一種制作大鼠單側(cè)肺肺纖維化模型的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種制作試驗(yàn)大鼠單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模型的方法。特別地，本發(fā)明公開(kāi)了一種制作大鼠單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模型的方法，其特征為：麻醉動(dòng)物，氣管切開(kāi)、氣管插管，單側(cè)肺博來(lái)霉素灌注，縫合氣管，術(shù)后護(hù)理。
【專利說(shuō)明】
-種制作大鼠單側(cè)肺肺纖維化模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種制作試驗(yàn)大鼠單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模 型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性肺纖維化疾病是目前導(dǎo)致全世界致死性肺臟疾病中的主要肺疾病之一。一種 快速，有效，低死亡率的曬齒類動(dòng)物的肺纖維化模型是目前該類疾病的病因?qū)W，病理學(xué)和藥 學(xué)研究所必需的。目前所采用的博來(lái)霉素誘導(dǎo)的曬齒類動(dòng)物的肺纖維化模型都是非選擇性 的雙肺肺纖維化。模型存在病變分布不均勻，變異性大，死亡率高等模型自身的不確定性因 素，給肺纖維化疾病研究帶來(lái)不便，特別是對(duì)肺纖維化治療藥物的研發(fā)影響巨大。因此，我 們的團(tuán)隊(duì)建立了一種大鼠單側(cè)肺肺纖維化模型，彌補(bǔ)了現(xiàn)有模型的諸多弊端，達(dá)到病變分 布均勻，變異性小，動(dòng)物死亡率接近零。為慢性肺纖維化疾病研究提供了一個(gè)穩(wěn)定，可靠和 有效的動(dòng)物模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種制作大鼠單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模型的方 法，在實(shí)驗(yàn)大鼠上建立與人類肺纖維化疾病高度相似疾病模型用于肺纖維化疾病的病因 學(xué)，病理學(xué)和藥學(xué)評(píng)價(jià)的模型。開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單易行、能廣泛推廣的、可真實(shí)模擬肺纖維化自 然發(fā)生過(guò)程、模型穩(wěn)定的方法。
[0004] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種制作單側(cè)肺肺纖 維化動(dòng)物模型的方法，包括步驟為：（1)麻醉動(dòng)物；（2)氣管切開(kāi)、氣管插管；（3)單側(cè)肺博來(lái) 霉素灌注；（4)縫合氣管；（5)術(shù)后護(hù)理;步驟(2)氣管插管和(3)單側(cè)肺灌注博來(lái)霉素誘發(fā)灌 注側(cè)肺肺損傷，造成單側(cè)肺肺纖維化。
[0005] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟(3)中所述博來(lái)霉素劑量為1.5、3.0、5. Omg/kg。
[0006] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述動(dòng)物為各類種系的實(shí)驗(yàn)性雌雄大鼠。
[0007] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制作肺纖維化動(dòng)物模型的方法，其包括:用有效 量的博來(lái)霉素灌注曬齒類動(dòng)物的單側(cè)肺。
[000引在一些實(shí)施方案中，所述有效量為0.5至lOmg/kg，優(yōu)選1至8mg/kg，更優(yōu)選1.5至 5.0mg/kg，例如1.5、3.0 或 5.0mg/kg。
[0009] 在另一些實(shí)施方案中，所述曬齒類動(dòng)物選自：大鼠、小鼠和豚鼠。
[0010] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的制作單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模型的方法，該方法制 作過(guò)程簡(jiǎn)單，可廣泛推廣，實(shí)驗(yàn)成果率高，病變分布均勻，結(jié)果穩(wěn)定，變異小，死亡率低。在對(duì) 肺纖維化疾病的病因?qū)W，病理學(xué)和藥學(xué)評(píng)價(jià)中具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)操作概圖，其中1是主氣管，2是肺灌注導(dǎo)管，主要對(duì)應(yīng)具體實(shí) 施方式中的步驟(3)。
[0012] 圖2是正常肺與不同劑量博來(lái)霉素(分別是1.5mg/kg，3.0mg/kg，5.0mg/kg)灌注后 一周、兩周和Ξ周肺的對(duì)比圖，其中3是正常肺，4-12是用不同濃度博來(lái)霉素誘導(dǎo)左側(cè)肺肺 纖維化不同時(shí)間后的肺。
[0013] 圖3是正常肺與不同劑量博來(lái)霉素(分別是1.5mg/kg，3.0mg/kg，5.0mg/kg)灌注后 一周、兩周和Ξ周的Masson Trichrome染色的組織學(xué)對(duì)比圖，其中左上圖是正常肺的皿染 色，右側(cè)Ξ列分別是博來(lái)霉素灌注后一周、兩周和Ξ周的Masson Trie虹ome染色圖，可體現(xiàn) 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)方法真實(shí)模擬肺纖維化的病理過(guò)程。
[0014] 圖4是使用不同劑量博來(lái)霉素灌注正常肺后一周、兩周、Ξ周肺的皿染色對(duì)比圖， 其中B圖和C圖從左至右分別為灌注后一周、兩周、Ξ周的皿染色。博來(lái)霉素灌注后一周肺的 肥染色可體現(xiàn)終末細(xì)支氣管上皮增生，肺泡壁損傷，炎細(xì)胞浸潤(rùn);博來(lái)霉素灌注后兩周肺的 皿染色可體現(xiàn)肺泡壁增厚，肺泡上皮再生，肺泡壁纖維母細(xì)胞增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn);博來(lái)霉素 灌注后Ξ周肺的肥染色可體現(xiàn)肺泡壁纖維化，肺泡壁肉芽腫形成，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，總體表現(xiàn)了 早期肺泡壁破壞、炎癥反應(yīng)、纖維膜細(xì)胞增生到中后期的膠原纖維沉積、肉芽腫形成、血管 新生、細(xì)小支氣管慢性病變等明確的肺纖維化病理改變。
[0015] 圖5是不同劑量博來(lái)霉素灌注后一周、兩周、Ξ周肺的組織病理評(píng)分。
[0016] 圖6是模型驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證藥物化菲尼酬在本模型中的預(yù)防性治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0017] 圖7是模型驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證藥物尼達(dá)尼布在本模型中的預(yù)防性治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施 例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0019] 實(shí)施例1.制作單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模型
[0020] WSprgue-Dawley(SD)雄性大鼠為例，提供一種制作單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模型的 方法(實(shí)驗(yàn)操作如圖1所示），包括步驟為：
[0021] (1)用50mg/kg戊己比妥鋼誘導(dǎo)麻醉動(dòng)物。
[0022] (2)動(dòng)物頸部正中線剌毛，消毒，切開(kāi)暴露主氣管。在氣管軟骨環(huán)之間行氣管切開(kāi)， 氣管插管，連接呼吸機(jī)，呼吸比為1:2，頻率為110次/分鐘，潮氣量為約lOml/kg。
[0023] (3)沿氣管插管通道導(dǎo)入陽(yáng)-50導(dǎo)管進(jìn)入左肺主支氣管，緩注博來(lái)霉素，150ul，博 來(lái)霉素濃度分別為1.5mg/kg，3. Omg/kg，5. Omg/kg。然后啟動(dòng)呼吸機(jī)，使得動(dòng)物在呼吸機(jī)的 控制下呼吸4-5分鐘，促使博來(lái)霉素液體均勻分布與左肺。
[0024] (4)造模完成，縫合氣管、逐層縫合各組織。縫合完畢，消毒表皮。
[0025] (5)術(shù)后動(dòng)物安置在37度溫控毯，時(shí)時(shí)觀察，直至完全清醒，返回飼養(yǎng)房（圖2-4分 別顯示使用不同濃度博來(lái)霉素灌注后不同時(shí)間的照片、Masson Trie虹ome染色圖和肥染色 圖，圖5顯示組織學(xué)評(píng)分）。
[0026] (6)博來(lái)霉素（3.Omg/kg)誘導(dǎo)的術(shù)后動(dòng)物接受驗(yàn)證藥物化菲尼酬口服給藥，進(jìn)行 預(yù)防性治療實(shí)驗(yàn)，50mg/kg，每天兩次，連續(xù)給藥14天。第十五天安樂(lè)死動(dòng)物，病理檢測(cè)左肺 肺纖維化程度，觀察療效(如圖6所示）。
[0027] (7)博來(lái)霉素（3.Omg/kg)誘導(dǎo)的術(shù)后動(dòng)物接受驗(yàn)證藥物尼達(dá)尼布口服給藥，進(jìn)行 預(yù)防性治療實(shí)驗(yàn)，60mg/kg，每天一次，連續(xù)給藥14天。第十五天安樂(lè)死動(dòng)物，病理檢測(cè)左肺 肺纖維化程度，觀察療效(如圖7A所示）。
[00%] (8)博來(lái)霉素（3.Omg/kg)誘導(dǎo)的術(shù)后動(dòng)物接受驗(yàn)證藥物尼達(dá)尼布口服給藥，進(jìn)行 臨床治療性藥效實(shí)驗(yàn)，50mg/kg，和lOOmg/kg，每天一次，連續(xù)給藥14天。第十五天安樂(lè)死動(dòng) 物，病理檢測(cè)左肺肺纖維化程度，觀察療效(如圖7B所示）。
[0029] 表1:本模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在各個(gè)劑量條件各組動(dòng)物生存率
[0030]
[0031] 博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于肺纖維化研究的模型之一，是公認(rèn) 的藥效評(píng)價(jià)模型。本發(fā)明采用博來(lái)霉素誘導(dǎo)單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模型，符合目前肺纖維化 動(dòng)物模型制作的基本理念。能真實(shí)模擬肺纖維化的病理過(guò)程，模型成功率百分之百，穩(wěn)定性 好，死亡率為零。改變了目前非選擇性雙肺肺纖維化模型的諸多弊端?？捎^察到早期肺泡壁 破壞，炎癥反應(yīng)，纖維膜細(xì)胞增生，中后期的膠原纖維沉積，肉芽腫形成，血管新生，細(xì)小支 氣管慢性病變等明確的肺纖維化病理改變。本模型通過(guò)目前臨床應(yīng)用的兩個(gè)不同作用機(jī)制 的口服藥物(化菲尼酬和尼達(dá)尼布)預(yù)防性給藥治療達(dá)到了良好的療效，驗(yàn)證了本模型的實(shí) 際應(yīng)用價(jià)值，即用于肺纖維化的新藥研發(fā)和科學(xué)研究。
[0032] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)有:在實(shí)驗(yàn)大鼠上建立與人類肺纖維化疾病高度相似疾病模型 用于肺纖維化疾病的病因?qū)W，病理學(xué)和藥學(xué)評(píng)價(jià)的模型。開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單易行、能廣泛推廣 的、可真實(shí)模擬肺纖維化自然發(fā)生過(guò)程、模型穩(wěn)定的方法。因其病理過(guò)程與人慢性肺纖維化 病理過(guò)程高度相似，具備較高病因?qū)W和病理學(xué)研究?jī)r(jià)值，在對(duì)抗肺纖維化藥物的評(píng)價(jià)中具 有重要意義。
[0033] W上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng) 域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制作大鼠單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模型的方法，其特征為:麻醉動(dòng)物，氣管切開(kāi)、氣 管插管，單側(cè)肺博來(lái)霉素灌注，縫合氣管，術(shù)后護(hù)理。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模型的方法，其特征為：氣管切開(kāi)、 氣管插管的手術(shù)操作和步驟。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模型的方法，其特征為:所述的博來(lái) 霉素劑量為1.5,3.0,5.0mg/kg。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的制作單側(cè)肺肺纖維化動(dòng)物模型的方法，其特征在于，所 述動(dòng)物為各種種系和性別的實(shí)驗(yàn)大鼠。5. -種制作肺纖維化動(dòng)物模型的方法，其包括：用有效量的博來(lái)霉素灌注嚙齒類動(dòng)物 的單側(cè)肺。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述有效量為0.5至10mg/kg，優(yōu)選1至8mg/kg，更優(yōu)選 1.5至5.0mg/kg，例如1 ·5、3·0或 5.0mg/kg。7. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述嚙齒類動(dòng)物選自：大鼠、小鼠和豚鼠。
【文檔編號(hào)】A61K49/00GK105999221SQ201610324204
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】莊永杰, 陳繼巧
【申請(qǐng)人】南京凱斯艾生物科技有限公司