專利名稱：：一種肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測基因芯片，屬于基因
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：我國是全球肝癌高發(fā)區(qū)，每年約20萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡人數(shù)的一半左右?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對肝癌進(jìn)行科學(xué)研究一百多年，雖然取得了不少成績，但肝癌人群的總體5年生存率至今仍只有3%左右，而提高肝癌預(yù)后的最大障礙是其極高的復(fù)發(fā)率，即使是根治性手術(shù)切除，仍有50%的病人會在5年內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。因此，預(yù)測肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)以便早期進(jìn)行必要的干預(yù)是進(jìn)一步改善肝癌預(yù)后的關(guān)鍵。目前臨床上雖然有一些預(yù)測肝癌預(yù)后的標(biāo)志物，但對于早期肝癌(TNM分期I期)及甲胎蛋白(AFP)陰性肝癌病人仍缺乏有效的預(yù)測手段。我們前期研究表明，利用基因芯片技術(shù)篩選癌中的差異表達(dá)基因可以來預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)。大量研究表明腫瘤干細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根本來源。我們前期研究表明肝癌中側(cè)群細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的特性，并且發(fā)現(xiàn)側(cè)群細(xì)胞和主群細(xì)胞之間基因差異表達(dá)譜和肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)關(guān)系密切。但是，由于芯片技術(shù)操作過于繁復(fù)，技術(shù)要求高，費(fèi)用昂貴，涉及基因數(shù)目龐大從而限制其在臨床上的應(yīng)用，而利用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)來聯(lián)合檢測數(shù)個關(guān)鍵基因，為肝癌的分子分型提供了一種在臨床上易于實(shí)施的方案。因此，我們從肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜中進(jìn)一步篩選，從中挑選出5個關(guān)鍵基因能夠較好的預(yù)測肝癌病人轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。到目前為止，從肝癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜中篩選預(yù)后相關(guān)基因的類似研究在國內(nèi)外未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的一種能夠方便運(yùn)用于臨床、能夠預(yù)測肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的基因芯片。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測基因芯片，其特征在于，所述芯片以EPAS1、JMJD1C、NEDD9、EPC2和USP36基因?yàn)闄z測位點(diǎn)，以e_肌動蛋白為內(nèi)參，以EPAS1基因上游引物5'TGCTACGCCACCCAGTACCA3'和下游引物5'CAGTTCGGGCAGCAGGTAGG3，、JMJD1C基因上游引物5'CAGCGGGAGCACTTCATCAG3，和下游引物5，TTCCTTCAAAAGTCTCAGTTCCTGTG3'、NEDD9基因上游引物5，CCCAAACCGAAGTCATAGCC3，和下游引物5，CAGGAACAGCCACCAATAAGC3，、EPC2基因上游引物5，CATTTGGGAGACTATGGTGGT3，和下游引物CTCTGCTTTAGGCTTCTTTGG3，、USP36基因上游引物5，CGAAGAGTTTGACCGAGGGAAG3'和下游引物5'GCAGCCTTTGCTGGGTGAGT3，、以及e-肌動蛋白上游引物5'AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC3'和下游引物5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA3'作為檢測探針。本發(fā)明的原理如下本發(fā)明采用流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株中側(cè)群細(xì)胞，利用基因芯片技術(shù)篩選出側(cè)群細(xì)胞和主群細(xì)胞之間的差異基因表達(dá)譜，而后在臨床病人組織標(biāo)本基因表達(dá)譜中篩選出一組能夠較好地預(yù)測肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的5個基因。這五個基因是EPAS1，JMJD1C，NEDD9，USP36和EPC2。如圖1所示，為獲得5個基因標(biāo)簽的分析流程圖，利用基因芯片技術(shù)篩選出側(cè)群細(xì)胞和主群細(xì)胞之間的差異基因表達(dá)譜。我們發(fā)現(xiàn)在268例臨床病人中，基因表達(dá)和差異基因表達(dá)譜相似的病人預(yù)后較差。為了便于臨床應(yīng)用，對于差異基因表達(dá)譜進(jìn)行進(jìn)一步篩選，從中挑選出一組能夠預(yù)測病人預(yù)后的基因組合。將268例臨床病人組織標(biāo)本隨機(jī)分成訓(xùn)練集和測試集，從訓(xùn)練集中篩選能夠預(yù)測病人術(shù)后復(fù)發(fā)的基因組合，并且在測試集中進(jìn)行驗(yàn)證。我們從中挑選出一組能夠較好地預(yù)測肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的含有5個基因的預(yù)測模型，并且最終采用實(shí)時熒光定量PCR在另一組100例臨床病人中進(jìn)行驗(yàn)證。圖2為五個基因標(biāo)簽在訓(xùn)練集中對肝癌病人術(shù)后總體生存的生存曲線，如圖2所示含有5個基因的預(yù)測模型能夠預(yù)測訓(xùn)練集肝癌病人術(shù)后總體生存，模型預(yù)測為高風(fēng)險組的生存時間明顯縮短(p=0.014)。圖3為五個基因標(biāo)簽在訓(xùn)練集中對肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)的生存曲線；如圖3所示含有5個基因的預(yù)測模型能夠預(yù)測訓(xùn)練集肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)，模型預(yù)測為高風(fēng)險組的復(fù)發(fā)時間明顯提前(p=0.002)。圖4為五個基因標(biāo)簽在測試集中對肝癌病人術(shù)后總體生存的生存曲線；如圖4所示含有5個基因的預(yù)測模型能夠預(yù)測測試集中肝癌病人術(shù)后總體生存，模型預(yù)測為高風(fēng)險組的生存時間明顯縮短(pO.OOOl)。圖5為五個基因標(biāo)簽在測試集中對肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)的生存曲線；如圖5所示含有5個基因的預(yù)測模型能夠預(yù)測測試集中肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)，模型預(yù)測為高風(fēng)險組的復(fù)發(fā)時間明顯提前(p<0.0001)。圖6為五個基因標(biāo)簽在驗(yàn)證集中對肝癌病人術(shù)后總體生存的生存曲線；如圖6所示含有5個基因的預(yù)測模型能夠預(yù)測驗(yàn)證集中肝癌病人術(shù)后總體生存，模型預(yù)測為高風(fēng)險組的生存時間明顯縮短(p=0.009)。圖7為五個基因標(biāo)簽在驗(yàn)證集中對肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)的生存曲線。如圖7所示含有5個基因的預(yù)測模型能夠預(yù)測驗(yàn)證集中肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)，模型預(yù)測為高風(fēng)險組的復(fù)發(fā)時間明顯提前(p=0.003)。本發(fā)明可通過利用定量PCR的方法來檢測這5個基因在肝癌組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，篩選出高復(fù)發(fā)風(fēng)險的肝癌病人。本發(fā)明具有診斷預(yù)測準(zhǔn)確、快速，方法簡單、易于推廣應(yīng)用等特點(diǎn)?？捎糜谂R床指導(dǎo)肝癌術(shù)后的輔助治療，降低高危肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率，從而改善肝癌患者的預(yù)后。這組基因標(biāo)簽對于甲胎蛋白陰性及早期肝癌病人預(yù)后的判斷具有重要的臨床意義。圖1為獲得5個基因標(biāo)簽的分析流程圖2為五個基因標(biāo)簽在訓(xùn)練集中對肝癌病人術(shù)后總體生存的生存曲線；圖3為五個基因標(biāo)簽在訓(xùn)練集中對肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)的生存曲線；圖4為五個基因標(biāo)簽在測試集中對肝癌病人術(shù)后總體生存的生存曲線；圖5為五個基因標(biāo)簽在測試集中對肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)的生存曲線；圖6為五個基因標(biāo)簽在驗(yàn)證集中對肝癌病人術(shù)后總體生存的生存曲線；圖7為五個基因標(biāo)簽在驗(yàn)證集中對肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)的生存曲線。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例一種肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測基因芯片，以EPAS1、JMJD1C、NEDD9、EPC2和USP36基因?yàn)闄z測位點(diǎn)，以e-肌動蛋白為內(nèi)參，以下表所示引物為檢測探針，其計算機(jī)可讀形式副本見附件<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述PCR芯片的制備方法如下采用預(yù)制PCR芯片的形式，將RT2SY服Green/R0XqPCRmastermix(SABiosciences，catalognumber:PA-122)[lOtilmastermix,7ul重蒸餾水(ddH20)，上述上、下游引物各lul(lOuM)]，預(yù)點(diǎn)于96孔實(shí)時定量PCR板(ABI公司生產(chǎn))，于-2(TC保存。96孔實(shí)時定量PCR板，每排12L，每個基因設(shè)復(fù)孔，共12孔，每排檢測一個病人，可以同時檢測8個病人。上述基因芯片的使用方法如下1、收集肝細(xì)胞肝癌病人術(shù)后腫瘤組織和癌旁組織，利用Trizol試劑盒分別抽提其中的總腿，取500ng總RNA用SuperscriptIIIFirst-StrandSynthesisS叩erMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)合成cDNA。2、定量PCR，檢測時PCR芯片中加入相應(yīng)的cDNA模板lul，共20wl反應(yīng)體系，在ABIPRISM7900熒光定量PCR儀中進(jìn)行檢測，e-肌動蛋白(0-actin)作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為95°C，10min;40個PCR循環(huán)(95°C，15秒；60°C，60秒(收集熒光))。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，(95°C，2min;60°C，20秒；99°C，10秒，并從6(TC緩慢加熱到99r(8分鐘)。各個基因表達(dá)值的計算方式采用相對定量-AACT[AACT=((CT(瘤內(nèi),耙細(xì))-CT灘內(nèi)，e—actin))_(CT鵬，！g鋼-CT(癌旁，P—actin)))]，取重復(fù)兩個點(diǎn)的平均值。e-actin是內(nèi)參，CT是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。3、病人的復(fù)發(fā)風(fēng)險預(yù)測值計算采用如下公式風(fēng)險系數(shù)=(-0.490XEPAS1)+(0.598XEPC2)+(0.258XNEDD9)+(0.302XJMJD1C)+(0.393XUSP36)，基因名稱代表每個基因最終檢測到的平均-AACT。如果風(fēng)險系數(shù)大于0.392則為高復(fù)發(fā)風(fēng)險，小于等于0.392則為低復(fù)發(fā)風(fēng)險。SEQUENCELISTING<110>復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院〈120〉一種肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測基因芯片〈140〉2009100471901〈141>2009-03-06<160>12<170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211>20〈212>DNA〈213>人體<400>1tgctacgccacccagtacca20〈210〉2<211〉20〈212>DNA〈213〉人體〈400〉2cagttcgggcagcaggtagg20〈210>3〈211>20〈212>DNA<213>人體〈400>3cagcgggagcacttcatcag20〈210>4〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人體<400>4ttccttcaaaagtctcagttcctgtg26<210>5〈211>20<212>DNA<213>人體〈400〉5cccaaaccgaagtcatagcc20〈210>6<211>21〈212>DNA<213>人體<400>6caggaacagccaccaataagc21〈210〉7〈211>22〈212>DNA〈213>人體<■>7cgaagagtttgaccgagggaag22<210>8<211>20〈212>腿〈213>人體〈400>8gcagcctttgctgggtgagt20〈210>9〈211>21<212>DNA〈213>人體〈400>9catttgggagactatggtggt21〈210〉10<211>21〈212>DNA<213〉人體〈400〉10ctctgctttaggcttctttgg21<210>11〈211>20〈212>DNA〈213〉人體<400>11aagaaggtggtgaagcaggc20〈210〉12〈211>20<212>DNA<213>人體〈400>12tccaccaccctgttgctgta20權(quán)利要求1、一種肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測基因芯片，其特征在于，所述芯片以EPAS1、JMJD1C、NEDD9、USP36、和USP36基因?yàn)闄z測位點(diǎn)，以β-肌動蛋白為內(nèi)參，以EPAS1基因上游引物5’TGCTACGCCACCCAGTACCA3’和下游引物5’CAGTTCGGGCAGCAGGTAGG3’、JMJD1C基因上游引物5’CAGCGGGAGCACTTCATCAG3’和下游引物5’TTCCTTCAAAAGTCTCAGTTCCTGTG3’、NEDD9基因上游引物5’CCCAAACCGAAGTCATAGCC3’和下游引物5’CAGGAACAGCCACCAATAAGC3’、EPC2基因上游引物5’CATTTGGGAGACTATGGTGGT3’和下游引物CTCTGCTTTAGGCTTCTTTGG3’、USP36基因上游引物5’CGAAGAGTTTGACCGAGGGAAG3’和下游引物5’GCAGCCTTTGCTGGGTGAGT3’、以及β-肌動蛋白上游引物5’AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC3’和下游引物5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’作為檢測探針。全文摘要本發(fā)明提供了一種肝細(xì)胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測基因芯片，其特征在于，所述芯片以EPAS1、JMJD1C、NEDD9、EPC2和USP36基因?yàn)闄z測位點(diǎn)，以β-肌動蛋白為內(nèi)參，以EPAS1、JMJD1C、NEDD9、EPC2和USP36基因的上游引物和下游引物作為檢測探針。本發(fā)明具有診斷預(yù)測準(zhǔn)確、快速，方法簡單、易于推廣應(yīng)用等特點(diǎn)?？捎糜谂R床指導(dǎo)肝癌術(shù)后的輔助治療，降低高危肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率，從而改善肝癌患者的預(yù)后。這組基因標(biāo)簽對于甲胎蛋白陰性及早期肝癌病人預(yù)后的判斷具有重要的臨床意義。文檔編號C40B40/04GK101560554SQ200910047190公開日2009年10月21日申請日期2009年3月6日優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日發(fā)明者儉周,泱徐,楊欣榮,嘉樊,邱雙健申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院