定條件下每分鐘水解10mg淀粉所需要的酶量。例如，0.14kg/MT干VAA。如本文中所使用，術(shù)語“平均DE級數(shù)(average DE progression)”是指經(jīng)過給定的時間段后所產(chǎn)生的DE的量。如本文中所使用，術(shù)語“DE”或“葡萄糖當量”是測量總還原糖濃度的行業(yè)標準，計算為基于干重的D-葡萄糖。未水解的顆粒淀粉的DE幾乎為零，而D-葡萄糖的DE為100。確定漿體或溶液的DE的示例性方法被描述在Schroorl方法(費林滴定法)中(參見實施例3a)。如本文中所使用，術(shù)語“平均DE級數(shù)”是指DE的變化，其作為二次液化的時間的函數(shù)。DE與液化的分鐘數(shù)的斜率是達到某DE水平的速度的量度。如本文中所使用，術(shù)語“液化(liquefaction)”或“液化(liquefy)”意思是淀粉被轉(zhuǎn)化成較短的鏈和較低黏度的糊精的過程。通常地，該過程包括淀粉的膠凝化和同時加入α-淀粉酶或隨后加入α-淀粉酶。如本文所使用，術(shù)語“初步液化”是指當漿體的溫度被升高到其膠凝化溫度或膠凝化溫度附近時的液化步驟。升高該溫度之后，漿體通過熱交換器或噴嘴被送至200-300_例如華氏220-235度。應(yīng)用熱交換或噴氣溫度之后，在此溫度下保持該漿體3-10分鐘的時間。保持該漿體在200-300_的這個步驟是初步液化。如本文所使用，術(shù)語“二次液化”是指當漿體被允許冷卻到環(huán)境溫度時在初次液化(加熱到200-300_)之后的液化步驟。該冷卻步驟可以是30分鐘到180分鐘(3小時)，例如90分鐘到120分鐘(2小時)。如本文所使用，術(shù)語“二次液化的分鐘數(shù)”是指從二次液化開始后經(jīng)過的時間，DE被測量的時間。
實施方案合適的淀粉酶來源[84]前體α-淀粉酶由能夠產(chǎn)生α-淀粉酶的任何來源產(chǎn)生。合適的α-淀粉酶來源是原核生物或真核生物，包括真菌、細菌、植物或動物。優(yōu)選地，前體α-淀粉酶來自于芽孢桿菌屬；更優(yōu)選地，來自地衣芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌；更優(yōu)選地，前體α-淀粉酶來自于嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)或嗜熱脂肪泥土芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)(SEQID NO3)。編碼前體α-淀粉酶的氨基酸序列的前體DNA序列的修飾可以通過本文所述的方法進行，并且包括在普遍所有的美國專利4,760,025和5,185,258中，其被引入于此作為參考。在另一個實施方案中，與圖3中的成熟嗜熱脂肪泥土芽孢桿菌等價的前體α-淀粉酶，具有與SEQ ID NO.3至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列同一性百分比。在另一個實施方案中，前體α-淀粉酶具有與圖3中的成熟嗜熱脂肪芽孢桿菌的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)相同的氨基酸序列。在另一個實施方案中，前體α-淀粉酶包括進一步包含至少4個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，所述4個連續(xù)氨基酸與SEQ ID NO.10相同，SEQ ID NO.10對應(yīng)于SEQ ID NO 3的氨基酸269-272的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述4個連續(xù)氨基酸包括序列DINK，例如Asp269(D269)、Iso270(I270)、Asn271(N271)和Lys272(K272)。在另一個實施方案中，前體淀粉酶包括進一步包含至少4個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，所述4個連續(xù)氨基酸與SEQ ID NO.11相同，SEQ ID NO.11對應(yīng)于SEQID NO.3的氨基酸178和181-183的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述4個連續(xù)氨基酸包括序列FIGK，例如Phe178(F178)-Iso181(I181)-Gly182(G182)-Lys183(K183)。在另一個實施方案中，前體淀粉酶包括進一步包含至少4個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，所述4個連續(xù)氨基酸與SEQ ID NO.12相同，SEQ ID NO.12對應(yīng)于SEQID NO.3的氨基酸301-304的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述4個連續(xù)氨基酸包括序列Gly301(G301)-ala302(A302)-phe303(F303)-asp304(D304)。在另一個實施方案中，前體淀粉酶包括進一步包含至少5個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，所述5個連續(xù)氨基酸與SEQ ID NO.13相同，SEQ ID NO.13對應(yīng)于SEQID NO.3的氨基酸412-416的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述5個連續(xù)氨基酸包括氨基酸序列EGGTE，例如glu412(E412)-Gly413(G413)-Gly414(G414)-Thr415(T415)-glu416(E416)。在另一個實施方案中，前體淀粉酶包括進一步包含至少4個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，所述4個連續(xù)氨基酸與SEQ ID NO.14相同，SEQ ID NO.14對應(yīng)于SEQID NO.3的氨基酸489-492的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述4個連續(xù)氨基酸包括序列ARPI，例如Ala489(″A489″)-arg490(″R490″)-pro491(″P491″)-iso492(″I492″)。在另一個實施方案中，前體淀粉酶包括進一步包含至少4個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，所述4個連續(xù)氨基酸與SEQ ID NO.15相同，SEQ ID NO.15包括SEQID NO.3的氨基酸498-501。在一個實施方案中，所述4個連續(xù)氨基酸包括序列TGEF，例如Thr498(T498)-Gly499(G499)-Glu500(E500)-phe501(F501)。在另一個實施方案中，前體淀粉酶包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包含至少一個、至少兩個、至少3個、至少4個和至少5個與相應(yīng)的氨基酸序列(a)FIGK、(b)GAFD、(c)EGGTE、(d)ARPI、(e)TGEF和(f)DINK相同的序列。目前為止在幾乎所有被測序的內(nèi)切淀粉酶之間都發(fā)現(xiàn)同源性，范圍從植物、哺乳動物到細菌(Nakajima et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，Vol.23，pp.355-360(1986)；Rogers，Biochem.Biophvs.Res.Commun.，Vol.128，pp.470-476(1985)；Janecek，Eur.J.Biochem.，Vol.224，pp.519-524(1994))。如圖5所示，在一些芽孢桿菌淀粉酶中存在四個特別高同源性的區(qū)域。序列比對也已經(jīng)被用于對芽孢桿菌內(nèi)切淀粉酶之間的關(guān)系進行作圖(Feng et al.，J.Molec.Evol.，Vol.35，pp.351-360(1987))。嗜熱脂肪芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌之間的相對序列同源性是大約66％，地衣芽孢桿菌和淀粉液化芽孢桿菌之間的相對序列同源性是大約81％，如由Holmet al.，Protein Engineering，Vol.3，No.3，pp.181-191(1990)所確定。盡管序列同源性是重要的，通常認為在比較淀粉酶或其它酶時結(jié)構(gòu)同源性也是重要的。例如，在真菌淀粉酶和細菌淀粉酶之間的結(jié)構(gòu)同源性已經(jīng)被揭示，并且因此真菌淀粉酶被包括在本發(fā)明之內(nèi)。為建立一級結(jié)構(gòu)的同源性，前體α-淀粉酶的氨基酸序列被直接相比于嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶一級序列，并且尤其相比于已知對于所有序列已知的α-淀粉酶都不變的一組殘基(例如參見圖3)。通過已報道的淀粉酶的晶體結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu)分析來確定等價的殘基也是可能的，所述已報道的淀粉酶有豬胰腺α-淀粉酶(Buisson et al.，EMBO Journal，Vol.6，pp.3909-3916(1987)；Qian et al.，Biochemistry，Vol.33，pp.6284-6294(1994)；Larson et al.，J.MoI.Biol.，Vol.235，pp.1560-1584(1994))、來自米曲酶的Taka-淀粉酶A(Matsuura et al.，J.Biochem.(Tokyo)，Vol.95，pp.697-702(1984))以及來自黑曲酶的酸性α-淀粉酶(Boel et al..Biochemistry，Vol.29，pp.6244-6249(1990))，其中前兩種結(jié)構(gòu)是相似的，并且所述已報道的淀粉酶有大麥α-淀粉酶(Vallee et al.，J.MoI.Biol.，Vol.236，pp.368-371(1994)；Kadziola，J.MoI.Biol.，Vol.239，pp.104-121(1994))。已經(jīng)公布了一些與α-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)有關(guān)的初步研究，即，(Suzuki et al.，J.Biochem.，Vol.108，pp.379-381(1990)；Lee et al.，Arch.Biochem.Biophys.Vol.291，pp.255-257(1991)；Chang et al.，J.Mol.Biol.，Vol.229，pp.235-238(1993)；Mizuno et al.，J.MoI. Biol.，Vol.234，pp.1282-1283(1993))，并且已經(jīng)公布了嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶晶體的至少一種結(jié)構(gòu)(Machius et al.，J.MoI.Biol.Vol.246，pp.545-549(1995))。然而，一些研究人員已經(jīng)預(yù)測了葡聚糖酶之間(MacGregor et al.，Biochem.J.，Vol.259，pp.145-152(1989))以及α-淀粉酶和其它淀粉代謝酶內(nèi)(Jaspersen，J.Prot.Chem.Vol.12，pp.791-805(1993)；MacGregor，Starke，Vol.45，pp.232-237(1993))的共同的超二級結(jié)構(gòu)，并且預(yù)測了與α-淀粉酶具有相似的超二級結(jié)構(gòu)的酶之間的序列相似性(Janecek，F(xiàn)EBS Letters，Vol.316，pp.23-26(1993)；Janecek et al.，J.Prot.Chem.，Vol.12，pp.509-514(1993))。嗜熱脂肪芽孢桿菌酶的結(jié)構(gòu)已經(jīng)基于Teka-淀粉酶A的結(jié)構(gòu)被建模(Holm et al.，ProteinEngineering，Vol.3，pp.181-191(1990))。圖3所示的四個高度保守區(qū)包含許多被認為是活性位點的一部分的殘基(Matsuura et al.，J.Biochem.(Tokyo)，Vol.95，pp.697-702(1984)；Buisson et al.，EMBO Journal.Vol.6，pp.3909-3916(1987)；Vihinenet al.，J.Biochem.，Vol.107，pp.267-272(1990))，包括在地衣芽孢桿菌的編號體系下的His+105、Arg+229、Asp+231、His+235、Glu+261以及Asp+328。序列間的同源性程度可以通過使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法確定(參見例如Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.，2482；Needleman and Wunsch，J.MoI.Biol.，48443；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444；程序例如Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group，Madison，Wl)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux et al.，Nucl.Acid Res.，12387-395)。例如，PILEUP是確定序列同源性水平的一個有用的程序。使用漸進的兩兩比對，PILEUP從一組相關(guān)序列建立了多序列比對。它也可以繪制顯示用于建立比對的群集關(guān)系的樹。PILEUP使用了Feng和Doolittle的漸進比對方法(Feng andDoolittle，J.MoI.Evol.，35351-360)的簡化形式。該方法類似于Higgins和Sharp描述的方法(Higgins and Sharp，CABIOS 5151-153)。有用的PILEUP參數(shù)包括默認空位權(quán)重(default gap weight)為3.00、默認空位長度權(quán)重(default gaplength weight)為0.10和加權(quán)末端空位(weighted end gaps)。另一個有用算法的例子是Altschul等人描述的BLAST算法(Altschul et al.，J.MoI.Biol.，215403-410，；和Karlin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787)。一個特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(參見Altschul et al.，Meth.Enzymol.，266460-480)。參數(shù)“W”、“T”和“X”決定比對的速度和靈敏度。BLAST程序默認使用字長(w)為11、BLOSUM62記分矩陣(參見Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)比對(B)為50、期望值(E)為10、M′5、N′-4以及兩條鏈的比較。除了本文中所提供的殘基缺失，本發(fā)明的實施方案進一步包括本領(lǐng)域已知的賦予穩(wěn)定性或提高的活性的任何一個或多個取代。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的α-淀粉酶可以進一步包括在與地衣芽孢桿菌(SEQ ID NO5)中的M15、A33、A52、S85、N96、V129、H133、S148、S187、N188、A209、A269和/或A379相應(yīng)的一個或多個殘基處的缺失或取代。
變體α-淀粉酶[98]根據(jù)本發(fā)明，提供了變體α-淀粉酶，其已導(dǎo)入了缺失，該缺失是對應(yīng)于前體芽孢桿菌(Bacillus)或泥土芽孢桿菌(Geobacillus)α淀粉酶例如具有氨基酸序列SEQID NO4的淀粉酶上的位置R179*和/或G180*的缺失。本文鑒定了對應(yīng)于嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶中的R179和/或G180的殘基的缺失，以及其它的缺失。因此，特定殘基例如R179是指氨基酸位置編號(即+179)，其參考圖3所描述的前體嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶序列(SEQ ID NO3)上分配的編號。然而，在另一個實施方案中，本發(fā)明不限于嗜熱脂肪芽孢桿菌的特定前體α-淀粉酶的突變，而是延及含有在嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶中的特定的鑒定殘基對應(yīng)的位置上的氨基酸殘基的前體α-淀粉酶。因此，在一個實施方案中，圖5(SEQ ID NO7)的嗜熱脂肪芽孢桿菌(Am-ster)的R179延及與嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的R179聯(lián)配的前體α-淀粉酶殘基。圖5顯示了示例性聯(lián)配(alignment)。在一個實施方案中，提供了具有圖14所示的氨基酸序列的截短型嗜熱芽孢桿菌α淀粉酶。在一個方面，該α淀粉酶具有氨基酸序列SEQ ID NO16。在另一個方面，α淀粉酶具有與氨基酸序列SEQ ID NO16至少97％的同一性。
編碼DNA[101]還提供了編碼氨基酸序列的核酸分子(DNA)，所述氨基酸序列包括本發(fā)明的變體α-淀粉酶。本發(fā)明另外的實施方案包括編碼根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶的DNA以及含有這類DNA的表達載體。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化DNA包括引入的序列。末端可以是閉合的，使得轉(zhuǎn)化DNA形成封閉的環(huán)，例如插入載體中。在一個實施方案中，DNA序列與核酸序列SEQ ID NO1(圖1)具有一定百分比的核酸同一性。在其它實施方案中，DNA序列與核酸序列SEQ ID NO1(圖1)具有至少75％、80％、85％、88％、90％、92％、95％、98％的核酸同一性。DNA構(gòu)建物可以包括DNA序列，其可操作性連接到能夠在合適的宿主中實現(xiàn)所述DNA的表達的合適的調(diào)控序列。核酸序列可以重組產(chǎn)生或合成產(chǎn)生，例如，通過PCR體外產(chǎn)生。這類調(diào)控序列可以包括影響轉(zhuǎn)錄的啟動子、調(diào)控此類轉(zhuǎn)錄的任選的操縱子序列、編碼合適mRNA核糖體結(jié)合位點的序列以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止和翻譯終止的序列。通過將DNA序列可操作性連接到適宜的表達載體中的表達調(diào)控序列以及根據(jù)熟知技術(shù)使用該表達載體轉(zhuǎn)化適宜的宿主，所述DNA序列可以被表達。例如，申請人已發(fā)現(xiàn)當宿主細胞是枯草芽孢桿菌時，芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子的優(yōu)選的表達控制序列是衍生自枯草芽孢桿菌的aprE信號肽。申請人還發(fā)現(xiàn)當宿主細胞是地衣芽孢桿菌時，地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子的優(yōu)選的表達控制序列是衍生自地衣芽孢桿菌的LAT信號肽。
表達載體/宿主細胞[102]類似地，本發(fā)明包括通過表達整合到已轉(zhuǎn)化入宿主細胞的表達體系的DNA而產(chǎn)生突變α-淀粉酶的方法。多種宿主/表達載體組合可以被用于表達本發(fā)明的DNA序列。許多原核表達載體和真核表達載體是商業(yè)上可獲得的。合適的表達載體的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆?；騼H僅是潛在的基因組插入物。一旦被轉(zhuǎn)化入合適的宿主，載體可以復(fù)制并獨立于宿主基因組起作用，或者在一些情況下可以整合到基因組本身中。由于目前質(zhì)粒是最廣泛使用的載體形式，在本說明書中質(zhì)粒和載體有時候可互相交換使用。然而，本發(fā)明意欲包括其它形式的表達載體，其具有等同的功能并且在本領(lǐng)域中已知或正在成為已知。有用的表達載體，例如包括染色體片段、非染色體DNA序列和合成DNA序列，例如對于該目的有用的多種已知質(zhì)粒和噬菌體。此外，在這些載體中，通常使用多種表達控制序列的任何序列。本發(fā)明中有用的宿主細胞通常是原核宿主或真核宿主，包括任何可轉(zhuǎn)化的微生物，其中可以實現(xiàn)本發(fā)明的α-淀粉酶的表達。使用通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞。這些轉(zhuǎn)化的宿主細胞能夠復(fù)制編碼α-淀粉酶和其變體(突變體)的載體或表達期望的α-淀粉酶。這些宿主可以包括熟知的原核和真核宿主，例如大腸桿菌、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬的菌株、多種真菌、酵母以及動物細胞。優(yōu)選地，宿主胞外表達本發(fā)明的α-淀粉酶，以便于純化和下游處理。在一些優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是芽孢桿菌屬的成員，而在一些實施方案中，宿主細胞是工業(yè)芽孢桿菌菌株中感興趣的芽孢桿菌菌株。工業(yè)芽孢桿菌菌株的例子包括，但不限于地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(Blentus)、淀粉液化芽孢桿菌。在另外的實施方案中，芽孢桿菌宿主菌株選自遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.cirulans)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)和巨大芽孢桿菌(B.megeterium)以及如上討論的屬于芽孢桿菌屬的其它有機體。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用枯草芽孢桿菌。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，使用地衣芽孢桿菌。例如，美國專利5,264,366和4,760,025(RE34,606)和US2002/0182734(國際公布號第WO 02/14490)描述了在本發(fā)明中有用的多種芽孢桿菌宿主菌株，盡管其它合適的菌株被考慮用于本發(fā)明。優(yōu)選地，使用α-淀粉酶陰性的芽孢桿菌菌株(基因被缺失)和/或α-淀粉酶和蛋白酶缺失的芽孢桿菌菌株(ΔamyE，Δapr，Δnpr)。
轉(zhuǎn)化[105]已知多種方法用于芽孢桿菌屬種的轉(zhuǎn)化。實際上，涉及質(zhì)粒構(gòu)建物和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的改變芽孢桿菌染色體的方法是熟知的。在大多數(shù)方法中，質(zhì)粒隨后從大腸桿菌分離出并被轉(zhuǎn)入芽孢桿菌。然而，使用此類中間微生物如大腸桿菌并非是必須的，在一些優(yōu)選的實施方案中，通過原生質(zhì)體或感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，DNA構(gòu)建物被直接轉(zhuǎn)化入感受態(tài)芽孢桿菌。本發(fā)明的突變體α-淀粉酶的表達和純化可以通過本領(lǐng)域公認的用于實施這些過程的方式來實現(xiàn)。在本發(fā)明的一個實施方案中，變體α-淀粉酶(VAA)是嗜熱脂肪泥土芽孢桿菌α-淀粉酶的變體。在該實施方案中，該α-淀粉酶在地衣芽孢桿菌中作為帶有地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(LAT)的信號肽的融合蛋白而被表達(見圖6a和6b)。通過來自質(zhì)粒pCPCori(從Enzyme BioSystems，Beloit，Wisconsin，USA獲得)的編碼變體α-淀粉酶的序列的PCR擴增以及克隆入載體pHPLT，可以構(gòu)建基因融合。PCR反應(yīng)可以使用Taq聚合酶在熱循環(huán)儀上按30個循環(huán)進行。pHPLT包含LAT啟動子(PLAT)、編碼LAT信號肽(preLAT)的序列，其后是用于克隆的PstI和HpaI限制性酶切位點。通過融合PCR(必須的，以在變體α-淀粉酶基因中刪除內(nèi)部PstI位點)，變體α-淀粉酶被構(gòu)建成PstI-HpaI片段，其中使用Taq聚合酶和下列引物VAA(PstI)_FWgaatgtctgcagcttcagcagccgcaccgtttaacggcaccatg(SEQ ID NO_)VAA(HpaI)_RV cccggggttaactcaaggccatgccaccaaccgtgg(SEQ ID NO_)VAAdelPstI_fw cccggccaagcgcttcagtcatgggtcgac(SEQ ID NO_)VAAdelPstI_rv gtcgacccatgactgaagcgcttggccggg(SEQ ID NO_)[107]然后，使用T4 DNA連接酶，將編碼成熟α-淀粉酶的PstI-HpaI片段連接到經(jīng)PstI和HpaI消化的pHPLT(圖7)并且將其轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌菌株OS14。LAT-VAA基因融合物的序列可以通過DNA測序被確認。正確的質(zhì)?？寺≈槐幻麨閜HPLT-VAAc1(圖8)。該質(zhì)粒通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Pragai et al.，Microbiology(1994)140305-310)被引入淀粉酶陰性地衣芽孢桿菌宿主(BML612)。新霉素抗性轉(zhuǎn)化子分泌變體α-淀粉酶，這通過碘染色后在淀粉板上的暈圈形成來判斷(圖9)。通過將來自pHPLT-VAAc1的LAT-VAA基因構(gòu)建物插入到載體pICatH中，構(gòu)建下一個質(zhì)粒pICatH-VAAc1(ori2)(圖10)。pICatH包含下列特征復(fù)制起點(oripE194，用于在芽孢桿菌中的復(fù)制)、ori pBR322(用于在大腸桿菌中的擴增)、用于選擇的新霉素抗性基因，以及用于選擇、染色體整合和序列盒擴增的天然地衣芽孢桿菌氯霉素抗性基因(cat)。preLAT-前體α-淀粉酶基因融合物(包括LAT啟動子和LAT轉(zhuǎn)錄終止子)是從pHPLT-VAAc1用下列引物擴增的VAAXhol_FW atcctactcgaggcttttcttttggaagaaaatataggg(SEQ ID NO_)VAAXhol_RV tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc(SEQ ID NO_)[109]如美國專利申請US2002/0182734(國際公布號WO 02/14490)所述，所得到的PCR片段用XhoI消化、被連接到經(jīng)XhoI消化的pICatH并且被轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌菌株OS14中。質(zhì)粒DNA從淀粉酶陽性轉(zhuǎn)化子中分離出來，并且變體α-淀粉酶基因構(gòu)建物的序列通過DNA測序被確認。一個正確克隆的質(zhì)粒被命名為pICatH-VAAc1(ori2)，然后在許可溫度(37℃)被轉(zhuǎn)化入地衣芽孢桿菌菌株BML612(BRA7衍生物，cat-、amyL-、spo-)。一種淀粉酶陽性、新霉素抗性(neoR)以及氯霉素抗性(CmR)的轉(zhuǎn)化子被選擇，被命名為BML612(pICatH-VAAc1)。通過使菌株在非許可溫度(50℃)在含5μg/ml氯霉素的培養(yǎng)基中生長，BML612(pICatH-VAAc1)中的質(zhì)粒被整合到地衣芽孢桿菌基因組的cat區(qū)域。一個CmR抗性克隆被選擇，被命名為BML612-pICatH-VAAc1。BML612-pICatH-VAAc1再次在許可溫度下在無抗生素的條件下生長多代，以環(huán)出載體序列，然后一個新霉素敏感(neoS)的CmR克隆被選擇。在該克隆中，染色體上的pICatH的載體序列被切除(包括新霉素抗性基因)，只有變體α-淀粉酶-cat序列盒被留下。接下來，通過使菌株在含增加濃度的氯霉素的培養(yǎng)基中/上生長，染色體上的變體α-淀粉酶-cat序列盒被擴增。在多輪擴增后，選擇一個克隆(耐受75μg/ml的氯霉素)并命名為BML612-VAAc1。
應(yīng)用[110]本發(fā)明的變體α-淀粉酶可以被用于淀粉的液化、作為洗衣去污劑的成分、自動洗碗去污劑、硬表面清洗產(chǎn)品、用于食物加工包括焙烤應(yīng)用、用于紡織品加工包括作為脫漿劑或用于α-淀粉酶活性有用的任何其它應(yīng)用中。根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶在α-淀粉酶通常被使用的多種應(yīng)用中是有用的，其表現(xiàn)出改變的性能特征，所述特征提供了期望且意想不到的結(jié)果。例如，根據(jù)本發(fā)明表現(xiàn)出改變的性能特征例如改善的黏度降低和改善的熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶在淀粉液化所使用的操作溫度下是有用的。增強的熱穩(wěn)定性在延長包含它們的產(chǎn)品的貨架期中也是有用的。相反地，降低的熱穩(wěn)定性在要求迅速有效地淬滅淀粉水解活性的工業(yè)過程中可以是有用的。表現(xiàn)出改善的熱穩(wěn)定性的本發(fā)明α-淀粉酶在淀粉加工特別是在淀粉液化中尤其有用。在工業(yè)上期望的液化過程中存在的條件特征性地包括高溫，其要求α-淀粉酶表現(xiàn)出改善的熱穩(wěn)定性。因此，在液化中特別有用的本發(fā)明α-淀粉酶在大約80-120℃之間的溫度表現(xiàn)出提高的熱穩(wěn)定性，優(yōu)選在大約100-110℃之間。表現(xiàn)出改善的黏度降低的本發(fā)明α-淀粉酶在淀粉加工特別是在淀粉液化中也是有用的。在工業(yè)上期望的液化過程中存在的條件特征性地包括在膠凝化過程中提高的黏度，這要求增加量的α-淀粉酶以降低漿體黏度。因此，在液化中特別有用的本發(fā)明α-淀粉酶表現(xiàn)出增強的降低黏度的能力，保持漿體黏度在期望水平以下。在液化過程中，根據(jù)已知的液化技術(shù)，用本發(fā)明的α-淀粉酶處理淀粉，尤其是來自濕磨或干磨過程的顆粒淀粉漿體。一旦漿體被制備，在淀粉降解過程的第一步中，對漿體施用熱，以使之膠凝化。通常地，通過在相對高的溫度(大約80℃和大約110℃之間)加熱，淀粉漿體被膠凝化。當熱度上升時，漿體膠凝化，漿體黏度增加。當黏度增加，漿體流動的能力下降。在淀粉漿體被膠凝化之后，使用α-淀粉酶使其液化。然而，在淀粉液化過程中，即當漿體溫度升高到60-110℃、60-90℃、60-85℃時，漿體黏度升高，時常到180Ncm水平或更高Ncm、190或更高Ncm、200或更高Ncm、220Ncm水平或更高Ncm、240或更高Ncm、260或更高Ncm、280或更高Ncm。將α-淀粉酶與黏性增加的淀粉漿體接觸可以降低黏度——期望的益處。通過確定漿體黏度進展，人們可以測量特定酶降低漿體黏度的能力。黏度可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法測量。在一個優(yōu)選的方法中，黏度用黏度計測量，所述黏度計包括帶水夾套的樣品容器和轉(zhuǎn)動部件，所述轉(zhuǎn)動部件用于插入到樣品容器中(Viscoklick.IKA Eurostar Labortechnik powercontrol-visc p7，帶有Viscokliick VK1控制器(Werke GMBH & Co，Germany)，在個人電腦上用Labworldsoft版本2.6(Fisher Scientific，GmbH，Germany)分析。一升漿體樣品被放入樣品容器中。所述部件的轉(zhuǎn)動被設(shè)定為任何速度，只要相同的速度被用來校準在對照樣品中測量的扭矩。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)動被設(shè)定為100rpm。當與對照樣品比較時，所述部件在漿體樣品中的轉(zhuǎn)動通過程序(Labworldsoftversion 2.6)被計算。將被測試的樣品的溫度從60-110℃、60到90℃、60-85℃逐步增加。然后，將扭矩的值與對照關(guān)聯(lián)，提供測量值(Ncm單位)，然后，在選擇的時間間隔記錄測量值。采集這些數(shù)字然后以適宜的時間間隔作圖。此外，在較高百分比干固體的體系中提供快速降黏的α-淀粉酶是特別有用的。此外，α-淀粉酶在pH5.5-5.8和/或5.0到6.5是有用的。因此，本發(fā)明的另一方面提供了液化淀粉的方法，其包括步驟將淀粉漿體與含有上述缺失的變體α-淀粉酶接觸，將所述漿體的溫度升高到85-100℃、92-97℃和/或大約95℃；以及在二次液化開始的60分鐘內(nèi)提供至少最小水平的平均DE級數(shù)。表現(xiàn)出改善的平均DE級數(shù)的本發(fā)明α-淀粉酶在淀粉加工中特別是淀粉液化中也是有用的。因此，本發(fā)明的另一方面提供了液化淀粉的方法，其包括步驟將淀粉漿體與含有上述缺失的變體α-淀粉酶接觸，將所述漿體的溫度升高到上述的水平；以及在二次液化開始的特定時間內(nèi)提供增加的DE級數(shù)。表現(xiàn)出改善的DE級數(shù)的本發(fā)明α-淀粉酶在淀粉加工中特別是淀粉液化中也是有用的。增加的DE水平或更迅速獲得提高的DE水平可以導(dǎo)致更好的底物水解。在一個實施方案中，DE水平可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法確定，例如，分光光度測定法、氣相色譜法。一個示例性方法是Schrool方法(見實施例3a)，其中DE在特定的預(yù)定時間周期被測定。在一個實施方案中，DE以30分鐘的間隔被測定。在一個實施方案中，預(yù)定的取樣時間從二次液化開始后30分鐘開始。因此，在液化中特別有用的本發(fā)明α-淀粉酶表現(xiàn)出增加的平均DE級數(shù)。在各個實施方案中，在二次液化開始后的60分鐘內(nèi)，本發(fā)明的α-淀粉酶實現(xiàn)至少7.00、至少8.00、至少8.50、至少9.00的DE。根據(jù)預(yù)定的反應(yīng)條件，可以加入本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的對液化有用的額外組分，所述組分包括，例如抗氧化劑、鈣、離子、鹽或其它酶如內(nèi)切糖苷酶、纖維素酶、蛋白酶、脂酶或其它淀粉酶。例如，根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶和其它來源的α-淀粉酶的組合可以提供獨特的作用特性，其在特定的液化條件下被發(fā)現(xiàn)具有特別的用途。具體地，預(yù)期的是，由于互補的作用方式，根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶和衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶的組合將在低于5.5的pH值提供增強的液化。在本發(fā)明的另一方面，含有本發(fā)明的變體α-淀粉酶的液體形式、凝膠形式或粒狀形式的去污劑組合物可以是有用的。這類去污劑組合物將從加入本發(fā)明的具有提高的熱穩(wěn)定性的變體α-淀粉酶中特別受益，以提高貨架期。因此，根據(jù)本發(fā)明的變體α-淀粉酶可以有利地配制到已知的粉末狀、液體或凝膠去污劑中，用于具有約80℃和約100℃之間的溫度的應(yīng)用中。包括根據(jù)本發(fā)明的變體α-淀粉酶的去污劑組合物可以進一步包括其它酶例如內(nèi)切糖苷酶、纖維素酶、蛋白酶、脂酶或其它淀粉酶，特別是衍生自地衣芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌的α-淀粉酶，以及本領(lǐng)域中通常已知的額外成分。包含根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶和蛋白酶的組合的本發(fā)明實施方案，優(yōu)選地包括氧化穩(wěn)定的蛋白酶，例如那些在U.S.Re.34,606中描述的蛋白酶——引入于此作為參考，以及商業(yè)上可獲得的酶例如DURAZYM(Novo Nordisk)和PURAFECT_ OxP(Genencor International，Inc.)。制備這類蛋白酶突變體(氧化穩(wěn)定的蛋白酶)的方法，尤其是制備在與淀粉液化芽孢桿菌中的M222等價的位置處具有甲硫氨酸的取代的這類突變體的方法被描述在U.S.Re.34,606中。與野生型芽孢桿菌α-淀粉酶相比，根據(jù)本發(fā)明的變體α-淀粉酶被預(yù)期提供重要的優(yōu)勢。例如，在通常的淀粉液化方法的典型的低pH和高溫下，被發(fā)現(xiàn)具有提高的活性是一個優(yōu)勢。其它的優(yōu)勢可以包括增加的高pH和氧化穩(wěn)定性，其有利于它們在去污劑中的使用；實現(xiàn)淀粉分子更完全的水解，其減少在加工流中殘留的淀粉；在缺少鈣離子的情況下改善的穩(wěn)定性；以及與野生型嗜熱脂肪泥土芽孢桿菌α-淀粉酶相比，由于在應(yīng)力條件(stressed conditions)下在比活性和穩(wěn)定性方面的改善，加入相等的蛋白劑量的本發(fā)明α-淀粉酶可以提供優(yōu)良的性能。下面提供了實施例，但不被解釋為對權(quán)利要求范圍的限制。此處使用的縮寫，尤其是氨基酸的三字碼或單字碼被描述在Dale，J.W.，Molecular Genetics ofBacteria.John Wiley & Sons，(1989)Appendix B。
實施例實施例1變體α-淀粉酶在地衣芽孢桿菌中的表達[124]變體α-淀粉酶——嗜熱脂肪泥土芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，在地衣芽孢桿菌中被表達為帶有地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(LAT)的信號肽的融合蛋白質(zhì)(見圖6a和6b)。通過來自質(zhì)粒pCPCori(從Enzyme BioSystems，Beloit，Wisconsin，USA獲得)的編碼變體α-淀粉酶的成熟鏈的序列的PCR擴增以及克隆到載體pHPLT，構(gòu)建出基因融合。典型地，根據(jù)供應(yīng)商的說明書，PCR反應(yīng)使用高保真Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)在熱循環(huán)儀上以30個循環(huán)進行(退火溫度為55℃)。pHPLT含有LAT啟動子(PLAT)、編碼LAT信號肽的序列(preLAT)，其后是用于克隆的PstI和HpaI限制性位點。根據(jù)供應(yīng)商的說明書和下列引物，使用高保真Platinum Taq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，通過融合PCR(必須，為了在EBS2基因中刪除內(nèi)部PstI位點)，變體α-淀粉酶(VAA)被構(gòu)建為PstI-HpaI片段VAA(PstI)_FWgaatgtctgcagcttcagcagccgcaccgtttaacggcaccatg(SEQ ID NO_)VAA(HpaI)_RV cccggggttaactcaaggccatgccaccaaccgtgg(SEQ ID NO_)VAAdelPstI_fw cccggccaagcgcttcagtcatgggtcgac(SEQ ID NO_)VAAdelPstI_rv gtcgacccatgactgaagcgcttggccggg(SEQ ID NO_)[125]根據(jù)供應(yīng)商(Invitrogen)的說明書，使用T4 DNA連接酶，將編碼變體α-淀粉酶的PstI-HpaI片段連接到經(jīng)PstI和HpaI消化的pHPLT，并將其轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌菌株OS14。LAT-VAA基因融合物的序列可以通過DNA測序(BaseClear，Leiden，The Netherlands)被確認，正確的質(zhì)?？寺≈槐幻麨閜HPLT-VAAc1(圖8)。該質(zhì)粒通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Pragai et al.，Microbiology(1994)140305-310)被引入淀粉酶陰性地衣芽孢桿菌宿主(BML612)。新霉素抗性轉(zhuǎn)化子分泌變體α-淀粉酶，這通過碘染色后在淀粉板上的暈圈形成來判斷(圖9)。通過將來自pHPLT-VAAc1的LAT-VAA基因構(gòu)建物插入到載體pICatH中，構(gòu)建下一個質(zhì)粒pICatH-VAAc1(ori2)(圖10)。pICatH包含下列特征復(fù)制起點(oripE194，用于在芽孢桿菌中的復(fù)制[Horinouchi，S，et al，J.Bacteriol.150(2)804-14(1982)])、ori pBR322(用于在大腸桿菌中的擴增)、用于選擇的新霉素抗性基因、以及用于選擇、染色體整合和序列盒擴增的天然地衣芽孢桿菌氯霉素抗性基因(cat)。preLAT-前體VAA基因融合物(包括LAT啟動子和LAT轉(zhuǎn)錄終止子)是從pHPLT-VAAc1用下列引物擴增VAAXhoI_FW atcctactcgaggcttttcttttggaagaaaatataggg(SEQ ID NO_)
VAAXhoI_RV tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc(SEQ ID NO_)。如美國專利申請US20020182734(國際公布號WO 02/14490)所述，所得到的PCR片段用XhoI消化、被連接到經(jīng)XhoI消化的pICatH并且被轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌菌株OS14中。質(zhì)粒DNA從淀粉酶陽性轉(zhuǎn)化子中分離出來，并且VAA基因構(gòu)建物的序列通過DNA測序被確認。一個正確克隆的質(zhì)粒被命名為pICatH-VAA2c1(ori2)，然后在許可溫度(37℃)被轉(zhuǎn)化入地衣芽孢桿菌菌株BML612(BRA7衍生物，cat-、amyL-、spo-)。一個淀粉酶陽性、新霉素抗性(neoR)以及氯霉素抗性(CmR)的轉(zhuǎn)化子被選擇，并被命名為BML612(pICatH-VAAc1)。通過使菌株在非許可溫度(50℃)在含5μg/ml氯霉素的培養(yǎng)基中生長，BML612(pICatH-VAAc1)中的質(zhì)粒被整合到地衣芽孢桿菌基因組的cat區(qū)。一個CmR抗性克隆被選擇，并被命名為BML612-pICatH-VAAc1。BML612-pICatH-VAAcl再次在許可溫度下在無抗生素下生長多代，以環(huán)出載體序列，然后一個新霉素敏感(neoS)的CmR克隆被選擇。在該克隆中，染色體上的pICatH的載體序列被切除(包括新霉素抗性基因)，只有VAA-cat序列盒被留下。接下來，通過使菌株在含提高濃度的氯霉素的培養(yǎng)基中/上生長，染色體上的VAA-cat序列盒被擴增。在多輪擴增后，選擇一個克隆(耐受75μg/ml的氯霉素)并命名為BML612-VAAc1。
實施例2測定α-淀粉酶活性的試驗[128]可溶底物試驗基于Megazyme(Aust.)Pty.Ltd.供應(yīng)的終點分析(end-pointassay)試劑盒，進行速率分析。一小瓶底物(對-硝基苯麥芽庚糖苷，BPNPG7)被溶解到10ml無菌水中，隨后用分析緩沖液(50mM馬來酸鹽緩沖液，pH6.7，5mM氯化鈣，0.002％吐溫20)以1∶4稀釋。通過在25℃將10μl淀粉酶加到樣品杯中的790μl底物中，進行試驗。水解速率被測量為在75秒的延遲之后在410nm處吸光度的變化速率。該試驗是線性的，可直至0.2個吸收單位/分鐘的速率?；贐radford，Anal.Biochem.，Vol.72，p.248(1976)的方法，使用牛血清白蛋白標準品，采用標準的Bio-Rad試驗(Bio-Rad Laboratories)測量α-淀粉酶蛋白質(zhì)濃度。
實施例3額外的突變體α-淀粉酶的制備和熱穩(wěn)定性測試[130]變體嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶被制備，其具有在R179/G180的缺失，如實施例1所述。根據(jù)下面的步驟，測量突變體的熱失活速率。淀粉酶儲液在20mM醋酸胺、4mM CaCl2pH6.5中被充分透析。每個樣品在4℃儲存。為了測量穩(wěn)定性，該儲液以＞50倍被稀釋到50mM醋酸胺、5mM CaCl2、0.02％吐溫20 pH4.8中，終濃度在30μg/ml和50μg/ml之間。六個100μl的等分樣品被放入Eppendorf管并置于83℃的水浴或熱塊(hot block)中。以30秒和5分鐘之間的規(guī)律的測量間隔，將Eppendorf管移走并置于冰上，以終止失活作用。使用實施例2所述的可溶性底物，測定殘留的活性。將活性的自然對數(shù)相對于溫育時間作圖，并從直線的斜率獲得失活的速率常數(shù)。結(jié)果被提供。預(yù)期的是，已經(jīng)在其中引入本發(fā)明突變的突變體酶在該分析試驗的條件下具有顯著改善的穩(wěn)定性。通過比色法可以測量α-淀粉酶活性，所述比色法監(jiān)測對-硝基苯基麥芽庚糖苷的降解速率。對-硝基苯基釋放的速率與淀粉酶活性成比例并且在410nm下監(jiān)測。
實施例3a測定漿體DE的Schrool方法(費林試驗)試劑溶液[133]費林溶液A&B(VWR，Brisane，CA Catalogue # VW3316-2；VW3317-1)[134]通過將150g碘化鉀溶解在450ml蒸餾水中，制備碘化鉀(30％w/v)溶液。向其中加入1.5ml 1N NaOH。該溶液被定量轉(zhuǎn)移到500ml的容量瓶中并用蒸餾水加到標線。通過輕度攪拌、在600ml燒杯中向400ml蒸餾水中緩慢加入72.5ml濃硫酸(S.G.1.84)，制備硫酸(26％w/v)溶液。然后，該溶液被冷卻到室溫。該溶液被定量轉(zhuǎn)移到500ml的容量瓶中并用蒸餾水加到標線。淀粉指示劑溶液如下制備。將150g NaCl溶解到300ml蒸餾水中并加熱到沸騰。用冷蒸餾水制備淀粉漿體，含5g(干重)可溶性淀粉。在攪拌熱NaCl溶液的同時，向淀粉漿體中緩慢加入NaCl溶液。所得到的混合物被帶至沸點并且沸騰5分鐘，然后被冷卻到室溫。然后，所得到的溶液被定量轉(zhuǎn)移到500ml的容量瓶中并用蒸餾水加到標線。并非所有鹽都溶解。
葡萄糖(1.00％w/v)，標準化葡萄糖(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)硫代硫酸鈉(VWR，International，Brisbane CA，Catalogue # EM-SX0810-11)(0.1N)，標準化試驗程序[137]加熱器被充分加溫并且被調(diào)節(jié)以在3分鐘內(nèi)將50ml水加熱到沸騰。獲得醪液樣品，制備每10ml含47mg到67mg葡萄糖的當量的稀釋液。例如，將約15g液化醪液(DE＝10-12)或4g糖化醪液(DE＝50-60)稀釋到100ml。通過折射計測量(阿貝折射計，型號10450，American Optical Corporation-Scientific InstrumentDivision，Buffalo，New York，USA)，采用數(shù)據(jù)表(Corn Refiners Association，Washington，D.C.，USA)，確定稀釋的溶液中的固體百分比。10ml稀釋樣品被轉(zhuǎn)移到瓶中(250ml錐形瓶(F是該燒瓶的重量))，并稱量(F+S)。伴隨著混合，加入15ml蒸餾水，然后加入10ml費林溶液A和10ml費林溶液B。所得到的混合物在3分鐘內(nèi)(+/-15秒)在加熱器上被加熱到沸騰并且沸騰又持續(xù)兩分鐘。然后，所得到的混合物在自來水流下被立即冷卻。通過混合，10ml 30％碘化鉀然后是10ml 26％硫酸被加入到該混合物中。然后，加入2ml淀粉指示劑并混合。立即用0.1N硫代硫酸鈉滴定所得到的混合物，直至藍色淀粉-碘復(fù)合物消失。藍色應(yīng)該至少一分鐘不重新出現(xiàn)。記錄滴定體積(TVs)。對于標準品，5.00ml的1.00％葡萄糖和20ml蒸餾水被轉(zhuǎn)移到250ml的錐形瓶中。對于水空白物，移取25ml蒸餾水到另一個燒瓶中。返回到費林溶液A和B的加入步驟并且對于每個燒瓶按照該程序進行。記錄滴定體積(分別是TVstd和TVwb)。
計算%DE=5×(TVwb-TVs)×100%S×[(F+S)-F]×(TVwb-TVstd)]]>實施例4平均DE進展(DE Progression)的測定[138]如實施例1描述產(chǎn)生的α-淀粉酶[EBS2]，由Genencor International(Palo Alto，CA)提供。380克玉米淀粉(Archer Daniels Midland 106-B Pearl Corn Starch，Decatur，IL，USA)被懸浮在1000ml水中并且漿體的pH被調(diào)到pH5.5。漿體被攪拌過夜以使淀粉水合(12小時)，用6.0N H2SO4調(diào)節(jié)pH直至pH被穩(wěn)定。20ppm Ca2+、100ppm SO2和變體α-淀粉酶以2A-10單位/克或0.28kg/MT干固體的量被加入，在106.5℃經(jīng)噴射蒸煮器操作5分鐘，冷卻，然后在95℃在水浴中溫育120分鐘。在30℃使用阿貝折射計(型號10450，American Optical Corporation-ScientificInstrument Division，Buffalo，New York，USA)以及使用由Corn Refiners Association(Washington，D.C.)Critical Data Tables提供的表，溶解的固體(DS)被確定為大約35ds。以30分鐘的間隔取出樣品并且通過Schrool費林滴定法(見實施例3a)測量DE。結(jié)果如圖11所示。
實施例5漿體黏度進展[139]如實施例1所描述產(chǎn)生變體α-淀粉酶。810克碾碎的玉米被懸浮在2升水中，所述水含有30％的2升稀廢醪，它們在IKA EUROSTAR Labortechnik Power control-帶Viscoklick VK12控制器的visc P7粘度計中的水夾套玻璃缸裝置中。漿體的pH用6.0N H2SO4調(diào)整到pH5.5。漿體在室溫下攪拌30分鐘，且漿體的溫度被升高到60℃，并且以每分鐘1度每升高到85度。當漿體正在加熱時，以4A-10單位/克立即加入變體α-淀粉酶。以4分鐘間隔測量黏度。結(jié)果如圖12所示。盡管由GENENCOR出售的變體地衣芽孢桿菌α-淀粉酶具有大約300Ncm的峰值，但該變體α-淀粉酶具有大約185Ncm的峰值。
實施例6LC/MS分析[141]通過LC/MS分析實施例1中表達的嗜熱脂肪泥土芽孢桿菌α-淀粉酶。所有的液體樣品都用10％TCA沉淀，然而與20mM DTT在50℃進行還原反應(yīng)15-20分鐘。也用55mM碘乙酰胺進行烷基化反應(yīng)。在室溫下允許烷基化反應(yīng)在暗處進行45分鐘。通過在37℃與25mM碳酸氫銨中的各種蛋白酶溫育4小時(酶與底物比為1∶20)，進行蛋白水解消化。使用與LCQ Advantage Ion Trap MS(ThermoFinnigan，San Jose，CA)偶聯(lián)的Surveyor HPLC系統(tǒng)，獲得所有的MS和MS/MS數(shù)據(jù)。Vydac反相C18柱(2.1×150mm)被應(yīng)用于所用的蛋白水解消化樣品，使用的HPLC梯度為從0％到70％的溶劑B，65分鐘，流速為200μl/min。溶劑A(水中0.1％TFA)和溶劑B(乙腈中0.08％TFA)。使用TurboSEQUEST和Xcalibur程序(ThermoFinnigan)進行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果如圖13和14所示。來自三種蛋白水解消化(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和Glu-c)的LC/MS數(shù)據(jù)確認了蛋白質(zhì)序列的大約83％。在該蛋白質(zhì)中的RG缺失也被確認。找不到具有序列(VSTIARPITTRPWTGEFVRWTEPRLVAWP[SEQID NO17])的C端肽。
權(quán)利要求
1.前體α-淀粉酶的變體，其包括在下面位置R179和G180中的一個或多個位置處的缺失，其中所述前體α-淀粉酶選自具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、與SEQ ID NO3的氨基酸序列具有至少90％同一性的α-淀粉酶、與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少90％同一性的α-淀粉酶和具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的α-淀粉酶。
2.權(quán)利要求1所述的變體α-淀粉酶，其中所述前體α-淀粉酶是具有SEQ IDNO3所示的氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶。
3.權(quán)利要求1所述的變體α-淀粉酶，其中所述前體α-淀粉酶是與SEQ IDNO3的氨基酸序列具有至少90％同一性的α-淀粉酶。
4.權(quán)利要求1所述的變體α-淀粉酶，其中所述前體α-淀粉酶是與SEQ IDNO2的氨基酸序列具有至少90％同一性的α-淀粉酶。
5.權(quán)利要求1所述的變體α-淀粉酶，其中所述前體α-淀粉酶是具有SEQ IDNO4的氨基酸序列的α-淀粉酶。
6.變體α-淀粉酶，選自具有SEQ ID NO16的氨基酸序列的α-淀粉酶和與SEQ ID NO16的氨基酸序列具有至少97％同一性的α-淀粉酶。
7.權(quán)利要求6所述的變體α-淀粉酶，其中所述變體α-淀粉酶具有SEQ IDNO16的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求6所述的變體α-淀粉酶，其中所述變體α-淀粉酶具有與SEQ IDNO16的氨基酸序列至少97％的同一性。
9.DNA，其編碼權(quán)利要求1所述的變體α-淀粉酶。
10.表達載體，包含權(quán)利要求9所述的DNA。
11.宿主細胞，用權(quán)利要求10所述的表達載體轉(zhuǎn)化。
12.權(quán)利要求11所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是芽孢桿菌屬某種。
13.權(quán)利要求12所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。
14.去污劑組合物，包括權(quán)利要求1所述的變體α-淀粉酶。
15.淀粉液化組合物，包括權(quán)利要求1所述的變體α-淀粉酶。
16.液化淀粉的方法，包括步驟將淀粉漿體與權(quán)利要求1所述的變體α-淀粉酶接觸，將所述漿體的溫度升高到60℃和80℃之間，以及保持所述漿體的黏度在200.0Ncm以下。
17.液化淀粉的方法，包括步驟將淀粉漿體與權(quán)利要求1所述的變體α-淀粉酶接觸，將所述漿體的溫度升高到85℃和100℃之間，以及在二次液化開始的60分鐘內(nèi)提供至少8.00的平均DE級數(shù)。
18.產(chǎn)生具有淀粉分解活性的變體α-淀粉酶的方法，包括，a)用權(quán)利要求10所述的表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化宿主細胞；b)在適合所述宿主細胞產(chǎn)生具有淀粉分解活性的酶的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細胞；和c)回收所述變體α-淀粉酶。
全文摘要
公開了變體α－淀粉酶，其中對應(yīng)于嗜熱脂肪芽孢桿菌(SEQ ID NO3)中的R179和G180的殘基被缺失。所公開的變體α－淀粉酶顯示了改變的或改善的穩(wěn)定性和/或活性特征。
文檔編號C11D17/04GK1938422SQ200580009913
公開日2007年3月28日 申請日期2005年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月8日
發(fā)明者E·費拉里, M·科爾克曼, C·E·皮爾格林 申請人:金克克國際有限公司