一種輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米碳量子點(diǎn)載體CQDs—PEG—Tf及其制備方法，以及以該載體介導(dǎo)抗腫瘤藥物聯(lián)合免疫細(xì)胞在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該載體能與腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)受體特異性結(jié)合，且利用該載體介導(dǎo)抗腫瘤藥物一定濃度下對(duì)免疫細(xì)胞具有良好的生物安全性。所述載體負(fù)載抗腫瘤藥物與免疫細(xì)胞聯(lián)合作用可雙重靶向和殺傷腫瘤細(xì)胞，在實(shí)現(xiàn)雙重抗腫瘤效應(yīng)的同時(shí)又能降低抗腫瘤藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。該載體制備方法簡單、易于實(shí)施，且具有高度靶向性、無毒性、優(yōu)異的生物相容性以及可生物降解性。本發(fā)明可適用于靶向抗腫瘤藥物的制備以及輔助免疫細(xì)胞對(duì)多種癌癥疾病的靶向治療。
【專利說明】
一種輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系，具體涉及一種碳量子點(diǎn) 納米靶向載體及其制備方法以及靶向抗腫瘤藥物的制備和該靶向抗腫瘤藥物聯(lián)合免疫細(xì) 胞在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 當(dāng)前，體細(xì)胞免疫治療已成為腫瘤患者手術(shù)、放療和化療后輔助治療的重要手段 之一，其對(duì)于促進(jìn)患者免疫系統(tǒng)的重建、消除殘留病灶及骨髓凈化都具有良好的效果。研究 表明，免疫細(xì)胞具有殺滅腫瘤細(xì)胞和提高抗腫瘤免疫的雙重作用，其可趨化和識(shí)別腫瘤細(xì) 胞，并對(duì)腫瘤細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞和其它處于非增殖期的腫瘤細(xì)胞均具有明顯的殺傷作用，同 時(shí)還能提尚機(jī)體的免疫力。
[0003] 免疫細(xì)胞療法，其治療效果顯著，無明顯副作用，與現(xiàn)代手術(shù)、化療和放療方法聯(lián) 合應(yīng)用，可有效清除體內(nèi)不同部位的微小殘留病灶，防止腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。然而這種聯(lián)合應(yīng) 用方法也并不能全部殺死腫瘤細(xì)胞，也存在不足之處。首先，每個(gè)人的腫瘤細(xì)胞不一定可以 被這些免疫系統(tǒng)所識(shí)別，即使識(shí)別了很快又被腫瘤細(xì)胞所逃避。其次，目前腫瘤化療方法對(duì) 患者身體損傷很大，其化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也損傷正常的組織器官，具有很大 的毒副作用。最后，大部分抗癌藥物是通過損傷細(xì)胞核內(nèi)DNA殺死癌細(xì)胞，因此，其作用靶點(diǎn) 位于癌細(xì)胞的細(xì)胞核中，然而由于細(xì)胞核的屏蔽作用，細(xì)胞質(zhì)中的藥物分子只有少量能進(jìn) 入細(xì)胞核，這大大降低了藥物分子在腫瘤細(xì)胞的濃度。另外，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐 藥性，導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)藥物濃度不斷下降，其細(xì)胞毒性逐漸減弱甚至喪失。因此，亟需開發(fā)新 型的集藥物治療效果好與毒副作用小于一體的藥物治療體系。
[0004] 研究表明納米微粒能跨越血腦屏障，實(shí)現(xiàn)藥物的傳遞，利用其作為藥物載體不僅 能保護(hù)藥物的活性，還能實(shí)現(xiàn)緩釋、控釋和靶向釋藥的目的。近年來，石墨烯、磁性納米顆 粒、碳納米管和富勒烯等納米材料作為藥物載體在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用獲得了一定進(jìn)展，但 這些材料均存在生物相容性、毒副作用、制備復(fù)雜等問題而限制其在臨床上的應(yīng)用。最近， 一種新型的碳納米材料一一碳量子點(diǎn)，由于其具有熒光可示蹤、良好的生物相容性、低毒 性、分子量和粒徑小、熒光穩(wěn)定性高、表面易功能化等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記、生物 成像和靶向治療等方面的生命科學(xué)領(lǐng)域。
[0005] 研究表明，在血液循環(huán)中的納米顆粒易于通過腫瘤新生血管壁的縫隙聚集到腫瘤 附近，即腫瘤血管具有的高滲透高阻溜效應(yīng)(EPR效應(yīng)），故納米載藥顆粒本身具有被動(dòng)靶 向。若在納米載藥顆粒表面修飾上靶向分子，聚集到腫瘤組織附近的納米載藥顆?？梢赃M(jìn) 一步通過靶向分子與癌細(xì)胞表面的受體的特異性作用，可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，減小 藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒性，即賦予納米顆粒主動(dòng)靶向的功能。由于腫瘤的快速成長，需要補(bǔ)充 大量的鐵，導(dǎo)致大多數(shù)癌細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的表達(dá)量高于正常細(xì)胞。研究表明在 腫瘤細(xì)胞上轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)量是正常細(xì)胞2-7倍，轉(zhuǎn)鐵蛋白與其受體的親和力是正常細(xì) 胞的10-100倍。因此，轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf)可作為一理想的靶向分子修飾到納米顆粒表面。轉(zhuǎn)鐵蛋 白是一種單鏈糖基化β-球蛋白，其分子量約80KDa，主要負(fù)責(zé)脊椎動(dòng)物體內(nèi)Fe3+的結(jié)合和運(yùn) 輸，是目前研究最多的活性藥物靶向載體。目前，大量的研究已證實(shí)以Tf作為靶向載體，經(jīng) Tf-TfR路徑介導(dǎo)的藥物輸送體系可將藥物運(yùn)送至腫瘤細(xì)胞用于癌癥的治療。基于此，利用 轉(zhuǎn)鐵蛋白與碳量子點(diǎn)偶聯(lián)介導(dǎo)抗腫瘤藥物，聯(lián)合免疫細(xì)胞的腫瘤趨化作用及腫瘤殺譜廣特 性可實(shí)現(xiàn)特異性與非特異性的雙重殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服上述免疫細(xì)胞療法不能全部識(shí)別腫瘤細(xì)胞和殺傷腫瘤細(xì)胞的不足以及 現(xiàn)有抗腫瘤藥物用藥劑量高、體內(nèi)半衰期短、對(duì)正常細(xì)胞毒副作用大的缺點(diǎn)和對(duì)腫瘤細(xì)胞 缺乏特異性的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種輔助免疫細(xì)胞療法實(shí)現(xiàn)高效雙重殺傷 腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)祀向性碳量子點(diǎn)納米載藥體系及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系，所述的靶向納米載藥體系是以 納米材料碳量子點(diǎn)CQDs為載體，聚乙二醇PEG為交聯(lián)物，轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf為靶向分子，通過共價(jià) 偶聯(lián)形成的靶向納米載體CQDs-PEG-Tf，其中每毫克CQDs-PEG偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量為 282-316微克，其粒徑大小為224 · 5 ± 90 · 2nm。
[0008] 本發(fā)明的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 1)將抗壞血酸溶于水中，攪拌均勻后，加入PEG攪拌，微波反應(yīng)，將所得溶液過濾、 洗滌和純化后，即得碳量子點(diǎn)水溶液;所得的碳量子點(diǎn)水溶液除去過量的溶劑，干燥，得到 碳量子點(diǎn)，粒徑為7 · 32 ± 0 · 98nm;
[0010] 2)取步驟1)所得干燥碳量子點(diǎn)，按比例加入無水N，N二甲基甲酰胺DMF和二氯亞砜 SOCl 2，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束旋除去過量的SOCl 2，得到酰氯化的碳量子點(diǎn)；
[0011] 3)取步驟2)所得酰氯化的碳量子點(diǎn)，按比例加入無水DMF中，并按比例加入聚乙二 醇和三乙胺，攪拌反應(yīng);離心，除去上清液，得沉積物碳量子點(diǎn)-聚乙二醇CQDs-PEG-OH，并 烘干；
[0012 ] 4)取步驟3)所得干燥碳量子點(diǎn)-聚乙二醇CQDs-PEG-OH中按比例加入無水DMF形 成懸濁液后，按質(zhì)量比加入琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP，攪拌反應(yīng);離心，除去上清 液，得沉積物碳量子點(diǎn)-聚乙二醇CQDs - PEG-COOH，并烘干；
[0013 ] 5)取步驟4)所得干燥沉積物碳量子點(diǎn)-聚乙二醇CQDs-PEG-COOH按比例加入至 硼酸緩沖溶液，形成懸濁液后，按比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺EDC，常溫 下攪拌反應(yīng);反應(yīng)液中按質(zhì)量比加入轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf，搖勻過夜，離心，除去上清液，得沉積物碳 量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白CQDs - PEG-Tf。
[0014]所述步驟1)中，抗壞血酸在反應(yīng)液中的濃度為0.03g/ml，PEG在反應(yīng)液中的的體積 百分?jǐn)?shù)為66.7 % ;透析袋截留分子量為8000;微波功率200~400W，設(shè)定溫度60~100°C，微 波作用時(shí)間80~200秒。
[0015] 所述步驟2)中，無水N，N二甲基甲酰胺(DMF)溶劑的體積與碳量子點(diǎn)的質(zhì)量比為 (0.1-0.2)1111^111^，二氯亞砜(30(：12)的體積與碳量子點(diǎn)的質(zhì)量比為(0.4-0.6)1]11^111^，反應(yīng) 溫度為65-70 °C。
[0016] 所述步驟3)中，無水DMF的體積與碳量子點(diǎn)的質(zhì)量比為(0.5-0.8)mL: Img;聚乙二 醇與碳量子點(diǎn)的質(zhì)量比為（2-2.5):1;三乙胺的體積與酰氯化碳量子點(diǎn)的質(zhì)量比為(0.05- 0.1)!1^:111^，反應(yīng)溫度為100°(：。
[0017] 所述步驟4)中，無水DMF的體積與CQDs-PEG-OH的質(zhì)量比為（2.0-3.0 )mL: Img， CQDs-PEG-OH、琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP質(zhì)量比為1: (2-2 · 5): (2-2 · 5)，反應(yīng)溫 度為l〇〇°C。
[0018] 所述步驟5)中，硼酸緩沖溶液的體積與CQDs-PEG-⑶OH的質(zhì)量比為（0.4-0.6) mL: Img，硼酸緩沖溶液pH為8.0; 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺EDC與CQDs-PEG- COOH的質(zhì)量比為（2.2-2.5): 1，所用的轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf的分子量為80kDa，CQDs-PEG-COOH與轉(zhuǎn) 鐵蛋白的質(zhì)量比1:(0.3-1)。
[0019]含有輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的免疫細(xì)胞一 CQDs-PEG-Tf復(fù)合 物，采用如下制備方法制成:首先按照每種類型的免疫細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn) 行體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴(kuò)增獲得免疫細(xì)胞，在獲得的免疫細(xì)胞中加入CQDs-PEG-Tf共同孵育 后得到免疫細(xì)胞內(nèi)吞碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物，即免疫細(xì)胞一CQDs-PEG-Tf 復(fù)合物。
[0020] 所述的免疫細(xì)胞一 CQDs-PEG-Tf復(fù)合物中：制備過程中所加入的CQDs-PEG-Tf 復(fù)合物濃度為40-100yg/mL，所述的免疫細(xì)胞，包括樹突狀細(xì)胞(dendr i t i c ce 11 s，DC)、細(xì) 胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL)、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell， NK)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer，CIK)或腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞 (tumor infiltrating lymphocyte，TIL)，其濃度為105-108/ml〇
[0021] 含有輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的CQDs-PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合 物，采用如下制備方法制成：將抗癌藥物分子通過物理吸附作用結(jié)合CQDs-PEG-Tf形成 CQDs - PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物。
[0022] 所述的CQDs-PEG-Tf一藥物分子復(fù)合物中，所述的抗腫瘤藥物分子是能通過物 理吸附作用結(jié)合靶向納米載體CQDs- PEG-Tf的藥物分子。
[0023] 含有CQDs-PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物的免疫細(xì)胞一 CQDs-PEG-Tf 一藥物分子 復(fù)合物，采用如下制備方法制成:首先按照每種類型的免疫細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法對(duì)免疫細(xì) 胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴(kuò)增獲得免疫細(xì)胞，在獲得的免疫細(xì)胞中加入CQDs-PEG-Tf 一藥 物分子復(fù)合物共同孵育，得到免疫細(xì)胞內(nèi)吞碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-藥物分子復(fù)合 物，即免疫細(xì)胞一 CQDs - PEG-Tf 一藥物分子。
[0024] 所述的免疫細(xì)胞一CQDs-TOG-Tf一藥物分子復(fù)合物中：制備過程中所加入的 CQDs-PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物濃度為40-100yg/mL，所述的免疫細(xì)胞，包括樹突狀細(xì)胞 (dendritic cells，DC)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)、自然殺傷細(xì)胞 (natural killer cell，NK)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer，CIK) 或腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)，其濃度為105_108/ml〇 [0025]本發(fā)明提供了輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系CQDs-PEG-Tf在制備抗腫 瘤藥物中的應(yīng)用。
[0026]本發(fā)明提供了CQDs-PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng) 用。
[0027]本發(fā)明提供了輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的免疫細(xì)胞一 CQDs-PEG- Tf復(fù)合物在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明提供了輔助免疫細(xì)胞療法的免疫細(xì)胞一 CQDs-PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物 在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用。
[0029]本發(fā)明的機(jī)理為：
[0030]本發(fā)明所制成的碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs - PEG-Tf)，一方面具有碳 量子點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)，即可透過毛細(xì)血管和跨越血腦屏障等機(jī)體屏障，提高藥物分子的穩(wěn)定性，延 長藥物分子在體內(nèi)的半衰期，通過被動(dòng)靶向作用增強(qiáng)靶細(xì)胞對(duì)藥物分子的攝取率。另一方 面利用轉(zhuǎn)鐵蛋白的主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞的作用，即可實(shí)現(xiàn)藥物分子經(jīng)循細(xì)胞膜上的TfR選擇 性的靶向于過表達(dá)TfR的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，殺傷腫瘤細(xì)胞，可有效避免藥物分子對(duì)正常組織的毒 副作用。碳量子點(diǎn)表面易修飾，在其表面修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白后可實(shí)現(xiàn)藥物分子的被動(dòng)和主動(dòng)靶 向性。碳量子點(diǎn)表面含有大量的羥基和羧基等官能團(tuán)，聚乙二醇作為橋梁，其一端可與碳量 子點(diǎn)上羧基形成酯基，另一端被羧基化后可與轉(zhuǎn)鐵蛋白上的氨基結(jié)合形成碳量子點(diǎn)-聚乙 二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs-PEG-Tf)。利用聚乙二醇作為交聯(lián)劑，實(shí)現(xiàn)碳量子點(diǎn)與轉(zhuǎn)鐵蛋白共 價(jià)偶聯(lián)，可避免轉(zhuǎn)鐵蛋白直接與碳量子點(diǎn)連接產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)。
[0031] 本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢：
[0032] 1)本發(fā)明的優(yōu)勢是納米材料碳量子點(diǎn)具有生物可降解性、生物相容性好、低毒性、 熒光強(qiáng)度高、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、表面易修飾及較高的親和力等諸多優(yōu)點(diǎn)，利用其作為載體可保 護(hù)藥物分子不被機(jī)體血漿或組織細(xì)胞中多種酶類的破壞，可跨越肺毛細(xì)血管、血腦屏障及 其他機(jī)體屏障將藥物分子的輸送至治療部位，可控制藥物分子在靶點(diǎn)部位的緩釋作用。
[0033] 2)轉(zhuǎn)鐵蛋白作為靶向分子，由于其受體在腫瘤細(xì)胞表面過量表達(dá)，利用轉(zhuǎn)鐵蛋白 與其受體的特異性識(shí)別作用可進(jìn)一步提高藥物分子的靶向性。因此通過轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾碳量 子點(diǎn)可形成具有緩釋作用、高度靶向性和生物兼容性好的靶向納米載體。利用該靶向納米 載藥體系介導(dǎo)藥物分子可實(shí)現(xiàn)藥物分子雙重靶向治療位點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)藥物分子的高度選擇靶 向腫瘤組織和病變組織，減少對(duì)正常組織器官的毒副作用，進(jìn)一步提高腫瘤治療效果。 [0034] 3)利用免疫細(xì)胞的腫瘤趨化作用及腫瘤殺譜廣等特性聯(lián)合靶向納米載藥體系 CQDs - PEG-Tf的特異性識(shí)別腫瘤及其靶向藥物的作用，可實(shí)現(xiàn)雙重抗腫瘤效應(yīng)，可彌補(bǔ)現(xiàn) 有免疫細(xì)胞治療技術(shù)的不足之處。
【附圖說明】
[0035]圖1為靶向納米載體CQDs-PEG-Tf的結(jié)構(gòu)模擬示意圖。
[0036]圖2為CQDs-PEG-Tf 一 MMC復(fù)合物1#對(duì)體外培養(yǎng)免疫細(xì)胞(CIK)存活率的影響結(jié) 果分析。
[0037]圖3為CQDs-PEG-Tf 一 MMC復(fù)合物2#對(duì)體外培養(yǎng)免疫細(xì)胞(CIK)存活率的影響結(jié) 果分析。
[0038]圖4為CQDs-PEG-Tf 一 MMC復(fù)合物3#對(duì)體外培養(yǎng)免疫細(xì)胞(CIK)存活率的影響結(jié) 果分析。
[0039] 圖 5為CQDs-PEG-Tf 1# 和CIK 一 CQDs-PEG-Tf 1# 作用于 HepG2細(xì)胞和 L-02細(xì)胞 的流式檢測圖。
[0040] 圖6為CQDs-PEG-Tf 2#和CIK一CQDs-PEG-Tf 2#作用于HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞 的流式檢測圖。
[0041 ]圖7為CQDs-PEG-Tf 3#和CIK一CQDs-PEG-Tf 3#作用于HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞 的流式檢測圖。
[0042] 圖8為靶向納米載體CQDs-PEG-Tf 1#進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的吸收機(jī)理圖。
[0043] 圖9為靶向納米載體CQDs-PEG-Tf 2#進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的吸收機(jī)理圖。
[0044] 圖10為靶向納米載體CQDs-PEG-Tf 3#進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的吸收機(jī)理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí) 施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0046] 實(shí)施例1
[0047]本發(fā)明的所述的革El向納米載藥體系是以納米材料碳量子點(diǎn)CQDs為載體，聚乙二醇 PEG為交聯(lián)物，轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf為靶向分子，通過共價(jià)偶聯(lián)形成的靶向納米載體CQDs-PEG-Tf， 其粒徑大小為224.5 ± 90.2nm。結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0048] 其制備過程如下：
[0049] (1)載體碳量子點(diǎn)-聚乙二醇(CQDs-PEG-OH)的制備
[0050] 取0.2g抗壞血酸溶于2mL超純水中，磁力攪拌15min，形成透明均勻的溶液后，加入 4mL PEG-200攪拌20min，使用微波功率200W，設(shè)定溫度60°C，微波反應(yīng)80s，將所得溶液用溶 劑過濾器過濾，并在透析袋(截留分子量8000)中進(jìn)行洗滌和純化，即得碳量子點(diǎn)水溶液。所 得的碳量子點(diǎn)水溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸除大部分溶劑后，于真空干燥箱中35-65Γ烘干;得 到碳量子點(diǎn)。
[0051 ] 取干燥后的碳量子點(diǎn)30.85mg，加入到3mL無水DMF中，超聲分散形成懸濁液后，立 即加入到12mL重蒸的SOCl2中，65°C回流反應(yīng)20h。反應(yīng)結(jié)束，旋蒸除去過量的SOCl2;得到酰 氯化的碳量子點(diǎn)。
[0052] 將所得的酰氯化碳量子點(diǎn)加入到15mL無水DMF中，并加入聚乙二醇（PEGn1500 ) 61.70mg，三乙胺1.5mL，100°C攪拌反應(yīng)20h。反應(yīng)結(jié)束，產(chǎn)物經(jīng)2000rmp離心10min，超純水洗 滌6次，除去上清液，得碳量子點(diǎn)-聚乙二醇(CQDs - PEG-OH)，真空干燥。
[0053] (2)靶向納米載體碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs-PEG-Tf )1#的制備
[0054] 取干燥的碳量子點(diǎn)-聚乙二醇（CQDs-PEG-OH)20.22mg于40mL DMF中，超聲分散 20min后，加入琥?自酸酐40.44mg，4-二甲氨基吡啶40.44mg，于100 °C下反應(yīng)20h。反應(yīng)結(jié)束， 2000rmp離心I Omin，超純水洗滌6次，除去上清液得CQDs -PEG一COOH，真空干燥I Oh。
[0055] 取干燥后的CQDs-PEG-COOH 2.Omg于0.8mL pH=8.0的硼酸緩沖液中，超聲分散 20min后，加入EDC 4.4mg，反應(yīng)20min后，加入轉(zhuǎn)鐵蛋白O . 62mg，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)IOh后， 2000rmp離心10min，超純水洗滌6次，除去上清液，得碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs- PEG-Tf)，4°C冷藏。
[0056]采用考馬斯亮藍(lán)G250試劑(Bradford)測定反應(yīng)后上清液中轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf)的含量 來計(jì)算碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白上Tf的偶聯(lián)量，方法為：反應(yīng)前的Tf量減去反應(yīng)后上 清液中的Tf量，即為碳量子點(diǎn)-聚乙二醇偶聯(lián)的轉(zhuǎn)鐵蛋白含量，計(jì)算后得，每毫克碳量子點(diǎn)-聚乙^?醇偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量為282yg。
[0057] (3)碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-絲裂霉素復(fù)合物(CQDs-PEG-Tf 一 MMC)1#的 制備(絲裂霉素為抗癌藥物分子）
[0058] 取3mg干燥的CQDs-PEG-Tf加入4mL超純水，超聲分散25min形成懸濁液，加入40μ 區(qū)絲裂霉素(1:11:〇1115^;[11，匪0，室溫下?lián)u211，20001'11^1離心15111；[11，超純水洗滌6次，除去上清 液，得到沉淀物碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-絲裂霉素(CQDs-PEG-Tf 一 MMC )，4 °C冷藏。 采用紫外可見光譜檢測MMC 365nm峰位處的吸光度，計(jì)算MMC的吸附量，經(jīng)計(jì)算獲得每毫克 CQDs - PEG-Tf 吸附 MMC約 4 · 6yg。
[0059] (4)免疫細(xì)胞-碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-藥物分子復(fù)合物（免疫細(xì)胞一 CQDs - PEG-Tf 一藥物分子）1 #的制備
[0060] 將體外經(jīng)免疫細(xì)胞特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增得到的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷 (cytokine-induced killer，CIK)細(xì)胞與40yg/mL的CQDs-PEG一Tf一MMC繼續(xù)共同孵育4h， CIK細(xì)胞濃度為105/ml，得到CIK 一 CQDs-PEG-Tf 一 MMC復(fù)合物。
[00611 (5)免疫細(xì)胞-碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物(免疫細(xì)胞一 CQDs-PEG-Tf) 1#的制備
[0062] 將體外經(jīng)免疫細(xì)胞特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增得到的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞CIK與 40yg/mL的CQDs-PEG-Tf 繼續(xù)共同孵育4h，CIK細(xì)胞濃度為 105/ml，得到CIK一CQDs-PEG- Tf復(fù)合物。
[0063] 實(shí)施例2
[0064]本發(fā)明的所述的革El向納米載藥體系是以納米材料碳量子點(diǎn)CQDs為載體，聚乙二醇 PEG為交聯(lián)物，轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf為靶向分子，通過共價(jià)偶聯(lián)形成的靶向納米載體CQDs-PEG-Tf， 其粒徑大小為224.5 ± 90.2nm。結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0065] 其制備過程如下：
[0066] (1)載體碳量子點(diǎn)-聚乙二醇(CQDs-PEG-OH)的制備
[0067] 取0.2g抗壞血酸溶于2mL超純水中，磁力攪拌15min，形成透明均勻的溶液后，加入 4mL PEG-200攪拌20min，使用微波功率300W，設(shè)定溫度85°C，微波反應(yīng)140s，將所得溶液用 溶劑過濾器過濾，并在透析袋(截留分子量8000)中進(jìn)行洗滌和純化，即得碳量子點(diǎn)水溶液。 所得的碳量子點(diǎn)水溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸除大部分溶劑后，于真空干燥箱中35-65Γ烘干； 得到碳量子點(diǎn)。
[0068] 取干燥后的碳量子點(diǎn)30.85mg，加入至lj5mL無水DMF中，超聲分散形成懸濁液后，立 即加入到15mL重蒸的SOCl2中，70°C回流反應(yīng)20h。反應(yīng)結(jié)束，旋蒸除去過量的SOCl2;得到酰 氯化的碳量子點(diǎn)。
[0069] 將所得的酰氯化碳量子點(diǎn)加入到20mL無水DMF中，并加入聚乙二醇（PEGn1500 ) 69.41mg，三乙胺2.2mL，100°C攪拌反應(yīng)20h。反應(yīng)結(jié)束，產(chǎn)物經(jīng)2000rmp離心10min，超純水洗 滌6次，除去上清液，得碳量子點(diǎn)-聚乙二醇(CQDs - PEG-OH)，真空干燥。
[0070] (2)靶向載體碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs-PEG-Tf )2#的制備
[0071] 取干燥的碳量子點(diǎn)-聚乙二醇（CQDs-PEG-OH)20.22mg于50mL DMF中，超聲分散 20min后，加入琥珀酸酐40.55mg，4-二甲氨基吡啶40.64mg，于100 °C下反應(yīng)20h。反應(yīng)結(jié)束， 2000rmp離心I Omin，超純水洗滌6次，除去上清液得CQDs -PEG一COOH，真空干燥I Oh。
[0072] 取干燥后的CQDs-PEG-⑶OH 2.0mg于ImL ρΗ = 8·0的硼酸緩沖液中，超聲分散 20min后，加入EDC 5. Omg，反應(yīng)20min后，加入Tf 1.32mg，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20h后，2000rmp離心 15min，超純水洗滌6次，除去上清液，得碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs-PEG-Tf)，4 C冷減。
[0073]采用考馬斯亮藍(lán)G250試劑(Bradford)測定反應(yīng)后上清液中轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf)的含量 來計(jì)算碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白上Tf的偶聯(lián)量，方法為：反應(yīng)前的Tf量減去反應(yīng)后上 清液中的Tf量，即為碳量子點(diǎn)-聚乙二醇偶聯(lián)的轉(zhuǎn)鐵蛋白含量，計(jì)算后得，每毫克碳量子點(diǎn)-聚乙^?醇偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量為294yg。
[0074] (3)碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-絲裂霉素復(fù)合物(CQDs-PEG-Tf 一 MMC) 2#的 制備(絲裂霉素為抗癌藥物分子）
[0075] 取3mg干燥的CQDs-PEG-Tf加入4mL超純水，超聲分散25min形成懸濁液，加入80μ g MMC，室溫下?lián)u2h，2000rmp離心15min，超純水洗滌6次，除去上清液，得到沉淀物碳量子 點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-絲裂霉素(CQDs-PEG-Tf一MMC)，4°C冷藏。采用紫外可見光譜檢 測麗C 365nm峰位處的吸光度，計(jì)算MMC的吸附量，經(jīng)計(jì)算獲得每毫克CQDs-PEG-Tf吸附 MMC約 9.8yg。
[0076] (4)免疫細(xì)胞-碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-藥物分子復(fù)合物(免疫細(xì)胞+CQDs- PEG-Tf 一藥物分子)2#的制備
[0077]將體外經(jīng)免疫細(xì)胞特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增得到的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷 (cytokine-induced killer，CIK)細(xì)胞與70yg/mL的CQDs-PEG一Tf一MMC繼續(xù)共同孵育4h， CIK細(xì)胞濃度為l〇Vml，得到CIK 一 CQDs-PEG-Tf 一 MMC復(fù)合物。
[0078] (5)免疫細(xì)胞-碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物(免疫細(xì)胞一 CQDs-PEG-Tf) 2#的制備
[0079] 將體外經(jīng)免疫細(xì)胞特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增得到的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞CIK與 70yg/mL的CQDs-PEG-Tf 繼續(xù)共同孵育4h，CIK細(xì)胞濃度為IOVml，得到CIK一CQDs-PEG- Tf復(fù)合物。
[0080] 實(shí)施例3
[0081 ]本發(fā)明的所述的革El向納米載藥體系是以納米材料碳量子點(diǎn)CQD S為載體，聚乙二醇 PEG為交聯(lián)物，轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf為靶向分子，通過共價(jià)偶聯(lián)形成的靶向納米載體CQDs-PEG-Tf， 其粒徑大小為224.5 ± 90.2nm。結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0082] 其制備過程如下：
[0083] (1)載體碳量子點(diǎn)-聚乙二醇(CQDs-PEG-OH)的制備
[0084] 取0.2g抗壞血酸溶于2mL超純水中，磁力攪拌15min，形成透明均勻的溶液后，加入 4mL PEG-200攪拌20min，使用微波功率400W，設(shè)定溫度100°C，微波反應(yīng)200s，將所得溶液用 溶劑過濾器過濾，并在透析袋(截留分子量8000)中進(jìn)行洗滌和純化，即得碳量子點(diǎn)水溶液。 所得的碳量子點(diǎn)水溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸除大部分溶劑后，于真空干燥箱中35-65Γ烘干； 得到碳量子點(diǎn)。
[0085] 取干燥后的碳量子點(diǎn)30.85mg，加入至lj6mL無水DMF中，超聲分散形成懸濁液后，立 即加入到18mL重蒸的SOCl2中，70°C回流反應(yīng)20h。反應(yīng)結(jié)束，旋蒸除去過量的SOCl2;得到酰 氯化的碳量子點(diǎn)。
[0086] 將所得的酰氯化碳量子點(diǎn)加入到24mL無水DMF中，并加入聚乙二醇（PEGn1500 ) 77.13mg，三乙胺3mL，100°C攪拌反應(yīng)20h。反應(yīng)結(jié)束，產(chǎn)物經(jīng)2000rmp離心10min，超純水洗滌 6次，除去上清液，得碳量子點(diǎn)-聚乙二醇(CQDs - PEG-OH)，真空干燥。
[0087] (2)靶向納米載體碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs-PEG-Tf )3#的制備
[0088] 取干燥的碳量子點(diǎn)-聚乙二醇（CQDs-PEG-OH)20.22mg于60mL DMF中，超聲分散 20min后，加入琥珀酸酐50.55mg，4_二甲氨基吡啶50.55mg，于100°C下反應(yīng)20h。反應(yīng)結(jié)束， 2000rmp離心I Omin，超純水洗滌6次，除去上清液得CQDs -PEG一COOH，真空干燥I Oh。
[0089] 取干燥后的CQDs-PEG-COOH 2.Omg于1.2mL pH=8.0的硼酸緩沖液中，超聲分散 20min后，加入EDC 4.8mg，反應(yīng)20min后，加入轉(zhuǎn)鐵蛋白2 . OOmg，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)IOh后， 2000rmp離心10min，超純水洗滌6次，除去上清液，得碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs- PEG-Tf)，4°C冷藏。
[0090] 采用考馬斯亮藍(lán)G250試劑(Bradford)測定反應(yīng)后上清液中轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf)的含量 來計(jì)算碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白上Tf的偶聯(lián)量，方法為：反應(yīng)前的Tf量減去反應(yīng)后上 清液中的Tf量，即為碳量子點(diǎn)-聚乙二醇偶聯(lián)的轉(zhuǎn)鐵蛋白含量，計(jì)算后得，每毫克碳量子點(diǎn)-聚乙^?醇偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量為316yg。
[0091] (3)碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-絲裂霉素復(fù)合物(CQDs-PEG-Tf 一 MMC) 3#的 制備(絲裂霉素為抗癌藥物分子）
[0092] 取3mg干燥的CQDs-PEG-Tf加入4mL超純水，超聲分散25min形成懸濁液，加入120 yg MMC，室溫下?lián)u2h，2000rmp離心15min，超純水洗滌6次，除去上清液，得到沉淀物碳量子 點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白一絲裂霉素 (CQDs-PEG-Tf 一 MMC)，4 °C冷藏。采用紫外可見光譜檢 測麗C 365nm峰位處的吸光度，計(jì)算MMC的吸附量，經(jīng)計(jì)算獲得每毫克CQDs-PEG-Tf吸附 MMC約10.2yg。
[0093] (4)免疫細(xì)胞-碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-藥物分子復(fù)合物（免疫細(xì)胞一 CQDs - PEG-Tf 一藥物分子)3#的制備
[0094] 將體外經(jīng)免疫細(xì)胞特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增得到的免疫細(xì)胞為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺 傷細(xì)胞(cytokine-induced killer，CIK)與 100yg/mL的CQDs-PEG一Tf一MMC繼續(xù)共同孵育 4h，CIK細(xì)胞濃度為 108/ml，得到CIK一CQDs-PEG-Tf一MMC復(fù)合物。
[0095] (5)免疫細(xì)胞-碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物(免疫細(xì)胞一 CQDs-PEG-Tf) 3#的制備
[0096]將體外經(jīng)免疫細(xì)胞特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增得到的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞CIK與 100yg/mL的CQDs - PEG-Tf繼續(xù)共同孵育4h，CIK細(xì)胞濃度為108/ml，得到CIK 一 CQDs - PEG-Tf復(fù)合物。
[0097] 實(shí)施例4碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-絲裂霉素復(fù)合物(CQDs-PEG-Tf-MMC) 1#對(duì)免疫細(xì)胞(CIK)的活性影響
[0098] 采用CCK8毒性試驗(yàn)檢測實(shí)施例1制備的CQDs-PEG-Tf 一 MMC 1#對(duì)免疫細(xì)胞(CIK) 活性的影響。CCK8毒性試驗(yàn)是將不同濃度的CQDs-PEG-Tf 一 MMC與CIK共培養(yǎng)，不同時(shí)間段 檢測CIK存活率的變化。以CQDs - PEG-Tf 一 MMC和CIK共培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)組，不加入CQDs - PEG- Tf一MMC培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組平行重復(fù)5次。取約I X IO5細(xì)胞接種96孔板 中，添加淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)液及因子IFN- γ，5 %⑶2，37°C環(huán)境下培養(yǎng)，24h后加入因子 IL-2和抗⑶3單抗繼續(xù)培養(yǎng)5d，除空白對(duì)照外，其余每個(gè)孔加入含的50yg/mL CQDs-PEG- Tf 一 MMC的培液IOOyL共培養(yǎng)3h，每孔更換新鮮培液IOOyL，持續(xù)培養(yǎng)5d，每天定時(shí)檢測并記 錄細(xì)胞的吸光值:每孔加入IOyL WST-8溶液，孵育Ih后，選擇480nm的波長，在酶標(biāo)儀上測定 各孔的光吸收值并計(jì)算5個(gè)平行孔的平均值，結(jié)果見圖2。存活率計(jì)算公式如下：
[0099] 存活率（％ ) =A48Q(實(shí)驗(yàn)組)/A48Q(對(duì)照組）X 100
[0100]圖2為CQDs-PEG-Tf一MMC復(fù)合物對(duì)體外培養(yǎng)免疫細(xì)胞(CIK)增殖的影響。由圖可 見，CQDs-PEG-Tf 一 MMC低于100yg/mL對(duì)細(xì)胞幾乎沒有毒性作用。但是，CIK對(duì)于CQDs- PEG-Tf 一 MMC在第一天產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，約30%CIK發(fā)生凋亡，隨后的四天，CIK以約5%的速 率擴(kuò)增并在第五天達(dá)到90%以上的存活率。因此，一定濃度下的CQDs-PEG-Tf一MMC具有 良好的生物安全性。
[0101] 實(shí)施例5碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-絲裂霉素復(fù)合物(CQDs-PEG-Tf-MMC) 2#對(duì)免疫細(xì)胞(CIK)的活性影響
[0102] 采用CCK8毒性試驗(yàn)檢測實(shí)施例2制備的CQDs-PEG-Tf一MMC 2#對(duì)免疫細(xì)胞(CIK) 活性的影響。CCK8毒性試驗(yàn)是將不同濃度的CQDs-PEG-Tf 一 MMC與CIK共培養(yǎng)，不同時(shí)間段 檢測CIK存活率的變化。以CQDs - PEG-Tf 一 MMC和CIK共培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)組，不加入CQDs - PEG- Tf一MMC培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組平行重復(fù)5次。取約I X IO5細(xì)胞接種96孔板 中，添加淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)液及因子IFN- γ，5 %⑶2，37°C環(huán)境下培養(yǎng)，24h后加入因子 IL-2和抗⑶3單抗繼續(xù)培養(yǎng)5d，除空白對(duì)照外，其余每個(gè)孔加入含的50yg/mL CQDs-PEG- Tf 一 MMC的培液IOOyL共培養(yǎng)3h，每孔更換新鮮培液IOOyL，持續(xù)培養(yǎng)5d，每天定時(shí)檢測并記 錄細(xì)胞的吸光值:每孔加入IOyL WST-8溶液，孵育Ih后，選擇480nm的波長，在酶標(biāo)儀上測定 各孔的光吸收值并計(jì)算5個(gè)平行孔的平均值，結(jié)果見圖3。存活率計(jì)算公式如下：
[0103] 存活率（％)=A48Q(實(shí)驗(yàn)組)/A48Q(對(duì)照組）XlOO
[0104] 圖3為CQDs-PEG-Tf 一MMC復(fù)合物對(duì)體外培養(yǎng)免疫細(xì)胞(CIK)增殖的影響。由圖可 見，CQDs-PEG-Tf 一 MMC低于100yg/mL對(duì)細(xì)胞幾乎沒有毒性作用。但是，CIK對(duì)于CQDs- PEG-Tf 一 MMC在第一天產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，約30%CIK發(fā)生凋亡，隨后的四天，CIK以約5%的速 率擴(kuò)增并在第五天達(dá)到90%以上的存活率。因此，一定濃度下的CQDs-PEG-Tf一MMC具有 良好的生物安全性。
[0105] 實(shí)施例6碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-絲裂霉素復(fù)合物(CQDs-PEG-Tf-MMC) 3#對(duì)免疫細(xì)胞(CIK)的活性影響
[0106] 采用CCK8毒性試驗(yàn)檢測實(shí)施例3制備的CQDs-PEG-Tf一MMC 3#對(duì)免疫細(xì)胞(CIK) 活性的影響。CCK8毒性試驗(yàn)是將不同濃度的CQDs-PEG-Tf 一 MMC與CIK共培養(yǎng)，不同時(shí)間段 檢測CIK存活率的變化。以CQDs - PEG-Tf 一 MMC和CIK共培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)組，不加入CQDs - PEG- Tf一MMC培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組平行重復(fù)5次。取約I X IO5細(xì)胞接種96孔板 中，添加淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)液及因子IFN- γ，5 %⑶2，37°C環(huán)境下培養(yǎng)，24h后加入因子 IL-2和抗⑶3單抗繼續(xù)培養(yǎng)5d，除空白對(duì)照外，其余每個(gè)孔加入含50yg/mL CQDs-PEG- Tf 一 MMC (實(shí)施例3制備所得)的培液I OOyL共培養(yǎng)3h，每孔更換新鮮培液I OOyL，持續(xù)培養(yǎng)5d， 每天定時(shí)檢測并記錄細(xì)胞的吸光值:每孔加入IOyL WST-8溶液，孵育Ih后，選擇480nm的波 長，在酶標(biāo)儀上測定各孔的光吸收值并計(jì)算5個(gè)平行孔的平均值，結(jié)果見圖4。存活率計(jì)算公 式如下：
[0107] 存活率（％)=A48Q(實(shí)驗(yàn)組)/A48Q(對(duì)照組）XlOO
[0108] 圖4為CQDs-PEG-Tf一MMC復(fù)合物對(duì)體外培養(yǎng)免疫細(xì)胞(CIK)增殖的影響。由圖可 見，CQDs-PEG-Tf 一 MMC低于100yg/mL對(duì)細(xì)胞幾乎沒有毒性作用。但是，CIK對(duì)于CQDs- PEG-Tf 一 MMC在第一天產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，約30%CIK發(fā)生凋亡，隨后的四天，CIK以約5%的速 率擴(kuò)增并在第五天達(dá)到90%以上的存活率。因此，一定濃度下的CQDs-PEG-Tf一MMC具有 良好的生物安全性。此外，比較CQDs-PEG-Tf一MMCl#、CQDs-PEG-Tf一MMC 2#和CQDs- PEG-Tf一MMC 3#對(duì)CIK的活性影響，發(fā)現(xiàn)這三種載體對(duì)CIK活性的影響無明顯差異，說明一 定范圍內(nèi)的載體粒徑大小以及載體上偶聯(lián)的轉(zhuǎn)鐵蛋白量對(duì)CIK的活性影響不大。
[0109] 實(shí)施例7靶向納米載體碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs-PEG-Tf )1#和免疫 細(xì)胞CIK-碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CIK一CQDs-PEG-Tf) 1#進(jìn)入體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞 !fepG2和正常肝細(xì)胞L-02量的差異
[0110] 取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞以6 X IO3/孔的密度分別接種于90mm培養(yǎng) 皿中，培養(yǎng)24h后，棄液，PBS洗滌，在HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞中均分別加入實(shí)施例1制備的 CQDs-PEG-Tf(100yg/mL) 1# 和 CIK 一 CQDs-PEG-Tf(100yg/mL) 1# 于 37 °C 孵育 4h，孵育完 畢，PBS洗滌，上流式細(xì)胞儀測定其熒光強(qiáng)度(380nm激發(fā)波長，發(fā)射波長468nm)，結(jié)果見圖5〇
[0111] 圖5為CQDs- PEG-Tf和CIK 一CQDs- PEG-Tf作用于HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞的流式 檢測圖，縱坐標(biāo)為CQDs-PEG-Tf和CIK一CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。由圖可知， CQDs - PEG-Tf和CIK-CQDs-PEG-Tf與兩種細(xì)胞作用4h后，熒光強(qiáng)度均比細(xì)胞自發(fā)熒光強(qiáng) 度大，且CIK 一 CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的量明顯高于CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的量，說明 CQDs - PEG-Tf載體具有靶向特性，且利用其聯(lián)合免疫細(xì)胞CIK的腫瘤趨化作用可高效靶向 腫瘤細(xì)胞。此外，CQDs-PEG-Tf和CIK 一 CQDs-PEG-Tf進(jìn)入HepG2細(xì)胞的量均明顯高于進(jìn) 入L-02細(xì)胞的量，這是因?yàn)镠印G2細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體高于L-02細(xì)胞表面的受體。
[0112] 實(shí)施例8靶向納米載體碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs-PEG-Tf )2#和免疫 細(xì)胞CIK-碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CIK一CQDs-PEG-Tf )2#進(jìn)入體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞 !fepG2和正常肝細(xì)胞L-02量的差異
[0113] 取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞以6 X IO3/孔的密度分別接種于90mm培養(yǎng) 皿中，培養(yǎng)24h后，棄液，PBS洗滌，在HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞中均分別加入實(shí)施例2制備的 CQDs-PEG-Tf(100yg/mL) 2# 和 CIK 一 CQDs-PEG-Tf(100yg/mL) 2# 于 37 °C 孵育 4h，孵育完 畢，PBS洗滌，上流式細(xì)胞儀測定其熒光強(qiáng)度(380nm激發(fā)波長，發(fā)射波長468nm)，結(jié)果見圖6〇
[0114] 圖6為CQDs- PEG-Tf和CIK 一CQDs- PEG-Tf作用于HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞的流式 檢測圖，縱坐標(biāo)為CQDs-PEG-Tf 一MMC和CIK一CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。由圖 可知，CQDs-PEG-Tf和CIK 一 CQDs-PEG-Tf與兩種細(xì)胞作用4h后，熒光強(qiáng)度均比細(xì)胞自發(fā) 熒光強(qiáng)度大，且CIK 一 CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的量明顯高于CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的量， 說明CQDs-PEG-Tf載體具有靶向特性，且利用其聯(lián)合免疫細(xì)胞CIK的腫瘤趨化作用可高效 靶向腫瘤細(xì)胞。此外，CQDs-PEG-Tf和CIK 一 CQDs-PEG-Tf進(jìn)入HepG2細(xì)胞的量均明顯高 于進(jìn)入L-02細(xì)胞的量，這是因?yàn)镠epG2細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體高于L-02細(xì)胞表面的受體。 相比于 CQDs-PEG-Tfli^PCIK-CQDs-PEG-Tfl#，CQDs-PEG-Tf2i^PCIK-CQDs-PEG- Tf2#進(jìn)入細(xì)胞的量較高，這可能是因?yàn)檩d體上偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量增加，促進(jìn)了載體與細(xì) 胞上過表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體接觸，從而提高細(xì)胞對(duì)載體的攝取。
[0115] 實(shí)施例9靶向納米載體碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs-PEG-Tf )3#和免疫 細(xì)胞CIK-碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CIK一CQDs-PEG-Tf )3#進(jìn)入體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞 !fepG2和正常肝細(xì)胞L-02量的差異
[0116] 取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞以6 X IO3/孔的密度分別接種于90mm培養(yǎng) 皿中，培養(yǎng)24h后，棄液，PBS洗滌，在HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞中均分別加入實(shí)施3制備所得的 CQDs-PEG-Tf (lOOyg/mL) 3# 和 CIK 一 CQDs-PEG-Tf (100yg/mL) 3# 于 37 °C 孵育 4h，孵育完 畢，PBS洗滌，上流式細(xì)胞儀測定其熒光強(qiáng)度(380nm激發(fā)波長，發(fā)射波長468nm)，結(jié)果見圖7〇
[0117] 圖7為CQDs- PEG-Tf和CIK 一CQDs- PEG-Tf作用于HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞的流式 檢測圖，縱坐標(biāo)為CQDs-PEG-Tf和CIK一CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。由圖可知， CQDs-PEG-Tf和CIK一CQDs-PEG-Tf與兩種細(xì)胞作用4h后，焚光強(qiáng)度均比細(xì)胞自發(fā)熒光 強(qiáng)度大，且CIK 一 CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的量明顯高于CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的量，說明 CQDs - PEG-Tf載體具有靶向特性，且利用其聯(lián)合免疫細(xì)胞CIK的腫瘤趨化作用可高效靶向 腫瘤細(xì)胞。此外，CQDs-PEG-Tf和CIK 一 CQDs-PEG-Tf進(jìn)入HepG2細(xì)胞的量均明顯高于進(jìn) 入L-02細(xì)胞的量，這是因?yàn)镠印G2細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體高于L-02細(xì)胞表面的受體。比較 CQDs-PEG-Tf 1#和CIK一CQDs-PEG-Tf 1#，CQDs-PEG-Tf 2#和CIK一CQDs-PEG-Tf 2#以及CQDs-PEG-Tf 3#和CIK一CQDs-PEG-Tf 3#與細(xì)胞作用后的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn) CQDs-PEG-Tf 3#和CIK一CQDs - PEG-Tf 3#的熒光強(qiáng)度較前兩者的高，說明CQDs - PEG- Tf 3#和CIK一CQDs-PEG-Tf 3#進(jìn)入細(xì)胞的量更高，且隨著載體上偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量增 加，!fepG2細(xì)胞對(duì)載體的攝入量也隨之增加。
[0118] 實(shí)施例10定量檢測體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞對(duì)碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs- PEG-Tf) 1 #攝取的靶向分析
[0119] 為了進(jìn)一步確定實(shí)施例1制備的載體CQDs-PEG-Tf 1#具有靶向性，我們采用游離 的轉(zhuǎn)鐵蛋白作競爭劑。通過該方法可證明CQDs-PEG-Tf是通過腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵 蛋白受體(TfR)介導(dǎo)的途徑。轉(zhuǎn)鐵蛋白有三種構(gòu)型：人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（h-Tf)、鐵飽和的轉(zhuǎn)鐵 蛋白（holo-Tf)、未含鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（apo-Tf)，這三種構(gòu)型的轉(zhuǎn)鐵蛋白與其受體的親和力也有 很大差異:鐵飽和的轉(zhuǎn)鐵蛋白與其受體的親和力最大，人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白次之，未含鐵轉(zhuǎn)鐵蛋 白的親和力最弱。由于載體CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的時(shí)間要明顯比游離的轉(zhuǎn)鐵蛋白慢，所 以為了使細(xì)胞外有足夠的含F(xiàn)e 3+形式的轉(zhuǎn)鐵蛋白與TfR結(jié)合，占據(jù)TfR位點(diǎn)，達(dá)到與載體 CQDs - PEG-Tf競爭TfR，我們選擇過表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的H印G2細(xì)胞作為靶細(xì)胞。
[0120] (1)首先取對(duì)數(shù)生長的HepG2細(xì)胞6 X 103/孔的密度接種于90mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h 后，棄液，PBS洗滌，加入不同濃度的游離轉(zhuǎn)鐵蛋白（I50yg/mL、350yg/mL和1.5mg/mL)和0.12 ymol/mL Fe3+于37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ih后，加入實(shí)施例1制備所得的CQDs - PEG-Tf (100yg/mL)繼續(xù)孵育 4h;
[0121] (2)HepG2細(xì)胞中僅加入實(shí)施例1制備所得的CQDs-PEG-Tf(100yg/mL)繼續(xù)孵育 4h作為對(duì)照組；
[0122] (3)孵育完畢，PBS洗滌，采用流式儀檢測其熒光強(qiáng)度（380nm激發(fā)波長，接受波長 468nm)，結(jié)果見圖8〇
[0123] 圖8為考察靶向納米載體CQDs-PEG-Tf是否以腫瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo) 的途徑進(jìn)入細(xì)胞。結(jié)果顯示，未加入Fe 3+，即使游離轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度不斷增加也未能影響載 體CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞，而當(dāng)溶液中含F(xiàn)e3+時(shí)，隨著游離轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度的增加，HepG2細(xì) 胞對(duì)載體CQDs - PEG-Tf的吸收抑制程度越大，當(dāng)游離轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為1.5mg/mL時(shí)，細(xì)胞吸 收抑制率約達(dá)82%。由此說明靶向納米載體CQDs-PEG-Tf是通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)作用 進(jìn)入細(xì)胞。
[0124] 實(shí)施例11定量檢測體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞對(duì)碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs- PEG-Tf) 2#攝取的靶向分析
[0125] 為了進(jìn)一步確定實(shí)施例2制備的載體CQDs-PEG-Tf2#具有靶向性，我們采用游離 的轉(zhuǎn)鐵蛋白作競爭劑。通過該方法可證明CQDs-PEG-Tf是通過腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵 蛋白受體(TfR)介導(dǎo)的途徑。轉(zhuǎn)鐵蛋白有三種構(gòu)型：人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（h-Tf)、鐵飽和的轉(zhuǎn)鐵 蛋白（holo-Tf)、未含鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（apo-Tf)，這三種構(gòu)型的轉(zhuǎn)鐵蛋白與其受體的親和力也有 很大差異:鐵飽和的轉(zhuǎn)鐵蛋白與其受體的親和力最大，人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白次之，未含鐵轉(zhuǎn)鐵蛋 白的親和力最弱。由于載體CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的時(shí)間要明顯比游離的轉(zhuǎn)鐵蛋白慢，所 以為了使細(xì)胞外有足夠的含F(xiàn)e 3+形式的轉(zhuǎn)鐵蛋白與TfR結(jié)合，占據(jù)TfR位點(diǎn)，達(dá)到與載體 CQDs - PEG-Tf競爭TfR，我們選擇過表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的H印G2細(xì)胞作為靶細(xì)胞。
[0126] (1)首先取對(duì)數(shù)生長的HepG2細(xì)胞6 X IO3/孔的密度接種于90mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h 后，棄液，PBS洗滌，加入不同濃度的游離轉(zhuǎn)鐵蛋白（I50yg/mL、350yg/mL和1.5mg/mL)和0.12 ymol/mL Fe3+于37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ih后，加入實(shí)施例2制備所得的CQDs - PEG-Tf (100yg/mL)繼續(xù)孵育 4h;
[0127] (2)HepG2細(xì)胞中僅加入實(shí)施例2制備所得的CQDs-PEG-Tf(100yg/mL)繼續(xù)孵育 4h作為對(duì)照組；
[0128] (3)孵育完畢，PBS洗滌，采用流式儀檢測其熒光強(qiáng)度（380nm激發(fā)波長，接受波長 468nm)，結(jié)果見圖9〇
[0129] 圖9為考察靶向納米載體CQDs-PEG-Tf是否以腫瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo) 的途徑進(jìn)入細(xì)胞。結(jié)果顯示，未加入Fe 3+，即使游離轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度不斷增加也未能影響載 體CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞，而當(dāng)溶液中含F(xiàn)e3+時(shí)，隨著游離轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度的增加，HepG2細(xì) 胞對(duì)載體CQDs - PEG-Tf的吸收抑制程度越大，當(dāng)游離轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為1.5mg/mL時(shí)，細(xì)胞吸 收抑制率約達(dá)80%。由此說明靶向納米載體CQDs-PEG-Tf是通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)作用 進(jìn)入細(xì)胞。
[0130]實(shí)施例12定量檢測體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞對(duì)碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（CQDs- PEG-Tf) 3#攝取的靶向分析
[0131]為了進(jìn)一步確定實(shí)施例3制備的載體CQDs-PEG-Tf3#具有靶向性，我們采用游離 的轉(zhuǎn)鐵蛋白作競爭劑。通過該方法可證明CQDs-PEG-Tf是通過腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵 蛋白受體(TfR)介導(dǎo)的途徑。轉(zhuǎn)鐵蛋白有三種構(gòu)型：人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（h-Tf)、鐵飽和的轉(zhuǎn)鐵 蛋白（holo-Tf)、未含鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（apo-Tf)，這三種構(gòu)型的轉(zhuǎn)鐵蛋白與其受體的親和力也有 很大差異:鐵飽和的轉(zhuǎn)鐵蛋白與其受體的親和力最大，人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白次之，未含鐵轉(zhuǎn)鐵蛋 白的親和力最弱。由于載體CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞的時(shí)間要明顯比游離的轉(zhuǎn)鐵蛋白慢，所以 為了使細(xì)胞外有足夠的含F(xiàn)e 3+形式的轉(zhuǎn)鐵蛋白與TfR結(jié)合，占據(jù)TfR位點(diǎn)，達(dá)到與載體CQDs-PEG-Tf競爭TfR，我們選擇過表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的H印G2細(xì)胞作為靶細(xì)胞。
[0132] (1)首先取對(duì)數(shù)生長的HepG2細(xì)胞6 X 103/孔的密度接種于90mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h 后，棄液，PBS洗滌，加入不同濃度的游離轉(zhuǎn)鐵蛋白（I50yg/mL、350yg/mL和1.5mg/mL)和0.12 ymol/mL Fe3+于37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ih后，加入實(shí)施例3制備所得的CQDs - PEG-Tf (100yg/mL)繼續(xù)孵育 4h;
[0133] (2)HepG2細(xì)胞中僅加入實(shí)施例3制備所得的CQDs-PEG-Tf(100yg/mL)繼續(xù)孵育 4h作為對(duì)照組；
[0134] (3)孵育完畢，PBS洗滌，采用流式儀檢測其熒光強(qiáng)度（380nm激發(fā)波長，接受波長 468歷），結(jié)果見圖10〇
[0135] 圖10為考察靶向納米載體CQDs-PEG-Tf是否以腫瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo) 的途徑進(jìn)入細(xì)胞。結(jié)果顯示，未加入Fe 3+，即使游離轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度不斷增加也未能影響載 體CQDs-PEG-Tf進(jìn)入細(xì)胞，而當(dāng)溶液中含F(xiàn)e3+時(shí)，隨著游離轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度的增加，HepG2細(xì) 胞對(duì)載體CQDs - PEG-Tf的吸收抑制程度越大，當(dāng)游離轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為1.5mg/mL時(shí)，細(xì)胞吸 收抑制率約達(dá)76%。由此說明靶向納米載體CQDs-PEG-Tf是通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)作用 進(jìn)入細(xì)胞。此外，通過比較HepG2細(xì)胞對(duì)載體CQDs-PEG-Tf l#，CQDs-PEG-Tf 2#和 CQDs-PEG-Tf 3#的抑制率，發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞對(duì)這三種載體的抑制率有一定的差別，其對(duì) CQDs - PEG-Tf 3#的抑制率明顯低于前兩者，這充分說明了載體上偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量的 增高有利于促進(jìn)ifepG2細(xì)胞對(duì)載體的攝取。
[0136] 實(shí)施例13碳量子點(diǎn)靶向納米載體靶向藥物的體外殺瘤性實(shí)驗(yàn)
[0137] 以抗癌藥物絲裂霉素 MMC作為該實(shí)施例的藥物制劑，以HepG2細(xì)胞為靶細(xì)胞。取處 于對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞分別接種于96孔板中，接種濃度為5000個(gè)/孔，培養(yǎng)液為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放置于37°C、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸棄原培養(yǎng)基，每孔按照表1實(shí) 驗(yàn)組別設(shè)定重新加入200yL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基配制的藥物，同時(shí)以未加入藥物的 HepG2作為陰性對(duì)照組，每組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48和72h，換新鮮培養(yǎng)基和MTT( 5mg/ mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清液，加入二甲基亞砜150yL/孔，振蕩IOmin左右，采用MTT測定 吸光值(〇D480nm)，并按照下述公式計(jì)算其殺瘤性：
[0138] 殺傷率（％ ) = [(空白組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白組OD值]X 100%
[0139] 表1體外殺瘤性實(shí)驗(yàn)組別設(shè)定
L0142J 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2,從表2可以看出，相比于細(xì)胞對(duì)照組，三種碳量于點(diǎn)靶向納米載體 CQDs - PEG-Tf在選定濃度下對(duì)細(xì)胞的影響很小，說明三種CQDs-PEG-Tf均具有很好的生 物相容性。在24h時(shí)，A組中三種CQDs - PEG-Tf 一 MMC對(duì)細(xì)胞的殺傷作用較弱，但隨著時(shí)間的 延長，A組中三種CQDs-PEG-Tf 一 MMC對(duì)細(xì)胞的殺傷作用明顯增強(qiáng)，說明A組藥物均能夠有 效殺死腫瘤細(xì)胞。在相同時(shí)間和相同絲裂霉素濃度條件下，B組藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷力大于A 組藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷力，說明CQDs-PEG-Tf一MMC藥物具有緩釋藥物特性。由此說明 CQDs - PEG-Tf 一 MMC藥物既具有靶向抗腫瘤效應(yīng)又具有緩釋藥物特性。
[0143] 表2體外殺瘤性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0145] 實(shí)施例14碳量子點(diǎn)靶向納米載體靶向藥物聯(lián)合免疫細(xì)胞的體外殺瘤性實(shí)驗(yàn)
[0146] 以免疫細(xì)胞CIK和絲裂霉素 MMC作為該實(shí)施例的藥物制劑，首先取對(duì)數(shù)生長期的約 I X IO5CIK細(xì)胞接種于96孔板中，添加淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)液及因子IFN-γ，5%C02,37°C環(huán) 境下培養(yǎng)，24h后加入因子IL-2和抗CD3單抗繼續(xù)培養(yǎng)5d，收獲CIK細(xì)胞。取處于對(duì)數(shù)生長期 的HepG2細(xì)胞分別接種于96孔板中，接種濃度為5X IO3個(gè)/孔，培養(yǎng)液為含10%FBS的DMEM培 養(yǎng)基，放置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸棄原培養(yǎng)基，每孔按照表3實(shí)驗(yàn)組別設(shè)定 分別重新加入200yL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基配制的藥物lOOyg/mL CQDs-PEG-Tf+2yg/mL MMC+重懸好的免疫細(xì)胞CIK懸液(濃度為I X lOVmL)和重懸好的免疫細(xì)胞CIK懸液(濃度為1 X 107/mL)+2yg/mL MMC(詳見表3)，同時(shí)以未加入藥物的HepG2作為陰性對(duì)照組。每組均設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)12、24和48h，換新鮮培養(yǎng)基和MTT (5mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清液， 加入二甲基亞砜150yL/孔，振蕩IOmin左右，采用MTT測定吸光值(0D480nm)，并按照下述公 式計(jì)算其殺瘤性：
[0147] 殺傷率（％) = [(空白組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白組OD值]X 100%
[0148] 表3體外殺瘤性實(shí)驗(yàn)組別設(shè)定
[0150] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4,從表4可以看出，相比于細(xì)胞對(duì)照組，A組藥物和B組藥物對(duì)細(xì)胞均 具有殺傷作用，且在相同時(shí)間和相同藥物制劑濃度條件下，B組藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷力均 大于A組藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷力，說明碳量子點(diǎn)靶向納米載體CQDs-PEG-Tf對(duì)藥物具有 緩釋特性。在12h時(shí)，A組藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷作用較弱，但隨著時(shí)間的延長，A組藥物對(duì)細(xì)胞的 殺傷力顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步說明了 CQDs - PEG-Tf對(duì)藥物的緩釋特性，且其靶向藥物后聯(lián)合免 疫細(xì)胞應(yīng)用可大幅度增強(qiáng)抗癌效果。
[0151]表4體外殺瘤性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系，其特征在于:所述的靶向納米載藥體 系是以納米材料碳量子點(diǎn)CQDs為載體，聚乙二醇PEG為交聯(lián)物，轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf為靶向分子，通 過共價(jià)偶聯(lián)形成的靶向納米載體CQDs-PEG-Tf，其中每毫克CQDs - PEG偶聯(lián)轉(zhuǎn)鐵蛋白的含 量為282-316微克，其粒徑大小為224.5 ± 90.2nm。2. 如權(quán)利要求書1所述的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的制備方法，其特征 在于:包括如下步驟： 1) 將抗壞血酸溶于水中，攪拌均勻后，加入PEG攪拌，微波反應(yīng)，將所得溶液過濾、洗滌 和純化后，即得碳量子點(diǎn)水溶液;所得的碳量子點(diǎn)水溶液除去過量的溶劑，干燥，得到碳量 子點(diǎn)，粒徑為7 · 32 ± 0 · 98nm; 2) 取步驟1)所得干燥碳量子點(diǎn)，按比例加入無水N，N二甲基甲酰胺DMF和二氯亞砜 SOCl 2，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束旋除去過量的SOCl 2，得到酰氯化的碳量子點(diǎn)； 3) 取步驟2)所得酰氯化的碳量子點(diǎn)，按比例加入無水DMF中，并按比例加入聚乙二醇和 三乙胺，攪拌反應(yīng);離心，除去上清液，得沉積物碳量子點(diǎn)-聚乙二醇CQDs-PEG-OH，并烘 干； 4) 取步驟3)所得干燥碳量子點(diǎn)-聚乙二醇CQDs-PEG-OH中按比例加入無水DMF形成懸 濁液后，按質(zhì)量比加入琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP，攪拌反應(yīng);離心，除去上清液，得 沉積物碳量子點(diǎn)-聚乙二醇CQDs - PEG-COOH，并烘干； 5) 取步驟4)所得干燥沉積物碳量子點(diǎn)-聚乙二醇CQDs-PEG-⑶OH按比例加入至硼酸 緩沖溶液，形成懸濁液后，按比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺EDC，常溫下攪 拌反應(yīng);反應(yīng)液中按質(zhì)量比加入轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf，搖勻過夜，離心，除去上清液，得沉積物碳量子 點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白CQDs - PEG-Tf。3. 根據(jù)權(quán)利要求書2所述的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的制備方法，其特 征在于:所述步驟1)中，抗壞血酸在反應(yīng)液中的濃度為0.03g/ml，PEG在反應(yīng)液中的的體積 百分?jǐn)?shù)為66.7 % ;透析袋截留分子量為8000;微波功率200~400W，設(shè)定溫度60~100°C，微 波作用時(shí)間80~200秒。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的制備方法，其特征 在于:所述步驟2)中，無水N，N二甲基甲酰胺(DMF)溶劑的體積與碳量子點(diǎn)的質(zhì)量比為(0.1- 0.2)mL: Img，二氯亞砜(SOCh)的體積與碳量子點(diǎn)的質(zhì)量比為(0.4-0.6)mL: Img，反應(yīng)溫度 為65-70 °C。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的制備方法，其特征 在于:所述步驟3)中，無水DMF的體積與碳量子點(diǎn)的質(zhì)量比為(0.5-0.8)mL: Img;聚乙二醇與 碳量子點(diǎn)的質(zhì)量比為（2-2.5): 1;三乙胺的體積與酰氯化碳量子點(diǎn)的質(zhì)量比為(0.05-0.1) mL: lmg，反應(yīng)溫度為100°C。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的制備方法，其特征 在于：所述步驟4)中，無水DMF的體積與CQD s-PEG-OH的質(zhì)量比為（2.0-3.0) mL: I mg， CQDs-PEG-OH、琥珀酸酐SA和4-二甲胺基吡啶DMAP質(zhì)量比為1: (2-2 · 5): (2-2 · 5)，反應(yīng)溫 度為l〇〇°C。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的制備方法，其特征 在于:所述步驟5)中，硼酸緩沖溶液的體積與CQDs - PEG-COOH的質(zhì)量比為(0.4-0.6)mL: lmg，硼酸緩沖溶液pH為8.0; 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺EDC與CQDs-PEG-COOH 的質(zhì)量比為(2.2-2.5): 1，所用的轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf的分子量為80kDa，CQDs-PEG-COOH與轉(zhuǎn)鐵蛋 白的質(zhì)量比1:(0.3-1)。8. 含有如權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的免疫 細(xì)胞一 CQDs-PEG-Tf復(fù)合物，其特征在于，采用如下制備方法制成：首先按照每種類型的 免疫細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴(kuò)增獲得免疫細(xì)胞，在獲得的免 疫細(xì)胞中加入CQDs-PEG-Tf共同孵育后得到免疫細(xì)胞內(nèi)吞碳量子點(diǎn)-聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白 復(fù)合物，即免疫細(xì)胞一 CQDs - PEG-Tf復(fù)合物。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的免疫細(xì)胞一CQDs - PEG-Tf復(fù)合物，其特征在于：制備過程中 所加入的CQDs-PEG-Tf復(fù)合物濃度為40-100yg/mL，所述的免疫細(xì)胞選自樹突狀細(xì)胞DC、 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞CTL、自然殺傷細(xì)胞NK、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞CIK或腫瘤浸潤性淋巴 細(xì)胞TIL，其濃度為IO 5-IO8Ail。10. 含有如權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的 CQDs-PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物，其特征在于，采用如下制備方法制成:將抗癌藥物分子 通過物理吸附作用結(jié)合CQDs - PEG-Tf形成CQDs - PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的CQDs - PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物，其特征在于，所述的抗 腫瘤藥物分子是能通過物理吸附作用結(jié)合靶向納米載體CQDs - PEG-Tf的藥物分子。12. 含有如權(quán)利要求10所述的CQDs-PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物的免疫細(xì)胞一 CQDs- PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物，其特征在于，采用如下制備方法制成:首先按照每種類型的免 疫細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴(kuò)增獲得免疫細(xì)胞，在獲得的免疫 細(xì)胞中加入CQDs-PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物共同孵育，得到免疫細(xì)胞內(nèi)吞碳量子點(diǎn)-聚乙 二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白-藥物分子復(fù)合物，即免疫細(xì)胞一 CQDs - PEG-Tf 一藥物分子。13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的免疫細(xì)胞一CQDs-PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物，其特征在 于：制備過程中所加入的CQDs-PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物濃度為40-100yg/mL，所述的免 疫細(xì)胞選自樹突狀細(xì)胞DC、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞CTL、自然殺傷細(xì)胞NK、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷 細(xì)胞CIK或腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞TIL，其濃度為IO 5-IO8Ail。14. 如權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系CQDs - PEG-Tf在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。15. 如權(quán)利要求10-11任意一項(xiàng)所述的CQDs-PEG-Tf 一藥物分子復(fù)合物在制備腫瘤靶 向治療藥物中的應(yīng)用。16. 如權(quán)利要求8-9任意一項(xiàng)所述的輔助免疫細(xì)胞療法的靶向納米載藥體系的免疫細(xì) 胞一 CQDs - PEG-Tf復(fù)合物在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用。17. 如權(quán)利要求12-13任意一項(xiàng)所述的輔助免疫細(xì)胞療法的免疫細(xì)胞一 CQDs-TOG- Tf 一藥物分子復(fù)合物在制備腫瘤靶向治療藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105944110SQ201610448034
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月20日
【發(fā)明人】徐妍, 陳蕾, 郭世磊
【申請(qǐng)人】徐妍