基因的異常表達(dá)與肝癌不同分化程度的關(guān)系及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因的異常表達(dá)與肝癌不同分化程度的關(guān)系及應(yīng)用。發(fā)明通過在TCGA數(shù)據(jù)庫的中挑選肝癌患者的測序數(shù)據(jù)和臨床信息，進(jìn)行挑選和歸類，數(shù)據(jù)分析獲得與肝癌分化相關(guān)的差異表達(dá)基因，進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，顯示TRAIP基因和NAT14基因的表達(dá)高低和肝癌的分化呈負(fù)相關(guān)，高度分化的肝癌組織中，TRAIP基因、NAT14基因的表達(dá)量較低，分化較差的組織中TRAIP基因、NAT14基因的表達(dá)量較高。本發(fā)明提供的分子標(biāo)志物，可用來輔助診斷肝癌的分化程度，有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】
基因的異常表達(dá)與肝癌不同分化程度的關(guān)系及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因的異常表達(dá)與肝癌不同分化程度的關(guān)系 及應(yīng)用，更具體的涉及TRAIP基因、NAT14基因在制備診治肝癌分化制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌是我國常見的惡性腫瘤，2015年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國四種最常見腫瘤分 別是肺癌、胃癌、肝癌和食管癌，其中預(yù)計(jì)肝癌新發(fā)病約46.6萬，繼肺癌、胃癌和食管癌之 后，排名第四，但是，預(yù)計(jì)肝癌的死亡率達(dá)42.2萬，繼肺癌和胃癌之后，排名第三。
[0003] 在醫(yī)生制定手術(shù)方案時(shí)，肝癌的分化程度是影響方案的重要因素之一。肝癌的治 療方式主要包括手術(shù)切除、射頻消融等局部治療、介入栓塞、化療、生物免疫治療等。這些治 療手段各有所長，各有一定的適應(yīng)癥和局限性。外科手術(shù)是肝癌治療的主要手段，但在切除 大肝癌時(shí)切緣易殘留微小的癌灶，并且對肝臟功能也有較大的負(fù)面影響，手術(shù)后易發(fā)生斷 面的復(fù)發(fā)或肝功能不全等并發(fā)癥。射頻消融等局部治療對較小的肝癌病灶有很好的消融作 用，且對肝功能影響不大，但是，當(dāng)癌灶的體積較大時(shí)，往往存在消融不完全等問題。介入栓 塞治療雖然對癌灶有很好的治療作用，對于較大的腫瘤，或者多發(fā)性腫瘤尤為適合，但該方 法對肝臟功能有較大的負(fù)面影響，治療過度容易引起肝功能不全等并發(fā)癥。化療雖屬全身 性治療，但選擇性抑制作用不強(qiáng)，化療藥物往往"敵我"不分，毒性較大，因此單靠使用化療 藥物很難把癌細(xì)胞徹底消滅。中醫(yī)中藥在調(diào)動機(jī)體臟腑功能、提高人體抗病能力、減輕其它 治療的副作用等方面有其長處，但對腫瘤的局部控制能力較差。生物免疫治療屬于腫瘤治 療研究的重點(diǎn)，但現(xiàn)有的生物免疫治療方法只能在殘存腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少的情況下發(fā)揮作 用。各種治療方法的優(yōu)點(diǎn)有機(jī)地結(jié)合起來，制定確切有效的綜合治療方案，揚(yáng)長避短，發(fā)揮 各種治療方法的優(yōu)勢以提高療效，是進(jìn)一步提高肝癌遠(yuǎn)期治療效果的最重要措施。對于分 化程度高或較高的肝癌，醫(yī)生更傾向于手術(shù)切除；如果分化程度差，要慎重選擇手術(shù)切除。 由于手術(shù)前醫(yī)生無法確切地知道肝癌細(xì)胞的分化程度，這需要將手術(shù)標(biāo)本放在顯微鏡讓病 理醫(yī)生來檢查。這樣為醫(yī)生制定適宜的手術(shù)方案增加難度。
[0004] 本發(fā)明通過在TCGA數(shù)據(jù)庫的中挑選333例肝癌患者的測序數(shù)據(jù)和臨床信息，進(jìn)行 挑選和歸類，并對所有原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行總體歸一化處理后進(jìn)行l(wèi)inear by linear association test，數(shù)據(jù)分析獲得與肝癌分化相關(guān)的基因，進(jìn)一步對篩選到的與肝癌分化 相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)顯示TRAIP基因、NAT14基因的表達(dá)高低和肝癌的 分化呈負(fù)相關(guān)，高度分化的肝癌組織中，TRAIP基因、NAT14基因的表達(dá)量較低，分化較差的 組織中TRAIP基因 、NATl 4基因的表達(dá)量較高。本發(fā)明提供與肝癌分化高度相關(guān)的分子標(biāo)志 物，可用來動態(tài)監(jiān)測肝癌的分化程度，具有重要的臨床意義及應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供調(diào)節(jié)TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)或蛋白含量的試劑在制備 調(diào)控肝癌分化制劑中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供抑制TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)或降低蛋白含量的試劑在 制備肝癌分化誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明通過生物信息學(xué)整合分析篩選到TRAIP基因、NAT14基因，進(jìn) 而通過RT-PCR驗(yàn)證了他們與肝癌分化具有很好的相關(guān)性，可用于制備肝癌分化輔助診療制 劑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0008] 肝癌分化采用肝癌Edmondson-Steiner分級法：
[0009] I級:癌細(xì)胞呈高分化狀態(tài)，核/質(zhì)比接近正常；
[0010] Π 級:癌細(xì)胞中度分化，但核/質(zhì)比增加，核染色更深；
[0011] m級:癌細(xì)胞分化較差，核/質(zhì)比更高，核異質(zhì)明顯，核分裂多見；
[0012] IV級:癌細(xì)胞分化最差，胞質(zhì)少，核染色質(zhì)濃染，細(xì)胞形狀極不規(guī)則，排列松散。
[0013] 腫瘤的誘導(dǎo)分化治療是指利用分化誘導(dǎo)劑促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞向成熟細(xì)胞方向分 化，重建正常表型，恢復(fù)正常功能，并最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制增殖，從而達(dá)到治愈腫 瘤的目的。肝癌中TRAIP和/或NAT14基因的低表達(dá)有利于肝癌的高分化，即抑制TRAIP和/或 NAT14基因的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞向成熟細(xì)胞方向分化，從而達(dá)到治愈肝癌的目的。
[0014] 本領(lǐng)域人員熟知抑制基因的表達(dá)或降低蛋白含量通?？梢圆捎孟率龇椒ㄖ械囊?種和/或幾種:通過激活基因的抑制基因、激活基因的抑制基因表達(dá)的蛋白、采用RNA干擾技 術(shù)抑制基因表達(dá)、激活促進(jìn)基因 mRNA降解的microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)基因編碼蛋白降解的分子、 抑制促進(jìn)基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。即通過激活基因的抑制基因、激活抑制基因表達(dá) 的蛋白、導(dǎo)入抑制基因表達(dá)的siRNA、激活促進(jìn)基因 mRNA降解的microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)蛋白降 解的分子、抑制促進(jìn)基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。
[0015] -種肝癌分化誘導(dǎo)劑，所述誘導(dǎo)劑中含有抑制TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)或降低 蛋白含量的試劑。優(yōu)選的，試劑含有TRAIP和/或NAT14基因的特異性干擾RNA。
[0016] RNA干擾(RNAi)是指外源性和內(nèi)源性雙鏈RNA在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的mRNA 特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，是一種使用小的雙鏈RNA高效、特異地阻斷體內(nèi) 某種特定基因的表達(dá)，促使mRNA降解，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的技術(shù)。s iRNA設(shè)計(jì) 完成后可以采用直接合成法或者構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，制備好的SiRNA可以通過磷酸鈣共沉 淀法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機(jī)械法、陽離子脂質(zhì)體 試劑法等途徑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)明的目的在于提供檢測TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)情況或蛋白含量的試劑在 制備診斷肝癌分化制劑中的應(yīng)用。
[0018] 進(jìn)一步，TRAIP和/或NAT14基因或其表達(dá)產(chǎn)物在高分化肝癌樣本中低表達(dá)。TRAIP 和/或NATl4基因在不同肝癌分化組中相對表達(dá)量:I級〈Π 級〈m級〈IV級。
[0019] 進(jìn)一步，診斷肝癌分化制劑包括用焚光定量PCR方法、基因芯片方法、northern雜 交方法或高通量測序方法檢測樣本中TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)情況。
[0020] 用于熒光定量PCR方法檢測肝癌中TRAIP和/或NAT14基因的產(chǎn)品含有特異性擴(kuò)增 TRAIP和/或NAT14基因基因的引物;基因芯片包括與TRAIP和/或NAT14基因的核酸序列雜交 的探針;northern雜交包括與TRAIP和/或NAT14基因的核酸序列雜交的探針。
[0021] 優(yōu)選的，熒光定量PCR方法檢測基因 TRAIP和/或NAT14基因，采用特異的引物，檢測 TRAIP基因的引物序列為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2;檢測NAT14基因的引物序列為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
[0022] 優(yōu)選的，檢測樣本為肝癌組織。樣本可以通過穿刺活檢等方式取得。
[0023] 熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記 跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的 初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對定量。 多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、重復(fù) 性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。
[0024] 基因芯片又稱為DNA微陣列(DNA microarray)，可分為三種主要類型：1)固定在聚 合物基片(尼龍膜，硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的靶 基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列， 通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針 陣列，與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測。基因芯片作為一種先進(jìn)的、大規(guī)模、高通量檢測 技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面:一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性;二是快速 簡便;三是可同時(shí)檢測多種疾病。
[0025] 進(jìn)一步，診斷肝癌分化制劑包括用免疫方法檢測TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)產(chǎn)物 含量。
[0026] 優(yōu)選的，免疫方法檢測TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)產(chǎn)物含量為western blot和/或 ELI SA和/膠體金檢測方法。
[0027] ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒檢測TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)產(chǎn)物含量。試劑 盒中的抗體可采用市售的TRAIP和/或NAT14單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的試劑盒包括:包被 TRAIP和/或NAT14單克隆抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照品， 稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終止液等。
[0028] 膠體金法為使用膠體金試劑盒檢測TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)產(chǎn)物含量，抗體可 采用市售的TRAIP和/或NAT14單克隆抗體。進(jìn)一步，膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層析 技術(shù)或膠體金滲濾法。進(jìn)一步，膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)（T)噴點(diǎn)有抗 TRAIP和/或NAT14單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0029] 優(yōu)選的，檢測樣本為肝癌組織。
[0030] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測試劑盒根據(jù)檢測目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的ELISA JLISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶(HRP)或者堿性磷酸 酶(AP)。
[0031] 常用的免疫膠體金檢測技術(shù)：（1)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記， 使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合， 然后進(jìn)行負(fù)染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。（3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜作 載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測相應(yīng) 的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金 標(biāo)記試劑(抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上 后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動至固定的 抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集 在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。
[0032] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測肝癌分化的試劑盒，試劑盒檢測基因 TRAIP和/或 NAT14,采用特異的引物，檢測TRAIP基因的引物序列為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2;檢測 NAT14基因的引物序列為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
[0033] 進(jìn)一步，該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增儀，靈 敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0034] 進(jìn)一步，上述熒光定量PCR試劑盒組分包括:特異性引物、內(nèi)參引物、焚光定量PCR 反應(yīng)液。
[0035]本發(fā)明目的是提供了一種檢測肝癌分化的蛋白試劑盒，檢測試劑盒檢測TRAIP和/ 或NAT14蛋白量。進(jìn)一步的，試劑盒還包括其他檢測試劑。
[0036] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測肝癌分化的基因芯片，基因芯片包括與TRAIP和/或 NAT14基因的核酸序列雜交的探針。
【附圖說明】
[0037] 圖1是在肝癌不同分化程度組中2個(gè)基因 mRNA相對表達(dá)情況圖
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測。
[0039]實(shí)施例1數(shù)據(jù)的選擇 [0040] 1納入排除標(biāo)準(zhǔn)
[0041 ] TCGA 數(shù)據(jù)庫的nationwi dechi Idrens · org_c Iini cal_patient_lihc文件中共記錄 377例肝癌患者的臨床信息。本項(xiàng)目排除11181:〇^_〇1:1161'_111311811311〇7或11181:〇^_ neoadjuvant_treatment為Yes的患者37例，剩余患者340例納入本研究。
[0042] 2測序平臺數(shù)據(jù)選擇：
[0043] 我們選擇相對數(shù)據(jù)較多的UNC IlluminaHiseq_RNASeqV2平臺，有case371例。其中 有臨床信息的case有336例。
[0044] 3肝癌分化程度樣本選擇
[0045] 根據(jù)臨床資料記載（仙1:;[0歷丨(16(311；[1(1代118.0坪_(31;[11；^&1_口&1:丨6111:_1;[11(3)，340例 患者中，高分化49例，中分化156例，低分化116例，更低分化12例，Notavai IabI e (數(shù)據(jù)不存 在)3例。去除NA后，使用333例患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。
[0046] 實(shí)施例2數(shù)據(jù)分析
[0047]上述符合要求的樣本中，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析軟件對TCGA數(shù)據(jù)庫肝癌腫瘤組織分 級相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分析方法為用coin包的Ibl. test函數(shù)linear by linear association test，具體做法是根據(jù)每個(gè)基因的表達(dá)量的四分位數(shù)將每個(gè)樣本劃 分到為4個(gè)表達(dá)量區(qū)間，然后檢測表達(dá)量區(qū)間與tumor grade的相關(guān)性。采用標(biāo)準(zhǔn)是FDR〈 0.05,得到與腫瘤分級相關(guān)基因（包括正相關(guān)基因和負(fù)相關(guān)基因）。為了更好的研究與分化 程度相關(guān)的基因的功能，我們首先通過GeneC 〇diS3對分級相關(guān)基因進(jìn)行GO功能聚類和KEGG 富集。結(jié)果顯示，差異基因顯著富集在有絲分裂細(xì)胞周期(mitotic cell cycle)、病毒轉(zhuǎn)錄 (viral transcription)、番面譯終止（translational termination)、病毒感染周期（viral infectious cycle)等生物功能，以及細(xì)胞周期(Cell cycle)，核糖體(Ribosome)，PPAR，卵 母細(xì)胞減數(shù)分裂(Oocyte meiosis)，黃體酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟(Progesterone-mediated oocyte maturation)，脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism)，丁酸甲酯代謝（Butanoate metabolism)，丙酮酸鹽/酯代謝(Pyruvate metabolism)，p53,補(bǔ)體系統(tǒng)等信號通路。
[0048] 最后，結(jié)合上述分析結(jié)果，人為篩選出相關(guān)基因 TRAIP和NAT14基因，TRAIP和NAT14 基因的表達(dá)與腫瘤分化密切相關(guān)，在肝癌高分化組基因表達(dá)量較低，肝癌分化程度較差的 組織中基因表達(dá)量較高。
[0049] 實(shí)施例3臨床樣本的采集
[0050] 本發(fā)明中相關(guān)肝癌以及癌旁組織均取自醫(yī)院中經(jīng)手術(shù)治療過的肝癌患者，并且與 患者本人簽定知情書。切取離體后的癌以及癌5厘米以外的部分，分別用于實(shí)驗(yàn)的癌組織以 及癌旁組織，癌灶以及癌旁的診斷和分級均以最終的醫(yī)院病理診斷為依據(jù)。樣本均存放于-80 °C冰箱中待用。
[0051 ]肝癌 Edmondson-Steiner 分級法：
[0052] I級:癌細(xì)胞呈高分化狀態(tài)，核/質(zhì)比接近正常；
[0053] Π 級:癌細(xì)胞中度分化，但核/質(zhì)比增加，核染色更深；
[0054] m級:癌細(xì)胞分化較差，核/質(zhì)比更高，核異質(zhì)明顯，核分裂多見；
[0055] IV級:癌細(xì)胞分化最差，胞質(zhì)少，核染色質(zhì)濃染，細(xì)胞形狀極不規(guī)則，排列松散。 [0056]經(jīng)統(tǒng)計(jì)，132例原發(fā)性肝癌患者采集的樣本中，22例為女性（占16.67%)，110例為 男性（占83.33%)，年齡在32-79之間，醫(yī)院病理診斷顯示除5例由于樣本關(guān)系無法確認(rèn)，127 例肝癌樣本中9例為I級（高分化）、28例Π 級（中度分化）、59例ΙΠ 級（分化較差）、31例IV級 (分化最差）。
[0057] 實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
[0058] 1肝癌組織樣本RNA抽提
[0059] 127例肝癌樣本的RNA抽提采用試劑Trizol抽提，利用Trizol試劑破壞組織細(xì)胞， 釋放細(xì)胞中的RN A。具體抽提過程如下：
[0060] (1)從-80°c冰箱中去取出樣本組織，放入預(yù)冷后的滅菌研缽中進(jìn)行研磨；
[0061] (2)研磨組織粉末移入EP管中，加1毫升的Trizol和200微升氯仿混勻；
[0062] (3)4°C最大轉(zhuǎn)速離心10分鐘，分層；
[0063] (4)加500微升異丙醇，室溫靜置后4°C最大轉(zhuǎn)速離心15分鐘；
[0064] (5)加入1毫升7 5 %乙醇洗滌RNA沉淀；
[0065] (6)4°C最大轉(zhuǎn)速離心5分鐘后，除去液體，自然干燥RNA;
[0066] (7)加入30-50微升DEPC水溶解RNA，測定濃度后，低溫保存。
[0067] 提取組織的總RNA通過Nanodrop ND-1000讀取260nm和280nm處的吸光度值(A)測 定RNA溶液的純度。經(jīng)1 %甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察，檢測RNA的完整性。
[0068] 2RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA
[0069] 使用M-MLV Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄cDNA，操作過程如下：RNA2微克； Random Primer 1 微升；Nuclease-Free H2O補(bǔ)至 17微升。
[0070] 反應(yīng)條件:70°C下加熱5分鐘，然后立即放在冰上冷卻5分鐘，離心。
[0071] 在上面的反應(yīng)體系中加入5XReaction M-MLV Buffer 5微升；dNTP Mixturel .25 微升；Ribonuclease Inhibitor 0.75微升;M-MLV Reverse Transcriptasel微升。上述反 應(yīng)液混勻后，37°C下1-2小時(shí)。用相同體積的ddH20 25微升稀釋原來的模版cDNA，-20°C保存 備用。
[0072] 3RT-PCR檢測目的基因的表達(dá)量
[0073] (1)引物設(shè)計(jì)：
[0074] TRAIP基因擴(kuò)增引物：
[0075] 上游引物：5'-CAGAAAGACAAGGAGAAAC-3'（SEQ ID N0.1)
[0076] 下游引物：5'-GCAGAGATACCACAGTAG-3'（SEQ ID N0.2)
[0077] 擴(kuò)增長度:91bp。
[0078] NAT14基因擴(kuò)增引物：
[0079] 上游引物：5'-CTCTCTGGGAAGGTTGAG-3'（SEQ ID N0.3)
[0080] 下游引物：5'-TCAGGCTTTATTAACAAACG_3'（SEQ ID N0.4)
[0081 ] 擴(kuò)增長度:91bp。
[0082] (2)反應(yīng)體系及反應(yīng)程序：
[0083]將各樣品cDNA取2μ1作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因 β-actin引物進(jìn)行擴(kuò) 增。同時(shí)在60-95 °C進(jìn)行溶解曲線分析。
[0084] 表1反應(yīng)體系
L0086J 反應(yīng)程序：95 °C預(yù)變性10秒，35個(gè)循環(huán)(95 °C變性5秒，58 °C延伸30秒），循環(huán)結(jié)束后 4°C保存。
[0087] 4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0088]采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P〈 0.05差異有顯著性意義。
[0089] 5實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0090] 取5ylRNA，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，條帶清晰，結(jié)果顯示肝癌組織樣本RNA抽提 合格。
[0091]各樣本實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚、整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，極 限平而無上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高;樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線都是 單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；比較不同分化程度組間（I級、π級、m級、IV 級）2個(gè)基因的相對表達(dá)情況，TRAIP和NAT14基因在高分化時(shí)相對表達(dá)量較低，低分化時(shí)表 達(dá)量較高，并且表達(dá)趨勢顯示，2個(gè)基因的表達(dá)和肝癌的分化高度相關(guān)，隨著肝癌分化程度 升高基因表達(dá)量不斷下降(具體見圖1)，驗(yàn)證結(jié)果與高通量數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 調(diào)節(jié)TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)或蛋白含量的試劑在制備調(diào)控肝癌分化制劑中的應(yīng) 用。2. 抑制TRAIP和/或NAT 14基因表達(dá)或降低蛋白含量的試劑在制備肝癌分化誘導(dǎo)劑中的 應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，抑制基因的表達(dá)或降低蛋白含量通?？梢?采用下述方法中的一種和/或幾種:通過激活基因的抑制基因、激活基因的抑制基因表達(dá)的 蛋白、采用RNA干擾技術(shù)抑制基因表達(dá)、激活促進(jìn)基因 mRNA降解的microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)基因 編碼蛋白降解的分子、抑制促進(jìn)基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。即通過激活基因的抑制基 因、激活抑制基因表達(dá)的蛋白、導(dǎo)入抑制基因表達(dá)的siRNA、激活促進(jìn)基因 mRNA降解的 microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)蛋白降解的分子、抑制促進(jìn)基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。4. 檢測TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)情況或蛋白含量的試劑在制備診斷肝癌分化制劑中 的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，TRAIP和/或NAT14基因或其表達(dá)產(chǎn)物在高 分化肝癌樣本中低表達(dá)。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，診斷肝癌分化制劑包括用熒光定量PCR方 法、基因芯片方法、northern雜交方法或高通量測序方法檢測樣本中TRAIP和/或NAT14基因 表達(dá)情況。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光定量PCR方法檢測樣本中TRAIP和/或 NAT14基因表達(dá)的產(chǎn)品含有特異性擴(kuò)增TRAIP和/或NAT14基因的引物； 基因芯片方法使用與TRAIP和/或NAT14基因的核酸序列雜交的探針； northern雜交方法使用與TRAIP和/或NAT14基因的核酸序列雜交的探針。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，熒光定量PCR方法檢測樣本中TRAIP基因表 達(dá)的引物序列為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2;NAT14基因表達(dá)的引物序列為SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.4。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，診斷肝癌分化制劑包括用免疫方法檢測樣 本中TRAIP和/或NAT14基因表達(dá)產(chǎn)物含量，優(yōu)選的，免疫檢測方法檢測TRAIP和/或NAT14基 因表達(dá)產(chǎn)物含量為western blot和/或ELISA和/膠體金檢測方法。10. 根據(jù)權(quán)利要求5、6或9任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，樣本為肝癌組織。
【文檔編號】A61P35/00GK105944102SQ201610527303
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月6日
【發(fā)明人】果春青, 楊承剛, 宋宏濤
【申請人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司