殼聚糖—絲膠蛋白復(fù)合生物支架及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供殼聚糖—絲膠蛋白復(fù)合生物支架及制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明采用乙酸溶液做為溶劑溶解殼聚糖得到殼聚糖溶液；采用絲素缺失型突變品種家蠶的蠶繭制備絲膠蛋白水溶液；將殼聚糖溶液與絲膠蛋白水溶液混勻后注入模具中，加入交聯(lián)劑成型，得到殼聚糖—絲膠蛋白復(fù)合水凝膠；將殼聚糖—絲膠蛋白水凝膠冷凍干燥，得到殼聚糖—絲膠蛋白復(fù)合生物支架。本發(fā)明還提供了一種用于外周神經(jīng)卡壓治療的搭載神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF的復(fù)合生物支架。本發(fā)明具有良好的生物相容性、較高的孔隙率和降解性，降解產(chǎn)物還具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，同時(shí)復(fù)合支架具有抗菌、防粘連等作用，與傳統(tǒng)單純手術(shù)解除坐骨神經(jīng)壓迫相比，本發(fā)明能有效促進(jìn)外周神經(jīng)卡壓損傷的修復(fù)。
【專利說(shuō)明】
[0001] 殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物復(fù)合材料領(lǐng)域，具體地指一種殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支 架和搭載神經(jīng)生長(zhǎng)因子的復(fù)合生物支架及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 外周神經(jīng)卡壓病變是臨床外科的常見疾病，在人群的患病率高達(dá)3.8%，其主要包 括腕管綜合征、肘管綜合征、橈管綜合征、腓總神經(jīng)卡壓綜合征等。神經(jīng)卡壓可以發(fā)生于身 體的任意部位，最常見于關(guān)節(jié)附近的骨性纖維管，特別是神經(jīng)行徑中的肥厚的肌腱弓、變異 韌帶及占位性病變(腱鞘囊腫、脂肪瘤、血腫或腫瘤等)均可對(duì)外周神經(jīng)進(jìn)行擠壓。傳統(tǒng)的外 周神經(jīng)卡壓治療方法有手術(shù)治療和保守治療兩種，少部分病人癥狀輕微，可采取保守治 療，如局部注射類固醇藥物、夾板固定、瑜伽等;大部分卡壓病人具備手術(shù)治療指征，通常采 取卡壓神經(jīng)松解術(shù)進(jìn)行手術(shù)治療。近年來(lái)有研究表明，手術(shù)治療的失敗率達(dá)到25%，部分患 者接受手術(shù)治療后不能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期療效。這種現(xiàn)象被認(rèn)為與手術(shù)后局部瘢痕組織形成以及神 經(jīng)卡壓后病理?yè)p傷有關(guān)。如何進(jìn)一步改善手術(shù)治療的效果是近年來(lái)手外科領(lǐng)域的重要課題 和熱點(diǎn)問(wèn)題。
[0004] 組織工程方法近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于外周神經(jīng)離斷損傷的治療，并取得了理想的效 果，但尚未被應(yīng)用于外周神經(jīng)卡壓治療領(lǐng)域。殼聚糖(Chitosan)是一種天然生物材料，由甲 殼素脫乙酰基所得，而甲殼素廣泛存在蟹殼、蝦殼和節(jié)肢動(dòng)物的外殼中，也存在藻類等低等 植物的細(xì)胞壁中，自然界每年生物合成的甲殼素有數(shù)十億噸之多，所以殼聚糖是一種十分 豐富的自然資源。因其有殺菌、抑菌和促進(jìn)傷口愈合的功能，在臨床上已經(jīng)被開發(fā)應(yīng)用為傷 口敷料。此外，殼聚糖具有良好的生物相容性，免疫原性弱，在體內(nèi)可降解代謝。目前殼聚糖 已在食物保鮮、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)保、化妝品、農(nóng)業(yè)等眾多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。通過(guò)化學(xué)修飾作用，在 殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中引入各種功能團(tuán)或?qū)ぞ厶桥c其他生物材料共混，改善殼聚糖的物化性 質(zhì)，從而使其各自具有不同的功能及功效，是殼聚糖以后研究的一個(gè)重要方面。
[0005] 絲膠蛋白（Silk Sericin)是包裹在絲素纖維表層的一種天然大分子粘性蛋白，約 占蠶苗含量的20~30%，由分子量為24~400 kDa的多肽組成，其分子由絲氨酸、天門冬氨酸和 甘氨酸等18種氨基酸組成。長(zhǎng)期以來(lái)由于人們對(duì)絲膠蛋白認(rèn)識(shí)的不足和研究的局限性，導(dǎo) 致絲膠在繅絲工業(yè)中被當(dāng)作廢物處理，浪費(fèi)了大量寶貴的天然資源。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)絲膠 蛋白具有保濕、抗菌、抗氧化、抗凝血以及促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖等生物特性。不僅如此，絲膠 具有親水性和可降解性，是理想的生物醫(yī)用材料。已有的報(bào)道顯示絲膠常用于與其他材料 (如彈性蛋白，聚乙烯醇等)共聚或簡(jiǎn)單交聯(lián)，混合制作生物支架以獲得性能優(yōu)良的生物材 料。充分發(fā)揮絲膠蛋白在組織工程學(xué)中的應(yīng)用，具有重要的社會(huì)意義和廣闊的應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明以家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭為材料，采用溴化鋰提取法提取純絲膠蛋 白，利用化學(xué)共價(jià)鍵交聯(lián)的方式將殼聚糖與絲膠蛋白結(jié)合，成功制備了殼聚糖一絲膠蛋白 復(fù)合支架。該復(fù)合支架兼具殼聚糖和絲膠蛋白各自的優(yōu)點(diǎn)，并且彌補(bǔ)了單一材料應(yīng)用存在 的不足。在治療外周神經(jīng)卡壓疾病的應(yīng)用中，復(fù)合材料的殼聚糖成分可發(fā)揮其殺菌、抑菌、 抗組織粘連的作用；而絲膠蛋白成分可以改善殼聚糖的機(jī)械性能，絲膠蛋白的降解產(chǎn)物可 發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)與保護(hù)作用。此外，本發(fā)明針對(duì)外周神經(jīng)受卡壓后的主要病理改變(髓鞘厚度 變薄及脫髓鞘改變、軸突數(shù)量減少、軸突直徑變細(xì)等），利用復(fù)合生物支架搭載和緩釋神經(jīng) 生長(zhǎng)因子(NGF)，NGF可以促進(jìn)軸突的再生，調(diào)節(jié)髓鞘蛋白的表達(dá)，促進(jìn)髓鞘的再生和髓鞘厚 度的恢復(fù)。
[0007] 本發(fā)明殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架結(jié)合了兩種成分各自的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的 生物相容性、優(yōu)異的機(jī)械性能，在體內(nèi)易于降解，可作為生長(zhǎng)因子，藥物以及細(xì)胞的載體。本 發(fā)明實(shí)例將殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架用作神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF的緩釋載體，分別利用 復(fù)合生物支架的優(yōu)點(diǎn)及NGF的作用，治療外周神經(jīng)卡壓疾病，促進(jìn)受損神經(jīng)組織學(xué)及功能學(xué) 的修復(fù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供一種殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架，具有良好生物活性和生物相容 性，可以在體內(nèi)自然降解并促進(jìn)外周神經(jīng)卡壓損傷的修復(fù)，同時(shí)所述復(fù)合支架兼具殼聚糖 和絲膠蛋白各自的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)單一材料的不足，如復(fù)合支架具有殼聚糖的殺菌、抑菌、抗組 織粘連的作用，絲膠蛋白的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)與保護(hù)作用，支架中的絲膠蛋白成分可改善殼聚糖的 機(jī)械性能。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架的制備方法，工藝簡(jiǎn)單， 成本低廉，同時(shí)有利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制以及大規(guī)模生產(chǎn)。
[0010]本發(fā)明還提供了上述用于外周神經(jīng)卡壓治療的搭載NGF的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合 生物支架的制備方法。
[0011]本發(fā)明首先提供一種殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架，其成分為殼聚糖與絲膠蛋 白。殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)經(jīng)過(guò)脫乙酰作用得到的。殼聚 糖具有滅菌、促進(jìn)傷口愈合、吸收傷口滲出物、抗組織粘連、不易脫水收縮等作用，已用于制 備外科敷料。殼聚糖能被生物體內(nèi)的溶菌酶降解為低聚糖，具有無(wú)毒、能被生物體完全吸收 代謝的特點(diǎn)。絲膠蛋白是包裹在絲素纖維表層的一種天然大分子蛋白，具有良好的生物相 容性和生物降解性，可在體內(nèi)降解，且降解產(chǎn)物為氨基酸（主要為絲氨酸、天冬氨酸和甘氨 酸），降解產(chǎn)物不僅對(duì)機(jī)體無(wú)毒，能被機(jī)體代謝，且具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)復(fù) 合支架兼具有殼聚糖與絲膠蛋白各自的優(yōu)點(diǎn)，是用于外周神經(jīng)卡壓治療的理想生物材料。
[0012] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架是采用絲素缺失型突變 品種家蠶的蠶繭作為原料提取絲膠蛋白，并與殼聚糖經(jīng)共價(jià)交聯(lián)劑交聯(lián)成型后獲得復(fù)合水 凝膠，進(jìn)一步冷凍干燥制備為復(fù)合支架。其中，殼聚糖購(gòu)自SIGMA公司，純度大于75%，家蠶絲 素缺失型突變品種蠶繭購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，該類品種資源保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科 學(xué)院蠶業(yè)研究所國(guó)家蠶資源保存中心。
[0013] 由于復(fù)合支架優(yōu)異的生物相容性和生物活性，殼聚糖成分可發(fā)揮其殺菌、抑菌、抗 組織粘連的作用；而絲膠蛋白成分可以改善殼聚糖的機(jī)械性能，絲膠蛋白的降解產(chǎn)物可發(fā) 揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)與保護(hù)作用。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例將殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架制備為緩釋 載體，搭載神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGH，支架的尺寸為直徑lcm，厚度2mm，薄圓片狀，用于大鼠坐骨 神經(jīng)卡壓的治療。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種上述殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架的制備方法，包括以下 步驟： 1) 采用絲素缺失型突變品種家蠶的蠶繭作為原料，將其粉碎并經(jīng)紫外線或乙醇滅菌， 然后使用LiBr或LiCl水溶液進(jìn)行絲膠蛋白的提取，將提取物制成濃度為質(zhì)量體積比0.005~ 0.2g/mL的絲膠蛋白水溶液； 2) 采用1 % (v/v)的乙酸溶液作為溶劑溶解殼聚糖，調(diào)pH至5.90~5.95，0.22 μπι濾器過(guò) 濾除菌，得到0.01 g/mL的殼聚糖乙酸溶液； 3) 將上述絲膠蛋白水溶液與殼聚糖乙酸溶液體積比按照80:20~20:80比例混勻，加入 共價(jià)交聯(lián)劑，再混勻后注入模具中成型，得到殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合水凝膠，所述共價(jià)交聯(lián) 劑的使用量為每1 ml殼聚糖一絲膠蛋白混合溶液加入333yL濃度為質(zhì)量體積比0.01 g/ml 的共價(jià)交聯(lián)劑； 4) 將所述殼聚糖一絲膠蛋白水凝膠冷凍干燥，得到所述殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合支架。
[0015] 其中，粉碎為可以采用剪刀將蠶繭剪碎或其他能使其破碎的方法。滅菌方法可采 用紫外照射法，把蠶繭粉碎成1 mm2左右，用紫外線分別照射正反面至少5 min;或者采用乙 醇浸泡法，將蠶繭粉碎成1 mm2左右，用70%~80%體積濃度的乙醇至少浸泡5 min，在3500 r/ min條件下離心5分鐘，去掉乙醇;還可以將上述紫外照射法和乙醇浸泡法聯(lián)合應(yīng)用，先用紫 外線照射正反面，再用乙醇浸泡，然后離心去掉乙醇。上述三種方法均可達(dá)到滿意的滅菌效 果。
[0016] 進(jìn)一步地，制取所述絲膠蛋白水溶液的方法包括： 1) 采用絲素缺失型突變品種家蠶的蠶繭作為原料，將其粉碎并滅菌，在25~50°C，采用 濃度為6~8 moVL的LiBr或LiCl水溶液，在25~50°C進(jìn)行提取處理5~24小時(shí)，每克蠶繭碎片 采用20~100 mL 6~8 mol/L的LiBr或LiCl水溶液進(jìn)行提取； 2) 將步驟1)得到的提取物離心，去除不溶性物質(zhì)，得到澄清溶液； 3) 向步驟2)得到的澄清溶液中加入0.5~3mol/L、pH 8. (Μ 1.0的Tris-HCl緩沖液，并在 超純水中進(jìn)行透析； 4) 將步驟3)得到的透析液離心去除沉淀，濃縮得到濃度為0.005~0.2g/mL的絲膠蛋白 水溶液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，可使所述絲膠蛋白水溶液的濃度為〇. 〇4g/mL，以取得更 好的交聯(lián)效果。
[0017] 上述絲膠蛋白水溶液的制備過(guò)程在無(wú)菌環(huán)境中操作，所用原料和設(shè)備均經(jīng)滅菌處 理，例如，所用的超純水、透析袋用前均采用高壓滅菌，所用的LiBr水溶液、三羥甲基氨基甲 烷鹽酸鹽(Tris-HCl)均經(jīng)過(guò)0.22 μπι濾器過(guò)濾除菌，乙醇為經(jīng)過(guò)親水性0.22 μπι濾器過(guò)濾 后，用滅菌的超純水配置而成。
[0018] 進(jìn)一步地，制備所述殼聚糖乙酸溶液的方法包括： 1) 雙蒸水配制體積比1 %冰醋酸溶液； 2) 稱取殼聚糖溶于步驟1)所得1%乙酸溶液，放置于37°C搖床中充分溶解30分鐘；用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至5.90~5.95;經(jīng)過(guò)0.22 μπι濾器過(guò)濾除菌得到0.01 g/mL殼聚糖乙 酸溶液。
[0019] 上述共價(jià)交聯(lián)劑可選擇戊二醛、丙二醛和京尼平等中的一種或多種。例如，本發(fā)明 的一個(gè)實(shí)施例中可使用濃度為1 Wt%的京尼平。
[0020] 進(jìn)一步地，將上述絲膠蛋白水溶液與殼聚糖乙酸溶液混勻，在所述殼聚糖一絲膠 蛋白混合溶液中加入所述共價(jià)交聯(lián)劑，混勻后注入模具，在37°c下維持至少8小時(shí)以上使之 成型，得到殼聚糖一絲膠蛋白水凝膠。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，可將其置于室溫下過(guò)夜成 型。在此過(guò)程中，殼聚糖與絲膠蛋白在交聯(lián)劑的作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，得到殼聚糖一絲膠蛋 白水凝膠。
[0021 ]為了利于增加復(fù)合支架的孔隙度，可將殼聚糖一絲膠蛋白水凝膠冷凍干燥之前， 在零度以下冷凍成型，例如，置于_20°C至_190°C下（一般可以置于液氮中）冷凍至少4小時(shí)， 可更有利于負(fù)載生長(zhǎng)因子和藥物等。
[0022] 上述殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合支架(尺寸可通過(guò)模具的選擇而控制），例如可以制成 直徑lcm，厚度2~3mm，薄圓片狀的緩釋載體，以適應(yīng)不同程度的外周神經(jīng)損傷。獲得的復(fù)合 支架應(yīng)在無(wú)菌條件下保存。
[0023] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架的制備方法及應(yīng)用具體 可包括以下步驟： 1) 稱取家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭，并將其剪成1 mm2碎片，清洗3次，去除水分，先 將蠶繭鋪在一個(gè)無(wú)菌平板，用紫外線照射五分鐘后，用另一個(gè)無(wú)菌平板覆蓋在其上面，然后 反過(guò)來(lái)，拿掉起始的無(wú)菌平板暴露出蠶繭碎片的另一面用紫外線再照射五分鐘，或者可以 用鑷子將蠶繭碎片逐個(gè)翻面，實(shí)現(xiàn)用紫外線分別照射正反面各5分鐘； 2) 將步驟1)的蠶繭碎片浸泡于無(wú)菌的濃度為約6 mol/L的LiBr或LiCl水溶液中（每克 蠶繭碎片加入55 mL的LiBr或LiCl水溶液)充分浸泡后(必要時(shí)進(jìn)行攪拌），置于35°C水浴24 小時(shí)左右，使原料中的絲膠蛋白被提取并溶解于LiBr或LiCl水溶液； 3) 然后將步驟2)中的提取物在3500 r/min離心，分離去除不溶性物質(zhì)，得到澄清的溶 液； 4) 向步驟3)得到的澄清溶液中加入四分之一體積無(wú)菌的1 mol/L，pH 9.0的Tris-HCl 緩沖液，并將其進(jìn)行透析，得到絲膠蛋白水溶液； 5) 將步驟4)得到絲膠蛋白水溶液離心去除沉淀，濃縮得到濃度為0.005~0.2g/mL的絲 膠蛋白水溶液，優(yōu)選濃度為4%，置于4 °C保存?zhèn)溆茫?6) 稱取殼聚糖溶于體積比1%乙酸溶液，放置于37°C搖床中充分溶解30分鐘；用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至5.90~5.95;經(jīng)過(guò)0.22 μπι濾器過(guò)濾除菌得到0.01 g/ml殼聚糖乙酸溶液， 置于4 °C保存?zhèn)溆茫?7) 將步驟5)得到的無(wú)菌絲膠蛋白水溶液與步驟6)得到的無(wú)菌殼聚糖溶液充分混勻，得 到殼聚糖一絲膠蛋白混合溶液； 8) 向步驟7)得到的殼聚糖一絲膠蛋白混合溶液中加入無(wú)菌京尼平，加入量為每1 ml混 合溶液中加入0.33 mL濃度為0.01 mg/mL的京尼平，充分混勻后注入無(wú)菌模具中，置于室 溫12小時(shí)，得到殼聚糖一絲膠蛋白水凝膠； 9) 將制成的殼聚糖一絲膠蛋白水凝膠放入無(wú)菌平皿中，再置于-80°C冷凍4小時(shí)。
[0024] 10)將9)中冷凍后半成品放入冷凍真空干燥機(jī)中，在零度以下過(guò)夜凍干，凍干后得 到的支架從模具中取出。
[0025] 11)使步驟7)得到的殼聚糖一絲膠蛋白混合溶液中殼聚糖與絲膠蛋白的體積比為 1:1，加入20 uL濃度為10 ng/uL的NGF溶液，充分混勻，后續(xù)步驟不變，得到搭載NGF的殼聚 糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架。
[0026] 本發(fā)明還提供上述殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架在外周神經(jīng)卡壓治療中的應(yīng) 用。本發(fā)明提供的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架可用于制備體內(nèi)可降解移植物，可用于 搭載神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF，用于外周神經(jīng)卡壓手術(shù)解壓后的神經(jīng)修復(fù)。
[0027]本發(fā)明的有益效果在于： 1、本發(fā)明采用絲素缺失型突變品種家蠶的蠶繭作為原料提取絲膠蛋白，并與殼聚糖經(jīng) 交聯(lián)成型，首次利用京尼平做為交聯(lián)劑制備出殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合水凝膠，并進(jìn)一步獲 得殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架，更進(jìn)一步地，首次將該類復(fù)合支架應(yīng)用于外周神經(jīng)卡 壓疾病修復(fù)領(lǐng)域。
[0028] 2、本發(fā)明提供的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架具有良好的生物相容性，在損傷 神經(jīng)修復(fù)完成后可以完全降解。殼聚糖降解產(chǎn)物為低聚糖，具有抗菌、防粘連作用，可預(yù)防 手術(shù)解壓操作后組織粘連與瘢痕形成;絲膠蛋白降解產(chǎn)物為氨基酸，能夠支持神經(jīng)細(xì)胞存 活和增殖，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架是一種優(yōu)良的生物 材料應(yīng)用于外周神經(jīng)卡壓的治療。
[0029] 3、本發(fā)明提供的上述殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架還具有良好的機(jī)械性能，如 強(qiáng)度和柔韌性，在體內(nèi)不會(huì)對(duì)組織造成過(guò)度擠壓。
[0030] 4、按照本發(fā)明方法制成的上述殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架還具有孔隙多、比 表面積大的特點(diǎn)，具有良好的藥物或細(xì)胞因子緩釋能力，支架可以搭載細(xì)胞因子或者藥物， 使其緩慢釋放，以促進(jìn)卡壓神經(jīng)損傷的修復(fù)。本發(fā)明提供的實(shí)例為復(fù)合生物支架搭載神經(jīng) 生長(zhǎng)因子NGF用于外周神經(jīng)卡壓的治療。
[0031] 5、與傳統(tǒng)單純手術(shù)解除坐骨神經(jīng)壓迫相比，本發(fā)明方法首次將神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF 用于外周神經(jīng)卡壓的治療，NGF可以促進(jìn)軸突的再生，調(diào)節(jié)髓鞘蛋白的表達(dá)，促進(jìn)髓鞘的再 生和髓鞘厚度的恢復(fù)，針對(duì)神經(jīng)卡壓損傷的病理變化進(jìn)行治療。
[0032] 6、本發(fā)明提供的上述殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉， 同時(shí)有利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制以及大規(guī)模生產(chǎn)。
[0033]
【附圖說(shuō)明】
[0034]其中，CS代表殼聚糖，SS代表絲膠蛋白。
[0035] 圖1為不同比例(體積比)無(wú)菌殼聚糖、絲膠蛋白混合溶液形成水凝膠效果圖；標(biāo)尺 為1厘米。
[0036] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例制備的不同比例殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合水凝膠冷凍并低溫真 空干燥得到的凍干支架外觀圖；標(biāo)尺為1厘米。
[0037] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例制備的不同比例殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架的橫截面掃 描電鏡圖片;標(biāo)尺均為500微米。
[0038] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例制備的不同比例殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架吸水膨脹率 隨時(shí)間的變化曲線。
[0039] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例制備的不同比例殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架的傅氏轉(zhuǎn)換 紅外線光譜分析。
[0040] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例制備的不同比例殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架中施萬(wàn)細(xì)胞 的增殖情況對(duì)比。
[0041 ]圖7A為搭載神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NGF)后不同比例殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架NGF 每日釋放量情況對(duì)比。圖7B為搭載神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NGF)后不同比例殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合 生物支架NGF累積釋放量情況對(duì)比。
[0042]圖8A為不同比例殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架緩釋NGF促未分化PC12細(xì)胞分化 顯微鏡相差圖；其中a為陰性對(duì)照組（未加入NGF)，b為CS100/SS0組，c為CS80/SS20組，d為 CS50/SS50組，e為CS20/SS80組，f為CS0/SS100組，標(biāo)尺均為50微米。圖8B為不同比例殼聚 糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架緩釋NGF促未分化PC12細(xì)胞分化情況柱狀統(tǒng)計(jì)圖。
[0043] 圖9為大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型解壓術(shù)后置入搭載NGF復(fù)合生物支架，復(fù)合生物支架 在不同時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)降解情況。
[0044] 圖10A、圖10B分別為大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型手術(shù)解壓后不同處理組第2周、第4周 卡壓部位坐骨神經(jīng)ΜΒΡ、β-3 tubulin、DAPI染色圖，標(biāo)尺為50微米。
[0045] 圖11為大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型手術(shù)解壓后不同處理組第2周、第4周腓腸肌肌纖維 Masson染色圖，標(biāo)尺為20微米。
[0046]圖12為大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型手術(shù)解壓后不同處理組第2周、第4周腓腸肌細(xì)胞直 徑統(tǒng)計(jì)。
【具體實(shí)施方式】
[0047]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例 中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不 是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前 提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0048]本發(fā)明首先制備了無(wú)菌殼聚糖溶液，同時(shí)以家蠶絲素缺失型突變品種蠶繭為原 料，應(yīng)用無(wú)菌抽提的方法，采用溴化鋰(LiBr)或氯化鋰(LiCl)提取法成功提取純絲膠蛋白， 并利用化學(xué)交聯(lián)和冷凍抽干的方式，成功地制備了殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架，該復(fù) 合支架具有防止組織粘連、抗菌作用，同時(shí)其降解產(chǎn)物對(duì)機(jī)體無(wú)毒無(wú)害且具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作 用。
[0049] 本發(fā)明提供的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架可用于制備體內(nèi)的可降解的移植 物，本發(fā)明利用殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架搭載神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF，能有效促進(jìn)外周神 經(jīng)卡壓疾病損傷的修復(fù)。
[0050] 實(shí)施例1殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架的制備 1、蠶繭的選擇： 選用家蠶絲素缺失突變品種的蠶繭(購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，該家蠶絲素缺 失突變品種保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所國(guó)家蠶資源保存中心，保藏編號(hào)（或商品編 號(hào)）從5M/-S，為原材料，主要的化學(xué)成分為:絲膠蛋白。
[00511 2、殼聚糖的選擇： 殼聚糖購(gòu)自Sigma公司，純度大于75%。
[0052] 3、絲膠的提取與分離 1)分別稱取家蠶絲素缺失突變品種的蠶繭lg并剪成1 mm2左右的碎片，置于潔凈的燒 杯中。將上述蠶苗碎片用超純水清洗3次，3500 r/min離心5分鐘去除水分。
[0053] 在無(wú)菌環(huán)境中，將蠶繭碎片使用75%酒精分別浸泡5分鐘，然后在3500r/min下離心 5分鐘去掉酒精后備用。
[0054] 2)向滅菌后的蠶繭碎片中加入55 mL的濃度為6 mol/L的LiBr水溶液，將燒杯放入 恒溫水浴鍋內(nèi)35°C水浴24小時(shí)，溶解絲膠蛋白； 3) 將步驟2)得到的提取物轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)3500 r/min離心5分鐘，去除不溶性物質(zhì)，得到 澄清的溶液； 4) 向步驟3)得到的澄清溶液中加入四分之一體積的Tris-HCl緩沖液（1 mol/L，pH 9.0)； 5) 將步驟4)中獲得的溶液轉(zhuǎn)入到預(yù)處理好的透析袋(MWC0 3500)中，然后放置于含有 超純水的燒杯中；將該燒杯置于攪拌器上慢速攪拌透析，每隔2小時(shí)換一次水，共透析24小 時(shí)； 6) 將步驟5)中獲得的透析液轉(zhuǎn)到離心管中，3500 r/min離心5分鐘，去除沉淀； 7) 將步驟6)獲得的溶液再裝入到透析袋中并將透析袋兩端用夾子夾緊，再將透析袋置 于質(zhì)量百分濃度為20%的PEG6000溶液(使用前經(jīng)高壓滅菌）中濃縮，將絲膠蛋白水溶液濃縮 到0.005~0.2 g/mL。
[0055] 4、無(wú)菌殼聚糖溶液的制備 1) 雙蒸水稀釋100%冰醋酸配制成體積比1 %的乙酸溶液； 2) 稱取殼聚糖溶于步驟1)所得1%乙酸溶液，得到0.01 g/mL殼聚糖乙酸溶液，放置于 37 °C搖床中充分溶解30分鐘； 3) 配制1 mol/L NaOH溶液，加入步驟2)所得0.01 g/mL殼聚糖乙酸溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值 至5.90~5.95; 4) 步驟3)得到的殼聚糖溶液經(jīng)過(guò)0.22 μπι濾器過(guò)濾除菌，即可得到無(wú)菌殼聚糖溶液，備 用。
[0056] 5、殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架的制備 1) 取5個(gè)潔凈燒杯，分別按照體積比:殼聚糖:絲膠蛋白=1:0、殼聚糖:絲膠蛋白=4:1、殼 聚糖:絲膠蛋白=1: 1、殼聚糖:絲膠蛋白=1:4、殼聚糖:絲膠蛋白=0:1將無(wú)菌殼聚糖乙酸溶液 與絲膠蛋白水溶液加入到燒杯中，充分混勻，得到CS100/SS0、CS80/SS20、CS50/SS50、CS20/ SS80、CS0/SS100五種不同濃度比例的殼聚糖一絲膠蛋白混合溶液； 2) 每種比例加入京尼平水溶液，加入量為每1 mL混合溶液中加入330 uL 0.01 g/mL的 京尼平水溶液，充分混勻后注入無(wú)菌模具中，在37°C下反應(yīng)8小時(shí)，得到殼聚糖一絲膠蛋白 復(fù)合水凝膠，其外觀如圖1所示(標(biāo)尺為1厘米）；將2)中得到的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合水凝 膠放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，放入-80°C冷凍4小時(shí)，再放入冷凍真空干燥機(jī)中過(guò)夜凍干，凍干后從 模具中取出得到無(wú)菌殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架，其外觀如圖2所示(標(biāo)尺為1厘米）； 實(shí)施例2殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架性能分析 對(duì)實(shí)施例1中制備的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架進(jìn)行以下性能分析，具體為： 1、宏觀結(jié)構(gòu) 使用選定的模具，使得到的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合支架被制備成直徑1 cm，高2~3mm的 薄片狀結(jié)構(gòu)，如圖2所示。
[0057] 2、微觀結(jié)構(gòu)。
[0058] 在掃描電子顯微鏡(ULTRA PLUS-43-13，Zeiss，德國(guó)產(chǎn)）下觀察殼聚糖一絲膠蛋 白復(fù)合生物支架。如圖3所示，五種不同比例殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架橫截面的SEM 圖，標(biāo)尺為500微米，支架內(nèi)部為多空隙結(jié)構(gòu)，CS100/SS0、CS80/SS20、CS50/SS50、CS20/ SS80、CS0/SS100五種復(fù)合支架孔徑平均值分別為 157.69 μπι、130·55 μπι、146·27 μπι、 136.35 μπι、151.99 μπι，大量微孔可很好地支持細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝物質(zhì)交換。 [0059] 3、力學(xué)性能 利用微型萬(wàn)能測(cè)試機(jī)（Instron5848 MicroTester，Instron, USA)在常溫下測(cè)試殼聚 糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架的力學(xué)性能。測(cè)得CS100/SS0、CS80/SS20、CS50/SS50、CS20/ SS80、CS0/SS100五種復(fù)合支架的彈性模量分別為0.0254 ± 0.0019 MPa、0.0310 土 0.0011 MPa、0.0347 ± 0.0022 MPa、0.0360 ± 0.0008 MPa、0.0478 ± 0.0023 MPa。可 見在五種復(fù)合生物支架中，隨著絲膠蛋白濃度的增加，復(fù)合支架的機(jī)械性能得到改善。其 中，CS50/SS50比例復(fù)合生物支架具有足夠合適的機(jī)械性能能夠支持神經(jīng)損傷修復(fù)。
[0060] 4、膨脹率 將凍干的復(fù)合生物支架浸泡于與體內(nèi)pH近似的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)中，在不同時(shí) 間點(diǎn)取出，按以下公式測(cè)定其吸水膨脹率(其中1為膨脹狀態(tài)下的重量，Wd為干重）。
[0061 ] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，以CS50/SS50為例，由圖4可知，在浸入ros溶液24小時(shí)之后， 絲膠蛋白神經(jīng)導(dǎo)管膨脹了 9.6倍，48小時(shí)之后趨于穩(wěn)定，在14倍左右，能夠適用于體內(nèi)環(huán)境。 [0062] 5、孔隙率 將凍干后的復(fù)合生物支架稱重記為Mo,測(cè)量其體積記SVm，浸泡到無(wú)水乙醇中24小時(shí) 后，稱重記為Mt，根據(jù)以下公式計(jì)算絲膠蛋白神經(jīng)導(dǎo)管的孔隙率(無(wú)水乙醇密度資=0.789 g/ cm3)
實(shí)施例 1 中制備的〇5100/550、〇580/5520、〇550/5550、〇520/5580、〇50/55100五種復(fù)合 生物支架孔隙率分別為83.30%、84.13%、85.34%、82.47%、90.73%，含有比較多的孔徑，有利 于細(xì)胞因子的包埋以及細(xì)胞的搭載。
[0063] 6、紅外光譜分析 利用傅里葉變換紅外光譜儀(Nexus, Thermal Nicolet, USA)分別測(cè)定五種復(fù)合生物 支架在4000-650 cnf1的特征峰，譜圖如圖5所示。
[0064] 圖5中可見CS0/SS100中絲膠蛋白獨(dú)特的酰胺I峰（1600-1690(^1)^^?^^ (1480-1575 cm-3和酰胺ΙΠ 峰（1229-1301 cm1) ;CS100/SS0中殼聚糖位于 1656 011^1490 cm1兩個(gè)特征性的吸收峰。兩種成分混合后，按照S100/SS0、CS80/SS20、CS50/SS50、CS20/ SS80、CS0/SS100比例順序，隨著絲膠蛋白濃度的增加，絲膠蛋白特征性吸收峰從無(wú)到有并 逐漸增強(qiáng)，而殼聚糖的特征性吸收峰則逐漸減弱最后消失，說(shuō)明復(fù)合生物支架確實(shí)具備殼 聚糖和絲膠蛋白兩種成分，且混合后的復(fù)合生物支架兼具了殼聚糖和絲膠蛋白兩者的優(yōu) 點(diǎn)。
[0065] 實(shí)施例3復(fù)合生物支架支持神經(jīng)細(xì)胞存活和增殖能力的評(píng)估 使用實(shí)施例1中制備的無(wú)菌殼聚糖溶液及絲膠蛋白水溶液按照CS100/SS0、CS80/SS20、 CS50/SS50、CS20/SS80、CS0/SS100五種比例直接加到細(xì)胞孔板中，每種比例加入京尼平水 溶液，加入量為每1 mL混合溶液中加入330 uL濃度為0.01 g/mL的京尼平水溶液，在37°C下 反應(yīng)8小時(shí)，接著在-80°C下冷凍4小時(shí)，然后放入真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得到凍干的殼聚 糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架;將從細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的大鼠施萬(wàn)細(xì)胞(RSC96)經(jīng)懸浮，吹散， 種植于鋪有凍干支架的細(xì)胞培養(yǎng)板上。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為DMEM(Dulbecco's Modified Eagle ' s Medium)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入5%胎牛血清，細(xì)胞放于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37°C，C02濃度 為5%，濕度為100%)中培養(yǎng)。
[0066] 如圖6所示，在種植后，采用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞在種植1，3，5，7和9天后細(xì)胞的增 殖情況。由圖6可知，大鼠施萬(wàn)細(xì)胞(RSC96)的數(shù)量隨時(shí)間增長(zhǎng)，因此凍干的殼聚糖一絲膠蛋 白復(fù)合生物支架能夠支持RSC96細(xì)胞的長(zhǎng)期存活和增殖，并且CS50/SS50濃度比例組優(yōu)于其 他四種濃度比例組。
[0067] 實(shí)施例4復(fù)合生物支架搭載NGF的控釋檢測(cè) 使用實(shí)施例1中制備的無(wú)菌殼聚糖溶液及絲膠蛋白水溶液按照CS100/SS0、CS80/SS20、 CS50/SS50、CS20/SS80、CS0/SS100五種比例混合均勻，加入20 uL濃度為10 ng/uL的無(wú)菌 NGF溶液，每種比例加入京尼平水溶液，加入量為每1 mL混合溶液中加入0.33mL質(zhì)量濃度為 0.01 g/mL的京尼平水溶液，混合均勻后注入模具中，在37°C下反應(yīng)8小時(shí)，接著在-80°C下 冷凍4小時(shí)，然后放入真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得到搭載NGF的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物 支架。
[0068] 小心將支架從模具中取出，放入潔凈的六孔板中，在孔中加入roS (pH 7.4) 1 mL 充分浸沒凍干支架，置于37°C。
[0069] 在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、25、30、35 和 40 天，小心取出上清液，并 重新加入 1 mL PBS (pH 7.4)。
[0070] 采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)量上清液中NGF的含量，圖7A所示為各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)NGF 的釋放量，圖7B所示為NGF累計(jì)釋放率，通過(guò)計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上清液中累計(jì)的NGF含量與總 緩釋量的比值即得到NGF累計(jì)釋放率。由圖7A、圖7B結(jié)果可知搭載了 NGF的五種復(fù)合生物支 架均可緩釋出NGF，緩釋的平臺(tái)期每日緩釋出的NGF量約為0.2 ng，可以達(dá)到治療外周神經(jīng) 損傷所需的治療量。五種復(fù)合生物支架的緩釋性能之間相比較沒有明顯的差異。
[0071] 實(shí)施例5搭載NGF的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架修復(fù)卡壓神經(jīng)能力的評(píng)估 選取32只200-250 g的SD大鼠，按照每100g注射0.3 ml 10%水合氯醛的劑量將32只大 鼠麻醉后，取右側(cè)臥位，暴露右后肢坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)上卡套一個(gè)內(nèi)徑1.3 mm外徑2.0 mm長(zhǎng)1.0 cm的硅膠套管。左側(cè)坐骨神經(jīng)作假手術(shù)處理，即小心暴露并游離坐骨神經(jīng)。然后用 7-0尼龍線進(jìn)行縫合?？▔禾幚?個(gè)月后將32只大鼠隨機(jī)平均分成四個(gè)組:單純手術(shù)解壓組、 空載支架組、卡壓部位直接注射NGF溶液組、搭載NGF復(fù)合生物支架組。仍按照每100 g注射 0.3 mL10%水合氯醛的劑量將32只大鼠麻醉后，取右側(cè)臥位，暴露右后肢坐骨神經(jīng)。單純手 術(shù)解壓組僅去除卡壓在神經(jīng)上的硅膠套管不做其他處理;手術(shù)解壓后置入空載支架組為： 去除卡壓在神經(jīng)上的硅膠套管后放置未搭載NGF的空載復(fù)合生物支架;卡壓部位直接注射 NGF溶液組為:去除卡壓在神經(jīng)上的硅膠套管后直接注射NGF溶液;搭載NGF復(fù)合生物支架組 為:去除卡壓在神經(jīng)上的硅膠套管后放置搭載NGF的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架，然后 用7-0尼龍線進(jìn)行縫合。其中，殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架規(guī)格為直徑1.0 cm，高2 _， 搭載NGF量為200 ng，所用殼聚糖與絲膠蛋白體積比為1:1，即CS50/SS50。
[0072]圖9為大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型解壓術(shù)后置入搭載NGF復(fù)合生物支架，復(fù)合生物支架 在不同時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)降解情況。
[0073] 在手術(shù)解壓并進(jìn)行上述4種分組處理2周、4周之后，對(duì)治療部位坐骨神經(jīng)做MBP和β 3-微管蛋白免疫組化染色，ΜΒΡ為髓鞘相關(guān)蛋白，β3-微管蛋白為神經(jīng)軸突微管的標(biāo)志，結(jié)果 分別如圖10Α、圖10Β所示。與其他三個(gè)處理組相比，手術(shù)解壓后置入搭載NGF復(fù)合生物支架 組治療部位坐骨神經(jīng)髓鞘相關(guān)蛋白和神經(jīng)軸突微管結(jié)構(gòu)密度明顯增大，說(shuō)明手術(shù)解壓后置 入搭載NGF復(fù)合生物支架組能更好地在手術(shù)解壓后促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù)。
[0074] 同時(shí)取坐骨神經(jīng)支配的腓腸肌做馬松染色統(tǒng)計(jì)肌纖維直徑，評(píng)估肌纖維萎縮情 況。如圖11所示，在四個(gè)處理組中手術(shù)解壓后置入搭載NGF復(fù)合生物支架組肌纖維直徑最 大，與假手術(shù)組無(wú)明顯差異，說(shuō)明手術(shù)解壓后置入搭載NGF復(fù)合生物支架組能更好地修復(fù)受 損神經(jīng)并減少腓腸肌細(xì)胞的萎縮。圖12為圖11的統(tǒng)計(jì)圖片。綜上，在大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型 中，手術(shù)解除卡壓后使用搭載NGF的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架治療，具有良好的神經(jīng) 損傷修復(fù)效果。
[0075] 最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制;盡 管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依 然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn) 行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù) 方案的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架的制備方法，包括以下步驟： 1) 采用絲素缺失型突變品種家蠶的蠶繭作為原料，將其粉碎并經(jīng)紫外線或乙醇滅菌， 然后使用LiBr或LiCl水溶液進(jìn)行絲膠蛋白的提取，將提取物制成濃度為0.005~0.2 g/mL的 絲膠蛋白水溶液； 2) 采用體積比1 %的乙酸溶液作為溶劑溶解殼聚糖，調(diào)pH至5.90~5.95，0.22 μπι濾器 過(guò)濾除菌，得到0.01 g/mL的殼聚糖乙酸溶液； 3) 將上述絲膠蛋白水溶液與殼聚糖乙酸溶液按照80 : 20~20 :80的體積比混勻得殼聚 糖一絲膠蛋白混合溶液，加入共價(jià)交聯(lián)劑，再混勻后注入模具中成型，得到殼聚糖一絲膠蛋 白復(fù)合水凝膠，所述共價(jià)交聯(lián)劑的使用量為每1 mL殼聚糖一絲膠蛋白混合溶液加入333 yL 濃度為0.01 g/mL的共價(jià)交聯(lián)劑； 4 )將所述殼聚糖一絲膠蛋白水凝膠冷凍干燥，得到所述殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合支架。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：其中，粉碎為采用剪刀或其他能使其 破碎的方法將蠶繭剪碎至1 _2;滅菌方法可采用紫外照射法，用紫外線分別照射剪碎的蠶 繭正反面至少5 min;或者采用乙醇浸泡法，用70%~80%體積濃度的乙醇至少浸泡剪碎的蠶 苗5 min，在3500 r/min條件下離心5min，去掉乙醇；或?qū)⑸鲜鲎贤庹丈浞ê鸵掖冀莘?lián) 合應(yīng)用，先用紫外線照射剪碎的蠶繭正反面，再用乙醇浸泡，然后離心去掉乙醇。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：制取所述絲膠蛋白水溶液的方法包 括： 1) 采用絲素缺失型突變品種家蠶的蠶繭作為原料，將其粉碎并滅菌，在25~50°C，每克 蠶繭碎片采用20~100 mL濃度為6~8 mol/L的LiBr或LiCl水溶液，在25~50°C進(jìn)行提取處理5 ~24小時(shí)； 2) 將步驟1)得到的提取物離心，去除不溶性物質(zhì)，得到澄清溶液； 3) 向步驟2)得到的澄清溶液中加入0.5~3 mo 1/L、pH 8.0~11.0的Tri s-HCl緩沖液，并 在超純水中進(jìn)行透析； 4) 將步驟3)得到的透析液離心去除沉淀，濃縮得到濃度為0.005~0.2 g/mL的絲膠蛋白 水溶液； 上述絲膠蛋白水溶液的制備過(guò)程在無(wú)菌環(huán)境中操作，所用原料和設(shè)備均經(jīng)滅菌處理， 其中，所用的超純水、透析袋用前均采用高壓滅菌，所用的LiBr水溶液、三羥甲基氨基甲烷 鹽酸鹽均經(jīng)過(guò)0.22 μπι濾器過(guò)濾除菌，乙醇為經(jīng)過(guò)親水性0.22 μπι濾器過(guò)濾后，用滅菌的超 純水配置而成。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：制備所述殼聚糖乙酸溶液的方法包 括： 1) 將冰醋酸稀釋成1%體積比的乙酸溶液； 2) 將殼聚糖溶于步驟1)所得乙酸溶液，放置于37°C搖床中充分溶解30分鐘；用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至5.90~5.95;然后經(jīng)過(guò)0.22 μπι濾器過(guò)濾除菌，得到0.01 g/mL殼聚糖乙酸 溶液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述共價(jià)交聯(lián)劑可選擇戊二醛、丙二 醛和京尼平中的一種或多種。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟3)所述混勻后注入模具中成型條 件為在37°C下維持至少8小時(shí)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟4)在所述殼聚糖一絲膠蛋白水凝 膠冷凍干燥之前先在_20°C至-190°C下冷凍至少4小時(shí)。8. 由權(quán)利要求1所述方法制得的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架。9. 權(quán)利要求1所述方法制得的殼聚糖一絲膠蛋白復(fù)合生物支架用于制備體內(nèi)可降解的 移植物的應(yīng)用，或用于外周神經(jīng)卡壓治療的搭載神經(jīng)生長(zhǎng)因子復(fù)合生物支架的制備。10. 搭載神經(jīng)生長(zhǎng)因子的復(fù)合生物支架，由下法制得： 1) 采用絲素缺失型突變品種家蠶的蠶繭作為原料，將其粉碎并經(jīng)紫外線或乙醇滅菌， 然后使用LiBr或LiCl水溶液進(jìn)行絲膠蛋白的提取，將提取物制成濃度為0.005~0.2g/mL的 絲膠蛋白水溶液； 2) 采用體積比1 %的乙酸溶液做為溶劑溶解殼聚糖，調(diào)pH至5.90~5.95，0.22μπι濾器過(guò) 濾除菌，得到0.01 g/ml的殼聚糖乙酸溶液； 3) 按殼聚糖乙酸溶液與絲膠蛋白水溶液的體積比為1:1的比例，將上述絲膠蛋白水溶 液與殼聚糖乙酸溶液混勻得200yL殼聚糖一絲膠蛋白混合溶液，加入20yL濃度為10 ng/yL 的NGF溶液，充分混勻;加入共價(jià)交聯(lián)劑，再混勻后注入模具中成型，得到殼聚糖一絲膠蛋白 復(fù)合水凝膠，所述共價(jià)交聯(lián)劑的使用量為每1 mL殼聚糖一絲膠蛋白混合溶液加入333 yL濃 度為0.01 g/ml的共價(jià)交聯(lián)劑； 4) 將所述殼聚糖一絲膠蛋白水凝膠冷凍干燥，得到所述搭載神經(jīng)生長(zhǎng)因子的復(fù)合生物 支架。
【文檔編號(hào)】A61L27/56GK106039416SQ201610477686
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】王琳, 王征, 楊文 , 張磊, 謝洪建, 王健, 李曉麟
【申請(qǐng)人】華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院