黃牡丹（變種）乙酸乙酯提取物對口腔癌及癌前病變的干預作用
【專利摘要】一種能顯著抑制口腔癌及癌前病變的中藥提取物，屬于新型口腔癌中藥研發(fā)領域。黃牡丹(變種)乙酸乙酯提取物，提取方法簡單、快捷，可批量生產(chǎn)。選用CCK8法檢測黃牡丹(變種)對口腔癌細胞株SCC15、CAL27和口腔癌前病變細胞株DOK細胞的增殖抑制作用。本發(fā)明為臨床口腔癌防治新藥的研發(fā)提供依據(jù)。
【專利說明】
黃牡丹(變種)乙酸乙酯提取物對口腔癌及癌前病變的干預作用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種干預口腔鱗狀細胞癌細胞生長的藥物，具體地說是以天然植物黃牡丹(變種)根為原料，經(jīng)乙酸乙酯提取，即黃牡丹(變種)乙酸乙酯提取物(ethyl acetateextract ,EA) 0本發(fā)明還涉及該藥物的制備方法。
【背景技術】
[0002]黃牡丹(變種)(Paeoniadelavayi Franch.Var.1utea(Delavay ex Franch.)?111的&6&811叩.)，科屬于毛莨科芍藥屬牡丹組，花黃色(有時邊緣紅色或基部有紫色斑塊，與野牡丹以此區(qū)別)，羽狀復葉，主要分布于云南、四川西南部及西藏東南部等地區(qū)，生于海拔2500-3000米的山地，是國家三級保護植物(1-2)。黃牡丹(變種)根可藥用，根皮(赤丹皮)具有清熱涼血、散瘀止痛的功效，去掉根皮的部分(“云白芍”)可治泄痢腹痛、自汗盜汗等癥
[3]。中醫(yī)臨床多用于腹痛、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等疾病的診治(4-5)。目前，尚未有學者報道黃牡丹(變種)的抗腫瘤作用，對其藥用價值及其機制的研究較少。
[0003]參考文獻
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[0009]現(xiàn)有技術背景缺陷:目前，臨床上口腔癌主要采用手術治療、放射治療及化學藥物治療為主的綜合序列治療，但治療效果往往不佳。盡管近年來治療手段有很大改進，但其5年生存率仍不足50%，嚴重影響了口腔癌患者的生存質(zhì)量?？谇徽衬ぐ┳兪且粋€多階段、多步驟的過程，口腔癌常由口腔癌前病變?nèi)绨装?、扁平苔蘚等發(fā)生惡變而來。至今尚無公認有效的防治口腔癌變的藥物和治療方法?，F(xiàn)代藥理研究表明許多傳統(tǒng)中藥具有抗腫瘤作用，且具有優(yōu)效、低毒、低副作用等優(yōu)點，人們開始逐步重視于傳統(tǒng)中藥的開發(fā)及應用。因此，尋找新型低毒高效的中草藥治療藥物，延長患者的生命，提高其生存質(zhì)量，對口腔癌綜合治療具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明目的是根據(jù)黃牡丹(變種)在中醫(yī)臨床上具有清熱涼血、散瘀止痛的功效，檢測黃牡丹(變種)乙酸乙酯提取物具有抑制口腔癌及癌前病變細胞生長的作用，以期為口腔癌的臨床藥物治療提供新的思路及實驗依據(jù)，開拓黃牡丹(變種)的藥用價值及新用途。[0011 ]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下。
[0012]具體包括以下步驟:
[0013](I)黃牡丹(變種)乙酸乙酯提取物的制備
[0014]黃牡丹(變種)樣品粉碎成粗粉，取粗粉500克，用80%乙醇濕潤后，再用3倍量80%乙醇回流提取兩次，合并提取液，減壓回收乙醇至無醇味，用等體積乙酸乙酯萃取2次(上層液體)，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至干燥，獲得乙酸乙酯萃取物(EA)。
[0015](2)黃牡丹(變種)EA對口腔癌及癌前病變細胞形態(tài)的影響
[0016]在倒置顯微鏡下觀察，口腔癌細胞SCC15和CAL27細胞呈梭形，不規(guī)則多邊形，CAL27細胞體積更小，口腔癌前病變DOK細胞呈長梭形，不規(guī)則多邊形。不同濃度黃牡丹(變種迮4處理三種細胞2411、4811、7211，隨著藥物濃度的增高細胞形態(tài)變圓、變小及細胞膜不連續(xù)的程度加重。
[0017](3)黃牡丹(變種)EA對口腔癌SCCl 5細胞增殖的影響
[0018]將I Oyg/ml、20yg/ml、40yg/ml、60yg/ml、80yg/ml、I OOyg/ml 不同濃度的黃牡丹(變種)EA作用于SCC15細胞24h、48h、72h，SCC15細胞增殖受到不同程度的抑制。隨著藥物濃度的升高，SCC15細胞增殖抑制率亦隨之升高。黃牡丹(變種)EA作用SCC15細胞24h，48h的IC50分別為65 土 0.48yg/ml，22.72 ± 0.51yg/ml，提示黃牡丹(變種)EA對口腔癌SCC15細胞增殖具有抑制作用，抑制作用呈濃度和時間依賴性。
[0019](4)黃牡丹(變種)EA對口腔癌CAL27細胞增殖的影響
[0020]將12.5yg/ml、25yg/ml、50yg/ml、100yg/ml 不同濃度的黃牡丹(變種)EA 作用于口腔癌細胞CAL27細胞24h、48h、72h，CAL27細胞增殖受到抑制。隨著藥物濃度的升高，CAL27細胞增殖抑制率亦隨著升高。黃牡丹(變種迮4作用041^27細胞2411，4811，7211的1050分別為36.5土 0.73yg/ml，27.I ± 0.55yg/ml，39.3 ± 0.89yg/ml，提示黃牡丹(變種)EA對口 腔癌CAL27細胞增殖具有抑制作用，且抑制作用具有濃度依賴性。
[0021 ] (5)黃牡丹(變種)EA對口腔癌前病變DOK細胞增殖的影響
[0022 ]將 12.5yg/ml、25yg/ml、50yg/ml、100yg/ml 不同濃度的黃牡丹(變種)EA 作用于 DOK細胞24h、48h、72h，D0K細胞增殖受到不同程度的抑制。隨著藥物濃度的升高，DOK細胞增殖抑制率亦隨著升高。黃牡丹(變種)EA作用DOK細胞24h，48h，72h的IC50分別為68.51±0.73μg/ml，22.86 ± 0.55yg/ml，40.41 ± 0.89yg/ml，提示黃牡丹(變種)EA對口 腔癌前病變DOK細胞增殖具有抑制作用，且抑制作用具有濃度依賴性。
【附圖說明】
[0023]圖1.黃牡丹(變種)EA對SCC15細胞增殖的影響；
[0024]圖2.黃牡丹(變種)EA對CAL27細胞增殖的影響；
[0025]圖3.黃牡丹(變種)EA對DOK細胞增殖的影響；
【具體實施方式】
[0026]CCK-8 法:
[0027]采用CCK-8法分別檢測黃牡丹(變種)EA對口腔癌細胞株SCC15、CAL27及癌前病變細胞株DOK細胞增殖的影響。實驗設置實驗組和對照組，實驗組設置梯度濃度黃牡丹(變種)EA組;對照組為與實驗組同劑量的溶劑DMSO組。取對數(shù)生長期細胞，用含0.25%EDTA胰酶消化，離心，棄上清。用含有10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2.5 X 14個/ml。每孔接種200μI細胞懸液入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組4個復孔。貼壁過夜后，吸棄上清，按組加入含有不同濃度黃牡丹(變種)ΕΑ的培養(yǎng)液(血清含量為10 % )，并設溶劑對照組。繼續(xù)培養(yǎng)不同時間(24h、4811、7211)。每孔加19(^1培養(yǎng)基和1(^1 CCK8試劑，置于37°C、5%⑶2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)2.5h后終止培養(yǎng)。在酶標儀上測定各孔吸光度(A值)，選擇450nm波長，記錄結果，并按以下公式計算細胞增殖抑制率:增殖抑制率(％ ) = (A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)X100%。實驗重復3次。
【主權項】
1.一種黃牡丹(變種)的提取物，該提取物為乙酸乙酯，對口腔癌及癌前病變的干預作用。2.根據(jù)權利要求1所述的提取物，其特征在于，所述黃牡丹(變種)的乙酸乙酯提取物由以下方法制備:黃牡丹(變種)用石油醚浸泡18_36h，滲濾提取至3-8倍藥材量，回收殘渣，揮干殘渣中的石油醚，用70 % -90 %乙醇提取，提取液濃縮得乙醇濃縮液，相對密度為1.15-1.20，用乙酸乙酯萃取，倒出上層，即得乙酸乙酯提取物。3.根據(jù)權利I所述的對口腔癌的干預作用，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)首先CCK-8法檢測黃牡丹(變種)乙酸乙酯對口腔癌細胞SCCl5的增殖抑制作用，效果明顯，且隨時間及藥物濃度增加抑制作用增強。 (2)CCK-8法檢測黃牡丹(變種)乙酸乙酯對口腔癌細胞CAL27的增殖抑制作用，效果明顯，且隨時間及藥物濃度增加抑制作用增強。 (3)CCK-8法檢測黃牡丹(變種)乙酸乙酯對口腔癌前病變細胞DOK的增殖抑制作用，效果明顯，且隨時間及藥物濃度增加抑制作用增強。4.含權利要求1和2所述提取物的制劑，其特征在于，所述制劑為由黃牡丹(變種)乙酸乙酯提取物和藥學上可接受的載體或稀釋劑組成。5.根據(jù)權利要求4所述的制劑，其特征在于，所述制劑為片劑、糖衣丸、膠囊、注射劑、溶液、乳液、油膏、乳膏、吸入劑、氣霧劑或栓劑。6.權利要求1所述的提取物或權利要求4、5中所述的含黃牡丹(變種)乙酸乙酯提取物的制劑在制備防治口腔癌的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK105998219SQ201610538603
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月8日
【發(fā)明人】湯曉飛, 王春曉, 陳慧, 黃林芳, 連增林
【申請人】首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院